DE2132357A1 - Verfahren zur Reinigung von Antibiotika - Google Patents

Description

Patentanwälte Dr. ing. Walter Abit2 Dr. Dieter F. Morf Dr. Hans-A. Brauns München 86, Pf«wtneuerair.28

29. Juni I97I Oase I4O4O

MEECK & GO., ING. Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.

Verfahren zur Reinigung von Antibiotika

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung und Reinigung eines neuen antibiotischen Gemisches aus Fermentationsflüssigkeit, wobei das Gemisch die beiden Produkte enthält: 7ß- (D-5-Ami:no-5-carboxyvaleramido )-3- (a-methoxy-p-sulfooxycirjnainoylox:yTnethyl)-7-iuethoxy-3-cepheL'j-4-car~ bonaäv.re (la) und 7ß-(D--5-Amino~5-carboxyiraleraniido)-3-(a~ me thoxy-p-hyd r oxyc iimainoyl oxyme thyl) ~7-me thoxy- 3- 0 eph em-4~ carbon?:äure (Ib). Diese Produkte besitzen die folgende Planan'oruicl:

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HOOC-CH- ( CH

COOH

(I)

worin K. einen Hydroxy- oder Sulfooxyrest, d.h. -OSO-H, bedeutet. Im folgenden wird das antibiotische Gemisch als Ge misch I bezeichnet.

Sowohl das Gemisch I als die daraus isolierten Produkte Ia und Ib sind Mittel mit breitem Spektrum, die eine etwa ausgeglichene gram-negative und gram-positive Wirkung ausüben. Dies schließt die Wirksamkeit in vivo gegen die folgenden gram-negativen Organismen: Proteus vulgaris, Proteus mirabilis,
Salmonella schottmuelleri, Salmonella gallinarum, Salmonella, pullorum, Escherichia coli und KLebsiella pneumoniae und die in-vivo-Wirksamkeit gegen die folgenden gram-positiven Organismen ein: Staphylcoccus aureus, Streptococcus pyogenes
und Diplococcus pneumoniae.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Abtrennimg der
einzelnen Produkte aus dem Gemisch I und voneinander.

Von den beiden in dem antibiotischen Gemisch I enthaltenen Produkten ist 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaloramido)-5-(o:-i;:otlioy.yp-sulfooxycinnainoylox3rraethyl)-7-inethoxy«3--ceplieiir-4-cax^>boiisäure das wirksamste hinsichtlich der InhibiQrung des Wachstums verschiedener Mikroorganismen. Dieses Produkt besitzt folgende Formel:

- 2 1 09882/188 4

14040

0 NHo ι

0 HOC-CH-(CH₂) .-C-EE

OCH

CH₂OC-C=CH OCH

COOH

(Ia)

und im folgenden wird dieses Produkt als Produkt Ia bezeichnet. Produkt Ia besitzt eine größere Resistenz gegen Cephalosporinasen als Cephalosporin C und Cephalothin und ist durch eine ge- ' ringe loxizität in Mäusen charakterisiert. Darüber hinaus ist j es gegen enzymatischen Abbau beständiger als Cephalosporin C
und es ist bakterizid. Bei oraler Verabreichung schützt es
gegen Infektionen aufgrund von Proteus vulgaris-und bei subkutaner Verabreichung ist es wirksam gegen eine Vielzahl gramnegativer und gram-positiver Infektionen.

Das Produkt 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-phydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

ist die zweite Hauptkomponente des antibiotischen Gemisches I. j Dieses Produkt besitzt folgende Strukturformel: '

0 HH₂

Il 1

HOC-CH-(CH₀),.-C-IiH

COOH

(Ib)

- 3 -109882/ 1 884

14040 ^H 2 Ί 32357 j

und im folgenden wird diese Verbindung als Produkt Ib be- ^:

zeichnet»

Reinigung von antibiotischem Gemisch I j

&eiöäß der Erfindung wird das antibiotische Gemisch I durch ■ Absorbierung von ITermentationsbrühe oder einer anderen un-

reinen lösung ₉ die das Gemisch enthält, auf einem Ionenaus- ' tauschharz₉ beispielsweise auf einem synthetischen Anionenaustauschharz9 das sich von Dextrose oder von einem Acrylcopolymeren oder von einem nicht-ionischen vernetzten Polymeren , ableitet oder durch Kontakt mit einem geeigneten Kationenaus- ' tauschharz gereinigt«, Das absorbierte Antibiotikum wird aus , dem Harz oder Polymerenadsorbat mit" irgendeinem geeigneten ; Lösungsmittel j Z₀B₀ mit einer wässerigen lösung oder mit j einer wässerigen alkoholischen lösung eines geeigneten Salzes ! oder mit einer wässerigen lösung einer anorganischen Säure ' -*■ eluierto Gegebenenfalls kann das nach diesem Verfahren er- _; haltene Eluat dann weiter durch eine zweite und dritte Ad- i sorptions- und Eluierstufe gereinigt werden. Konzentrate sämtlicher Equate werden dann erhalten^und die aktiven Fraktionen
werden vereinigt, um das gerein^e Gemisch I zu erhalten.

- j

In der Praxis wird die Eluierstufe am günstigsten mit Wasser ■ oder einer wässerigen alkoholischen Lösung oder mit einer
wässerigen alkoholischen lösung eines oder mehrerer geeigneter Salze j wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Natriumchlorid oder Kaliumchlorid und dergleichen,oder durch Eluierung
mit einer wässerigen lösung eines niederen Alkylketons oder
durch Eluierung mit einer wässerigen lösung einer Mineral- säure, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure. Schwefelsäure oder Phosphorsäure und dergleichen, durchgeführt. Gegebenenfalls können die nach diesem Verfahren erhaltenen
Eluate weiter durch eine zweite und dritte Adsorptions- und

- 4 -09882/1814

14040

Eluierstufe gereinigt werden. Konzentrate dieser Eluate

werden dann erhalten, um das gereinigte antibiotische Ge- j

misch I zu ergeben. Typische Eluiermittel, die verwendet I

werden können, sind beispielsweise (l) 5 $ige, 60 folge und J

90 %ige Lösungen von Methanol und Wasser, (2) eine verdünnte :

Lösung von Chlorwasserstoffsäure, z.B. Chlorwasserstoffsäure ;

von pH 0,95, (3) eine 20 $ige oder 25 $ige Lösung von Aceton j und Wasser, (4) ein Gemisch einer Lösung aus Im-Natriumnitratj

und 0,1m Natriumacetat von pH 7,5, (5) eine Lösung aus 0,5m-Ammoniumbromid und O,5m-Essigsäure und (6) eine 1 $ige Lösung aus Ameisensäure in Wasser.

Beispiele für in diesem Verfahren verwendbare Ionenaustausch harze und Polymere sind z.B. DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia
Eine Chemicals, Inc.), ein synthetisches Anionenaustauschharz, das sich von dem Polysaccharidbextran ableitet, in
seiner Chloridform oder Amberlite IRA-68 (Rohm & Haas Co.), " ein synthetisches Anionenaustauschharz, das aus einem vernetzten Acrylcopolymeren besteht, welches ein schwachbasisches tertiäres Amin enthält, oder Amberlite XAD-2,
ein nicht-ionischer vernetzter Polystyrolpolymersorbent. Zu
geeigneten verwendbaren Kationenaustauschharzen gehören beispielsweise Harze des Sulfonat-Iyps mit einer Styrol-Divinylbenzolmatrix, z.B. das kernsulfonierte Polystyrolharz
Dowex 50 X 2 (Dow Chemical Co.) in der Wasserstofform.

Der pH-Wert der das antibiotische Gemisch I enthaltenden

Eermentationsbrühe ist nicht kritisch, und im allgemeinen I kann die rohe Brühe direkt in dem Gewinnungs- und Reinigungsverfahren verwendet werden. Jedoch ist es gewöhnlich vorteilhaft, die Acidität der Brühe auf einen pH-Wert im Bereich ; von etv/a 2 biü 7 einzustellen und in der Praxis ist es be- j sonders günstig, einen pH-Wert von etwa 3 bis 4 herzusteller].'

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14040 ^v

Bioversuch ;

Das sowohl hinsichtlich des antibiotischen Gemisches I und
der einzelnen Produkte Ia und Ib angewendete Bioversuchsverfahren wird durch ein Scheibenplattenverfahren unter Verwendung von Proteus vulgaris (MB-838 ) als TestOrganismus durchgeführt. Der Testorganismus wird als eine Schrägkultur auf
Nähragar (Difco) plus 0,2 $ Hefeextrakt (Difco) gehalten. ! Die beimpften Schrägkulturen werden bei 37° während 18 bis · 24 Stunden inkubiert und bei Kühlschranktemperaturen eine j Woche gelagert, wobei jede Woche frische Schrägkulturen her- j gestellt werden. !

• j

Das Inokulum für die Versuchsplatten wird jeden Tag durch Beimpfung eines 250 ml Erlenmeyer-Kolbens, der 50 ml Nährlösung (Difco) plus 0,2 <fo Hefeextrakt (Difco) enthält, unter ^! einem Abkratzen von der Schrägkultur hergestellt. Der Kolben wird bei 27° auf einer Schüttelmaschine während 18 bis '

24 Stunden inkubiert. Die Kulturbrühe wird dann auf 40 $ i Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 m /u unter Verwendung eines Bausch & Lomb-Spectronic-Gerätes 20 durch Zugabe von 0,2 folgex Hefe ex traktlö sung zu der Wuchskultur eingestellt. Nicht beimpfte Brühe wird als Blindprobe für diese
Bestimmung verwendet. Die eingestellte Brühe (30 ml) wird zur Beimpfung von 1 Itr. Medium verwendet. '

Mhragar (Difco) plus 0,2 % Hefeextrakt (Difco) wird als Unter suchungsmedium verwendet. Dieses Medium wird hergestellt,
durch Autoklavieren sterilisiert und auf [50⁰G abkühlen gelassen. Nachdem das Medium beimpft ist, werden 10 ml jeweils
in verschiedene sterile Petrischalen gegeben und das Medium
kann sich verfestigen. Untersuchungen wurden an diesen Platten nach dem Scheibenplattenverfahren unter Verwendung von
Filterpapierscheiben von 12 mm '■' Die Verouchsplatten wurden

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20 bis 24 Stunden bei 37⁰C inkubiert. In den folgenden Bei-I spielen werden die Untersuchungen als mm-Durchmesser der In-S hibierungszone ausgedrückt. Sie wurden zur Bestimmung der ι relativen Wirksamkeiten oder^bei Vergleich mit einem gereinigten Bezugsstandard, der Wirksamkeit in /ug/ml verwendet. Wenn I ein derartiger Versuch in quantitativer Weise durchgeführt wird, können 2 bis 4 /Ug/ml Antibiotikum nachgewiesen werden.

Die biologische Wirksamkeit der nach diesem Reinigungsverfah- : ren erhaltenen Eluate wird durch Untersuchung der Eluate ge- {

■ gen Proteus vulgaris MB-838 (ATCG 21100 und NRRL B-3361) und ; Vibrio percolans MB-1272 (ATCC 8461} gemessen.

■ Trennung und Reinigung der Komponenten

i Das nach der vorstehenden Methode erhaltene gereinigte Ge-

i misch I kann in seine zwei Komponenten 7ß-(D-5-Amino-5-carb-

j oxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-

j iDethoxy-3-cephein-4-carbonsäure (Ia) und 7ß-(D-5-Aiaino-5-carb-

j oxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-

'■■ methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ib) durch chromatographische

j Mittel getrennt werden. Zu diesem Verfahren gehören:

j (l) Chromatographie auf einem stark hydrophilen Anionenausi tauschharz, das sich von Polysacchariden ableitet, entwickelt mit einem Ainmoniiimbromid-Ameisensäuresystem. Verschiedene Konzentrationen dieses Systems können angewendet v/erden, jedoch v:ird in der Praxis eine Lösung aus 0,5m-Ammoniumbromid vv.ä. O,lm~Ameisensäure bevorzugt. Typische Harze, die verwendet v;erden können, sind solche von Dextrose abgeleiteten in ihrer Chloridforra, d.h. mit Chloridgegenionen, v/ie beispielsv.^reise durcli das oben beschriebene DBAE Sepiiadex A-25-Ears erläutert wird.

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(2) Chromatographie auf einem schwach-"basischen Anionenaustauschharz. Dies ist eine Gruppenabtrennung, "bei der i Material in Rohform "bei einem pH-Wert von etwa 3 "bis 3,5 zugeführt wird und zunächst mit einer Säure bei einem i pH-Wert von etwa 2 und dann mit einem Gemisch aus Natrium- ■ Chlorid und Chlorwaseerstoffsäure bei einem pH-Wert von etwa 1 eluiert wird. Zu geeigneten Harzen gehören die vernetzten Acrylcopolymerharze, die ein schwach-basisches tertiäres Amin enthalten. Amberlite IRA-68 ist ein typisches Beispiel und ist für dieses Verfahren besonders geeignet.

(3) Chromatographie auf einem nicht-ionischen vernetzten j Polystyrolpolymeren wie beispielsweise Amberlite XAD-2. j Die Eluierung erfolgt mit einem geeigneten wässerigen j System, jedoch ist es im allgemeinen am günstigsten, ein ! Gemisch aus Wasser und einem niederen Alkylketon, wie bei- ' spielsweise Aceton, zu verwenden. Typische verwendbare \ Eluiermittel sind beispielsweise 10 $iges Methanol in Was- J ser mit anschließendem 50 $igem Methanol in Wasser. 20 fo j Aceton in Wasser kann auch anstelle der 50 folgen Methanol- ,' in-Wasseriiösung eingesetzt werden. :

Die nach dem obigen Verfahren erhaltenen einzelnen "Produkte Ia und Ib können durch ReChromatographie gereinigt werden. So kann beispielsweise 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraroido)"3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methüxy-3--cephem-4-carbonsäure (la) gereinigt werden, indem"das Produkt der in der obigen Methode I beschriebenen Reinigungsmethode mit anschließender Entsalzung auf Amberlite XAD-2 Absorbent unterworfen wird, und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(ß-niethoxy-p-hydrox3?'ciiina]iioylox3⁷inetlijl)-7-methoxy-3-cephem-4--carbonsäure kann durch Rechroinatogra·- phie auf einem Sephadex A-25 Anionenaustauochhara, das mit einer Lösung aus O,5m-Atnmoniumbromid und O,ö5m-Essigsä.ure entwickelt wird, erneut gereinigt werden.

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In der Praxis wird das antibiotische Gemisch I einer das Adsorbens enthaltenden Kolonne zugeführt, und ein geeignetes Eluat wird durch das Bett gepumpt. Wie im Falle der Reinigung¹ des oben "beschriebenen antibiotischen Gemisches I wird die j Eluierung so durchgeführt, daß Fraktionen oder Schnitte erhalten werden, und diese werden gegen einen Standardversuchs-' mikroorganismus, wie beispielsweise Proteus vulgaris (MB-838) biologisch untersucht, so daß solche Fraktionen erhalten werden, welche die höchste Konzentration an Antibiotikum enthalten. Im allgemeinen wurde die höchste Konzentration an 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-phydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ib) in den Anfangsfraktionen gefunden, während die späteren Fraktionen, in gleicher Weise vereinigt und dem Bioversuch unterworfen, das Produkt 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem·- 4-carbonsäure (la) ergaben.

Herstellung des Antibiotikumgemisches (i)

Das die Produkte Ia und Ib enthaltende Antibiotikumgemisch I wird durch Züchten eines bisher unbekannten Mikroorganismen-Stammes unter geregelten Bedingungen erhalten. Dieses Verfahren besteht in der aeroben Fermentation eines geeigneten wässerigen Nährmediums durch Beimpfung mit einer Streptomyces-griseus-Kultur. Dieser Organismus, der aus einer Bodenprobe isoliert wurde, ist ein neues Actinomycetum und wurde als MA-2837 in der Kulturensammlung von Merck & Co. Inc., Rahway, New Jersey, bezeichnet. Diese Kultur wurde zur ständigen Hinterlegung bei der Kulturensammlung der Northern Utilization Research and Development Branch of the U.S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois gebracht und mit der Kulturnummer NRRL 3851 bezeichnet.

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14040 'ν

Wässerige Medien, die bei der Fermentation verwendet werden können, sind solche, die üblicherweise für die Herstellung anderer Antibiotika verwendet werden. Derartige Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, die von dem Mikroorganismus assimilierbar sind und anorganische Salze.

Die genaue Zusammensetzung und Menge der verwendeten Kohlehydratquelle hängt zum Teil von den anderen Bestandteilen j des Mediums ab, im allgemeinen variiert die Menge an Kohle- ^: hydrat zwischen etwa 1 und 6 Gew.-%. Beispiele für Kohlehydrat quell en, die bei der Fermentation verwendet werden ι können, sind z.B. Zucker, wie beispielsweise Glukose, Arabinose, Maltose, Xylose, Mannit und dergleichen oder Stärken, wie beispielsweise Getreide, z.B. Hafer, Roggen, Maisstärke, ; Maismehl und dergleichen, die gegebenenfalls entweder allein ; oder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Uährmedium verwendet werden können. Im allgemeinen kann jedes Protein-haltige Material als Stickstoff- ;

quelle in dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Zu ! geeigneten Stickstoffquellen gehören beispielsweise Hefe- i hydrolysate, Hefeautolysat, Sojabohnenmehl, C.aseinhydrolysate, Maisquellflüssigkeit, lösliche Ireber j

oder Tomatenpaste und dergleichen. Die Stickstoffquellen werden entweder allein oder in Kombination, in Mengen im Berebh von etwa 0,2 bis 6 -Gew.-% des wässerigen Mediums verwendet. ;

Die Fermentation erfolgt bei Temperaturen Im Bereich von , 20 bis 37 C, jedoch wird zur Erzielung optimaler Ergebnisse die Durchführung der Fermentation bei Temperaturen von etwa 22 bis 30⁰C bevorzugt. Der pH-Wert des für das Wachstum der Streptomyces-griseus-Kultur (MA-2837) und aur Erzeugung des antibiotlschen Gemisches I geeigneten Nährmediums soll iiri Bereich von etwa 5,5 bis 8,0 liegen.

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Das Antibiotikumgemisch I und die Produkte la und Ib inhibieren in wirksamer Weise das Wachstum verschiedener Species von Sämonella und können daher als Desinfiziermittel verwendet werden. So üben beispielsweise 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido )-3- (oc-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-inethoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ib) und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyioxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (la) Wirksamkeit gegenüber Salmonella schottmuelleri und Salmonella gallinarum aus, und diese Eigenschaft zeigt deren Brauchbarkeit als sanitäres Mittel bei Haushalts- und Industrieanwendungen an.

Die in dem Antibiotikumgemisch I enthaltenen Produkte Ia und Ib werden mit dem 5-Amino-5-carboxyvaleramido-Anteil in der ß-Konfiguration in Hinblick auf den Cephemkern beschrieben. Diese Bezeichnung basiert auf derzeit verfügbaren Informationen, jedoch soll keine Bindung an diese Bezeichnung der räumlichen Konfiguration bestehen für den Fall, daß spätere Informationen nachweisen, daß diese Konfiguration falsch ist.

Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren der Erfindung. Das beanspruchte Verfahren unterliegt jedoch weitgehender Variation und Modifikation, und daher wird ein geringfügiges Abweichen oder eines Ausdehnung vom Fachmann als im Rahmen der Erfindung liegend angesehen.

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Beispiel

Reinigung des Antibiotikumgemisches und Trennung in seine Komponenten

Stufe A: Fermentation

Stufe 1: Der Inhalt eines lyophilisierten Rohres von Streptomyces griseus (MA-2837) wurde in 2 ml Medium I (in Beispiel 1 beschrieben) suspendiert und das erhaltene Inokulum wurde zur Beimpfung von Schrägkulturen des gleichen Mediums verwendet. Diese Schrägkulturen wurden bei 28⁰C 5 Tage inkubiert oder bis gute Spurenbildung vorlag, und dann wurden 10 ml des im folgenden angegebenen Mediums "VIII \ zu den Schrägkulturen zugefügt.

Medium VIII:

Hefeextrakt 0,3 &

NaOl 0,5 %

*FZ Amin 1 %

Dextrose 1 % pH 7,0

* ein enzymatisch abgebautes Casein

Das Wachstum jeder Schrägkultur wurde in Suspension gekratzt und die Suspension wurde als Inokulum in der Stufe 2 j verwendet. ' j

Stufe 2: Die in Stufe 1 erhaltene Suspension wurde zur Beimpfung eines mit Prallkörpern versehenen 250 ml Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 50 ml sterilisiertes Medium VIII (in Stufe 1 beschrieben) enthielt. Der beimpfte Kolben wurde dann auf einen mit 220 Upm betriebenen Rotationsschüttler gebracht und 48 Stunden bei 28⁰C inkubiert.

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Stufe 5: Der Inhalt eines Impfkolbens aus Stufe 2 wurde zur Beimpfung eines mit Prallkörper versehenen 2 Itr. Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 500 ml des als Medium VIII in Stufe 1 identifizierten Mediums enthielt. Der "beimpfte j

Kolben wurde dann auf einen bei 220 Upm betriebenen Rota- j tionsschüttler gebracht und 48 Stunden bei 28⁰O inkubiert. j

Stufe 4: Ein Inokulum von 500 ml der aus Stufe 3 erhaltenen Kultur wurde zur Beimpfung eines Fermentationsbehälters aus [ rostfreiem Stahl von 760 Ltr. (200 gallon), der 467 Ltr. eines sterilen Mediums VIII (in Stufe 1 beschrieben) enthielt, verwendet. Man ließ die Fermentation bei einer Temperatur von 28⁰C unter Bewegung (130 Upm) fortschreiten, während ein Luftstrom von etwa 280 Ltr./Min. (10 cfm) während 65 Stunden beibehalten wurde. Während der Fermentation wurde ein Antischäumungsmittel, Polyglykol 2000, in kleinen Mengen zugegeben, um übermäßiges Schäumen zu verhindern.

Stufe 5: Ein Inokulum von 380 Ltr. des sich aus Stufe 4 ergebenden Wuchses wurde zur Beimpfung eines Fermentationsbehälters aus rostfreiem Stahl von 565 Ltr. (1500 gallon), der 450 Ltr. (1200 gallon) des im folgenden aufgeführten Mediums IX enthielt.

Medium IX:

Maisquellflüssigkeit Dextrose

pH auf 7,2 mit NaOH eingestellt

Man ließ die Fermentation bei einer Temperatur von 28 C unter Bewegung (120 Upm) fortschmten, während eine Luftströmung j von 1570 Ltr./Min. (55,3 cfm) während 30 bis 36 Stunden bei- j behalten wurde. Während der Fermentation wurde Polyglykol 2000 in kleinen Mengen zugegeben, um überschüssiges Schäumen zu

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verhindern. Der Ansatz wurde gewonnen und die Wirksamkeit durch Scheiben-Plattenversuch bestimmt. Unter Verwendung von . 13 mm (0,5 inch) Scheiben ergab diese Flüssigkeit eine Inhibierungszone von 32,5 mm gegen Proteus vulgaris MB-838 nach Gewinnung bei einem Alter von 31 Tagen. i

Stufe B; Isolierung des Antibiotikumgemisches !

Die filtrierte Brühe (4050 Ltr., 1075 gallon) _aus Stufe A, Stufe 5 wurde nach 36 Stunden gewonnen und der pH-Wert von dem Bereich von 7 bis 8 auf 3,0 in dem Fermentationsbehälter durch Zugabe von Phosphorsäure eingestellt. Das Mycel wurde durch Durchgang durch eine Filterpresse vom Plattensieb-Typ ent- ; fernt und verworfen. Die filtrierte Brühe wurde dann durch ein Bett aus 380 Ltr. (100 gallon) Amberlite XAD-2 Adsorbens-Harz mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 38 Ltr. (10 gallon) je Minute durchgeleitet. Die verbrauchte Brühe wurde untersucht und verworfen und das Harzbett wurde mit zwei Volumen, Wasser gewaschen. Das Antibiotikum wurde aus dem Harzbett mit einer 60 $igen Lösung aus Methanol und Wasser mit einer ; Strömungsgeschwindigkeit von 19 Ltr. (5 gallon) je Minute eluiert. 40 Fraktionen von jeweils 19 Ltr. (5 gallon) wurden gesammelt und untersucht. Die Fraktionen 2 bis 40 wurden vereinigt, und das Methanol wurde durch Eindampfen im Vakuum entfernt. Das endgültige Konzentrat (158 Ltr. [41,5 gallon]) wurde durch Zugabe von Ammoniumhydroxyd auf pH 3,5 eingestellt und gefroren gehalten.

Proben des so erhaltenen Antibiotikumgemisches wurden dem biologischen Versuch nach der Scheiben-Plattenmethode gegenüber Proteus vulgaris unterworfen.

Filtrierte Brühe: Versuche, die mit.4000 Ltr. (1060 gallon) filtrierter Brühe durchgeführt wurden, ergaben .folgende Zonendur chmesser:

- 14 -

TWTBTTfIT*

Filtrierte Brühe

Verdünnung

1:2 1:4 1:8

Zonengröße

26,8 mm 23,8 mm 21,1 mm

Verbrauchte Brühe und Waschlösung: 10 Fraktionen von jeweils 380 Ltr. (100 gaüLon) ergaben beim Versuch Null ohne Verdünnung. Das Waschwasser ergab beim Versuch Null.

Eluatfraktionen: Es wurden Versuche bei sämtlichen Fraktionen

durchgeführt.	Die Zonendurchmesser	sind im	- 15 -	folgenden aufg	A	38 mm
führt:			109882/188		36
	Eluatfraktionen		36
Fraktion	Zonengröße	Fraktion Zonengröße	35
1	0	17	33
2	28 mm	18	33
3	35	19	34
4	34	20	34
5	36	21	33
6	36	22	34
7	36	23	32
8	38	24	33
9	38	1 25	32
10	36	26	32
11	36	27	32
12	38	28	30
13	40	29
14	37	30
15	36	31
16	37	32

Eluatfraktionen j

Fraktion	Zonengröße	Fraktion	Zonengröße
33	30 mm	37	28 am
34	30	• 38	26
35	28	39	26
36	27	40	26

Eluatzusammensetzung und Eluatkonzentrat:

Es wurden auch. Versuche mit 735 Ltr. (195 gallon) Eluatzusammensetzung und 156 Ltr. (41,5 gallon) Eluatkonzentrat durchgeführt.

Eluatzusammensetzung Eluatkonzentrat

Verdünnung	Zonengröße	Verdünnung	Zonengröße
1:5	28,8 mm	1:16	27,25 mm
1:10	27,0 mm	1:32	24,5 mm
1:20	23,8 mm
1:40	21,0 mm
Untersuchung bezüglich der Gesamtfeststoffe:

Filtrierte Brühe 119 kg

735 Iitr. (195 gallon) Eluatzusammensetzung 7,23 kg

156 Ltr. (41,5 gallon) Eluatkonzentrat 7,20 kg

Stufe 0: Reinigung auf, einem Anionenaustauschharz

79 Ltr. (20,7 gallon) des Konzentrats aus Stufe B wurden auf 117 Ltr. (31 gallon) mit Wasser verdünnt und auf einem 22,5 Ltr. Bett aus schwach-basischem Anionenaustauschharz (Amberlite IRA-68»IIarz, Chloridzyklus) bei pH 4,0 und einer

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Strömung von 7,6 Ltr. (2 gallon) je Minute adsorbiert. Danach

wurde mit 45 Ltr. Wasser gewaschen, wonach das Harzbett mit '

einer Lösung von pH 7,5 aus lm-Natriumnitrat und 0,lm-Natrium- i

acetat bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 Ltr./Min. j

eluiert wurde. 10 Eluatfraktionen von 19 Ltr. (5 gallon) wur- j

den gesammelt und so wie sie gesammelt wurden mit Chlorwas- : serstoffsäure auf pH 4 eingestellt.

Sämtliche Fraktionen wurden dem Bioversuch nach der Scheiben-

Plattenmethode gegen Proteus vulgaris wie folgt untersucht:

Beschickungslösung Verdünnung

1:10 28,5 mm 1:20 26,5 mm 1:40 24 mm

Eluatfraktionen, 1:10	Λ·Λ W t^f .4» *■> V%> ^f ** *J φ Verdünnung	1 27 mm	6	25 mm
Fraktion Zonen- Fraktion Zonen größe größe	30 mm	7	23 mm
1	28,5 mm	8	22 mm
2	26 mm	9	21 mm
3	26 mm	10	17,5 mn
4
5

Der verbrauchte Strom ergab bei der Probe 25 mm ohne Verdünnun
und das Waschwasser ergab bei der Probe 23 mm ohne Verdünnung. !

Stufe D: Zusätzliche-Reinigung des Antibiotikumgemisches

Die Fraktionen 1 bis 10 aus Stufe C wurden vereinigt und einem ! 45 Ltr. Bett aus Amberlite XAD-2 Adsorbens bei pH 3,0 und einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 Ltr./Min. zugeführt. Das Harz- ' bett wurde mit 90 Ltr. Wasser bei der gleichen Geschwindigkeit
gewaschen. Das Antibioticum wurde dann aus dem Harz durch eine ! 25 $ige Lösung aus Aceton und Wasser bei einer Strömungsge- ^; schv/indigkeit von 5 Ltr./Min. eluiert. Es wurden 16 Fraktionen ; von 19 Ltr. (5 gallon) gesammelt. j

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1f

Sämtliche !Fraktionen wurden nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris wie folgt untersucht. Die Beschickung (190 Ltr.) ergab folgende Zonendurchmesser:

BescMckungslösung Verdünnung Zonengröße

1:5	30	mm
1:10	27	,5 mm
1:20	24	,2 mm

Die Zonendurchmesser der Eluatfraktionen sind in der folgenden Tabelle aufgeführt: \

Eluatfraktxon	Verdünnung Zonen größe	20,5 mm	Eluatfraktion	1:10	25 mm
Fraktion	1:10	29 mm	Fraktion Verdünnung Zonen größe	1:10	26,5 mm
1	1:10	29 mm	9	1:5	26 mm
2	1:10	29 mm	10	1:5	28 mm
3	1:10	28 mm	11	1:5	27,5 mm
4	1:10	27 mm	12	1:5	25 mra
5	1:10	26 mm	13	1:5	25 ΐοΐΰ
6	1:10	26 mm	14	1:5	24j 5 mm
7	1:10		15
8	16

Die obigen Eluatfraktionen 2 bis 16 wurden vereinigt und dao Aceton durch Eindampfen im Vakuum auf ein Eiidvolumen von 17,4 Ltr. entfernt. Das Konzentrat von 17,4 Ltr. wurde durch Ammoniumhydroxyd auf pH 4,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wobei 620 g eines gereinigten Gemisches aus 7i3-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnaiTJoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbon3äure und 7ß-(O-5-Aj'ilno-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-hydroxycinnaiBoylo.xymethyl)-7-methoxy-3~cephem-4-carbonsäure erhalten wurde'. Dieses trockene Produkt besaß eine biologische Wirksamkeit von 320 mcg/ml für eine 25 mm Zone.

_- 18 10 9 8 82/18 8A

Stufe E; Abtrennung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3_(α-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

Eine Chromatographie-Kolonne von 2,5 cm (l inch) Durchmesser wurde zu einer Betthöhe von 100 cm mit DEAE Sephadex A-25 Anionenaustauschharz in einem 0,5m-Ammoniumbromid und 0,05 m-Essigsäure enthaltenden System gepackt. Das Gemisch aus 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (10,0 g) das in Stufe D erhalten worden war, wurde in 18 ml einer Lösung aus 0,5m-Ammoniumbromid und 0,05m-Essigsäure gelöst und auf die Kolonne aufgegeben. Eluierlösung wurde durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von 80 ml/h gepumpt,und es wurden 10 ml-Fraktionen Eluat maschinell gesammelt. Der Eluatstrom wurde durch ein Differentialrefraktometer registriert. Die Refraktometerregistrierung zeigte Massenspitzen bei den Rohren 19, 36, 79, 109 und 206. Scheiben-Plattenversuche gegen Proteus vulgaris (MB-838) erfolgten bei jeder dritten Fraktion unter Verwendung von Scheiben von 13 mm Durchmesser, die auf pH 7,0 gepuffert waren. Die Zonendurchmesser sind in der folgenden Tabelle aufgeführt: (Die Fraktionen 1 bis 66 ergaben beim Versuch Null)

- 19 -

109882/1884

14040

o&O

Fraktion Zonendurchmesser

Fraktion Zonendurchmesser

Fraktion Zonendurchmesser

69	18 mm
72	24
75	26
78	31
81	--
83	35
86	• 37
89	38
92	38
95	40 +
98	40 +
101	40 +
104	40 +
107	40 +
110	40 +
113	40
116	38
119	33

122 125 128 131 134 137 140 150 160 170 180 183 186 189 192 195 198 201

29 28

27

26

24

21

20

18

20

29

35

38

40

40 +

40 +

40 +

40 +

40 +

204

207

210

213

216

219

222

225

228

231

234

237

240

243

246

249

252

40 +

40 +

40 +

40 +

40 +

40

38

35

32

31

27

24

23

19

17

Die Fraktionen 80 bis 133 wurden vereinigt und die Fraktionen 170 bis 230 wurden vereinigt.

Es erfolgte eine Wiederholung des obigen Versuchs, und die Fraktionen 82 bis 130 wurden vereinigt und die Fraktionen 180 bis 234 wurden vereinigt.

Die Fraktionen, welche die erste aktive Komponente aus den beiden obigen Versuchen enthielten, wurden vereinigt und auf einem 100 ml-Bett aus Amberlite XAD-2 Harz adsorbiert. Das Bett wurde mit einem Volumen Wasser gewaschen und dann mit drei Volumen eine 90 folge Lösung aus Methanol und Wasser

- 20 109882/18

eluiert. Das Methanol wurde durch Eindampfen im Vakuum entfernt und das wässerige Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei 810 mg eines Produktes erhalten wurde, das als 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(of:-methoxy-p-hydroxycinnamoylmethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure identifiziert wurde. Die biologische Wirksamkeit dieses Produktes, bestimmt nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris, betrug 18 /Ug/ml, wobei sich eine 25 mm Zone ergab. Analyse durch Ultraviolettabsorption ergab die folgenden charakterisierenden Daten:

UV-Absorption in .0,In-HCl k _mBV 305 E^⁰ _nm 524 UV-Absorption in 0,In-NaOH J^ _max 328 E$ 564

Stufe Έ: Abtrennung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyli-T-methoxy-„

^-cephem-^-carbonsäure

Die Fraktionen aus den beiden Versuchen auf Sephadex A-25, welche die zweite aktive Komponente enthielten, wurden vereinigt und auf einem 100 ml-Bett aus Araberlite XAD-2 Harz adsorbiert. Das Bett wurde mit einem Volumen Wasser gewaschen und dann mit drei Volumen einer 90 folgen lösung aus Methanol und Wasser eluiert. Die angereicherten Eluate wurden vereinigt und Methanol wurde durch Eindampfen im Vakuum entfernt. Das wässerige Konzentrat wurde gefriergetrocknet und ergab 720 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (la). Analyse durch Ultraviolettabsorption ergab folgende charakterisierende Daten:

UV-Absorption in 0,In-HCl /( „ 287 mm E^ „ 432

Hi d λ .-L Olli

UV-Absorption in 0,In-NaOH/(_max 280 mm Ef _Qm 432

- 21 -1 09882/18 8 4

Beispiel 2

Abtrennung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure aus dem Antibiotikumgemisch

20,0 g des Gemisches nach Beispiel 5, Stufe D aus 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (la) und 7ß-(D-5-Amino~5-carboxyvaleramido)-3-(a-inethoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ib) wurde in 200 ml Wasser gelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde auf 3,5 eingestellt. Diese Lösung wurde durch ein 200 ml-Bett aus Amberlite IRA-68 Anionenaustauschharz (Chloridzyklus) mit nachfolgender Zugabe von 300 ml Waschwasser geleitet. Das Bett wurde dann mit 1 Ltr. 1 %iger (V/V) Ameisensäure in Wasser eluiert. Daran schloß sich die Zugabe von zwei Portionen ver- dünnter Chlorwasserstoffsäure von pH 0,95 an. Die Beschickungslösung, die verbrauchte Lösung und Waschwasser und die Eluate 1, 2 und 3 wurden durch Papierelektrophorese bei pH 4,0 analysiert, wobei der Versuch eine Stunde bei 1000 Volt Gleichstrom durchgeführt wurde. Das Papierchromatogramm wurde getrocknet, gegenüber Ammoniak ausgesetzt, um die Säure zu neutralisieren und auf einer mit Proteus vulgaris (MB-838) beimpften Mhragarplatte inkubiert. Die Prüfung nach 17-stündiger Inkubierung bei' 37⁰C ergab zwei Inhibierungszonen in dem Beschickungsmaterial (in Richtung der Anode), lediglich eine einzige Komponente (leichter als die beiden) in der verbrauchten Lösung und den Ameisensäureeluaten und eine einzige Komponente in dem zweiten Chlorwasserstoffsäureeluat, die der schnelleren Komponente in der Beschickung entsprach. Die folgende Tabelle zeigt den Gesaintfeststoff und die biologischen Versuchsdaten:

- 22 -

1Q98S2/1884

14040

Beschickung

Masse Volumen gesamte biolo- Produkt(e)

gische Einhei-

ten -

20 g 200 ml 60 000 Einhei- Ia und Ib

ten

verbrauchte Lösung und Waschlösung 11,15 g 500 ml

7 500 Einheiten ITd

Ameisensäure-

eluat 4,52 g 1000 ml 20 000 Einheiten Ib

erstes Chlorwas-

serstoffsäure-

eluat

500 ml

1 000 Einheiten —

zweites Chlorwasserstoff säureeluat 2,10 g 500 ml 10 000 Einheiten Ia

Diese Fraktionen wurden durch Adsorption auf Amberlite XAD-2 Harz gewonnen, um 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(amethoxy-p-sulfooxycinnan]oyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (la) abzutrennen und dieses wurde durch eine 50 $ige Lösung aus Methanol und Wasser eluiert, wobei praktisch reines Produkt (Ia) erhalten wurde.

Beispiel 3

Abtrennung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy- i p-s-ulfooxycinnamoyloxyiiiethyl)-7-n3ethoxy-3-cepheiD-4-carbonsäu- ' re aus dem Antibiotikumgemisch ' \

5,0 g eines gemäß Beispiel 1, Stufe D erhaltenen Gemisches aus j 7ß-(D-5-Airiino-5-carboxyvaleran]ido)-3-(cc-methoxy-p-sulfoox3'^rcinnamo3'-lox3T!7etliyl)-"7-me&ioxy-3-cephen!-4-carbonsäure (la) und | 7ß~(D-5-Anino-5-carboxyvaleramido)-(a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-rjethox3'-_3_eephem-4-carbonsäure (Ib) wurden in . · 2Ό ml einer 20 ^igen Lösung aus Aceton und Wasser gelöst und ί der pH-V/ort auf 4,0 eingestellt. Diese Lösung wurde auf ein Bett aus Amberlite XAD-2 Adsorbens von 5 era Durchmesser χ 100 cm Höhe in 20 ^c/>iger Aceton und Wasserlösung aufgegeben. Eine Lö- \

- 2.3 -

109882/188Λ

14040

sung aus 20 % Aceton und Wasser wurde durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von 880 ml/h gepumpt, und es wurden 20 ml-Fraktionen automatisch gesammelt.

Scheiten-Plattenversuche gegen Proteus vulgaris (MB-838) erfolgten hei jeder dritten Fraktion unter Verwendung von Scheihen von 6,3 mm (0,25 inch). Die Zonendurchmesser sind im fol-

genden	aufgeführt:	messer	0	8	Fraktion	Zonen	Fraktion	Zonendurch
Fraktion Zonendurch-		1 O mm	. 8		durch		messer !
	±ii mm OO	8		messer
	C.C. 25 OQ		131	0	221	18
1-41	31 35 7A	134	0	224	18
44	pU OP.	137	0	227	. 18
47	on	140	8	230	17
50	c. I 25 24 OT,	143	11	233	17
53	C.L· on	146	13	236	15
56	cX) ~\ Ω	149	13	239	15 -j
59	iy	152	15	242	15 I
62	J.D -I Λ	155	15	245	15
65	J~4 13 13 η 1Z -	158	16	248	14 ι
68	-I Λ	161	17	251	14
71	i-4	164	18	254	14 !
74	J-P	167	17	257	13 ;
77	13	170	18	260	13
80	11	173	20	263	12 :
83	10	176	21	266	12 !
86	9	179	21	269	12 :
89	182	21	272	11
83	185	21	275	11
95	188	22	278	10
98	191	23	281	10
101	194	23	284	9
104	197	23	287	8
107	200	22	290	o ..:
110	203	24	293	0
113	206	24	296	0
116	209	24	299	0
119	212	24	302	0
122	215	24
125"	218	19	330	0
128

24 -

09882/18 8

Die Fraktionen 44 bis 90 wurden vereinigt, Aceton wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt und das wässerige Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei 3,3 g rohe 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (la) erhalten wurden.

Die Fraktionen 150 bis 225 wurden vereinigt und nach ähnlicher Behandlung erhielt man 700 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ib).

Eine Wiederholung des obigen Versuches ergab 3,1 g rohe 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oi;-niethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (la) und 400 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ib). -

Die beiden Mengen an 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(amethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (la) die nach dem obigen Verfahren erhalten wur^ den, wurden vereinigt und die 6,4 g des Materials wurden auf ein Bett aus Amberlite XAD-2 Adsorbens von 5 cm Durchmesser χ 100 cm Höhe in einer 5 $igen lösung aus Methanol und Wasser aufgegeben. Eine 5 $ige Methanol- und Wasserlösung wurde durch das Bett mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 880 ml/h gepumpt, und es wurden 20 ml-Fraktionen automatisch gesammelt. 287 Fraktionen wurden gesammelt und jede vierte Fraktion wurde nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris (MB-838) unter Verwendung von Scheiben von 6,3 mm (0,25 inch) untersucht. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Die Fraktionen 1 bis 50 wurden nicht untersucht .

109882/1384

14040	Zonengröße	Fraktion	2132357	Zonengröße
Fraktion	23 mm	115	20
51	26	119	20
55	23	123	19
59	18	127	18
63	12	131	19
67	0	155	16
71	0	139	17
75	0	143	15
79	7	147	16
83	9	151	15
87	13	155	13
91	19	159	11
95	21	163	9
99	22	167	0
103	22	171	0
107	21	287	0
111

Die Fraktionen 95 "bis 159 wurden vereinigt, das Methanol wurde im Vakuum abgedampft und das wässerige Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei 700 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido )-3-(a~meth.oxy-p-sulfooxycinnamoyloxyinet]iyl)-7-met]ioxy-3~ cephem-4-carbonsäure (la) erhalten wurden. Das Ultraviolettspektrum von 7ß-(D-5--Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a~methoxyp-sulfooxycinnamoyloxyiaethyl)-7-methoxy-3-cephera-4-carbonsäure (la) ergab folgende Adsorptionsdaten: · ·

UV-Adsorption in 0,In-HCl λ _max 285 E^ _cm 160 UV-Adsorption in 0,In-UaOH i_max 277 E^ _cm 166

Bei der Prüfung mit Scheiben von 13 mm (0,5 inoh) DurchraesBer nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris ergab '-die 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(a-methoxy~p-Bulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ia)-

-_26 - ^:

Ϊ0988 2/188 4

Probe eine 25 nan Zone "bei 88 mcg/ml und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalerainido)-3-(o:-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-car'bonsäure (Ib) ergab eine 25 mm Zone j

bei 167 mcg/ml.

Beispiel 4

Gereinigtes Gemisch aus 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-metlioxy-3-cephem-4-carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carTboxyvaleramido)-3-to^:- methoxy-p-hydroxycinnamoylox^ethy^^-methoxy^-cepheiil··^- carbonsäure

Das 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cepliem-4-carbonsäure 1 und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxy-p-hydroxy- ■, cinnaiDoyloxymethyl)-7-methoxy~3-cephem-4-carbonsäure enthaltende Konzentrat nach Beispiel 1, Stufe B wurde auf 1500 g -j DEAE Sephadex A-25 Anionenaustauschharz unter ansatzweisem ' Rühren während 16 Stunden bei 0° bis 5⁰C adsorbiert. Das Harz ■

wurde abfiltriert, mit drei 20 Ltr.-Portionen kaltem Wasser ' gewaschen und dann in eine Kolonne gegeben. Das Antibiotikumgemisch wurde durch Eluierung mit 3 tigern Ammoniurachlorid in 70 tigern wässerigem Methanol gewonnen, und es wurden 3,8 Ltr.-Fraktionen gesammelt. Die aktiven !Fraktionen 3 bis 7 wurden vereinigt und unter Vakuum konzentriert, wobei ein 3>8 Ltr.-Anteil erhalten wurde, der 625 g !Feststoffe enthielt. Dieser Anteil (3,8 Ltr.) wurde auf eine 20 Ltr.-Kolonne mit Dowex 50 X 2 Harz (Wasserstoffzyklus) gegeben. Die Kolonne wurde mit Wasser bei 50 ml/Min, entwickelt und es wurden 2 Ltr.-Fraktionen des ausströmenden Gutes gesammelt und untersucht. Die wirksamen Fraktionen 6 bis 33 wurden vereinigt, zu 4 Ltr. durch Eindampfen im Vakuum konzentriert und gefriergetrocknet, v:obei 41 g eines gereinigten Gemisches aus '7ß-(D-5-Ajaino-5-carbcxyvalera.Eiicio)-3-(«-methoxy-p-sulfooxyc.irmamoyloyyristhyl)-7-iaethoxy-3-cepheffi-4-carbonsaure ur-d 7ß- (D-5-Ai:i.ii2G- ^-carboiiyvalera:; Iuο )-3- (a-metlioxy-p-hyd:» o:-:ycinnamoylj.xy:;;c !:hyl)-7--^Tnethoxy--"~':cT;];-_r;;:»4-cai-bonEäure r-rhaltcn wurden. - 27 -

109882/18 8 Λ ^BAD ORIGINAL

Scheiben-Plattenversuche gegen Proteus vulgaris (MB-838)
erfolgten mit dem Ausgangskonzentrat und mit dem gereinigten Gemisch. Mit dem Ausgangskonzentrat wurde eine
25 mm-Zone bei 0,30 mg/ml erhalten. Das gereinigte Gemisch ergab eine 25 mm-Zone bei 0,033 mg/ml.

Die Verbindungen (I) der Erfindung wurden mit dem 5-Amino-5-carboxyvaleramido-Anteil in der ß-Konfiguration mit Bezug auf den Cephemkern beschrieben. Diese Bezeichnung basiert
auf zur Zeit zur Verfügung stehenden Informationen, jedoch soll keine Bindung an die räumliche Konfiguration bestehen für den Fall, daß durch spätere Informationen nachgewiesen wird, daß sie unkorrekt ist.

- 28 -

109882/18 8 L·

Claims (20)

14040 3

Patentansprüche

Verfahren zur Gewinnung und Reinigung eines Antibiotikumgemisches, das 7S-(I>-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-.methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem- 4-carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-Came thoxy-p-hydroxyc innamoyl oxymethyl )-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure enthält sowie zur Trennung der beiden Komponenten voneinander, dadurch gekennzeichnet, daß eine verunreinigte Lösung des Gemisches mit einem Anionen- oder Kationenaustauschharz oder mit einem nicht-ionischen Polymeren in Berührung gebracht wird, das Adsorbat mit einem Lo-. sungsmittel eluiert wird, die Eluate gesammelt und die aktiven Fraktionen vereinigt werden und das so erhaltene gereinigte Gemisch entweder isoliert oder gegebenenfalls in seine Hauptbestandteile durch chromatographische Mittel getrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Anionenaustauschharz ein von Dextran abgeleitetes Anionenaustauschharz in seiner Chloridform oder ein von einem Acrylcopolymeren abgeleitetes Anionenaustauschharz verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Anionenaustauschharz ein von einem vernetzten Acrylcopolymeren, das ein schwach-basisches tertiäres Amin aufweist, abgeleitetes Anionenaustauschharz verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als nicht-ionisches Polymeres ein vernetzter P_olystyrol-

- 29 109882/1884

14040

polymersorbent verwendet wird.

5. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, j daß ein Kationenaustauschharz verwendet wird, das aus am j Kern betindlichen Sulfonsäuregruppen, die mit einer Styrol-\ Divinylbenzolmatrix verknüpft sind, aufgetaut ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Eluierlösung Wasser, eine wässerige alkoholische Lösung, eine wässerige alkoholische Lösung eines oder mehrerer Salze oder eine wässerige Lösung einer Mineralsäure verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Eluierlösungsmittel eine Lösung aus lm-Natriunmitrat und O,lm-lSFatriumacetat verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

* t

daß die Fermentationsbrühe des verunreinigten Antibiotikum-; gemisches einen pH-Wert von etwa 2 Ms 7 aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das so erhaltene verunreinigte Gemisch in seine Komponenten 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-inethoxyp-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-niethoxy-3-cephein-4-carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-hydr oxycinnamoyl oxyme thyl)-7-methoxy-3-c ephem-4-c art» onsäure getrennt wird, indem das Gemisch mit einem Anionenaustauschharz in Berührung gebracht wird oder mit einem schwach basischen Ionenaustauschharz unter sauren Bedingungen in Berührung gebfacht wird oder mit nicht-ioniscliem vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht wird und anschließend das erhaltene Adsorbat mit einem Lösungsmittel eluiert wird und zwei Eluatfraktionen, welche die beiden höchsten Antibiotilaunkonzentratiöneii enthalten, gewonnen werden.

- 30 _-
109882/1884

10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß als Anionenaustauschharz ein stark hydrophiles oder ein schwach-basisches Anionenaustauschharz unter sauren Bedingungen verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Eluatfraktion, welche die erste Konzentration an Antibiotikum enthält, mit einem nicht-ionischen vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht wird und mit einer wässerigen alkoholischen lösung unter Erhalt von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure eluiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Eluatfraktion, welche die zweite Konzentration an Antibiotikum enthält, mit einem nicht-ionischen vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht wird und mit einer alkoholischen wässerigen lösung unter E_rhalt von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure eluiert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch mit einem von Dextran in seiner Chloridform abgeleiteten Anionenaustauschharz in Berührung gebracht wird.

14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Eluatfraktion mit einem nicht-ionischen vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht wird. ■

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch, gekennzeichnet, daß die zweite Eluatfraktion mit einem nicht-ionischen vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht wird,

- 31 109882/1884

14040 $

16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Eluiennittel eine Lösung aus Methanol und Wasser verwendet wird.

17. Verfahren nach Anspruch 1 zur Trennung und Reinigung; von 7ß-(B-5-Amino-5-carboxyvalerajnido)-3-(a-methoxy-p-sulfo- · oxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure aus einem Antibiotikumgemisch, dadurch gekennzeichnet, daß ein 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy~3-cephem-4-carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-car'bonsäure enthaltendes Gemisch mit einem Anionenaustauschharz in Berührung gebracht wird, das Adsorbat mit einem Lösungsmittel eluiert wird, die Eluatfraktionen gesammelt werden, die Fraktionen mit einem nicht-ionischen vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht werden und die Adsorbate mit einer wässerigen alkoholischen Lösung eluiert werden.

18. Verfahren nach Anspruch 17_} dadurch gekennzeichnet, daß als Anionenaustauschharz ein vernetztes Aerylcopolymeres, das ein schwach-basisches tertiäres Amin enthält, verwendet wird.

19. Verfahren zur Gewinnung und Reinigung eines Antibiotikumgemisches, das 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(a-iriethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und 7ß-(D-5~Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(«- methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-inethoxy-3-cepliem-4-carbonsäure aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß eine verunreinigte Lösung dieses Geraisches mit einem Anionen- oder Kationenaustauschharz oder mit einem nicht-ionischen Polymeren in Berührung gebracht wird, das Adsorbat mit einem

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Lösungsmittel eluiert wird, die Eluate gesammelt werden und die aktiven Fraktionen vereinigt werden.

20. Verfahren zur Trennung von 7ß-(D^-Amino-S-carboxy- ι valeramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7- j meth.oxy-3-cephem-4-carbonsäure und 7ß-(D^-Amino-S-carboxy- ! valeramido)-3-(ct-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure aus einem dieselben enthal- j tenden Gemisch, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch mit ; einem Anionenaustauschharz oder mit einem nicht-ionischen vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht wird, das Adsorbat mit einem Lösungsmittel eluiert wird, die Eluatfraktion, welche die beiden höchsten Konzentrationen an Antibiotikum enthält, gewonnen wird, die !"raktionen mit einem nicht-ionischen vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht werden und die Adsorbate mit einem Lösungsmittel unter Erhalt der gewünschten Produkte eluiert werden.

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