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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums und seiner Salze
EMI1.1
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EMI2.1
Das Antibiotikum ZN-6 ist in Wasser und Hexan schwer bzw. kaum löslich, dagegen in Äthanol,
Aceton, Methylbutylketon, Amylacetat, Chloroform und ähnlichen Lösungsmitteln löslich.
Bei der Papierchromatographie unter Verwendung der von Bush beschriebenen Systeme (Biochemical Journal, Bd. 50 [1952], S. 370) hat das Antibiotikum ZN-6 Rf-Werte von 0,38 und 0,73 im B (1)-bzw.
B (5)-System.
Mit Benzol bildet es ein kristallines Benzolsolvat, das in heissem Benzol löslich ist, jedoch von kal- tem Benzol nur in geringem Umfang gelöst wird. Das genannte Solvat hat einen Fp von 189 bis 189, 50C.
Nach dem Trocknen des Solvates bei einer Temperatur von 500C und einem absoluten Druck von
0,01 mm Hg bis zur Gewichtskonstanz wird ein reines Produkt erhalten, das von Benzol frei ist und einen
EMI2.2
bei 220 mit einen molaren Extinktionskoeffizienten von 8000 in Äthanol und keine charakteristischen Absorptionsbanden oberhalb dieser Wellenlänge aufweist.
Das reine Antibiotikum ZN-6 ist ferner durch sein Spektrum im UR-Bereich, wie es in der Zeichnung gezeigt ist, gekennzeichnet, aus der sich ergibt, dass es charakteristische Absorptionsbanden bei den in reziproken Zentimetern ausgedrückten Frequenzen v = 1265, 1385,1695, 1730 und 3450 cm -1 aufweist, wenn diese Bestimmung unter Anwendung der Kaliumbromid-Methode erfolgt.
Bei bakteriologischen Untersuchungen hat sich erwiesen, dass das Antibiotikum ZN-6 gegen eine Anzahl von pathogenen Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Neisseria gonorhoeae einschliesslich der penicillinresistenten Stämme, Neisseria meiiingitides, Mycobacterium tuberculoses und die gegen Streptomycin, Isonicotinsäurehydrazid und p-Aminosalicylsäure resistenten Stämme dieses Organismus und Corynebacterium diphtheriae wirksam ist.
Die besondere spezifische fungizide und antibakterielle Aktivität des Antibiotikums gemäss der Erfindung ist aus der folgenden Tabelle ersichtlich, in welcher die Aktivität als die Menge des Natriumsalzes des Antibiotikums ZN -6 in mgXl angegeben ist, die eine age Hemmung des in Frage stehenden Organismus nach der angegebenen Zeitdauer (in Stunden) verursacht :
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> Nährmedium <SEP> Zeit <SEP> 50% <SEP> Hemmkonzentration
<tb> (Stunden) <SEP> (mg/l)
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> 0,063
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus, <SEP> Pencillinase <SEP> bildender <SEP> Stamm <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 050
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus, <SEP> penicillinresistenter <SEP> Laboratoriumsstamm,
<tb> der <SEP> nicht <SEP> Penicillinase <SEP> bildet <SEP> Bouillon <SEP> 48 <SEP> 0,16
<tb> Neisseria <SEP> gonorhoeae <SEP> Blutascitesagar <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP>
<tb> Neisseria <SEP> gonorhoeae, <SEP> penicillinresistenter <SEP> Stamm <SEP> Blutascitesagar <SEP> 24 <SEP> 0,63
<tb>
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> Nährmedium <SEP> Zeit <SEP> 50% <SEP> Hemmkonzentration
<tb> (Stunden) <SEP> (mg/l)
<tb> Neisseria <SEP> meningitides <SEP> Blutascitesagar <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP>
<tb> Haemophilus <SEP> influenzae <SEP> Blutascitesagar <SEP> 24 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> zooepidemicus <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> agalactiae <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> lactis <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> Bouillon <SEP> mit <SEP> 5% <SEP> 24 <SEP> 5,
<SEP> 0 <SEP>
<tb> Serum
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Vibrio <SEP> comma <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Alcaligenes <SEP> faecalis <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30,0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> > <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> Bouillon <SEP> 24 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis, <SEP> Dubos <SEP> 144 <SEP> 0, <SEP> 79 <SEP>
<tb> var.
<SEP> hum.
<tb>
Mycobacterium <SEP> tuberculosis,
<tb> var. <SEP> hum.
<tb> streptomycinresistenter <SEP> Stamm <SEP> Dubos <SEP> 144 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis,
<tb> var. <SEP> hum.
<tb>
Stamm <SEP> resistent <SEP> gegen <SEP> p-Aminosalicylsäure <SEP> Dubos <SEP> 144 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis,
<tb> var. <SEP> hum.
<tb>
Stamm <SEP> resistent <SEP> gegen <SEP> Isonicotinsäurehydrazid <SEP> Dubos <SEP> 240 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> Sabouraud <SEP> 24 <SEP> 100,0
<tb> Tricophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> Sabouraud <SEP> 72 <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> Sabouraud <SEP> 72 <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Clostridium <SEP> perfringens <SEP> Thioglykolat-Medium <SEP> 48 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> Nährmedium <SEP> Zeit <SEP> 501o <SEP> Hemmkonzentration
<tb> (Stunden) <SEP> (mg/l)
<tb> Clostridium <SEP> tetani <SEP> Thioglykolat-Medium <SEP> 48 <SEP> 0, <SEP> 02
<tb> Aetinomyces <SEP> bovis <SEP> Thioglykolat-Medium <SEP> 48 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Corynebacterium <SEP> Fleischwasser <SEP> mit <SEP> 24 <SEP> 0,
<SEP> 05 <SEP>
<tb> 10% <SEP> Serum
<tb>
Klinische Versuche, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden sind, haben gezeigt, dass das Antibiotikum ZN-6 und gewisse seiner Salze den Anforderungen für phar- mazeutisch verwendbare Antibiotika entsprechen, da sie für die Behandlung von Infektionskrankheiten brauchbar und insbesondere bei der Behandlung jener Krankheiten wertvoll sind, die durch verschiedene
Stämme von Staphylococcen, einschliesslich der penicillinresistenten Stämme, hervorgerufen werden.
Für pharmazeutische Zwecke kann das Antibiotikum ZN-6 als solches oder in Form seiner mehr oder weniger wasserlöslichen Salze mit nichttoxischen anorganischen oder organischen Basen verwendet werden.
Wässerige Lösungen von Salzen des Antibiotikums ZN-6 können zwar parenteral angewandt werden, doch werden die Salze vorzugsweise oral verabreicht, da sie leicht vom Magen-Darm-Trakt in die Kör- perflüssigkeiten gelangen, in welchen eine angemessene Konzentration des Antibiotikums über einen be- friedigend langen Zeitraum nachweisbar ist.
Dies wurde bei einem Resorptionsversuch festgestellt, bei dem acht Personen jeweils oral einer ein- maligen Behandlung unterzogen wurden, bei der zwei Kapseln, von welchen jede 0, 250 g des Natrium- salzes des Antibiotikums ZN-6 enthielt, verabreicht wurden, worauf die Plasmakonzentrationen in fest- gelegten Intervallen nach der Einnahme bestimmt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II wiedergegeben, in der die Zahlen die angeführte Plasmakonzentration, ausgedrückt in y/ml Plasma, eine und mehrere Stunden nach der Einnahme angeben.
Tabelle II
EMI4.2
<tb>
<tb> Plasmakonzentrationen <SEP> in <SEP> y/ml
<tb> Versuchsperson <SEP> Stunden
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> 9 <SEP> 12
<tb> Gruppe <SEP> I
<tb> A <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 9, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> B <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP>
<tb> C <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP>
<tb> D <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> 9, <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Gruppe <SEP> Il
<tb> E <SEP> 1,6 <SEP> 6,6 <SEP> 8,1 <SEP> 6,6 <SEP> 4,0 <SEP> 3,2 <SEP> 2,4
<tb> F <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 6,
<SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP>
<tb> G <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
In Gruppe I erhielten die Versuchspersonen das Mittel auf nüchternen Magen, wogegen es den Personen der Gruppe II nach Einnahme einer Mahlzeit verabreicht wurde.
Bei einem ähnlichen Versuch betrug die Durchschnittskonzentration des Plasmas, die 24 h nach der Einnahme der gleichen Menge des Mittels festgestellt wurde, 0, 75 y/ml, wodurch die ausserordentlich langsame Ausscheidung des Stoffes aus dem Körper angezeigt wird.
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Bei Tierversuchen unter Verwendung von Mäusen als Versuchstiere wurde eine ausreichend niedrige akute Toxizität des Antibiotikums ZN-6 beobachtet. Es wurden die folgenden Werte für DD , ausgedrückt in mg/kg Körpergewicht, gefunden :
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<tb>
<tb> a) <SEP> Natriumsalz <SEP> von <SEP> Antibiotikum <SEP> ZN-6 <SEP> 200 <SEP> - <SEP> 250 <SEP>
<tb> intravenös <SEP> verabreicht
<tb> b) <SEP> Natriumsalz <SEP> von <SEP> Antibiotikum <SEP> ZN-6 <SEP> 400
<tb> subkutan <SEP> verabreicht
<tb> c) <SEP> Benzolsolvat <SEP> von <SEP> Antibiotikum <SEP> ZN-6 <SEP> > <SEP> 1500
<tb> peroral <SEP> verabreicht
<tb>
Ferner wurden bei fortgesetzten toxikologischen Versuchen, bei welchen die Tiere, männliche und weibliche Ratten, sechs Tage wöchentlich mit dem Natriumsalz des Antibiotikums ZN-6 in Dosen von
0,
400 g/kg des Körpergewichtes oral behandelt wurden, weder bedeutsame Unterschiede im Gewicht zwi- schen den Versuchstieren und den Kontrolltiere, noch irgendwelche durch dieses Mittel verursachte pa- thologische Änderungen beobachtet, woraus sich das Fehlen einer chronischen Toxizität ergibt.
Die einzigartigen Eigenschaften des Antibiotikums ZN-6 zeigten sich in einem noch eindrucksvolle- ren Ausmass bei einer kontrollierten klinischen Verwendung des Natriumsalzes des Antibiotikums ZN-6 in
Form einer geeigneten, in Gelatinekapseln eingeschlossenen Zusammensetzung bei Patienten, die an Fu- runkulose, Osteomyelitis und Endokarditis litten.
Nach einer oralen Behandlung der Patienten in täglichen oder ähnlichen Abständen, wie sie für eine praktische Verwendung über einen ausreichenden Zeitraum zweckmässig sind, zeigte sich, dass die Kuren zu 100% ohne Auftreten von Nebenerscheinungen oder toxischen Reaktionen verliefen, und selbst nach längeren Beobachtungszeiten wurden keine Rückfälle festgestellt.
Bei klinischen Behandlungen können diewasserlöslichen Salze des Antibiotikums ZN-6 und insbeson- dere dessen Natriumsalz verwendet werden.
Anderseits können auch schwach wasserlösliche Salze des Antibiotikums ZN-6 oder sogar die freie
Säure für eine orale Verabreichung benutzt werden, wobei die Absorptionsgeschwindigkeit des Wirkstof- fes abnimmt, so dass er seine Aktivität vorzugsweise im Magen-Darm-Trakt selbst ausübt, was bei der
Behandlung von gewissen Krankheiten wünschenswert sein kann.
Ferner können die schwach wasserlöslichen Salze des Antibiotikums ZN-6 in Form einer Suspension des Salzes in einem geeigneten Medium injiziert werden, um Blutspiegel des Antibiotikums zu erzeugen, die sogar noch länger andauern als die oben beschriebenen.
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Proteine, und geeignete Mengen der anorganischen Salze und andern Stoffe, die für die Ernährung des
Pilzes erforderlich sind, enthält, und die Fermentation wird so lange fortgesetzt, bis die genannte Lösung eine wesentliche antibiotische Aktivität erreicht hat ; hierauf wird das auf diese Weise gebildete Antibio- tikum ZN-6 gewonnen, konzentriert und in reiner Form isoliert oder mit pharmazeutisch annehmbaren bzw. erwünschten Basen mit Hilfe bekannter Reaktionen in eines seiner Salze übergeführt.
Bei der Ausführung des Verfahrens gemäss der Erfindung wird die Bildungsgeschwindigkeit des Antibiotikums ZN-6 während der Fermentation durch routinemässige Auswertung bzw. Bestimmung der Aktivität der filtrierten Kultur bestimmt, wobei für diesen Zweck die Agarplattenmethode angewandt werden kann, indem beispielsweise Staphylococcus aureus als Testorganismus benutzt wird.
Gemäss den bei der Herstellung von Antibiotikum ZN-6 in technischem Umfang erhaltenen Ergebnissen wurde die optimale Ausbeute an dem Stoff im Verlauf von 80 bis 100 h erhalten, wenn der Fermentationsprozess bei einer Temperatur zwischen 20 und 300C und vorzugsweise zwischen 24 und 280C durchgeführt wurde.
Die angeführten Temperaturbereiche stellen jedoch keine Begrenzung dar, da die für den Erhalt der genannten Ausbeuten erforderliche Zeitdauer in einem gewissen Umfang von der Konstruktion des Fermentationsgefässes und der Type des verwendeten Rührers bzw. Rührwerkes in mechanischer Hinsicht abhängt.
Es soll in diesem Zusammenhang erwähnt werden, dass die verwendeten Gefässe Einheiten von der üblichen Grösse mit einem Inhalt von 10 bis 30 m3 an Kulturmedium waren und nicht spezifisch für die Herstellung von Antibiotikum ZN-6 bestimmt waren.
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Eine grosse Anzahl der bekannten Kulturmedien hat sich für die Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung als Kulturmedium als brauchbar erwiesen, doch werden jene Medien, die als Proteinquelle
Maisquellwasser oder Sojabohnenmehl und als Kohlehydratquelle Glucose oder Saccharose enthalten, be- vorzugt.
Als andere Bestandteile eines geeigneten Kulturmediums können beispielsweise Hefeextrakt, Glyce- rin, Maltose, Fructose, Fettsäuren, Caseinhydrolysate, bestimmte Aminosäuren und wasserlösliche Vit- amine genannt werden.
Wenn die Erzeugung des Antibiotikums ZN-6 beim Fermentationsprozess aufhört oder wenn bereits eine zufriedenstellende Ausbeute erreicht worden ist, kann die antibiotisch wirksame Substanz nach einer grossen Anzahl von Verfahren gewonnen werden.
Vorteilhafterweise besteht die erste Stufe des Verfahrens in einer Abtrennung des Mycels von der Kul- turflüssigkeit, beispielsweise durch Filtration. Das Antibiotikum ZN-6 kann durch Behandeln des Kultur- lösung mit einem festen Adsorptionsmittel und Eluieren der Substanz aus diesem Adsorptionsmittel kon- zentriert werden, wobei für diesen Zweck als Adsorptionsmittel beispielsweise Aktivkohle oder lonenaus- tauschharze verwendet werden können ; oder aber, und dies vorzugsweise, die Kulturlösung wird mit einem geeigneten Lösungsmittel oder einer geeigneten Lösungsmittelmischung, gegebenenfalls nach Einstellen des wässerigen, das Antibiotikum ZN-6 enthaltenden Mediums auf einen geeigneten pH-Wert, extrahiert.
Als geeignete Lösungsmittel können Ester, Ketone oder halogenierte Kohlenwasserstoffe genannt wer- den. Bei einer in technischem Umfang erfolgenden Herstellung haben sich jedoch insbesondere Methyl- isobutylketon, Amylacetat und Butylacetat für die Extraktion der Fermentationslauge als geeignet erwie- sen.
Wenn die aktive Substanz aus der Fermentationslösung extrahiert ist, kann sie durch Eindampfen der organischen Phase auf ein kleines Volumen, aus welchem das Antibiotikum ZN-6 beim Kühlen ausge- fällt oder durch Zusatz einer Komponente, welche die Löslichkeit des Antibiotikums ZN-6 vermindert, ausgefällt werden kann, und vorzugsweise durch Eindampfen der organischen Phase zur Trockne und Zu- satz von Benzol zwecks Erhalt des leicht kristallisierbaren, oben erwähnten Benzolsolvates gewonnen werden.
Anderseits ermöglichen die sauren Eigenschaften des Antibiotikums ZN-6 die Durchführung einer anschliessenden Extraktion der organischen Phase mit einer wässerigen alkalischen Lösung oder einer wäs- serigen Suspension einer alkalischen Verbindung, wobei mehr oder weniger konzentrierte wässerige Lö- sungen von Salzen des Antibiotikums ZN-6 erhalten werden.
Durch Ansäuern von solchen Lösungen kann das'Antibiotikum ZN-6 ausgefällt werden oder das Salz von Antibiotikum ZN-6, das darin enthalten ist, kann, wenn dies gewünscht wird, als solches isoliert werden.
Gemäss einer zweckmässigen Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung wird das leicht kri- stallisierbare Benzolsolvat direkt aus der genannten wässerigen Lösung eines Salzes des Antibiotikums ZN-6 hergestellt, gegebenenfalls nachdem ein Teil des Wassers durch Eindampfen, z.
B. in einem Vakuumein- dampfer, entfernt worden ist, indem der wässerigen konzentrierten Lösung eine zur Bildung des Solvats ausreichende Menge Benzol zugesetzt und die Lösung dann angesäuert wird, um das Antibiotikum ZN-6 in Form des genannten Solvates auszufällen, das nach der Isolierung und dem Trocknen entweder das rei- ne Benzolsolvat oder das Antibiotikum ZN-6 selbst ergibt, in Abhängigkeit von den Trocknungsbedingungen und der Temperatur, die angewendet werden, da bei erhöhten Temperaturen das Benzol aus dem Solvat in Freiheit gesetzt wird.
In Hinblick auf die Reinigung des Antibiotikums ZN-6 ist seine Fähigkeit zur Bildung von Solvaten mit bestimmten Lösungsmitteln ein wichtiges Merkmal. So wird z. B. bei einer andern geeigneten Ausführungsform der Erfindung das rohe Antibiotikum ZN-6 in einem kleinen Volumen von heissem Methanol gelöst, aus welchem beim Kühlen das Methanolsolvat in einer überraschend reinen Form auskristallisiert, so dass aus diesem Grunde diese Verfahrensweise besonders für den Erhalt einer pharmazeutisch anwendbaren Qualität der Substanz geeignet ist. Das erwähnte Methanolsolvat hat einen Fp von 179 bis 179, 50C.
Wenn Salze des Antibiotikums ZN-6 gewünscht werden, dann können diese durch einfache Neutralisation des Antibiotikums ZN-6 oder eines seiner Solvate mit der in Frage stehenden Base in Gegenwart eines geeigneten Reaktionsmediums, das die Umsetzung erleichtert und aus welchem das Salz ausfallen kann oder erforderlichenfalls durch Zusatz einer geeigneten Komponente zur Herabsetzung der Löslichkeit des gewünschten Salzes ausgefällt werden kann, hergestellt werden oder das Salz kann durch Eindampfen der Reaktionsmischung isoliert werden.
Anderseits kann ein von vornherein hergestelltes Salz des Antibiotikums ZN-6 mit der in Betracht
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kommenden Base umgesetzt werden, oder das gewünschte Salz von Antibiotikum ZN-6 kann durch eine doppelte Umsetzung eines vorher gewonnenen Salzes von Antibiotikum ZN-6 mit einem andern Salz, welches das gewünschte Metallion bzw. die gewünschte Base enthält, hergestellt werden.
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Procainsalze.
Als andere Salze, die nach dem Verfahren gemäss der Erfindung hergestellt werden können, können beispielsweise jene genannt werden, die als Basenkomponente Pyrrolidin, Piperazin, Guanidin, Methylamin, Äthylamin, Benzylamin oder ähnliche unsubstituierte oder substituierte Amine, ferner quaternäre
Amine, wie Cholin und seine Derivate, oder andere antibiotische Stoffe mit basischen Eigenschaften, wie
Streptomycin, enthalten, erwähnt werden.
Die Erfindung wird nun an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel l : Benzolsolvat von Antibiotikum ZN-6.
In einen Fermentationstank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsraum von 1, 5 m3, der mit einem
Rührer ausgestattet war, wurde 1, 00 ni eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung einge- bracht :
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<tb>
<tb> Glukose <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> kg <SEP>
<tb> Fleisch- <SEP> und <SEP> Knochenmehl <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> kg
<tb> Maisquellwasser,
<tb> 50% <SEP> Trockensubstanz <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> kg
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> kg <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> kg <SEP>
<tb> MgSO4 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> kg <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 1000 <SEP> l <SEP>
<tb>
Das Kulturmedium hatte einen pH-Wert von 6, 1, der durch Zugabe einer verdünnten Lösung von NaOH auf 6,5 eingestellt wurde, worauf das Medium durch Erhitzen sterilisiert wurde.
Nach dem Kühlen wurde es mit 3 l einer Kultur von Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki, die 48 h lang in einem Schüttelgefäss bei einer Temperatur von 280C gezüchtet worden war, beimpft. Der Inhalt des Tankes wurde gerührt und in einem Ausmass von 0,6 m3 Luft pro Stunde bei einer Temperatur von 280C 96 h lang belüftet. Während dieses Zeitraumes war es nicht erforderlich, den PH-Wert zur Aufrechterhaltung des oben genannten Wertes von 6,5 einzuregeln.
Nach der erwähnten Fermentationszeit zeigte sich bei einer Bestimmung der antibiotischen Aktivität des Kulturmediums nach dem üblichen Agar-Schalentest mit Staphylococcus aureus, dass diese Aktivität einem Gehalt von 70 mg an Antibiotikum ZN-6 pro Liter entspricht, wenn sie mit der Aktivität dieses Stoffes, nach der gleichen Methode bestimmt, verglichen wird.
Das Mycel wurde von dem Kulturmedium durch Filtration abgetrennt ; die Menge des Filtrates betrug 700 l. Der PH-Wert des Filtrates wurde durch Zusatz einer 25%gen Lösung von Schwefelsäure auf 3, 3 eingestellt und das Filtrat wurde in einem Podbielniak-Extraktor im Gegenstrom mit 230 1 Butylacetat
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Lösung von NaOH bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 10, Oder wässerigen Phase zugesetzt worden war, extrahiert und dann wurde die wässerige Phase von der Butylacetatphase getrennt. Der pH-Wert der wässerigen Phase wurde durch Zusatz einer 25"lagen Lösung von Schwefelsäure auf 3, 2 eingestellt und die erhaltene Lösung mit 40 1 Methylisobutylketon extrahiert.
Die Methylisobutylketonphase wurde von der wässerigen Phase abgetrennt, mit 40 g Aktivkohle behandelt und anschliessend im Vakuum bei einer Siedetemperatur von 25 C zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde in 500 ml Benzol gelöst und die Lösung über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Dabei kristallisierte das Benzolsolvat von Antibiotikum ZN-6 aus. Es wurde abfiltriert und aus Benzol umkristallisiert, wobei 12,0 g der reinen Sub-
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500 mg des auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellten Benzolsolvats wurden in 20 ml Wasser suspendiert und der Suspension wurde 0, 5n-wässeriges NaOH bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 9, 0 zugesetzt.
Die Lösung wurde filtriert, und zu dem Filtrat wurden 50 ml n-Butanol zugesetzt, worauf der Wasseranteil der Lösung durch azeotrope Destillation im Vakuum entfernt wurde. Aus dem Rückstand wurde durch Zusatz von Äther das gewünschte Natriumsalz ausgefällt. Es wurde abfiltriert, mit
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Äther gewaschen und getrocknet. Durch Umkristallisieren aus Äthanol/Aceton wurden 360 mg des reinen, kristallinen Natriumsalzes erhalten.
Beispiel3 :HerstellungvonAntibiotikumZN-6.
Sporen von Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki wurden von einer Agarplatte in 3 1 eines sterilen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung eingebracht :
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<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Glukose <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgSC. <SEP> 7Hp <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> FeS04. <SEP> HO <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g/l <SEP>
<tb> CUS04. <SEP> 5 <SEP> H2O <SEP> 0,004g/l
<tb>
Die Kultur wurde unter aeroben Bedingungen bei 270C 40 - 60 h lang in einer hin-und hergehenden Schüttelvorrichtung bebrütet.
Das auf diese Weise gewonnene Keimmaterial kann direkt als Impfmittel für einen Fermenter in technischem Massstab verwendet werden ; in diesem Falle wurde das Material jedoch in ein Gefäss mit einem Fassungsraum von 700 1, das ein Kulturmedium von der gleichen Zusammensetzung wie der Fermenter in technischem Massstab enthielt, eingebracht und bei einer Temperatur von 260C während eines Zeitraumes von 40 bis 48 h bebrütet, um die Entwicklung des vegetativen Wachstums des Pilzes vor dem Animpfen des Hauptfermenters zu bewirken.
Anschliessend wurden 16 000 1 eines Kulturmediums der Zusammensetzung
EMI8.2
<tb>
<tb> Glukose <SEP> 30 <SEP> g/l
<tb> Glycerin <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KH. <SEP> 2H2O <SEP> 5g/l
<tb> NaNO <SEP> 6 <SEP> g/l
<tb> KC1 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgS04. <SEP> 7H2O <SEP> 0,5g/l
<tb> ZnSO4. <SEP> 6H2O <SEP> 1 <SEP> mg/l
<tb> Hefeextrakt <SEP> (Difco) <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> g/l,
<tb>
das vor der Sterilisation auf einen PH-Wert von 7, 2 eingestellt worden war, in dem Hauptfermenter bei einer Temperatur von 120 C 1/2 h lang sterilisiert und das Medium wurde nach dem Kühlen mit einer der beiden Formen von Impfmaterial, die oben erwähnt sind, beimpft.
Unter Rühren und Einpressen von Luft durch eine Einlassöffnung bzw. ein Abbrennkontaktstück in einem Ausmass von 0, 05 1 pro Liter Kulturflüssigkeit pro Minute wurde das Mycel gebildet und die Fermentation bei einer Temperatur von 260C 4 Tage lang fortgesetzt.
Während der Fermentation wurde die Aktivität von Proben der abfiltrierten Kultur durch Messung der Hemmungszone, die bei der Agar-Schalenmethode unter Verwendung von Staphylococcus aureus als Testorganismus hervorgerufen wurde, bestimmt. Sobald das Verfahren beendet war, entsprach die erhaltene Aktivität einer Konzentration von 150 y Antibiotikum ZN-6 pro ml in dem Kulturmedium.
Beispiel 4 : Herstellung von Antibiotikum ZN-6.
160001 eines Kulturmediums der Zusammensetzung
EMI8.3
<tb>
<tb> Maisquellwasser, <SEP> 50% <SEP> 2,5g/l
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> oder
<tb> Fleischmehl <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,5g/l
<tb> MgSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,5g/l,
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
das vor der Sterilisation auf einen PH-Wert von 6, 80 eingestellt worden war, wurden in dem Fermenter bei einer Temperatur von 1200C 1/2 h lang sterilisiert.
Nach dem Kühlen wurde das Medium mit dem in Beispiel 3 erwähnten Impfstoff beimpft und die Fermentation wurde 100 h lang fortgesetzt, wobei in dem Kulturmedium eine Konzentration an Antibiotikum ZN-6 erhalten wurde, die einem Gehalt von 260 y gemäss der Agar-Schalenmethode entsprach.
Beispiel 5 : Herstellung von Antibiotikum ZN -6.
16 000 l eines Kulturmediums der Zusammensetzung
EMI9.1
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 60, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Maisquellwasser, <SEP> 50% <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KH2PO <SEP> 4 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgS04.7 <SEP> HO <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l, <SEP>
<tb>
EMI9.2
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
<tb>
Base <SEP> Umkristallisiert <SEP> aus <SEP> Fp <SEP> in <SEP> C
<tb> Triäthylamin <SEP> Aceton <SEP> 143 <SEP> - <SEP> 144 <SEP>
<tb> Piperidin <SEP> Aceton <SEP> 155 <SEP> - <SEP> 156 <SEP>
<tb> Morpholin <SEP> Aceton <SEP> 112 <SEP> - <SEP> 114 <SEP>
<tb> Cyclohexylamin <SEP> Aceton <SEP> 180 <SEP> - <SEP> 182 <SEP>
<tb> Dibenzyl-äthylendiamin <SEP> +) <SEP> Äthylacetat <SEP> 112 <SEP> - <SEP> 113 <SEP>
<tb> Benzyl- <SEP> B <SEP> -phenyläthylamin <SEP> +) <SEP> Aceton <SEP> -Hexan <SEP> 103 <SEP> - <SEP> 105 <SEP>
<tb> Monoäthanolamin <SEP> Aceton-Hexan <SEP> 130-132 <SEP>
<tb> Procain <SEP> +) <SEP> amorph
<tb>
+) Schwer löslich in Wasser.
Beispiel 8 : Gewinnung von Antibiotikum ZN-6 aus der Fermentationslösung.
200 ml des Anionenaustauschharzes Amberlite IRA 401 S (OH) wurden 1 h lang mit drei 2 1-Portio- nen einer geklärten Fermentationslösung mit einem Gehalt von 110 y an Antibiotikum ZN-6 pro ml ge- rührt. Während des Rührens wurde der pH-Wert durch Zusatz von 2n-wässerigem Natriumhydroxyd auf 9, 5 gehalten.
Analysen des Filtrates ergaben, dass 85% des Antibiotikums ZN-6 von dem Harz absorbiert worden waren. Nach dem Filtrieren wurde das Harz mit drei 1,5 l-Portionen Wasser gewaschen und hierauf in
500 ml Aceton suspendiert. Unter Rühren wurde während eines Zeitraumes von 3 h durch Zusatz von 6n-
Salzsäure der PH-Wert auf 3, 6 erniedrigt und dann wurde das Harz abfiltriertund mit Aceton (zweimal
100 ml) gewaschen.
Die vereinigten Filtrate und Waschlaugen enthielten 375 mg Antibiotikum ZN-6, was 57% der in der
Fermentationslösung vorhandenen Menge entspricht.
Beispiel 9 : Gewinnung von Antibiotikum ZN-6 aus der Fermentationslösung.
1 l der geklärten Fermentationslösung mit einem Gehalt von 500 mg Antibiotikum ZN-6 wurde 1 h lang mit 5 g Entfärbungskohle (S. B. C. A. III) gerührt. Nach dem Filtrieren wurde das Filtrat analysiert und es wurde festgestellt, dass es weniger als 25 mg Antibiotikum ZN-6 enthielt. Der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und anschliessend mit 100 ml Methanol 2 h lang unter Rückfluss erhitzt, hierauf gekühlt und filtriert. Das Filtrat enthielt etwa 150 mg Antibiotikum ZN-6.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung des neuen, als Antibiotikum ZN-6 bezeichneten Antibiotikums und seiner Salze, dadurch gekennzeichnet, dass der Pilz Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki (hinterlegt im Centralbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland) unter aeroben Bedingungen in einem Fermentationsmedium gezüchtet wird, das Kohlehydrate, Stickstoffquellen und geeignete Mengen der anorganischen Salze und andern Stoffe, die für die Ernährung des Pilzes erforderlich sind, enthält, und die Fermentation so lange fortgesetzt wird, bis die Fermentationslösung eine wesentliche antibiotische Aktivität aufweist, und dass dann das auf diese Weise gebildete Antibiotikum ZN-6 gewonnen, konzentriert und in reiner Form isoliert oder mit Hilfe an sich bekannter Umsetzungen in eines seiner Salze umgewandelt wird.