DE2417642B2 - Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose, d. h. ein Verfahren solcher Art, bei denen die Eigenschaften der Enzyme, die durch bestimmte Mikroorganismen erzeugt werden, wenn sie in einem Xylose enthaltendem Medium gezüchtet werden, es diesen Mikroorganismen erlauben, Glucose zu Fructose zu isomerisieren, wenn sie mit Glucose kontaktiert werden.
Es ist bekannt, daß bestimmte Mikroorganismen, die den Familien Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus und Streptomyces angehören, in der Lage sind, die vorstehenden Isomerisierungsenzyme zu erzeugen.
Es ist ebenfalls bekannt, daß die Mehrzahl der Mikroorganismen, von denen die Rede sein wird, trotz der Tatsache, daß sie dazu befähigt sind, Enzyme zu produzieren, die Glucose isomerisieren, schwerwiegende Nachteile aufweist, wie insbesondere Schwierigkeiten bei der Filtration nach der Isomerisierung und bei der Reinigung der erhaltenen isomerisierten Sirupe, auf Grund der Anwesenheit von kolloidalen Substanzen, die Trübung oder Färbungen (Pigmente, die durch den Mikroorganismus abgesondert werden und die nicht vollständig vom Mycelium bei seinem Waschen entfernt werden) hervorrufen (Agr. Biol. Chem, 30, 1966, 1247-53).
Die vorstehenden bekannten Mikroorganismen besitzen auch andere Nachteile, wie Schwierigkeiten bei der Rückgewinnung des Maceliums bzw. Mycels am Ende eines Isomerisierungszyklus, schnellen Abbau der enzymatischen Aktivität des genannten Myceliums, was verhindert, daß es durch Rezyklisierung auf eine Mehrzahl aufeinanderfolgender Chargen aus zu isorrierisierendem Glucosesirup einwirkt.
Es wurde nunmehr in überraschender Weise ein besonderer Mikroorganismus gefunden, und zwar ein Stamm der Gattung Streptomyces violaceoniger, der nicht nur in der Lage ist, ein Enzym zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose zu erzeugen, sondern auch zusätzlich die vorstehenden Nachteile nicht mehr aufweist.
Dieser Mikroorganismus, dessen Zuordnungseigenschaften nachstehend beschrieben werden, wurde beim Centralbureau voor Schimmel Cultures de Baarn (Niederlange) unter der Nr. CBS 409'73 hinterlegt. bo
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Isomerisierungsenzym erzeugenden Mikroorganismus einen Stamm von Streptomyces violaceoniger, hinterlegt beim Centralbureau voor Schimmel Cultures de Baarn (Niederlande) unter der Nr. CBS 409-73, oder Mutanten davon einsetzt.
Weitere Charakterisüka des Verfahrens gehen aus der nachstehenden Beschreibung hervor, die durch die Beispiele und die entsprechenden Figuren, die sich auf vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beziehen, veranschaulicht werden. .
In den Figuren beziehen sich die Fig. 1, 2 und 3 auf das Beispiel 1 und zeigen die Entwicklung einerseits des pH-Werts (Kurve Ci, F i g. 1), andererseits der Menge Q der im Milieu anwesenden reduzierenden Zucker, ausgedrückt in g/L (Kurve C2, F i g. 2) und weiterhin des
Verhältnisses -± des Volumens VJ des Mikroorganis-
'1
mus zum Volumen V2 der Kultur (Kurve Cy1 F i g. 3) in Abhängigkeit von der Zeit t, ausgedrückt in Stunden, und
die F i g. 4 bezieht sich ebenfalls auf das Beispiel 1 und zeigt die Entwicklung des absoluten Drehwerts an ausgedrückt in Grad, (Kurve G) und des wahren Fructosegehaltes des Milieus, ausgedrückt in %, (Kurve Cs) in Abhängigkeit von der Zeit t, ausgedrückt in Stunden.
Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm von Streptomyces violaceoniger wird unter aeroben Bedingungen in untergetauchter Kultur in einem die geeigneten Nährstoffe sowie Xylose und Kohlenhydrat enthaltenden Milieu gezüchtet. Das so gebildete Mycellium wird gesammtelt und kann bei Glucosesirupei, eingesetzt werden
Die Kulturmedien, die zur Herstellung eines Myceliums von Streptomyces violaceoniger, das gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, verwendet werden, enthalten 5 bis 15 g Xylose pro 1 sowie 5 bis 50 g Stickstoffverbindungen pro 1, wie z. B. Soja, Maiswasser, Rückstände des Vegetationswasser von Kartoffeln und Hefeectrakte.
Die pH-, Temperatur- und Zeitdauer-Bedingungen dieser Kultur bzw. Züchtung sind im übrigen:
5,0 < pH < 8,5, vorzugsweise 5,5 < pH < 7,5,
25°C< f<40°C,vorzugsweise30cC < f<35°C,
Zeitdauer 24 bis 48 Stunden.
Es zeigt sich, daß dieses Verfahren der Kultur es ermöglicht, unter diesen Bedingungen ein leicht filtrierbares ausgiebiges Mycelium bzw. ein leicht filtrierbares Mycelium im Oberfluß zu erhalten, das eine gute Isomierisierungsaktivität aufweist.
Im Hinblick auf seinen Einsatz an einem Glucosesirup filtriert man das so erhaltene Mycelium, wäscht es durch Versprühen bzw. Pulverisation mit Wasser und sammelt es in Pastenform. Es kann in dieser Form in der Kälte (im allgemeinen bei einer Temperatur in der Größenordnung von -20° C) aufbewahrt werden oder durch Lyophilisierung getrocknet werden, wodurch seine Aufbewahrung ebenfalls ermöglicht wird, jedoch verwendet man es im allgemeinen sofort, indem man es in dem zu isomerisierenden Sirup dispergiert.
Das filtrierte Mycellium wird gewaschen und unter den folgenden allgemeinen Isomerisierungsbedingungen eingesetzt:
Temperatur: 50 bis 75°C
pH: 6 bis 8
Konzentration des Milieus
an Glucose: 25 bis 60%
CoCI2: 0,0 bis 0,50 g/l
MgSO4: 0,0 bis 2,4 g/l
Die Zeitdauer hängt von den Bedingungen und der Menge des eingesetzten Myceliums ab.
von Glucose zu Fructose durch Einsatz des erfindungsgemäßen Mikroorganismus für eine Mycelium-Menge bzw. -Konzentration von 1 Volumen Kulturbrühe auf 1 Volumen einer 50%igen Dextroselösung innerhalb 24 Stunden in der Größenordnung von 45% lit-gt
Die Klassifizierungseigenschaften bzw. die taxonomisc'hen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes von Streptomyces violaceoniger sind wie folgt:
Aussehen der Sporen: kugelförmig, mit einer Dimension von 0,9 bis 1,2 μ und mit glatten oder wenig rauhen Wartungen;
Aussehen des aerialen Myceliums bzw. Luftmyceliums: Sporen tragend und bildend, graubräunlich, das sich zu schwarzen feuchten Flecken verflüssigt und das Verzweigungen von monopodialen Sporophoren bzw. Sporenträgern aufweist;
Aussehen der Spiralen: sie sind kurz, agglomeriert, mit i oder 2 Ranken (viticula);
Aussehen des vegetativen Myceliums: es ist weißlich bis gelblich (bis gemsfarben).
Es ist möglich, ein lösliches Pigment zu extrahieren, das schwachrosa und das in der abgerahmten Milch erzeugt wird.
Kultur auf einen »Eisen-Pepton-Agar«-Medium: keine melanoiden Pigmente (die auch bei der Kultur auf einem Tyrosin-Agar-Medium nicht auftreten).
Diastase-Aktivität: Agar +; Stärke +
Proteolytische Aktivität:
Milchkoagulation
gute Peptonisierung
Gelatineverflüssigung
Durch den Stamm assimilierte Zucker:
Saccharose
Inosit
Rhamnose
Raffinose
Die Gesamtheit der vorstehenden Eigenschaften erlaubt es, zu bestätigen, daß der in Rede stehende Stamm der Gattung Streptomyces violaceoniger (Kataloge Waksman & Curtis und Waksman & Henrici) angehört Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß das Kohlenstoff-Assimilationsspektrum sich etwas unterscheidet.
Das umfaßt erfindungsgemäße Verfahren den Einsatz von Mutanten des genannten Stammes, die z. B. natürliche oder künstliche Mutanten sein können, welch letztere z. B. durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen oder durch Behandlung des Ausgangsstammes mit mutagenen Chemikalien, wie z. B. Nitrosoguanidin und Methansulfonsäureäthylester, erhalten werden können.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung
Beispiel 1
a) Herstellung des Myceliums
In ein Fermentiergefäß von 201, das 151 Wasser enthält, bringt man 525 g Maiswasser mit 50% Trockenextrakten, 1050 g Xylose und 15 g Magnesiumsulfat ein, wobei alles sterilisiert wird.
Man stellt den pH-Wert vor der Sterilisation mit Ammoniak auf 6,8 ein und gibt 10 g Maisöl hinzu, um ein übermäßiges Schäumen bzw. Sprudeln zu verhindern.
Nach «;iner 10 minütigen Sterilisation bei 1200C wird das Milieu mit 400 ml einer 48stiindigen Vorkultur von Streptomyces violaceoniger, vom Stamm CBS 409-73 enthalten in einem Erlenmeyer-Kolben von 21, aneeimDft.
Das Fermentiergefäß ist mit einem System zum mechanischen Rühren, eingestellt auf 600 UpM, versehen, und die Belüftung ist auf 81 sterilisierte Luft pro Minute eingestellt
Die Kurven der Fig. 1, 2 und 3 zeigen die Entwicklung des pH-Werts (Fig. 1, Kurve C1), der Menge der anwesenden reduzierenden Zucker (F i g. 2, Kurve C2) und des Mikroorganismus-Volumens pro Kultur-Volumen (F i g. 3, Kurve C3) in Abhängigkeit von der Zeit, wobei die letztere Größe durch die Höhe des Bodensatzes nach dem Zentrifugieren in einem graduierten Meßzylinder bzw. Reagensglas unter Standardbedingungen, d.h. 5000UpM, während 10 Minuten gemessen wird.
Aus F i g. 3 ergibt sich, daß nach 24 Stunden Kultur die erhaltene Streptomyces-Menge ein Maximum erreicht und nicht mehr ansteigt
Die 151 der Kultur werden auf einem Büchner-Filter, der mit einer Vorschicht aus Filtererde versehen ist, filtriert Der gesammelte Streptomyces wird mit Trinkwasser gewaschen.
Man sammelt auf diese Weise ohne Schwierigkeiten 800 g feuchte Zellen auf.
b) Glucose-Isomerisierung
Die vorstehend erhaltenen 800 g Streptomyces werden in 151 einer Dextroselösung mit 500 g/kg der Lösung, die Spuren von Magnesium- und Kobaltsalzen, nämlich 2,4 g/l MgSO4 und 0,24 g/l CoCl2, enthält, suspendiert.
Der pH-Wert wird mit Hilfe einer Lösung von Natriumhydroxyd und Natriumsulfit auf 6,8 eingestellt, anschließend wird die Temperatur der Suspension auf 65° C gebracht und der pH mit Hilfe eines automatischen pH-Meßgeräts auf dem Wert von 6,8 gehalten.
In der nachstehenden Tabelle I sind die fortschreitenden Werte des absoluten Drehwerts *ound des wahren Fructosegehalts des Mediums und des pH in Abhängigkeit von der Zeit zusammengefaßt.
Zeit in Stunden CD % Fructose pH
2 +40°5 8,5 6,9
4 +29°1 16,5 6,8
6 +12°2 28,0 6,9
16 -13°1 45,5 7,0
20 -15°2 47,5 7,1
Mit Hilfe der in Tabelle 1 zusammengefaßten Werte wurden die entsprechenden Kurven G («o) und Cs (% Fructose) des Diagramms der Fig.4 erstellt, was auf eine wesentliche Isomerisierungsaktivität schließen läßt, wobei innerhalb von 20 Stunden Isomerisierungszeit 47,5% D-Fructose gebildet werden.
Beispie! 2
a) Herstellung des Myceliums
Die Herstellung erfolgte unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß die Maiswasser durch 300 g Proteine ersetzt wurden, die der Ausflockung der Vegetationswasser von Kartoffeln entstammten, wobei der pH-Wert immer mit Ammoniak auf 6,8 eingestellt wurde.
Nach 26stündiger Fermentation (Rühren bei 600 UpM1 Luftzufuhr 8 l/Min.) sammelt man nach der
Filtration 750 g feuchte Zellen von Streptomyces violaceoniger.
b) Isomerisierung von Glucose
Der vorstehend erhaltene Streptomyces-Kuchen wird in 151 einer 50gewichtsprozentigen Dextroselösung unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen dispergiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Tabelle II 52°5
+180I
-15°6		 % Fructose pH
Zeit in Stunden 0
27,5
46,5		 6,8
7,0
6,9
0
5
21
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Leichtigkeit der Filtration des Stamms und die Möglichkeit, ihn zu rezyklisieren.
a) Herstellung des Myceliums
Zwei Fermentierungsgefäße von 15 1 werden unter den in Beispiel 1 beschriebenen allgemeinen Bedingungen vorbereitet.
Die Maiswasser wurden durch ein proteolytisches Hydrolysat von Casein (1% Casein, d.h. 150g, wurden 25
30
in einer ammoniakalischen Lösung durch die alkalische Protease während 8 Stunden hydrolysiert) ersetzt.
Nach 24stündiger Fermentation und praktisch vollständigem Verschwinden von reduzierenden Substanzen erhält man nach lOminütigem Zentrifugieren bei 5000 UpM ein Streptimyces-Volumen von 0,6 ecm/ 10 ml Kultur.
Die Filtration dieser Kulturmedien ergibt 580 bzw. 560 g feuchte Streptomyces-Zellen.
b) Isomerisierung mit Rezyklisierung des Enzyms
Man führt sieben aufeinanderfolgende Isomerisierungen an 151 einer 50%igen Dextroselösung unter denselben Bedingungen wie Beispiel Ib durch. Die erste Isomerisierung wird mil 560 g Streptomyces-Zellen, die dem zweiten Fermentiergefäß entstammen, durchgeführt.
Die zweite Isomerisierung wird mit einer neuen Charge von 15 1 50%igem Glucosesirup mit dem nach der Filtration des der 1. Operation entstammenden Reaktionsmediums wiedergewonnenen Streptomyces durchgeführt.
Die Isomerisierungen 3,4,5 und 6 werden an anderen Chargen von 151 des Sirups durchgeführt, indem man dem Mycelium, das nach der Filtration aus der vorangegangenen Operation wiedergewonnen wurde, 145 g frische Zellen aus dem Fermentiergefäß 1 zusetzte.
Eine 7. und letzte Isomerisierung wird ohne Zugabe von frischen Streptomyces-Zellen durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser ganzen Operationen sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefaßt.
Tabelle III
Sieben aufeinanderfolgende Isomerisierungen, durchgeführt mit demselben Mycelium
1. 2. ' 3. 4. 5. 6. 7.
Isomerisierung Isomerisierung Isomerisierung Isomerisierung Isomerisierung Isomerisierung Isomerisierung
% Fructose
Zeit
% Fructose
Zeit
% Fructose
Zeit
% Fructose
Zeit % Fructose
Zeit
% Fructose
Zeit
% Fructose
14 42,0
Std.
20 33,0
Std.
27 39,0
Std.
14 28,5
Std.
38 42,5
Std.
42,0 38 42,5 45 40,0
Std. Std. Std.
Dieses Vorgehen erlaubt es, 107150%igen Glukosesirups zu isomerisieren, wobei das Mycelium 301 Kulturbrühe entstammt, während es ohne Rezyklisierung notwendig wäre, das 1071 Kulturbrühe entstammende Mycelium zu verwenden.
Des weiteren erlauben es die Zahlen der Tabelle III, festzustellen, daß, während der durchschnittliche Fructosegehalt der sieben Sirupe etwa 42% betrug, die gute Beibehaltung der isomerisierenden Aktivität des Myceliums während seines ganzen Einsatzes klar bewiesen wurde.
Mutation durch Ultraviolettbestrahlung
Man läßt eine Kultur von Streptomyces violaceoniger CBS 409-73 auf einem geneigten Agar-Agar auf der 20 21,0
Std.
68 41,0
Std.
Grundlage von Maismehl von 60 g/l bei einem pH 7
sporulieren.
Die Sporen werden gesammelt, indem man die Oberfläche der Kultur in Anwesenheit einer kleinen Menge einer sterilen Trypton-Kochsalzlösung abkratzt und sie in Suspension in 10 ml des Verdünnungsmittels
Trypton-Kochsalz bringt
Die so erhaltene Suspension wird in einen sterilen Kristallisator plaziert und einer langsamen Rührung mit Hilfe eines Magnetrührers unterworfen. Man bestrahlt die Suspension unter Verwendung einer Ultraviolettlampe (z.B. Philips» 125W black light), die in einer Entfernung von 20 cm angebracht ist Alle 10 min innerhalb 1 Std. entnimmt man 0,1 bis 0,2 ml der Suspension, die man auf der Oberfläche eines
Agar-Agar-Milieus, enthaltend 0,5% Xylose und 1% Hefeextrakt, untergebracht in Petrischalen, aufträgt. Nach einer Kultur bei 30° bringt man die isolierten Kolonien auf geneigtes Agar-Agar auf der Grundlage von Maismehl.
Ausgehend von so hergestellten geneigten Agar-Kulturen nimmt man 10 ml einer Bouillon, die 1% Dextrose und 1 % Hefeextrakt in einem konischen Fläschchen von 50 ml enthält. Man kultiviert unter Rühren bei 30°C während 2 Tagen. Mit Hilfe von 5 ml der so erhaltenen Vorkultur beimpft man 50 ml einer Produklionsbouillon, die 1,2% Xylose und 1% Hefeextrakt in einem konischen Fläschchen von 500 ml enthält.
Man kultiviert unter Rühren bei 30° während 3 Tagen. Man entnimmt dann 5 ml der so gewonnenen Kultur, die man in ein Proberöhrchen enthaltend 25 ml einer bei pH 7,5 gehaltenen Lösung und 36 g/l Dextrose und 5 g/l Magnesiumsulfat enthält. Die Proberöhrchen werden dann in ein Wasserbad bei 65° C während 7 Stdn. placiert.
Nach Abkühlung werden die Mikroorganismus-Zellen durch Filtration oder Zentrifugierung abgetrennt und man bestimmt die in der Lösung gebildete Fructose mittels einer kolorimetrischen Technik mit Resorcin auf einem Auto-Analysator.
Die nachfolgende Tabelle zeigt die erhaltenen Konzentrationen an Fructose:
Fructose Stamm A-6 Fructose
g/l A-7 g/l
CBS 409 / 73 3 A-8 1
CBS 409/73 3,4 A-9 2,6
CBS 409/73 3,2 A-10 3
Stamm A-I 2,3 A-Il 3,5
A-2 3,8 A-12 4,8
A-3 4,5 A-13 4,3
AA 3,5 2,7
A-5 4,0 2,9
Eine Variante der Herstellung der Mutanten des Stammes violaceoniger CBS 409-73 besteht in einer Bestrahlung mit ultraviolettem Licht, wobei die Sporensuspension wie oben hergestellt wurde, aber wobei man während 16 bis 24 Stdn. inkubiert, um die Keimung der Sporen anzuregen.
Mutation mit Hilfe von Nitroso-methylguanidin
Zu einer wie vorausgehend angegeben hergestellten
lü Sporensuspension fügt man Nitroso-methylguanidin in solcher Menge zu, um eine Konzentration von 1 bis 3 mg/ml zu erhalten. Man beläßt den Kontakt bei 30°C während 30 bis 120 Min. Man entnimmt alle 30 Min. 0,5 ml der Suspension, die man in 0,5 ml einer sterilen
!■j Glykokoü-Lösung von 1% einführt. Nach 1 Std. Kontakt isoliert man auf die Oberfläche eines Agar-Milieus enthaltend 0,5% Xylose und 1% Hefeextrakt, die in Petrischalen enthalten sind. Nach einer Kultur bei 30°C bringt man die isolierten Kolonien auf geneigten Agar-Agar auf Grundlage von Maismehl.
Ausgehend von den so hergestellten geneigten Agar-Proben beimpft man 10 ml einer Boullin enthaltend 1% Dextrose und 1% Hefeextrakt in einem konischen Fläschchen von 50 ml. Man kultiviert unter Rühren bei 30° während 2 Tagen. Mit Hilfe von 5 ml der so erhaltenen Vorkultur beimpft man 50 ml einer Produktionsbouillon enthaltend 1,2% Xylose und 1% Hefeextrakt in einem konischen Fläschchen von 500 ml. Man kultiviert unter Rühren bei 30° während 3 Tagen.
j» Man entnimmt dann 5 ml der so erhaltenen Kultur, die man in ein Proberührchen einführt, das 25 ml einer beim pH von 7,5 gehaltenen Lösung und 36 g/l Dextrose und 5 g/l Magnesiumsulfat enthält. Die Proberöhrchen werden dann in ein Wasserbad bei 65° während 7 Stdn.
placiert.
Nach Abkühlen werden die Mikroorganismus-Zellen durch Filtration und Zentrifugieren abgetrennt und man bestimmt die in der Lösung gebildete Fructose durch eine colorimetrische Technik mit Resorcin auf einem Auto-Analysator.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zur Fructose bei einer Temperatur von; 50 bis 75°C, einem pH-Wert von 6 bis 8, einer Konzentration an Glucose von 25 bis 60%, an CcCb von 0 bis 0,50 g/l und an MgSO4 von 0 bis 2,4 g/l, gekennzeichnet durch den Einsatz eines Stammes von Streptomyces violaceoniger mit der Hinterlegungsnummer CBS 409-73 oder eines Mutantenstammes dieses Stammes.
DE2417642A 1973-04-10 1974-04-10 Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose Expired DE2417642C3 (de)

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