DE3329218C2 - Verfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methionin - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methioninInfo
- Publication number
- DE3329218C2 DE3329218C2 DE3329218A DE3329218A DE3329218C2 DE 3329218 C2 DE3329218 C2 DE 3329218C2 DE 3329218 A DE3329218 A DE 3329218A DE 3329218 A DE3329218 A DE 3329218A DE 3329218 C2 DE3329218 C2 DE 3329218C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- sam
- liquid
- methionine
- adenosyl
- adsorbent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von
S-Adenosyl-L-methionin (nachstehend als SAM abgekürzt)
und insbesondere ein Verfahren zur wirksamen Isolierung
von SAM mit hoher Reinheit aus einer rohes SAM
enthaltenden Lösung.
SAM ist eine wichtige Substanz, die beim Stoffwechsel
von Fetten, Proteinen und Kohlenhydraten in vivo beteiligt
ist. In letzter Zeit ist gefunden worden, daß
SAM einen therapeutischen Effekt auf Jecur adiposum,
Lipämie, Arteriosklerose, Depressionen und Schlaflosigkeit
ausweist. Es besteht daher ein Bedürfnis nach
einer Herstellung von SAM in größeren Mengen.
Zur Reinigung von SAM sind viele Methoden bereits bekannt.
Spezielle Beispiele hierfür sind (1) ein Verfahren,
umfassend eine Kombination einer Stufe der Behandlung
der SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem
stark sauren Kationenaustauscherharz und einer Stufe
der Behandlung mit Aktivkohle (JA-AS 13680/1971); (2)
ein Verfahren, umfassend die Behandlung der rohes SAM
enthaltenden Flüssigkeit mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz
(Enzymologia, Band 29, Seite 183);
(3) ein Verfahren, umfassend eine Kombination einer
Stufe der Behandlung einer rohes SAM enthaltenden
Flüssigkeit mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz
vom H⁺-Typ und einer Stufe der Behandlung
mit Aktivkohle (JA-OS 1 45 2999/1981); (4) ein Verfahren,
umfassend die Behandlung der rohes SAM enthaltenden
Flüssigkeit mit einem Celatharz (JA-AS 20 998/1978);
und (5) ein Verfahren unter Verwendung eines Salzes
von SAM mit Picrinsäure oder Picrolonsäure (US-PSen
37 07 536 und 39 54 726).
Das Verfahren (2) ist hinsichtlich der Prozeßstufen
einfacher und wirtschaftlicher als die Verfahren (1),
(4) oder (5). Dieses Verfahren hat aber den Nachteil,
daß die Abtrennung von SAM von Verunreinigungen und
Fremdmaterialien unvollständig ist und daß auf diese
Weise kein SAM mit der für Arzneimittel erforderlichen
Reinheit hergestellt werden kann. Bei dem Verfahren
(3), das eine Verbesserung gegenüber dem Verfahren (1)
darstellt, ist zwar die Reinheit des SAM erhöht, doch
wird aufgrund der Tatsache, daß die Adsorption von SAM
an der Aktivkohle stark ist, das Ausbeuteverhältnis
von SAM vermindert. Versuche, das Ausbeuteverhältnis
durch Erhöhung der Menge an organischem Lösungsmittel
in dem Elutionsmittel zu erhöhen, führen nachteiligerweise
zu einer nicht ausreichenden Abtrennung von SAM
von den Verunreinigungen und Fremdmaterialien.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur
Verfügung zu stellen, durch das SAM mit hoher Reinheit
wirksam isoliert werden kann.
Es wurden ausgedehnte Untersuchungen in dieser Hinsicht
durchgeführt, und es wurde dabei festgestellt,
daß SAM aus einer rohres SAM enthaltenden Flüssigkeit
wirksam isoliert und gereinigt werden kann, wenn man
eine Kombination einer Stufe der Behandlung mit einem
schwach sauren Kationenaustauscherharz vom H⁺-Typ und
einer Stufe der Behandlung mit einem porösen, synthetischen
Harz-Adsorptionsmittel anwendet.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur
Reinigung von SAM, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
man eine rohes S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit
in einen Reinigungsprozeß einführt, wobei der Reinigungsprozeß
ein Serien- bzw. Reihen-Reinigungsprozeß ist,
der in jeder beliebigen, gewünschten Reihenfolge aus
- (A) mindestens einer Stufe der Behandlung der Flüssigkeit mit einem schwachsauren kationischen Austauscherharz vom H⁺-Typ und
- (B) mindestens einer Stufe der Behandlung der Flüssigkeit mit einem porösen synthetischen Harz-Adsorptionsmittel besteht,
wobei man in der Stufe (A) die rohes S-Adenosyl-L-methionin
enthaltende Flüssigkeit, die einen pH-Wert von 3,5 bis 6,5
besitzt, mit dem Kationenaustauscherharz kontaktiert, um
das in der Flüssigkeit enthaltende S-Adenosyl-L-methionin
auf dem Harz zu adsorbieren, und daß man danach das S-Adenosyl-
L-methionin von dem Kationenaustauscherharz unter
Verwendung einer wäßrigen Lösung einer Säure mit einem pH-
Wert von nicht mehr als 3,0 fraktioniert eluiert und in der
Stufe (B) die das rohe S-Adenosyl-L-methionin enthaltende
Flüssigkeit, welche einen pH-Wert von nicht mehr als 6,5
hat, mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert,
um hierdurch Fremdmaterialien in der Flüssigkeit auf
dem Adsorptionsmittel zu adsorbieren.
Bezüglich des Herstellungsverfahrens der rohes SAM enthaltenden
Flüssigkeit bestehen keine besonderen Begrenzungen.
So kann diese beispielsweise dadurch hergestellt werden,
daß ein Mikroorganismus der Gattung Saccharomyces, Candida
oder Mucor, der SAM erzeugen kann, in einem Methionin enthaltenden
Kulturmedium kultiviert wird, um SAM innerhalb
und/oder außerhalb der Mikrobenzellen zu erzeugen, und die
Kulturbrühe mit einem Extraktionsmittel, wie Perchlorsäure,
Salzsäure, Schwefelsäure oder Ameisensäure, extrahiert
wird, oder indem man Adenosintriphosphat und Methionin in
Gegenwart von Methionin-Adenosyl-Transferase enzymatisch
miteinander umsetzt.
Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es wesentlich, daß
eine rohes SAM enthaltende Flüssigkeit in der Weise gereinigt
wird, daß sie in einen Serien- bzw. Reihen-Reinigungsprozeß
eingeführt wird, der in jeder beliebigen Reihenfolge
aus (A) mindestens einer Stufe der Behandlung der rohes SAM
enthaltenden Flüssigkeit mit einem schwachsauren Kationenaustauscherharz
vom H⁺-Typ und (B) mindestens einer Stufe
der Behandlung mit einem porösen synthetischen Harz-Adsorptionsmittel
besteht.
Die Behandlungsstufe (A) wird folgendermaßen durchgeführt.
Zuerst wird der pH-Wert der rohes SAM enthaltenden
Flüssigkeit gewöhnlich auf 3,5 bis 6,5, vorzugsweise 4
bis 6,5, eingestellt. Wenn der pH-Wert der rohes SAM
enthaltenden Flüssigkeit zu niedrig ist, dann wird die
Adsorption von SAM auf dem Ionenaustauscherharz erschwert.
Wenn der pH-Wert der Flüssigkeit zu hoch ist,
dann wird SAM gegenüber einer Zersetzung empfindlich.
Die Methode der Einstellung des pH-Wertes unterliegt
keinen besonderen Beschränkungen. Vorzugsweise wird
die pH-Einstellung in der Weise vorgenommen, daß man
eine Kombination aus einer Säure und einem Alkali, die
dazu imstande ist, einen in Wasser schwer löslichen
oder unlöslichen Niederschlag zu bilden, oder ein
Anionenaustauscherharz (OH--Typ) verwendet.
Durch die Kontaktierung der rohes SAM enthaltenden
Flüssigkeit mit dem auf die obige Weise eingestellten
pH-Wert mit dem schwach sauren Kationenaustauscherharz
vom H⁺-Typ wird SAM, das eine positive Ladung aufweist,
selektiv auf dem Kationenaustauscherharz adsorbiert.
Die Verunreinigungen mit neutraler und negativer Ladung
in der Flüssigkeit werden auf dem Harz nicht adsorbiert.
Das verwendete, schwach saure Kationenaustauscherharz
kann ein beliebiges Kationenaustauscherharz mit Carbonsäuregruppen
als Ionenaustauchergruppen sein. Spezielle
Beispiele sind Amberlite IRC-50 und IRC-80 (Produkte
von Rohm & Haas Co.) sowie Diaion WK20 (ein Produkt der
Mitsubishi Chemical Co., Ltd.). Die Kontaktierung kann
durch ein absatzweise durchgeführtes Verfahren oder ein
Säulenverfahren erfolgen. Das Säulenverfahren wird aufgrund
seiner guten Betriebsfähigkeit und leichten Entfernung
der Verunreinigungen bevorzugt.
Das auf dem Ionenaustauscherharz adsorbierte SAM wird
sodann abgetrennt, indem das Harz mit einer wäßrigen
Lösung einer anorganischen oder organischen Säure mit
einem pH-Wert von gewöhnlichen nicht mehr als 3,0, vorzugsweise
0,2 bis 2,0, fraktioniert eluiert wird. Die
verwendete Säure unterliegt keinen besonderen Beschränkungen.
Beispiele sind Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure
und p-Toluolsulfonsäure. Erforderlichenfalls kann
vor der fraktionierten Elution des SAM das Ionenaustauscherharz
mit Wasser oder einer verdünnten, wäßrigen
Säurelösung (z. B. mit einem pH-Wert von 3,5 oder mehr)
gewaschen werden, um Spuren von darin befindlichen Verunreinigungen
zu entfernen.
Die Behandlungsstufe (B) wird folgendermaßen durchgeführt.
Zuerst wird die rohes SAM enthaltende Flüssigkeit auf
einen pH-Wert von 6,5 oder weniger eingestellt und
wird sodann mit dem porösen, synthetischen Harz-Adsorptionsmittel
kontaktiert. Die pH-Einstellung und die
Kontaktierung kann in der gleichen Weise wie in der
Behandlungsstufe (A) erfolgen. Die Kontaktierung mit
dem Adsorptionsmittel führt zu einer selektiven Adsorption
der Amine, von Methylthioadenosin (dem Zersetzungsprodukt
von SAM) und Farbstoffen, die Fremdmaterialien
in der Flüssigkeit sind. Durch Auswahl der Bedingungen
in der nachstehend beschriebenen Weise können SAM und
die Fremdmaterialien miteinander auf dem Adsorptionsmittel
adsorbiert werden. In diesem Fall kann das SAM
selektiv abgetrennt werden, indem man das Adsorptionsmittel
mit einer wäßrigen Lösung einer anorganischen
oder organischen Säure mit einem pH-Wert von nicht
mehr als 3,5, vorzugsweise 0,2 bis 2,0, fraktioniert
eluiert.
Anorganische und organische Säuren, die hierin verwendet
werden können, können die gleichen wie die in der Behandlungsstufe
(A) eingesetzten sein. Ein organisches
Lösungsmittel kann zusammen mit der anorganischen oder
organischen Säure verwendet werden, solange es in einer
Menge vorliegt, die eine gleichförmige Lösung ergeben
kann. Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel
sind Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, Aceton,
Methylethylketon, Methylformiat, Ethylacetat, Dioxan
und Toluol. Gewünschtenfalls kann in der gleichen Weise
wie in Behandlungsstufe (A) das Adsorptionsmittel mit
Wasser oder einer verdünnten, wäßrigen Säurelösung vor
der fraktionierten Elution gewaschen werden, um etwa
vorhandene Spuren von Verunreinigungen zu entfernen.
Das erfindungsgemäß verwendete, poröse, synthetische
Harz-Adsorptionsmittel ist wasserunlöslich und hat
eine große Netzwerkstruktur. Spezielle Beispiele sind
nichtpolare Adsorptionsmittel, aufgebaut auf Styrol/
Divinylbenzol-Copolymeren als Matrix, wie Amberlite
XAD-2 und XAD-4 (Produkte von Rohm & Haas Co.) sowie
Diaion HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 und HP-50 (Produkte
der Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), und mäßig polare
Adsorptionsmittel auf der Basis eines Polymeren von
Acrylsäureester und/oder Methacrylsäureester oder
eines Copolymeren eines solchen Monomeren mit einem
nichtpolaren Monomeren, wie Styrol und Divinylbenzol,
als Matrix, z. B. Amberlite XAD-7 und XAD-8
(Produkte von Rohm & Haas Co.) sowie Diaion HP-ZMG
(Produkt der Mitsubishi Chemical Co., Ltd.). Gewünschtenfalls
können diese Adsorptionsmittel in Kombination
verwendet werden.
Diesen Adsorptionsmitteln ist gemein, daß sie Fremdmaterialien
in der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit,
wie Amine und Farbstoffe, selektiv adsorbieren. Sie
haben jedoch, je nach ihrem Typ, eine selektive Adsorptionsfähigkeit
für SAM. So adsorbieren nichtpolare
Adsorptionsmittel Fremdmaterialien, jedoch kein SAM,
während mäßig polare Adsorptionsmittel SAM zusammen
mit den Fremdmaterialien bei relativ schwacher Azidität
adsorbieren, jedoch bei relativ starker Azidität nur
die Fremdmaterialien adsorbieren und das SAM nicht
adsorbieren.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Behandlung
der Stufe (A) und die Behandlung der Stufe (B)
jeweils mindestens einmal durchgeführt. Die Reihenfolge
bzw. Sequenz der Behandlungsstufen ist beliebig. Bevorzugte
Beispiele der Reihenfolge sind (1) (A) und
dann (B); (2) (B) und dann (A); (3) (A), (B) und dann
(A); und (4) (B), (A) und dann (B). Erforderlichenfalls
können die Behandlungsstufe (A) und/oder die Behandlungsstufe
(B) an diese Beispiele weiter angefügt werden.
Bei zunehmender Anzahl der Behandlungsstufen wird
naturgemäß die Wirtschaftlichkeit des Reinigungsprozesses
geringfügig vermindert.
Wenn die Behandlungsstufe (B) vor der Behandlungsstufe
(A) durchgeführt wird, dann ist es vom Betrieb her gesehen
vorteilhaft, derartige Bedingungen einzustellen,
daß nur die Verunreinigungen auf dem synthetischen
Harz-Adsorptionsmittel selektiv adsorbiert werden,
ohne daß eine Adsorption von SAM erfolgt. Eine spezielle
Technik der Einstellung dieser Bedingungen besteht
beispielsweise darin, ein nichtpolares Adsorptionsmittel
zu verwenden oder ein mäßig polares Adsorptionsmittel
zu verwenden, und die Kontaktierung bei einer
Azidität eines pH-Wertes von nicht mehr als 3,5, vorzugsweise
0,2 bis 3,0, vorzunehmen.
Wenn die Endstufe des Reihenreinigungsprozesses die
Stufe (B) ist, dann ist es möglich, ein Verfahren anzuwenden,
bei dem man zuerst das SAM auf dem synthetischen
Harz-Adsorptionsmittel adsorbiert und sodann abtrennt,
oder ein Verfahren, bei dem man SAM durch das
synthetische Harz-Adsorptionsmittel ohne Adsorption
leitet.
Die SAM-Lösung, die von der beschriebenen Reihenreinigungsstufe
eluiert worden ist, wird gewünschtenfalls
unter vermindertem Druck konzentriert. Hierauf wird sie
mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol,
Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol,
Methoxyethanol, Aceton, Methylethylketon, Methylformiat,
Ethylformiat, Methylacetat, Ethylacetat, Butylacetat
und Dioxan, kontaktiert. Als Ergebnis kann ein
Niederschlag eines Salzes erhalten werden, das aus SAM
und einer organischen oder anorganischen Säure gebildet
worden ist. Alternativ kann ohne Kontaktierung der SAM-
Lösung mit einem organischen Lösungsmittel pulverförmiges
Salz aus SAM und einer anorganischen oder organischen
Säure erhalten werden, indem man die überschüssige
Säure aus der SAM-Lösung unter Verwendung eines Anionenaustauscherharzes
(OH--Typ) oder eines Alkalis, das dazu
imstande ist, durch Umsetzung mit der bei der fraktionierten
Elution von SAM verwendeten Säure ein Salz zu
bilden, entfernt und hierauf das Lösungsmittel bei vermindertem
Druck aus der Lösung abdampft, bis der Rückstand
trocken ist.
Das schwach saure Ionenaustauscherharz vom H⁺-Typ wird
in einer Stufe regeneriert, wo das SAM daraus eluiert
worden ist. Es ist daher nicht immer notwendig, das
Austauscherharz einer speziellen Regenerierungsbehandlung
zu unterwerfen. Es kann lediglich nach Waschen mit Wasser
wiederholt verwendet werden. Andererseits kann das synthetische
Harz-Adsorptionsmittel leicht regeneriert
werden, indem man es beispielsweise mit einer 50%igen
wäßrigen Methanollösung und hierauf mit Wasser wäscht.
Somit kann erfindungsgemäß SAM mit sehr hoher Reinheit
wirksam durch einfache Verfahrensstufen und unter Verwendung
von leicht zu regenerierenden Substanzen erhalten
werden.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.
Saccharomyces cerevisiae (IFO 2044) wurde in dem Kulturmedium
von F. Schlenk et al. [Journal of Biological
Chemistry, Band 229, Seite 1037 (1957)] kultiviert, um
Mikrobenzellen mit darin angesammeltem SAM zu bilden.
210 g der resultierenden Zellen wurden in 1000 ml 1,5 N
Perchlorsäure suspendiert und unter Schütteln bei Raumtemperatur
1 h extrahiert. Sodann wurden die Zellrückstände
durch Zentrifugieren abgetrennt. Kaliumhydrogencarbonat
wurde zu dem Extrakt zugegeben, um den pH
auf 5,0 einzustellen. Der resultierende Niederschlag
von Kaliumperchlorat wurde durch Saugfiltration entfernt,
wodurch 1080 ml eines Extrakts mit einem Gehalt
von 1,15 g SAM erhalten wurden.
Der Extrakt wurde durch eine Säule geleitet, die mit
200 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes
[Amberlite IRC-50 (H⁺-Typ), Warenzeichen für ein Produkt
von Rohm & Haas Co.) gefüllt war, um SAM zu adsorbieren.
Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001N Essigsäure gewaschen
und mit 0,1 N Schwefelsäure fraktioniert eluiert,
wodurch 630 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.
Die resultierende SAM-Lösung wurde auf einen pH-Wert
von 4,5 mit einem schwach basischen Anionenaustauscherharz
[Amberlite IRA-45 (OH--Typ), Warenzeichen für
ein Produkt von Rohm & Haas Co.] eingestellt und sodann
durch eine Säule geleitet, die mit 1,5 l Amberlite
XAD-7 (Warenzeichen für ein synthetisches Harz-Adsorptionsmittel
vom Acrylat-Typ, hergestellt von Rohm &
Haas Co.) gefüllt war, um SAM zu adsorbieren. Die Säule
wurde mit 2 l 0,0001 N Essigsäure gewaschen und sodann
mit 0,1 N Schwefelsäure fraktioniert eluiert, wodurch
1440 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.
Die SAM-Lösung wurde bei vermindertem Druck konzentriert,
bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug. Hierauf wurden
800 ml Aceton zugesetzt, wodurch ein Niederschlag von
SAM-sulfat erhalten wurde. Der Niederschlag wurde durch
Zentrifugieren abgetrennt, in einer geringen Menge Wasser
aufgelöst und sodann lyophilisiert, wodurch 1,74 g
SAM-sulfat als weißes Pulver erhalten wurden. Dieses
Produkt zeigte bei der Papierchromatographie und der
Dünnschichtchromatographie mit Silikagel einen einzigen
Flecken.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit
sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Ein Extrakt, enthaltend 1,06 g SAM, erhalten wie in
Beispiel 1, wurde durch eine Säule geleitet, die mit
200 ml Amberlite IRC-84 (H⁺-Typ) (Warenzeichen für
ein schwach saures Kationenaustauscherharz, hergestellt
von Rohm & Haas Co.) gefüllt war, um SAM zu adsorbieren.
Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001 N Salzsäure
gewaschen und sodann mit Salzsäure fraktioniert eluiert,
wodurch 640 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.
Die SAM-Lösung wurde mit Amberlite IRA-45 (OH--Typ),
einem schwach basischen Anionenaustauscherharz, auf
einen pH-Wert von 4,8 eingestellt und hierauf durch
eine Säule geleitet, die mit 1,5 l Amberlite XAD-7
(Warenzeichen für ein synthetisches Harz-Adsorptionsmittel,
hergestellt von Rohm & Haas Co.) gefüllt war,
um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 2 l 0,0001 N
Essigsäure gewaschen und hierauf fraktioniert eluiert,
indem ein Mischlösungsmittel, bestehend aus 0,1 N Salzsäure
und Aceton (im Volumenverhältnis von 1 : 0,1) hindurchgeleitet
wurde. Auf diese Weise wurden 1120 ml
einer SAM-Lösung erhalten.
Die SAM-Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert,
bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug. Hierauf
wurde Amberlite IRA-45 (OH--Typ), ein schwach basisches
Anionenaustauscherharz, zugesetzt, um den pH-Wert
der Lösung auf 2,0 einzustellen. Das Harz wurde durch
Absaugfiltration abgetrennt und das Filtrat bei vermindertem
Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde
lyophilisiert und ergab 1,19 g SAm-hydrochlorid als
weißes Pulver. Das Produkt zeigte bei der Papierchromatographie
und der Dünnschichtchromatographie auf Silikagel
einen einzigen Flecken.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit
sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Ein Extrakt, enthaltend 0,98 g SAM, erhalten wie in
Beispiel 1, wurde durch eine Säule geleitet, die mit
200 ml Amberlite XAD-2 (Warenzeichen für ein Adsorptionsmittel
vom Styrol/Divinylbenzol-Typ, hergestellt
von Rohm & Haas Co.) gefüllt war, um Fremdmaterialien
zu adsorbieren. Kaliumhydrogencarbonat wurde zu der SAM-
Lösung, aus der die Fremdstoffe, wie oben beschrieben,
entfernt worden waren, zugesetzt, um den pH-Wert auf 5,0
einzustellen. Der resultierende Niederschlag von Kaliumperchlorat
wurde durch Saugfiltration entfernt.
Hierauf wurde die SAM-Lösung durch eine Säule geleitet,
die mit 200 ml Amberlite RC-50 (H⁺-Typ), ein schwach
saures Kationenaustauscherharz, gefüllt war, um SAM zu
adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001 N Essigsäure
gewaschen und mit 0,1 N Schwefelsäure fraktioniert
eluiert, wodurch 630 ml einer SAM-Lösung erhalten wurden.
Die resultierende SAM-Lösung wurde bei vermindertem
Druck konzentriert, bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug.
Danach wurden 800 ml Aceton zugegeben, wodurch ein Niederschlag
von SAM-sulfat erhalten wurde. Der Niederschlag
wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, in einer
geringen Wassermenge aufgelöst und lyophilisiert, wodurch
1,50 g SAM-sulfat als weißes Pulver erhalten wurden.
Dieses Produkt zeigte bei der Papierchromatographie
und der Dünnschichtchromatographie mit Silikagel einen
einzigen Flecken.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit
sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Mikrobielle Zellen mit darin angesammeltem SAM wurden
wie in Beispiel 1 hergestellt. 200 g der mikrobiellen
Zellen wurden in 1000 ml 0,1 N Ameisensäure suspendiert.
Die Suspension wurde 10 min auf 60°C erhitzt und dann
sofort abgekühlt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren
abgetrennt, wodurch 1020 ml eines Extrakts mit einem
Gehalt an 0,91 g SAM erhalten wurden.
Der Extrakt wurde durch eine mit 200 ml Amberlite XAD-8
(Warenzeichen für ein Acrylat-Adsorptionsmittel, hergestellt
von Rohm & Haas Co.) gefüllte Säule geleitet, um
Fremdmaterialien zu adsorbieren.
Die SAM-Lösung, aus der die Fremdmaterialien entfernt
worden waren, wurde mit der Amberlite IRA-45 (OH--Typ),
einem schwach basischen Anionenaustauscherharz, auf
einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und sodann durch eine
mit 200 ml Amberlite IRC-84 (H⁺-Typ), einem schwach
sauren Kationenaustauscherharz, gefüllte Säule geleitet,
um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml
0,0001 N Salzsäure gewaschen und dann mit 0,2 N Salzsäure
fraktioniert destilliert, wodurch 710 ml einer SAM-
Lösung erhalten wurden.
Amberlite IRA-45 (OH--Typ), ein schwach basisches Anionenaustauscherharz,
wurde zu der SAM-Lösung zur Einstellung
ihres pH-Wertes auf 2,0 zugesetzt. Das Harz
wurde durch Saugfiltration entfernt und das Filtrat
unter vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert,
wodurch 1,01 g SAM-hydrochlorid als weißes Pulver erhalten
wurden. Dieses Produkt zeigte bei der Papierchromatographie
und der Dünnschichtchromatographie auf Silikagel
einen einzigen Flecken.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit sind
in Tabelle 1 angegeben.
630 ml einer SAM-Lösung, erhalten durch Behandlung mit
dem Styrol/Divinylbenzol-Adsorptionsmittel und dem
schwach sauren Kationenaustauscherharz vom H⁺-Typ, wie
in Beispiel 3, wurden durch eine mit 200 ml eines Adsorptionsmittels
vom Acrylat-Typ (Amberlite XAD-7)
gefüllte Säule geleitet, um Fremdmaterialien zu adsorbieren.
Die SAM-Lösung, aus der die Fremdmaterialien wie oben
beschrieben entfernt worden waren, wurde bei vermindertem
Druck konzentriert, bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug.
Hierauf wurden 800 ml Aceton zugesetzt, um einen
Niederschlag von SAM-sulfat zu bilden. Der Niederschlag
wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, in einer geringen
Wassermenge aufgelöst und lyophilisiert, wodurch 1,46 g
SAM-sulfat als weißes Pulver erhalten wurden. Dieses
Produkt zeigte bei der Papierchromatographie und der
Dünnschichtchromatographie mit Silikagel einen einzigen
Flecken.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit sind
in Tabelle 1 aufgeführt.
950 g eines Extraktes mit einem Gehalt an 0,98 g SAM,
erhalten gemäß Beispiel 1, wurden mit Kaliumhydrogencarbonat
auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Der
resultierende Niederschlag von Kaliumperchlorat wurde
durch Saugfiltration unter Bildung einer SAM enthaltenden
Flüssigkeit entfernt.
Die SAM enthaltende Flüssigkeit wurde durch eine mit
200 ml Amberlite IRC-50 (H⁺-Typ), einem schwach sauren
Kationenaustauscherharz, gefüllte Säule geleitet, um
SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001 N
Essigsäure gewaschen und dann mit 0,1 N Sulfat fraktioniert
eluiert, wodurch 610 ml einer SAM-Lösung erhalten
wurden.
Die SAM-Lösung wurde durch eine mit 200 ml Aktivkohle
für die Chromatographie gefüllte Säule geleitet. Die
Säule wurde mit 600 ml 0,2 N Schwefelsäure gewaschen und
dann mit einem Mischlösungsmittel, bestehend aus 1,0 N
Schwefelsäure und Methanol (1 : 1, Vol.), fraktioniert
eluiert, wodurch eine SAM-Lösung erhalten wurde.
Die SAM-Lösung wurde bei vermindertem Druck konzentriert,
bis ihr Gesamtvolumen 200 ml betrug. 800 ml Aceton wurden
zugesetzt, wodurch ein Niederschlag von SAM-sulfat
erhalten wurde. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren
abgetrennt, in einer geringen Wassermenge gelöst
und lyophilisiert, wodurch 1,28 g SAM-sulfat als weißes
Pulver erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte bei der
Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie
auf Silikagel einen einzigen Flecken.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und seine Reinheit sind
in Tabelle 1 aufgeführt.
Beispiel 1 wurde lediglich mit der Ausnahme wiederholt,
daß die Behandlung mit dem Amberlite IRD-50 (H⁺-Typ)
als Reinigungsbehandlung durchgeführt wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Bsp. steht für Beispiel und VglB. für Vergleichsbeispiel.
(+1) Die Reinheit von SAM wurde durch zweidimensionale
Papierchromatographie gemessen.
(+2) Die Ninhydrinreaktion mit anderen Materialien
als SAM wurde wie folgt durchgeführt: Eine Probe
wurde durch zweidimensionale Dünnschichtchromatographie
auf Cellulose entwickelt und das Vorhandensein von anderen
Flecken als einem Flecken von SAM wurde anhand der
Farbbildung mit Ninhydrin erfaßt und wie folgt bewertet:
- nicht vorhanden
+ geringfügiges Vorhandensein
++ erhebliches Vorhandensein.
(+3) Die Menge an Methylthioadenosin wurde durch zweidimensionale Papierchromatographie ermittelt.
+ geringfügiges Vorhandensein
++ erhebliches Vorhandensein.
(+3) Die Menge an Methylthioadenosin wurde durch zweidimensionale Papierchromatographie ermittelt.
Die obigen Ergebnisse zeigen eindeutig, daß durch das
erfindungsgemäße Verfahren SAM mit höherer Reinheit
und mit höherem Gewinnungsverhältnis als bei bekannten
Methoden erhalten werden kann.
Claims (9)
1. Verfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methionin,
dadurch gekennzeichnet, daß man eine rohes
S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit in einen
Reinigungsprozeß einführt, wobei der Reinigungsprozeß ein
Serien- bzw. Reihen-Reinigungsprozeß ist, der in jeder beliebigen,
gewünschten Reihenfolge aus
- (A) mindestens einer Stufe der Behandlung der Flüssigkeit mit einem schwachsauren kationischen Austauscherharz vom H⁺-Typ und
- (B) mindestens einer Stufe der Behandlung der Flüssigkeit mit einem porösen synthetischen Harz-Adsorptionsmittel besteht,
wobei man in der Stufe (A) die rohes S-Adenosyl-L-methionin
enthaltende Flüssigkeit, die einen pH-Wert von 3,5 bis 6,5
besitzt, mit dem Kationenaustauscherharz kontaktiert, um
das in der Flüssigkeit enthaltene S-Adenosyl-L-methionin
auf dem Harz zu adsorbieren, und daß man danach das S-Adenosyl-
L-methionin von dem Kationenaustauscherharz unter
Verwendung einer wäßrigen Lösung einer Säure mit einer pH-
Wert von nicht mehr als 3,0 fraktioniert eluiert und in der
Stufe (B) die das rohe S-Adenosyl-L-methionin enthaltende
Flüssigkeit, welche einen pH-Wert von nicht mehr als 6,5
hat, mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert,
um hierdurch Fremdmaterialien in der Flüssigkeit auf
dem Adsorptionsmittel zu adsorbieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man in der Stufe (B) die das rohe S-
Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, welche einen
pH-Wert von nicht mehr als 6,5 hat, mit dem synthetischen
Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert, wodurch sowohl S-Adenosyl-
L-methionin als auch Fremdmaterialien in der Flüssigkeit
auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert werden, und daß
man danach das S-Adenosyl-L-methionin von dem synthetischen
Harz-Adsorptionsmittel unter Verwendung einer wäßrigen
Lösung einer Säure mit einem pH-Wert von nicht mehr als 3,5
fraktioniert eluiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Reinigungsprozeß aus der Stufe
(A) und der Stufe (B), in dieser Reihenfolge, besteht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Reinigungsprozeß aus der Stufe
(A), der Stufe (B) und der Stufe (A), in dieser Reihenfolge,
besteht.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Reinigungsprozeß aus der Stufe
(B) und der Stufe (A), in dieser Reihenfolge, besteht.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Reinigungsprozeß aus der Stufe
(B), der Stufe (A) und der Stufe (B), in dieser Reihenfolge,
besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß man in der Stufe (B) die das rohe S-
Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, welche einen
pH-Wert von nicht mehr als 6,5 hat, mit dem synthetischen
Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert, wodurch nur Fremdmaterialien
in der Flüssigkeit auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert
werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß man in der ersten Stufe (B) die das
rohe S-Adenosyl-L-methionin enthaltende Flüssigkeit, welche
einen pH-Wert von nicht mehr als 6,5 hat, mit dem synthetischen
Harz-Adsorptionsmittel kontaktiert, wodurch nur die
Fremdmaterialien in der Flüssigkeit auf dem Adsorptionsmittel
adsorbiert werden.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57139948A JPS5929700A (ja) | 1982-08-13 | 1982-08-13 | S−アデノシル−l−メチオニンの精製法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3329218A1 DE3329218A1 (de) | 1984-03-01 |
DE3329218C2 true DE3329218C2 (de) | 1993-11-25 |
Family
ID=15257401
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3329218A Expired - Fee Related DE3329218C2 (de) | 1982-08-13 | 1983-08-12 | Verfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methionin |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5929700A (de) |
CH (1) | CH653341A5 (de) |
DE (1) | DE3329218C2 (de) |
FR (1) | FR2531714B1 (de) |
IT (1) | IT1169764B (de) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1169900B (it) * | 1983-10-26 | 1987-06-03 | Tecofar Srl | Sale di s-adenosil-l-metionina, composizione contenente tale sale preferibilmente per uso farmaceutico e procetimento di preparazione |
IT1173990B (it) * | 1984-05-16 | 1987-06-24 | Bioresearch Spa | Sali stabili della solfo-adenosil-l-metionina (same) particolarmente adatti per uso parenterale |
IT1318535B1 (it) * | 2000-05-25 | 2003-08-27 | Chementecno Srl | Processo per la preparazione di sali farmaceuticamente accettabili di(ss,rs)-s-adenosil-l-metionina. |
DE102005009751A1 (de) | 2005-03-03 | 2006-09-07 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von S-Adenosyl-Methionin |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5934312B2 (ja) * | 1975-07-30 | 1984-08-21 | キヤノン株式会社 | 熱定着装置 |
JPS5217033A (en) * | 1975-07-31 | 1977-02-08 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Electroconductive thermal printing process |
US4077762A (en) * | 1976-06-21 | 1978-03-07 | Johnson Controls, Inc. | Fuel ignition system having contact interlock protection |
JPS543879A (en) * | 1977-06-10 | 1979-01-12 | Hitachi Ltd | Method of increasing interlaminar strength of composite material |
JPS5625199A (en) * | 1979-08-06 | 1981-03-10 | Wakamoto Pharmaceut Co Ltd | Purification of coenzyme a |
JPS56145299A (en) * | 1980-04-11 | 1981-11-11 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Purification of s-adenosyl-l-methionine |
NL8002667A (nl) * | 1980-05-09 | 1981-12-01 | Philips Nv | Electrische beveiligingscircuit. |
-
1982
- 1982-08-13 JP JP57139948A patent/JPS5929700A/ja active Granted
-
1983
- 1983-08-11 FR FR8313208A patent/FR2531714B1/fr not_active Expired
- 1983-08-12 IT IT22555/83A patent/IT1169764B/it active
- 1983-08-12 DE DE3329218A patent/DE3329218C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1983-08-15 CH CH4446/83A patent/CH653341A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5929700A (ja) | 1984-02-16 |
FR2531714B1 (fr) | 1986-04-25 |
JPS635039B2 (de) | 1988-02-01 |
FR2531714A1 (fr) | 1984-02-17 |
IT1169764B (it) | 1987-06-03 |
IT8322555A1 (it) | 1985-02-12 |
CH653341A5 (de) | 1985-12-31 |
IT8322555A0 (it) | 1983-08-12 |
DE3329218A1 (de) | 1984-03-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69828517T2 (de) | Methode zur dns-isolierung. | |
EP0174525A2 (de) | Verfahren zur Aufreinigung synthetischer Oligonucleotide | |
DE60101575T2 (de) | Verfahren zur herstellung von pharmazeutisch annehmbaren salzen des (ss,rs)-s-adenosyl-l-menthionin | |
EP0041180B1 (de) | Verfahren zur Anreicherung von Nikkomycin-Gemischen | |
DE2604697C2 (de) | ||
DE68911158T2 (de) | Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von Erythrit aus einem dieses enthaltenden Kulturmedium. | |
DE3329218C2 (de) | Verfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methionin | |
DE2519382A1 (de) | Verfahren zur gewinnung einer gereinigten alpha-galactosidase aus einer alpha-galactosidase enthaltenden fluessigkeit | |
CH370871A (de) | Verfahren zur Gewinnung eines antibiotischen Fermentierungsprodukts aus einer Fermentierungsbrühe | |
DE69830985T2 (de) | Gerstenmalzöl enthaltend mit ceramid assoziierte pflanzliche substanzen sowie verfahren zu ihrer herstellung | |
DE2802789C3 (de) | Verfahren zum Reinigen von wäßrigen Anthocyanlösungen | |
DE3541807A1 (de) | Reinigung von l-phenylalanin | |
EP0872556A2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Moenomycin A | |
DE10085149B4 (de) | Verfahren zur Herstellung von Acarbose mit hohem Reinheitsgrad | |
DE60022960T2 (de) | Verfahren für die Aufreinigung von S-Adenosyl-L-methionin und für die Herstellung von pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon | |
EP0377430A1 (de) | Verfahren zur Abtrennung von Säuren aus salz- und kohlenhydrathaltigen Substraten | |
EP0294410B1 (de) | Verfahren zur anreicherung und/oder isolierung von herzglykosiden unter verwendung unpolarer adsorberharze | |
DE4042156C2 (de) | Verfahren zur Reinigung von Mitomycin C | |
DE2309899C2 (de) | Verfahren zum Abtrennen von Cephalosporin C aus rohen wäßrigen Lösungen | |
DE3622818C2 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Anthocyanosid-Polymeren von Trauben (Vitis vinifera L.) | |
DE2559588C3 (de) | Verfahren zur Reinigung von Kallidinogenase | |
EP0306541B1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Daunorubicinhydrochlorid aus Fermentbrühe | |
DE2418088C3 (de) | Verfahren zur Abtrennung von Cephalosporin C aus seinen wässrigen Lösungen in Form von Urethan-Derivaten | |
DE2450411B2 (de) | Aminoglykoside, xk-88-1, xk-88-2, xk-88-3 und xk-88-5 ihre salze, verfahren zu ihrer herstellung und arzneimittel | |
DE2501958C2 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Bicyclomycin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |