DE3329218C2

DE3329218C2 - Verfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methionin

Info

Publication number: DE3329218C2
Application number: DE3329218A
Authority: DE
Inventors: Shozo Shiozaki; Hideaki Yamada; Yoshiki Tani; Sakayu Shimizu
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1982-08-13
Filing date: 1983-08-12
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2003-08-13
Also published as: JPS5929700A; FR2531714B1; JPS635039B2; FR2531714A1; IT1169764B; IT8322555A1; CH653341A5; IT8322555A0; DE3329218A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methionin (nachstehend als SAM abgekürzt) und insbesondere ein Verfahren zur wirksamen Isolierung von SAM mit hoher Reinheit aus einer rohes SAM enthaltenden Lösung.

SAM ist eine wichtige Substanz, die beim Stoffwechsel von Fetten, Proteinen und Kohlenhydraten in vivo beteiligt ist. In letzter Zeit ist gefunden worden, daß SAM einen therapeutischen Effekt auf Jecur adiposum, Lipämie, Arteriosklerose, Depressionen und Schlaflosigkeit ausweist. Es besteht daher ein Bedürfnis nach einer Herstellung von SAM in größeren Mengen.

Zur Reinigung von SAM sind viele Methoden bereits bekannt. Spezielle Beispiele hierfür sind (1) ein Verfahren, umfassend eine Kombination einer Stufe der Behandlung der SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz und einer Stufe der Behandlung mit Aktivkohle (JA-AS 13680/1971); (2) ein Verfahren, umfassend die Behandlung der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz (Enzymologia, Band 29, Seite 183); (3) ein Verfahren, umfassend eine Kombination einer Stufe der Behandlung einer rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz vom H⁺-Typ und einer Stufe der Behandlung mit Aktivkohle (JA-OS 1 45 2999/1981); (4) ein Verfahren, umfassend die Behandlung der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem Celatharz (JA-AS 20 998/1978); und (5) ein Verfahren unter Verwendung eines Salzes von SAM mit Picrinsäure oder Picrolonsäure (US-PSen 37 07 536 und 39 54 726).

Das Verfahren (2) ist hinsichtlich der Prozeßstufen einfacher und wirtschaftlicher als die Verfahren (1), (4) oder (5). Dieses Verfahren hat aber den Nachteil, daß die Abtrennung von SAM von Verunreinigungen und Fremdmaterialien unvollständig ist und daß auf diese Weise kein SAM mit der für Arzneimittel erforderlichen Reinheit hergestellt werden kann. Bei dem Verfahren (3), das eine Verbesserung gegenüber dem Verfahren (1) darstellt, ist zwar die Reinheit des SAM erhöht, doch wird aufgrund der Tatsache, daß die Adsorption von SAM an der Aktivkohle stark ist, das Ausbeuteverhältnis von SAM vermindert. Versuche, das Ausbeuteverhältnis durch Erhöhung der Menge an organischem Lösungsmittel in dem Elutionsmittel zu erhöhen, führen nachteiligerweise zu einer nicht ausreichenden Abtrennung von SAM von den Verunreinigungen und Fremdmaterialien.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, durch das SAM mit hoher Reinheit wirksam isoliert werden kann.

Es wurden ausgedehnte Untersuchungen in dieser Hinsicht durchgeführt, und es wurde dabei festgestellt, daß SAM aus einer rohres SAM enthaltenden Flüssigkeit wirksam isoliert und gereinigt werden kann, wenn man eine Kombination einer Stufe der Behandlung mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz vom H⁺-Typ und einer Stufe der Behandlung mit einem porösen, synthetischen Harz-Adsorptionsmittel anwendet.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reinigung von SAM, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine rohes S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit in einen Reinigungsprozeß einführt, wobei der Reinigungsprozeß ein Serien- bzw. Reihen-Reinigungsprozeß ist, der in jeder beliebigen, gewünschten Reihenfolge aus

(A) mindestens einer Stufe der Behandlung der Flüssigkeit mit einem schwachsauren kationischen Austauscherharz vom H⁺-Typ und
(B) mindestens einer Stufe der Behandlung der Flüssigkeit mit einem porösen synthetischen Harz-Adsorptionsmittel besteht,

wobei man in der Stufe (A) die rohes S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, die einen pH-Wert von 3,5 bis 6,5 besitzt, mit dem Kationenaustauscherharz kontaktiert, um das in der Flüssigkeit enthaltende S-Adenosyl-L-methionin auf dem Harz zu adsorbieren, und daß man danach das S-Adenosyl- L-methionin von dem Kationenaustauscherharz unter Verwendung einer wäßrigen Lösung einer Säure mit einem pH- Wert von nicht mehr als 3,0 fraktioniert eluiert und in der Stufe (B) die das rohe S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, welche einen pH-Wert von nicht mehr als 6,5 hat, mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert, um hierdurch Fremdmaterialien in der Flüssigkeit auf dem Adsorptionsmittel zu adsorbieren.

Bezüglich des Herstellungsverfahrens der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit bestehen keine besonderen Begrenzungen. So kann diese beispielsweise dadurch hergestellt werden, daß ein Mikroorganismus der Gattung Saccharomyces, Candida oder Mucor, der SAM erzeugen kann, in einem Methionin enthaltenden Kulturmedium kultiviert wird, um SAM innerhalb und/oder außerhalb der Mikrobenzellen zu erzeugen, und die Kulturbrühe mit einem Extraktionsmittel, wie Perchlorsäure, Salzsäure, Schwefelsäure oder Ameisensäure, extrahiert wird, oder indem man Adenosintriphosphat und Methionin in Gegenwart von Methionin-Adenosyl-Transferase enzymatisch miteinander umsetzt.

Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es wesentlich, daß eine rohes SAM enthaltende Flüssigkeit in der Weise gereinigt wird, daß sie in einen Serien- bzw. Reihen-Reinigungsprozeß eingeführt wird, der in jeder beliebigen Reihenfolge aus (A) mindestens einer Stufe der Behandlung der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem schwachsauren Kationenaustauscherharz vom H⁺-Typ und (B) mindestens einer Stufe der Behandlung mit einem porösen synthetischen Harz-Adsorptionsmittel besteht.

Die Behandlungsstufe (A) wird folgendermaßen durchgeführt.

Zuerst wird der pH-Wert der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit gewöhnlich auf 3,5 bis 6,5, vorzugsweise 4 bis 6,5, eingestellt. Wenn der pH-Wert der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit zu niedrig ist, dann wird die Adsorption von SAM auf dem Ionenaustauscherharz erschwert. Wenn der pH-Wert der Flüssigkeit zu hoch ist, dann wird SAM gegenüber einer Zersetzung empfindlich. Die Methode der Einstellung des pH-Wertes unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Vorzugsweise wird die pH-Einstellung in der Weise vorgenommen, daß man eine Kombination aus einer Säure und einem Alkali, die dazu imstande ist, einen in Wasser schwer löslichen oder unlöslichen Niederschlag zu bilden, oder ein Anionenaustauscherharz (OH^--Typ) verwendet.

Durch die Kontaktierung der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit dem auf die obige Weise eingestellten pH-Wert mit dem schwach sauren Kationenaustauscherharz vom H⁺-Typ wird SAM, das eine positive Ladung aufweist, selektiv auf dem Kationenaustauscherharz adsorbiert. Die Verunreinigungen mit neutraler und negativer Ladung in der Flüssigkeit werden auf dem Harz nicht adsorbiert.

Das verwendete, schwach saure Kationenaustauscherharz kann ein beliebiges Kationenaustauscherharz mit Carbonsäuregruppen als Ionenaustauchergruppen sein. Spezielle Beispiele sind Amberlite IRC-50 und IRC-80 (Produkte von Rohm & Haas Co.) sowie Diaion WK20 (ein Produkt der Mitsubishi Chemical Co., Ltd.). Die Kontaktierung kann durch ein absatzweise durchgeführtes Verfahren oder ein Säulenverfahren erfolgen. Das Säulenverfahren wird aufgrund seiner guten Betriebsfähigkeit und leichten Entfernung der Verunreinigungen bevorzugt.

Das auf dem Ionenaustauscherharz adsorbierte SAM wird sodann abgetrennt, indem das Harz mit einer wäßrigen Lösung einer anorganischen oder organischen Säure mit einem pH-Wert von gewöhnlichen nicht mehr als 3,0, vorzugsweise 0,2 bis 2,0, fraktioniert eluiert wird. Die verwendete Säure unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Beispiele sind Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure und p-Toluolsulfonsäure. Erforderlichenfalls kann vor der fraktionierten Elution des SAM das Ionenaustauscherharz mit Wasser oder einer verdünnten, wäßrigen Säurelösung (z. B. mit einem pH-Wert von 3,5 oder mehr) gewaschen werden, um Spuren von darin befindlichen Verunreinigungen zu entfernen.

Die Behandlungsstufe (B) wird folgendermaßen durchgeführt.

Zuerst wird die rohes SAM enthaltende Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 6,5 oder weniger eingestellt und wird sodann mit dem porösen, synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert. Die pH-Einstellung und die Kontaktierung kann in der gleichen Weise wie in der Behandlungsstufe (A) erfolgen. Die Kontaktierung mit dem Adsorptionsmittel führt zu einer selektiven Adsorption der Amine, von Methylthioadenosin (dem Zersetzungsprodukt von SAM) und Farbstoffen, die Fremdmaterialien in der Flüssigkeit sind. Durch Auswahl der Bedingungen in der nachstehend beschriebenen Weise können SAM und die Fremdmaterialien miteinander auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert werden. In diesem Fall kann das SAM selektiv abgetrennt werden, indem man das Adsorptionsmittel mit einer wäßrigen Lösung einer anorganischen oder organischen Säure mit einem pH-Wert von nicht mehr als 3,5, vorzugsweise 0,2 bis 2,0, fraktioniert eluiert.

Anorganische und organische Säuren, die hierin verwendet werden können, können die gleichen wie die in der Behandlungsstufe (A) eingesetzten sein. Ein organisches Lösungsmittel kann zusammen mit der anorganischen oder organischen Säure verwendet werden, solange es in einer Menge vorliegt, die eine gleichförmige Lösung ergeben kann. Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, Aceton, Methylethylketon, Methylformiat, Ethylacetat, Dioxan und Toluol. Gewünschtenfalls kann in der gleichen Weise wie in Behandlungsstufe (A) das Adsorptionsmittel mit Wasser oder einer verdünnten, wäßrigen Säurelösung vor der fraktionierten Elution gewaschen werden, um etwa vorhandene Spuren von Verunreinigungen zu entfernen.

Das erfindungsgemäß verwendete, poröse, synthetische Harz-Adsorptionsmittel ist wasserunlöslich und hat eine große Netzwerkstruktur. Spezielle Beispiele sind nichtpolare Adsorptionsmittel, aufgebaut auf Styrol/ Divinylbenzol-Copolymeren als Matrix, wie Amberlite XAD-2 und XAD-4 (Produkte von Rohm & Haas Co.) sowie Diaion HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 und HP-50 (Produkte der Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), und mäßig polare Adsorptionsmittel auf der Basis eines Polymeren von Acrylsäureester und/oder Methacrylsäureester oder eines Copolymeren eines solchen Monomeren mit einem nichtpolaren Monomeren, wie Styrol und Divinylbenzol, als Matrix, z. B. Amberlite XAD-7 und XAD-8 (Produkte von Rohm & Haas Co.) sowie Diaion HP-ZMG (Produkt der Mitsubishi Chemical Co., Ltd.). Gewünschtenfalls können diese Adsorptionsmittel in Kombination verwendet werden.

Diesen Adsorptionsmitteln ist gemein, daß sie Fremdmaterialien in der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit, wie Amine und Farbstoffe, selektiv adsorbieren. Sie haben jedoch, je nach ihrem Typ, eine selektive Adsorptionsfähigkeit für SAM. So adsorbieren nichtpolare Adsorptionsmittel Fremdmaterialien, jedoch kein SAM, während mäßig polare Adsorptionsmittel SAM zusammen mit den Fremdmaterialien bei relativ schwacher Azidität adsorbieren, jedoch bei relativ starker Azidität nur die Fremdmaterialien adsorbieren und das SAM nicht adsorbieren.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Behandlung der Stufe (A) und die Behandlung der Stufe (B) jeweils mindestens einmal durchgeführt. Die Reihenfolge bzw. Sequenz der Behandlungsstufen ist beliebig. Bevorzugte Beispiele der Reihenfolge sind (1) (A) und dann (B); (2) (B) und dann (A); (3) (A), (B) und dann (A); und (4) (B), (A) und dann (B). Erforderlichenfalls können die Behandlungsstufe (A) und/oder die Behandlungsstufe (B) an diese Beispiele weiter angefügt werden. Bei zunehmender Anzahl der Behandlungsstufen wird naturgemäß die Wirtschaftlichkeit des Reinigungsprozesses geringfügig vermindert.

Wenn die Behandlungsstufe (B) vor der Behandlungsstufe (A) durchgeführt wird, dann ist es vom Betrieb her gesehen vorteilhaft, derartige Bedingungen einzustellen, daß nur die Verunreinigungen auf dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel selektiv adsorbiert werden, ohne daß eine Adsorption von SAM erfolgt. Eine spezielle Technik der Einstellung dieser Bedingungen besteht beispielsweise darin, ein nichtpolares Adsorptionsmittel zu verwenden oder ein mäßig polares Adsorptionsmittel zu verwenden, und die Kontaktierung bei einer Azidität eines pH-Wertes von nicht mehr als 3,5, vorzugsweise 0,2 bis 3,0, vorzunehmen.

Wenn die Endstufe des Reihenreinigungsprozesses die Stufe (B) ist, dann ist es möglich, ein Verfahren anzuwenden, bei dem man zuerst das SAM auf dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel adsorbiert und sodann abtrennt, oder ein Verfahren, bei dem man SAM durch das synthetische Harz-Adsorptionsmittel ohne Adsorption leitet.

Die SAM-Lösung, die von der beschriebenen Reihenreinigungsstufe eluiert worden ist, wird gewünschtenfalls unter vermindertem Druck konzentriert. Hierauf wird sie mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, Methoxyethanol, Aceton, Methylethylketon, Methylformiat, Ethylformiat, Methylacetat, Ethylacetat, Butylacetat und Dioxan, kontaktiert. Als Ergebnis kann ein Niederschlag eines Salzes erhalten werden, das aus SAM und einer organischen oder anorganischen Säure gebildet worden ist. Alternativ kann ohne Kontaktierung der SAM- Lösung mit einem organischen Lösungsmittel pulverförmiges Salz aus SAM und einer anorganischen oder organischen Säure erhalten werden, indem man die überschüssige Säure aus der SAM-Lösung unter Verwendung eines Anionenaustauscherharzes (OH^--Typ) oder eines Alkalis, das dazu imstande ist, durch Umsetzung mit der bei der fraktionierten Elution von SAM verwendeten Säure ein Salz zu bilden, entfernt und hierauf das Lösungsmittel bei vermindertem Druck aus der Lösung abdampft, bis der Rückstand trocken ist.

Das schwach saure Ionenaustauscherharz vom H⁺-Typ wird in einer Stufe regeneriert, wo das SAM daraus eluiert worden ist. Es ist daher nicht immer notwendig, das Austauscherharz einer speziellen Regenerierungsbehandlung zu unterwerfen. Es kann lediglich nach Waschen mit Wasser wiederholt verwendet werden. Andererseits kann das synthetische Harz-Adsorptionsmittel leicht regeneriert werden, indem man es beispielsweise mit einer 50%igen wäßrigen Methanollösung und hierauf mit Wasser wäscht.

Somit kann erfindungsgemäß SAM mit sehr hoher Reinheit wirksam durch einfache Verfahrensstufen und unter Verwendung von leicht zu regenerierenden Substanzen erhalten werden.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Saccharomyces cerevisiae (IFO 2044) wurde in dem Kulturmedium von F. Schlenk et al. [Journal of Biological Chemistry, Band 229, Seite 1037 (1957)] kultiviert, um Mikrobenzellen mit darin angesammeltem SAM zu bilden. 210 g der resultierenden Zellen wurden in 1000 ml 1,5 N Perchlorsäure suspendiert und unter Schütteln bei Raumtemperatur 1 h extrahiert. Sodann wurden die Zellrückstände durch Zentrifugieren abgetrennt. Kaliumhydrogencarbonat wurde zu dem Extrakt zugegeben, um den pH auf 5,0 einzustellen. Der resultierende Niederschlag von Kaliumperchlorat wurde durch Saugfiltration entfernt, wodurch 1080 ml eines Extrakts mit einem Gehalt von 1,15 g SAM erhalten wurden.

Der Extrakt wurde durch eine Säule geleitet, die mit 200 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes [Amberlite IRC-50 (H⁺-Typ), Warenzeichen für ein Produkt von Rohm & Haas Co.) gefüllt war, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001N Essigsäure gewaschen und mit 0,1 N Schwefelsäure fraktioniert eluiert, wodurch 630 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.

Die resultierende SAM-Lösung wurde auf einen pH-Wert von 4,5 mit einem schwach basischen Anionenaustauscherharz [Amberlite IRA-45 (OH^--Typ), Warenzeichen für ein Produkt von Rohm & Haas Co.] eingestellt und sodann durch eine Säule geleitet, die mit 1,5 l Amberlite XAD-7 (Warenzeichen für ein synthetisches Harz-Adsorptionsmittel vom Acrylat-Typ, hergestellt von Rohm & Haas Co.) gefüllt war, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 2 l 0,0001 N Essigsäure gewaschen und sodann mit 0,1 N Schwefelsäure fraktioniert eluiert, wodurch 1440 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.

Die SAM-Lösung wurde bei vermindertem Druck konzentriert, bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug. Hierauf wurden 800 ml Aceton zugesetzt, wodurch ein Niederschlag von SAM-sulfat erhalten wurde. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, in einer geringen Menge Wasser aufgelöst und sodann lyophilisiert, wodurch 1,74 g SAM-sulfat als weißes Pulver erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie mit Silikagel einen einzigen Flecken.

Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Beispiel 2

Ein Extrakt, enthaltend 1,06 g SAM, erhalten wie in Beispiel 1, wurde durch eine Säule geleitet, die mit 200 ml Amberlite IRC-84 (H⁺-Typ) (Warenzeichen für ein schwach saures Kationenaustauscherharz, hergestellt von Rohm & Haas Co.) gefüllt war, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001 N Salzsäure gewaschen und sodann mit Salzsäure fraktioniert eluiert, wodurch 640 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.

Die SAM-Lösung wurde mit Amberlite IRA-45 (OH^--Typ), einem schwach basischen Anionenaustauscherharz, auf einen pH-Wert von 4,8 eingestellt und hierauf durch eine Säule geleitet, die mit 1,5 l Amberlite XAD-7 (Warenzeichen für ein synthetisches Harz-Adsorptionsmittel, hergestellt von Rohm & Haas Co.) gefüllt war, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 2 l 0,0001 N Essigsäure gewaschen und hierauf fraktioniert eluiert, indem ein Mischlösungsmittel, bestehend aus 0,1 N Salzsäure und Aceton (im Volumenverhältnis von 1 : 0,1) hindurchgeleitet wurde. Auf diese Weise wurden 1120 ml einer SAM-Lösung erhalten.

Die SAM-Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert, bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug. Hierauf wurde Amberlite IRA-45 (OH^--Typ), ein schwach basisches Anionenaustauscherharz, zugesetzt, um den pH-Wert der Lösung auf 2,0 einzustellen. Das Harz wurde durch Absaugfiltration abgetrennt und das Filtrat bei vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde lyophilisiert und ergab 1,19 g SAm-hydrochlorid als weißes Pulver. Das Produkt zeigte bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie auf Silikagel einen einzigen Flecken.

Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Beispiel 3

Ein Extrakt, enthaltend 0,98 g SAM, erhalten wie in Beispiel 1, wurde durch eine Säule geleitet, die mit 200 ml Amberlite XAD-2 (Warenzeichen für ein Adsorptionsmittel vom Styrol/Divinylbenzol-Typ, hergestellt von Rohm & Haas Co.) gefüllt war, um Fremdmaterialien zu adsorbieren. Kaliumhydrogencarbonat wurde zu der SAM- Lösung, aus der die Fremdstoffe, wie oben beschrieben, entfernt worden waren, zugesetzt, um den pH-Wert auf 5,0 einzustellen. Der resultierende Niederschlag von Kaliumperchlorat wurde durch Saugfiltration entfernt.

Hierauf wurde die SAM-Lösung durch eine Säule geleitet, die mit 200 ml Amberlite RC-50 (H⁺-Typ), ein schwach saures Kationenaustauscherharz, gefüllt war, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001 N Essigsäure gewaschen und mit 0,1 N Schwefelsäure fraktioniert eluiert, wodurch 630 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.

Die resultierende SAM-Lösung wurde bei vermindertem Druck konzentriert, bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug. Danach wurden 800 ml Aceton zugegeben, wodurch ein Niederschlag von SAM-sulfat erhalten wurde. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, in einer geringen Wassermenge aufgelöst und lyophilisiert, wodurch 1,50 g SAM-sulfat als weißes Pulver erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie mit Silikagel einen einzigen Flecken.

Beispiel 4

Mikrobielle Zellen mit darin angesammeltem SAM wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. 200 g der mikrobiellen Zellen wurden in 1000 ml 0,1 N Ameisensäure suspendiert. Die Suspension wurde 10 min auf 60°C erhitzt und dann sofort abgekühlt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, wodurch 1020 ml eines Extrakts mit einem Gehalt an 0,91 g SAM erhalten wurden.

Der Extrakt wurde durch eine mit 200 ml Amberlite XAD-8 (Warenzeichen für ein Acrylat-Adsorptionsmittel, hergestellt von Rohm & Haas Co.) gefüllte Säule geleitet, um Fremdmaterialien zu adsorbieren.

Die SAM-Lösung, aus der die Fremdmaterialien entfernt worden waren, wurde mit der Amberlite IRA-45 (OH^--Typ), einem schwach basischen Anionenaustauscherharz, auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und sodann durch eine mit 200 ml Amberlite IRC-84 (H⁺-Typ), einem schwach sauren Kationenaustauscherharz, gefüllte Säule geleitet, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001 N Salzsäure gewaschen und dann mit 0,2 N Salzsäure fraktioniert destilliert, wodurch 710 ml einer SAM- Lösung erhalten wurden.

Amberlite IRA-45 (OH^--Typ), ein schwach basisches Anionenaustauscherharz, wurde zu der SAM-Lösung zur Einstellung ihres pH-Wertes auf 2,0 zugesetzt. Das Harz wurde durch Saugfiltration entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wodurch 1,01 g SAM-hydrochlorid als weißes Pulver erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie auf Silikagel einen einzigen Flecken.

Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit sind in Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 5

630 ml einer SAM-Lösung, erhalten durch Behandlung mit dem Styrol/Divinylbenzol-Adsorptionsmittel und dem schwach sauren Kationenaustauscherharz vom H⁺-Typ, wie in Beispiel 3, wurden durch eine mit 200 ml eines Adsorptionsmittels vom Acrylat-Typ (Amberlite XAD-7) gefüllte Säule geleitet, um Fremdmaterialien zu adsorbieren.

Die SAM-Lösung, aus der die Fremdmaterialien wie oben beschrieben entfernt worden waren, wurde bei vermindertem Druck konzentriert, bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug. Hierauf wurden 800 ml Aceton zugesetzt, um einen Niederschlag von SAM-sulfat zu bilden. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, in einer geringen Wassermenge aufgelöst und lyophilisiert, wodurch 1,46 g SAM-sulfat als weißes Pulver erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie mit Silikagel einen einzigen Flecken.

Vergleichsbeispiel 1

950 g eines Extraktes mit einem Gehalt an 0,98 g SAM, erhalten gemäß Beispiel 1, wurden mit Kaliumhydrogencarbonat auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Der resultierende Niederschlag von Kaliumperchlorat wurde durch Saugfiltration unter Bildung einer SAM enthaltenden Flüssigkeit entfernt.

Die SAM enthaltende Flüssigkeit wurde durch eine mit 200 ml Amberlite IRC-50 (H⁺-Typ), einem schwach sauren Kationenaustauscherharz, gefüllte Säule geleitet, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001 N Essigsäure gewaschen und dann mit 0,1 N Sulfat fraktioniert eluiert, wodurch 610 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.

Die SAM-Lösung wurde durch eine mit 200 ml Aktivkohle für die Chromatographie gefüllte Säule geleitet. Die Säule wurde mit 600 ml 0,2 N Schwefelsäure gewaschen und dann mit einem Mischlösungsmittel, bestehend aus 1,0 N Schwefelsäure und Methanol (1 : 1, Vol.), fraktioniert eluiert, wodurch eine SAM-Lösung erhalten wurde.

Die SAM-Lösung wurde bei vermindertem Druck konzentriert, bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug. 800 ml Aceton wurden zugesetzt, wodurch ein Niederschlag von SAM-sulfat erhalten wurde. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, in einer geringen Wassermenge gelöst und lyophilisiert, wodurch 1,28 g SAM-sulfat als weißes Pulver erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie auf Silikagel einen einzigen Flecken.

Vergleichsbeispiel 2

Beispiel 1 wurde lediglich mit der Ausnahme wiederholt, daß die Behandlung mit dem Amberlite IRD-50 (H⁺-Typ) als Reinigungsbehandlung durchgeführt wurde.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Bsp. steht für Beispiel und VglB. für Vergleichsbeispiel.

(+1) Die Reinheit von SAM wurde durch zweidimensionale Papierchromatographie gemessen.

(+2) Die Ninhydrinreaktion mit anderen Materialien als SAM wurde wie folgt durchgeführt: Eine Probe wurde durch zweidimensionale Dünnschichtchromatographie auf Cellulose entwickelt und das Vorhandensein von anderen Flecken als einem Flecken von SAM wurde anhand der Farbbildung mit Ninhydrin erfaßt und wie folgt bewertet:

- nicht vorhanden
+ geringfügiges Vorhandensein
++ erhebliches Vorhandensein.
(+3) Die Menge an Methylthioadenosin wurde durch zweidimensionale Papierchromatographie ermittelt.

Die obigen Ergebnisse zeigen eindeutig, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren SAM mit höherer Reinheit und mit höherem Gewinnungsverhältnis als bei bekannten Methoden erhalten werden kann.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methionin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine rohes S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit in einen Reinigungsprozeß einführt, wobei der Reinigungsprozeß ein Serien- bzw. Reihen-Reinigungsprozeß ist, der in jeder beliebigen, gewünschten Reihenfolge aus

wobei man in der Stufe (A) die rohes S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, die einen pH-Wert von 3,5 bis 6,5 besitzt, mit dem Kationenaustauscherharz kontaktiert, um das in der Flüssigkeit enthaltene S-Adenosyl-L-methionin auf dem Harz zu adsorbieren, und daß man danach das S-Adenosyl- L-methionin von dem Kationenaustauscherharz unter Verwendung einer wäßrigen Lösung einer Säure mit einer pH- Wert von nicht mehr als 3,0 fraktioniert eluiert und in der Stufe (B) die das rohe S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, welche einen pH-Wert von nicht mehr als 6,5 hat, mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert, um hierdurch Fremdmaterialien in der Flüssigkeit auf dem Adsorptionsmittel zu adsorbieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe (B) die das rohe S- Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, welche einen pH-Wert von nicht mehr als 6,5 hat, mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert, wodurch sowohl S-Adenosyl- L-methionin als auch Fremdmaterialien in der Flüssigkeit auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert werden, und daß man danach das S-Adenosyl-L-methionin von dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel unter Verwendung einer wäßrigen Lösung einer Säure mit einem pH-Wert von nicht mehr als 3,5 fraktioniert eluiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Reinigungsprozeß aus der Stufe (A) und der Stufe (B), in dieser Reihenfolge, besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Reinigungsprozeß aus der Stufe (A), der Stufe (B) und der Stufe (A), in dieser Reihenfolge, besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Reinigungsprozeß aus der Stufe (B) und der Stufe (A), in dieser Reihenfolge, besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Reinigungsprozeß aus der Stufe (B), der Stufe (A) und der Stufe (B), in dieser Reihenfolge, besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe (B) die das rohe S- Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, welche einen pH-Wert von nicht mehr als 6,5 hat, mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert, wodurch nur Fremdmaterialien in der Flüssigkeit auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in der ersten Stufe (B) die das rohe S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, welche einen pH-Wert von nicht mehr als 6,5 hat, mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert, wodurch nur die Fremdmaterialien in der Flüssigkeit auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert werden.