DE2132357A1 - Verfahren zur Reinigung von Antibiotika - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von AntibiotikaInfo
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- C07D501/14—Compounds having a nitrogen atom directly attached in position 7
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- C07D501/20—7-Acylaminocephalosporanic or substituted 7-acylaminocephalosporanic acids in which the acyl radicals are derived from carboxylic acids
- C07D501/57—7-Acylaminocephalosporanic or substituted 7-acylaminocephalosporanic acids in which the acyl radicals are derived from carboxylic acids with a further substituent in position 7, e.g. cephamycines
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Description
Patentanwälte Dr. ing. Walter Abit2 Dr. Dieter F. Morf
Dr. Hans-A. Brauns München 86, Pf«wtneuerair.28
29. Juni I97I
Oase I4O4O
MEECK & GO., ING. Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.
Verfahren zur Reinigung von Antibiotika
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung und Reinigung eines neuen antibiotischen Gemisches aus
Fermentationsflüssigkeit, wobei das Gemisch die beiden Produkte
enthält: 7ß- (D-5-Ami:no-5-carboxyvaleramido )-3- (a-methoxy-p-sulfooxycirjnainoylox:yTnethyl)-7-iuethoxy-3-cepheL'j-4-car~
bonaäv.re (la) und 7ß-(D--5-Amino~5-carboxyiraleraniido)-3-(a~
me thoxy-p-hyd r oxyc iimainoyl oxyme thyl) ~7-me thoxy- 3- 0 eph em-4~
carbon?:äure (Ib). Diese Produkte besitzen die folgende Planan'oruicl:
— 1 — 109882/1884
HOOC-CH- ( CH
COOH
(I)
worin K. einen Hydroxy- oder Sulfooxyrest, d.h. -OSO-H, bedeutet.
Im folgenden wird das antibiotische Gemisch als Ge misch I bezeichnet.
Sowohl das Gemisch I als die daraus isolierten Produkte Ia und Ib sind Mittel mit breitem Spektrum, die eine etwa ausgeglichene
gram-negative und gram-positive Wirkung ausüben. Dies schließt die Wirksamkeit in vivo gegen die folgenden gram-negativen
Organismen: Proteus vulgaris, Proteus mirabilis,
Salmonella schottmuelleri, Salmonella gallinarum, Salmonella, pullorum, Escherichia coli und KLebsiella pneumoniae und die in-vivo-Wirksamkeit gegen die folgenden gram-positiven Organismen ein: Staphylcoccus aureus, Streptococcus pyogenes
und Diplococcus pneumoniae.
Salmonella schottmuelleri, Salmonella gallinarum, Salmonella, pullorum, Escherichia coli und KLebsiella pneumoniae und die in-vivo-Wirksamkeit gegen die folgenden gram-positiven Organismen ein: Staphylcoccus aureus, Streptococcus pyogenes
und Diplococcus pneumoniae.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Abtrennimg der
einzelnen Produkte aus dem Gemisch I und voneinander.
einzelnen Produkte aus dem Gemisch I und voneinander.
Von den beiden in dem antibiotischen Gemisch I enthaltenen
Produkten ist 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaloramido)-5-(o:-i;:otlioy.yp-sulfooxycinnainoylox3rraethyl)-7-inethoxy«3--ceplieiir-4-cax>boiisäure
das wirksamste hinsichtlich der InhibiQrung des Wachstums verschiedener Mikroorganismen. Dieses Produkt besitzt
folgende Formel:
- 2 1 09882/188 4
14040
0 NHo ι
0 HOC-CH-(CH2) .-C-EE
OCH
CH2OC-C=CH OCH
COOH
(Ia)
und im folgenden wird dieses Produkt als Produkt Ia bezeichnet.
Produkt Ia besitzt eine größere Resistenz gegen Cephalosporinasen als Cephalosporin C und Cephalothin und ist durch eine ge- '
ringe loxizität in Mäusen charakterisiert. Darüber hinaus ist j es gegen enzymatischen Abbau beständiger als Cephalosporin C
und es ist bakterizid. Bei oraler Verabreichung schützt es
gegen Infektionen aufgrund von Proteus vulgaris-und bei subkutaner Verabreichung ist es wirksam gegen eine Vielzahl gramnegativer und gram-positiver Infektionen.
und es ist bakterizid. Bei oraler Verabreichung schützt es
gegen Infektionen aufgrund von Proteus vulgaris-und bei subkutaner Verabreichung ist es wirksam gegen eine Vielzahl gramnegativer und gram-positiver Infektionen.
Das Produkt 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-phydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
ist die zweite Hauptkomponente des antibiotischen Gemisches I. j Dieses Produkt besitzt folgende Strukturformel: '
0 HH2
Il 1
HOC-CH-(CH0),.-C-IiH
COOH
(Ib)
- 3 -109882/ 1 884
14040 H 2 Ί 32357 j
und im folgenden wird diese Verbindung als Produkt Ib be- :
zeichnet»
Reinigung von antibiotischem Gemisch I j
&eiöäß der Erfindung wird das antibiotische Gemisch I durch ■
Absorbierung von ITermentationsbrühe oder einer anderen un-
reinen lösung 9 die das Gemisch enthält, auf einem Ionenaus- '
tauschharz9 beispielsweise auf einem synthetischen Anionenaustauschharz9
das sich von Dextrose oder von einem Acrylcopolymeren
oder von einem nicht-ionischen vernetzten Polymeren , ableitet oder durch Kontakt mit einem geeigneten Kationenaus- '
tauschharz gereinigt«, Das absorbierte Antibiotikum wird aus ,
dem Harz oder Polymerenadsorbat mit" irgendeinem geeigneten ;
Lösungsmittel j Z0B0 mit einer wässerigen lösung oder mit j
einer wässerigen alkoholischen lösung eines geeigneten Salzes ! oder mit einer wässerigen lösung einer anorganischen Säure ' -*■
eluierto Gegebenenfalls kann das nach diesem Verfahren er- ;
haltene Eluat dann weiter durch eine zweite und dritte Ad- i
sorptions- und Eluierstufe gereinigt werden. Konzentrate sämtlicher
Equate werden dann erhalten^und die aktiven Fraktionen
werden vereinigt, um das gerein^e Gemisch I zu erhalten.
werden vereinigt, um das gerein^e Gemisch I zu erhalten.
- j
In der Praxis wird die Eluierstufe am günstigsten mit Wasser ■
oder einer wässerigen alkoholischen Lösung oder mit einer
wässerigen alkoholischen lösung eines oder mehrerer geeigneter Salze j wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Natriumchlorid oder Kaliumchlorid und dergleichen,oder durch Eluierung
mit einer wässerigen lösung eines niederen Alkylketons oder
durch Eluierung mit einer wässerigen lösung einer Mineral- säure, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure. Schwefelsäure oder Phosphorsäure und dergleichen, durchgeführt. Gegebenenfalls können die nach diesem Verfahren erhaltenen
Eluate weiter durch eine zweite und dritte Adsorptions- und
wässerigen alkoholischen lösung eines oder mehrerer geeigneter Salze j wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Natriumchlorid oder Kaliumchlorid und dergleichen,oder durch Eluierung
mit einer wässerigen lösung eines niederen Alkylketons oder
durch Eluierung mit einer wässerigen lösung einer Mineral- säure, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure. Schwefelsäure oder Phosphorsäure und dergleichen, durchgeführt. Gegebenenfalls können die nach diesem Verfahren erhaltenen
Eluate weiter durch eine zweite und dritte Adsorptions- und
- 4 -09882/1814
14040
Eluierstufe gereinigt werden. Konzentrate dieser Eluate
werden dann erhalten, um das gereinigte antibiotische Ge- j
misch I zu ergeben. Typische Eluiermittel, die verwendet I
werden können, sind beispielsweise (l) 5 $ige, 60 folge und J
90 %ige Lösungen von Methanol und Wasser, (2) eine verdünnte :
Lösung von Chlorwasserstoffsäure, z.B. Chlorwasserstoffsäure ;
von pH 0,95, (3) eine 20 $ige oder 25 $ige Lösung von Aceton j
und Wasser, (4) ein Gemisch einer Lösung aus Im-Natriumnitratj
und 0,1m Natriumacetat von pH 7,5, (5) eine Lösung aus 0,5m-Ammoniumbromid
und O,5m-Essigsäure und (6) eine 1 $ige Lösung aus Ameisensäure in Wasser.
Beispiele für in diesem Verfahren verwendbare Ionenaustausch harze und Polymere sind z.B. DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia
Eine Chemicals, Inc.), ein synthetisches Anionenaustauschharz, das sich von dem Polysaccharidbextran ableitet, in
seiner Chloridform oder Amberlite IRA-68 (Rohm & Haas Co.), " ein synthetisches Anionenaustauschharz, das aus einem vernetzten Acrylcopolymeren besteht, welches ein schwachbasisches tertiäres Amin enthält, oder Amberlite XAD-2,
ein nicht-ionischer vernetzter Polystyrolpolymersorbent. Zu
geeigneten verwendbaren Kationenaustauschharzen gehören beispielsweise Harze des Sulfonat-Iyps mit einer Styrol-Divinylbenzolmatrix, z.B. das kernsulfonierte Polystyrolharz
Dowex 50 X 2 (Dow Chemical Co.) in der Wasserstofform.
Eine Chemicals, Inc.), ein synthetisches Anionenaustauschharz, das sich von dem Polysaccharidbextran ableitet, in
seiner Chloridform oder Amberlite IRA-68 (Rohm & Haas Co.), " ein synthetisches Anionenaustauschharz, das aus einem vernetzten Acrylcopolymeren besteht, welches ein schwachbasisches tertiäres Amin enthält, oder Amberlite XAD-2,
ein nicht-ionischer vernetzter Polystyrolpolymersorbent. Zu
geeigneten verwendbaren Kationenaustauschharzen gehören beispielsweise Harze des Sulfonat-Iyps mit einer Styrol-Divinylbenzolmatrix, z.B. das kernsulfonierte Polystyrolharz
Dowex 50 X 2 (Dow Chemical Co.) in der Wasserstofform.
Der pH-Wert der das antibiotische Gemisch I enthaltenden
Eermentationsbrühe ist nicht kritisch, und im allgemeinen I
kann die rohe Brühe direkt in dem Gewinnungs- und Reinigungsverfahren
verwendet werden. Jedoch ist es gewöhnlich vorteilhaft, die Acidität der Brühe auf einen pH-Wert im Bereich ;
von etv/a 2 biü 7 einzustellen und in der Praxis ist es be- j
sonders günstig, einen pH-Wert von etwa 3 bis 4 herzusteller].'
109882718 84
14040 v
Bioversuch ;
Das sowohl hinsichtlich des antibiotischen Gemisches I und
der einzelnen Produkte Ia und Ib angewendete Bioversuchsverfahren wird durch ein Scheibenplattenverfahren unter Verwendung von Proteus vulgaris (MB-838 ) als TestOrganismus durchgeführt. Der Testorganismus wird als eine Schrägkultur auf
Nähragar (Difco) plus 0,2 $ Hefeextrakt (Difco) gehalten. ! Die beimpften Schrägkulturen werden bei 37° während 18 bis · 24 Stunden inkubiert und bei Kühlschranktemperaturen eine j Woche gelagert, wobei jede Woche frische Schrägkulturen her- j gestellt werden. !
der einzelnen Produkte Ia und Ib angewendete Bioversuchsverfahren wird durch ein Scheibenplattenverfahren unter Verwendung von Proteus vulgaris (MB-838 ) als TestOrganismus durchgeführt. Der Testorganismus wird als eine Schrägkultur auf
Nähragar (Difco) plus 0,2 $ Hefeextrakt (Difco) gehalten. ! Die beimpften Schrägkulturen werden bei 37° während 18 bis · 24 Stunden inkubiert und bei Kühlschranktemperaturen eine j Woche gelagert, wobei jede Woche frische Schrägkulturen her- j gestellt werden. !
• j
Das Inokulum für die Versuchsplatten wird jeden Tag durch Beimpfung eines 250 ml Erlenmeyer-Kolbens, der 50 ml Nährlösung
(Difco) plus 0,2 <fo Hefeextrakt (Difco) enthält, unter !
einem Abkratzen von der Schrägkultur hergestellt. Der Kolben wird bei 27° auf einer Schüttelmaschine während 18 bis '
24 Stunden inkubiert. Die Kulturbrühe wird dann auf 40 $ i
Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 m /u unter Verwendung
eines Bausch & Lomb-Spectronic-Gerätes 20 durch Zugabe
von 0,2 folgex Hefe ex traktlö sung zu der Wuchskultur eingestellt.
Nicht beimpfte Brühe wird als Blindprobe für diese
Bestimmung verwendet. Die eingestellte Brühe (30 ml) wird zur Beimpfung von 1 Itr. Medium verwendet. '
Bestimmung verwendet. Die eingestellte Brühe (30 ml) wird zur Beimpfung von 1 Itr. Medium verwendet. '
Mhragar (Difco) plus 0,2 % Hefeextrakt (Difco) wird als Unter
suchungsmedium verwendet. Dieses Medium wird hergestellt,
durch Autoklavieren sterilisiert und auf [500G abkühlen gelassen. Nachdem das Medium beimpft ist, werden 10 ml jeweils
in verschiedene sterile Petrischalen gegeben und das Medium
kann sich verfestigen. Untersuchungen wurden an diesen Platten nach dem Scheibenplattenverfahren unter Verwendung von
Filterpapierscheiben von 12 mm '■' Die Verouchsplatten wurden
durch Autoklavieren sterilisiert und auf [500G abkühlen gelassen. Nachdem das Medium beimpft ist, werden 10 ml jeweils
in verschiedene sterile Petrischalen gegeben und das Medium
kann sich verfestigen. Untersuchungen wurden an diesen Platten nach dem Scheibenplattenverfahren unter Verwendung von
Filterpapierscheiben von 12 mm '■' Die Verouchsplatten wurden
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20 bis 24 Stunden bei 370C inkubiert. In den folgenden Bei-I
spielen werden die Untersuchungen als mm-Durchmesser der In-S
hibierungszone ausgedrückt. Sie wurden zur Bestimmung der ι relativen Wirksamkeiten oder^bei Vergleich mit einem gereinigten
Bezugsstandard, der Wirksamkeit in /ug/ml verwendet. Wenn
I ein derartiger Versuch in quantitativer Weise durchgeführt wird, können 2 bis 4 /Ug/ml Antibiotikum nachgewiesen werden.
Die biologische Wirksamkeit der nach diesem Reinigungsverfah- : ren erhaltenen Eluate wird durch Untersuchung der Eluate ge- {
■ gen Proteus vulgaris MB-838 (ATCG 21100 und NRRL B-3361) und
; Vibrio percolans MB-1272 (ATCC 8461} gemessen.
■ Trennung und Reinigung der Komponenten
i Das nach der vorstehenden Methode erhaltene gereinigte Ge-
i misch I kann in seine zwei Komponenten 7ß-(D-5-Amino-5-carb-
j oxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-
j iDethoxy-3-cephein-4-carbonsäure (Ia) und 7ß-(D-5-Aiaino-5-carb-
j oxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-
'■■ methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ib) durch chromatographische
j Mittel getrennt werden. Zu diesem Verfahren gehören:
j (l) Chromatographie auf einem stark hydrophilen Anionenausi
tauschharz, das sich von Polysacchariden ableitet, entwickelt mit einem Ainmoniiimbromid-Ameisensäuresystem. Verschiedene
Konzentrationen dieses Systems können angewendet v/erden, jedoch
v:ird in der Praxis eine Lösung aus 0,5m-Ammoniumbromid
vv.ä. O,lm~Ameisensäure bevorzugt. Typische Harze, die verwendet
v;erden können, sind solche von Dextrose abgeleiteten in ihrer Chloridforra, d.h. mit Chloridgegenionen, v/ie beispielsv.reise
durcli das oben beschriebene DBAE Sepiiadex A-25-Ears
erläutert wird.
109882/1884
(2) Chromatographie auf einem schwach-"basischen Anionenaustauschharz.
Dies ist eine Gruppenabtrennung, "bei der i Material in Rohform "bei einem pH-Wert von etwa 3 "bis 3,5
zugeführt wird und zunächst mit einer Säure bei einem i pH-Wert von etwa 2 und dann mit einem Gemisch aus Natrium- ■
Chlorid und Chlorwaseerstoffsäure bei einem pH-Wert von etwa 1 eluiert wird. Zu geeigneten Harzen gehören die vernetzten
Acrylcopolymerharze, die ein schwach-basisches tertiäres Amin enthalten. Amberlite IRA-68 ist ein typisches
Beispiel und ist für dieses Verfahren besonders geeignet.
(3) Chromatographie auf einem nicht-ionischen vernetzten j Polystyrolpolymeren wie beispielsweise Amberlite XAD-2. j
Die Eluierung erfolgt mit einem geeigneten wässerigen j System, jedoch ist es im allgemeinen am günstigsten, ein !
Gemisch aus Wasser und einem niederen Alkylketon, wie bei- '
spielsweise Aceton, zu verwenden. Typische verwendbare \ Eluiermittel sind beispielsweise 10 $iges Methanol in Was- J
ser mit anschließendem 50 $igem Methanol in Wasser. 20 fo j
Aceton in Wasser kann auch anstelle der 50 folgen Methanol- ,'
in-Wasseriiösung eingesetzt werden. :
Die nach dem obigen Verfahren erhaltenen einzelnen "Produkte
Ia und Ib können durch ReChromatographie gereinigt werden. So kann beispielsweise 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraroido)"3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methüxy-3--cephem-4-carbonsäure
(la) gereinigt werden, indem"das Produkt
der in der obigen Methode I beschriebenen Reinigungsmethode mit anschließender Entsalzung auf Amberlite XAD-2
Absorbent unterworfen wird, und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(ß-niethoxy-p-hydrox3?'ciiina]iioylox37inetlijl)-7-methoxy-3-cephem-4--carbonsäure
kann durch Rechroinatogra·- phie auf einem Sephadex A-25 Anionenaustauochhara, das mit
einer Lösung aus O,5m-Atnmoniumbromid und O,ö5m-Essigsä.ure
entwickelt wird, erneut gereinigt werden.
- 8 10988271884
14040
In der Praxis wird das antibiotische Gemisch I einer das Adsorbens enthaltenden Kolonne zugeführt, und ein geeignetes
Eluat wird durch das Bett gepumpt. Wie im Falle der Reinigung1
des oben "beschriebenen antibiotischen Gemisches I wird die j Eluierung so durchgeführt, daß Fraktionen oder Schnitte erhalten
werden, und diese werden gegen einen Standardversuchs-' mikroorganismus, wie beispielsweise Proteus vulgaris (MB-838)
biologisch untersucht, so daß solche Fraktionen erhalten werden, welche die höchste Konzentration an Antibiotikum
enthalten. Im allgemeinen wurde die höchste Konzentration an 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-phydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ib) in den Anfangsfraktionen gefunden, während die späteren Fraktionen, in gleicher Weise vereinigt und dem Bioversuch
unterworfen, das Produkt 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem·-
4-carbonsäure (la) ergaben.
Das die Produkte Ia und Ib enthaltende Antibiotikumgemisch I wird durch Züchten eines bisher unbekannten Mikroorganismen-Stammes
unter geregelten Bedingungen erhalten. Dieses Verfahren besteht in der aeroben Fermentation eines geeigneten
wässerigen Nährmediums durch Beimpfung mit einer Streptomyces-griseus-Kultur. Dieser Organismus, der aus
einer Bodenprobe isoliert wurde, ist ein neues Actinomycetum und wurde als MA-2837 in der Kulturensammlung von Merck & Co.
Inc., Rahway, New Jersey, bezeichnet. Diese Kultur wurde zur ständigen Hinterlegung bei der Kulturensammlung der
Northern Utilization Research and Development Branch of the U.S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois gebracht
und mit der Kulturnummer NRRL 3851 bezeichnet.
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14040 'ν
Wässerige Medien, die bei der Fermentation verwendet werden können, sind solche, die üblicherweise für die Herstellung
anderer Antibiotika verwendet werden. Derartige Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, die von dem
Mikroorganismus assimilierbar sind und anorganische Salze.
Die genaue Zusammensetzung und Menge der verwendeten Kohlehydratquelle
hängt zum Teil von den anderen Bestandteilen j des Mediums ab, im allgemeinen variiert die Menge an Kohle- :
hydrat zwischen etwa 1 und 6 Gew.-%. Beispiele für Kohlehydrat
quell en, die bei der Fermentation verwendet werden ι
können, sind z.B. Zucker, wie beispielsweise Glukose, Arabinose, Maltose, Xylose, Mannit und dergleichen oder Stärken,
wie beispielsweise Getreide, z.B. Hafer, Roggen, Maisstärke, ; Maismehl und dergleichen, die gegebenenfalls entweder allein ;
oder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Uährmedium verwendet werden können. Im allgemeinen
kann jedes Protein-haltige Material als Stickstoff- ;
quelle in dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Zu !
geeigneten Stickstoffquellen gehören beispielsweise Hefe- i hydrolysate, Hefeautolysat, Sojabohnenmehl, C.aseinhydrolysate,
Maisquellflüssigkeit, lösliche Ireber j
oder Tomatenpaste und dergleichen. Die Stickstoffquellen werden
entweder allein oder in Kombination, in Mengen im Berebh
von etwa 0,2 bis 6 -Gew.-% des wässerigen Mediums verwendet. ;
Die Fermentation erfolgt bei Temperaturen Im Bereich von ,
20 bis 37 C, jedoch wird zur Erzielung optimaler Ergebnisse die Durchführung der Fermentation bei Temperaturen von etwa
22 bis 300C bevorzugt. Der pH-Wert des für das Wachstum der
Streptomyces-griseus-Kultur (MA-2837) und aur Erzeugung des
antibiotlschen Gemisches I geeigneten Nährmediums soll iiri
Bereich von etwa 5,5 bis 8,0 liegen.
- 10 109882/1884
14040
Das Antibiotikumgemisch I und die Produkte la und Ib inhibieren
in wirksamer Weise das Wachstum verschiedener Species von Sämonella und können daher als Desinfiziermittel verwendet
werden. So üben beispielsweise 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido )-3- (oc-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-inethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ib) und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyioxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(la) Wirksamkeit gegenüber Salmonella schottmuelleri und Salmonella gallinarum aus, und diese Eigenschaft
zeigt deren Brauchbarkeit als sanitäres Mittel bei Haushalts- und Industrieanwendungen an.
Die in dem Antibiotikumgemisch I enthaltenen Produkte Ia und Ib
werden mit dem 5-Amino-5-carboxyvaleramido-Anteil in der ß-Konfiguration in Hinblick auf den Cephemkern beschrieben.
Diese Bezeichnung basiert auf derzeit verfügbaren Informationen, jedoch soll keine Bindung an diese Bezeichnung der
räumlichen Konfiguration bestehen für den Fall, daß spätere Informationen nachweisen, daß diese Konfiguration falsch ist.
Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren der Erfindung. Das beanspruchte Verfahren unterliegt jedoch weitgehender Variation
und Modifikation, und daher wird ein geringfügiges Abweichen oder eines Ausdehnung vom Fachmann als im Rahmen
der Erfindung liegend angesehen.
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Reinigung des Antibiotikumgemisches und Trennung in seine
Komponenten
Stufe A: Fermentation
Stufe 1: Der Inhalt eines lyophilisierten Rohres von Streptomyces griseus (MA-2837) wurde in 2 ml Medium I (in
Beispiel 1 beschrieben) suspendiert und das erhaltene Inokulum wurde zur Beimpfung von Schrägkulturen des gleichen
Mediums verwendet. Diese Schrägkulturen wurden bei 280C
5 Tage inkubiert oder bis gute Spurenbildung vorlag, und dann wurden 10 ml des im folgenden angegebenen Mediums "VIII \
zu den Schrägkulturen zugefügt.
Medium VIII:
Hefeextrakt 0,3 &
NaOl 0,5 %
*FZ Amin 1 %
Dextrose 1 % pH 7,0
* ein enzymatisch abgebautes Casein
Das Wachstum jeder Schrägkultur wurde in Suspension gekratzt
und die Suspension wurde als Inokulum in der Stufe 2 j verwendet. ' j
Stufe 2: Die in Stufe 1 erhaltene Suspension wurde zur Beimpfung
eines mit Prallkörpern versehenen 250 ml Erlenmeyer-Kolbens
verwendet, der 50 ml sterilisiertes Medium VIII (in Stufe 1 beschrieben) enthielt. Der beimpfte Kolben wurde
dann auf einen mit 220 Upm betriebenen Rotationsschüttler
gebracht und 48 Stunden bei 280C inkubiert.
- 12 1 098 82/18 8Ä
14040
Stufe 5: Der Inhalt eines Impfkolbens aus Stufe 2 wurde zur Beimpfung eines mit Prallkörper versehenen 2 Itr.
Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 500 ml des als Medium VIII in Stufe 1 identifizierten Mediums enthielt. Der "beimpfte j
Kolben wurde dann auf einen bei 220 Upm betriebenen Rota- j
tionsschüttler gebracht und 48 Stunden bei 280O inkubiert. j
Stufe 4: Ein Inokulum von 500 ml der aus Stufe 3 erhaltenen
Kultur wurde zur Beimpfung eines Fermentationsbehälters aus [ rostfreiem Stahl von 760 Ltr. (200 gallon), der 467 Ltr. eines
sterilen Mediums VIII (in Stufe 1 beschrieben) enthielt, verwendet. Man ließ die Fermentation bei einer Temperatur von
280C unter Bewegung (130 Upm) fortschreiten, während ein
Luftstrom von etwa 280 Ltr./Min. (10 cfm) während 65 Stunden beibehalten wurde. Während der Fermentation wurde ein Antischäumungsmittel,
Polyglykol 2000, in kleinen Mengen zugegeben, um übermäßiges Schäumen zu verhindern.
Stufe 5: Ein Inokulum von 380 Ltr. des sich aus Stufe 4 ergebenden
Wuchses wurde zur Beimpfung eines Fermentationsbehälters
aus rostfreiem Stahl von 565 Ltr. (1500 gallon), der 450 Ltr. (1200 gallon) des im folgenden aufgeführten
Mediums IX enthielt.
Medium IX:
Maisquellflüssigkeit Dextrose
pH auf 7,2 mit NaOH eingestellt
Man ließ die Fermentation bei einer Temperatur von 28 C unter
Bewegung (120 Upm) fortschmten, während eine Luftströmung j von 1570 Ltr./Min. (55,3 cfm) während 30 bis 36 Stunden bei- j
behalten wurde. Während der Fermentation wurde Polyglykol 2000 in kleinen Mengen zugegeben, um überschüssiges Schäumen zu
- 13 -
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verhindern. Der Ansatz wurde gewonnen und die Wirksamkeit durch Scheiben-Plattenversuch bestimmt. Unter Verwendung von .
13 mm (0,5 inch) Scheiben ergab diese Flüssigkeit eine Inhibierungszone
von 32,5 mm gegen Proteus vulgaris MB-838 nach Gewinnung bei einem Alter von 31 Tagen. i
Stufe B; Isolierung des Antibiotikumgemisches !
Die filtrierte Brühe (4050 Ltr., 1075 gallon) aus Stufe A,
Stufe 5 wurde nach 36 Stunden gewonnen und der pH-Wert von dem Bereich von 7 bis 8 auf 3,0 in dem Fermentationsbehälter durch
Zugabe von Phosphorsäure eingestellt. Das Mycel wurde durch Durchgang durch eine Filterpresse vom Plattensieb-Typ ent- ;
fernt und verworfen. Die filtrierte Brühe wurde dann durch ein Bett aus 380 Ltr. (100 gallon) Amberlite XAD-2 Adsorbens-Harz
mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 38 Ltr. (10 gallon) je Minute durchgeleitet. Die verbrauchte Brühe wurde untersucht
und verworfen und das Harzbett wurde mit zwei Volumen, Wasser gewaschen. Das Antibiotikum wurde aus dem Harzbett
mit einer 60 $igen Lösung aus Methanol und Wasser mit einer ;
Strömungsgeschwindigkeit von 19 Ltr. (5 gallon) je Minute eluiert. 40 Fraktionen von jeweils 19 Ltr. (5 gallon) wurden
gesammelt und untersucht. Die Fraktionen 2 bis 40 wurden vereinigt, und das Methanol wurde durch Eindampfen im Vakuum
entfernt. Das endgültige Konzentrat (158 Ltr. [41,5 gallon]) wurde durch Zugabe von Ammoniumhydroxyd auf pH 3,5 eingestellt
und gefroren gehalten.
Proben des so erhaltenen Antibiotikumgemisches wurden dem biologischen Versuch nach der Scheiben-Plattenmethode gegenüber
Proteus vulgaris unterworfen.
Filtrierte Brühe: Versuche, die mit.4000 Ltr. (1060 gallon)
filtrierter Brühe durchgeführt wurden, ergaben .folgende Zonendur
chmesser:
- 14 -
TWTBTTfIT*
Filtrierte Brühe
1:2 1:4 1:8
26,8 mm 23,8 mm 21,1 mm
Verbrauchte Brühe und Waschlösung: 10 Fraktionen von jeweils
380 Ltr. (100 gaüLon) ergaben beim Versuch Null ohne Verdünnung.
Das Waschwasser ergab beim Versuch Null.
Eluatfraktionen: Es wurden Versuche bei sämtlichen Fraktionen
durchgeführt. | Die Zonendurchmesser | sind im | - 15 - | folgenden aufg | A | 38 mm |
führt: | 109882/188 | 36 | ||||
Eluatfraktionen | 36 | |||||
Fraktion | Zonengröße | Fraktion Zonengröße | 35 | |||
1 | 0 | 17 | 33 | |||
2 | 28 mm | 18 | 33 | |||
3 | 35 | 19 | 34 | |||
4 | 34 | 20 | 34 | |||
5 | 36 | 21 | 33 | |||
6 | 36 | 22 | 34 | |||
7 | 36 | 23 | 32 | |||
8 | 38 | 24 | 33 | |||
9 | 38 | 1 25 | 32 | |||
10 | 36 | 26 | 32 | |||
11 | 36 | 27 | 32 | |||
12 | 38 | 28 | 30 | |||
13 | 40 | 29 | ||||
14 | 37 | 30 | ||||
15 | 36 | 31 | ||||
16 | 37 | 32 | ||||
Eluatfraktionen j
Fraktion | Zonengröße | Fraktion | Zonengröße |
33 | 30 mm | 37 | 28 am |
34 | 30 | • 38 | 26 |
35 | 28 | 39 | 26 |
36 | 27 | 40 | 26 |
Eluatzusammensetzung und Eluatkonzentrat:
Es wurden auch. Versuche mit 735 Ltr. (195 gallon) Eluatzusammensetzung
und 156 Ltr. (41,5 gallon) Eluatkonzentrat durchgeführt.
Verdünnung | Zonengröße | Verdünnung | Zonengröße |
1:5 | 28,8 mm | 1:16 | 27,25 mm |
1:10 | 27,0 mm | 1:32 | 24,5 mm |
1:20 | 23,8 mm | ||
1:40 | 21,0 mm | ||
Untersuchung bezüglich der Gesamtfeststoffe: |
Filtrierte Brühe 119 kg
735 Iitr. (195 gallon) Eluatzusammensetzung
7,23 kg
156 Ltr. (41,5 gallon) Eluatkonzentrat 7,20 kg
Stufe 0: Reinigung auf, einem Anionenaustauschharz
79 Ltr. (20,7 gallon) des Konzentrats aus Stufe B wurden auf 117 Ltr. (31 gallon) mit Wasser verdünnt und auf einem
22,5 Ltr. Bett aus schwach-basischem Anionenaustauschharz (Amberlite IRA-68»IIarz, Chloridzyklus) bei pH 4,0 und einer
- 16 109882/18 84
Strömung von 7,6 Ltr. (2 gallon) je Minute adsorbiert. Danach
wurde mit 45 Ltr. Wasser gewaschen, wonach das Harzbett mit '
einer Lösung von pH 7,5 aus lm-Natriumnitrat und 0,lm-Natrium- i
acetat bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 Ltr./Min. j
eluiert wurde. 10 Eluatfraktionen von 19 Ltr. (5 gallon) wur- j
den gesammelt und so wie sie gesammelt wurden mit Chlorwas- :
serstoffsäure auf pH 4 eingestellt.
Sämtliche Fraktionen wurden dem Bioversuch nach der Scheiben-
Plattenmethode gegen Proteus vulgaris wie folgt untersucht:
Beschickungslösung
Verdünnung
1:10 28,5 mm 1:20 26,5 mm 1:40 24 mm
Eluatfraktionen, 1:10 |
Λ·Λ W t^f .4» *■>
V%> ^f ** *J φ Verdünnung |
1 27 mm | 6 | 25 mm |
Fraktion Zonen- Fraktion Zonen größe größe |
30 mm | 7 | 23 mm | |
1 | 28,5 mm | 8 | 22 mm | |
2 | 26 mm | 9 | 21 mm | |
3 | 26 mm | 10 | 17,5 mn | |
4 | ||||
5 |
Der verbrauchte Strom ergab bei der Probe 25 mm ohne Verdünnun
und das Waschwasser ergab bei der Probe 23 mm ohne Verdünnung. !
und das Waschwasser ergab bei der Probe 23 mm ohne Verdünnung. !
Stufe D: Zusätzliche-Reinigung des Antibiotikumgemisches
Die Fraktionen 1 bis 10 aus Stufe C wurden vereinigt und einem !
45 Ltr. Bett aus Amberlite XAD-2 Adsorbens bei pH 3,0 und einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 Ltr./Min. zugeführt. Das Harz- '
bett wurde mit 90 Ltr. Wasser bei der gleichen Geschwindigkeit
gewaschen. Das Antibioticum wurde dann aus dem Harz durch eine ! 25 $ige Lösung aus Aceton und Wasser bei einer Strömungsge- ; schv/indigkeit von 5 Ltr./Min. eluiert. Es wurden 16 Fraktionen ; von 19 Ltr. (5 gallon) gesammelt. j
gewaschen. Das Antibioticum wurde dann aus dem Harz durch eine ! 25 $ige Lösung aus Aceton und Wasser bei einer Strömungsge- ; schv/indigkeit von 5 Ltr./Min. eluiert. Es wurden 16 Fraktionen ; von 19 Ltr. (5 gallon) gesammelt. j
- 17 10 9882/188 4
14040
1f
Sämtliche !Fraktionen wurden nach der Scheiben-Plattenmethode
gegen Proteus vulgaris wie folgt untersucht. Die Beschickung (190 Ltr.) ergab folgende Zonendurchmesser:
BescMckungslösung Verdünnung Zonengröße
1:5 | 30 | mm |
1:10 | 27 | ,5 mm |
1:20 | 24 | ,2 mm |
Die Zonendurchmesser der Eluatfraktionen sind in der folgenden Tabelle aufgeführt: \
Eluatfraktxon | Verdünnung Zonen größe |
20,5 mm | Eluatfraktion | 1:10 | 25 mm |
Fraktion | 1:10 | 29 mm | Fraktion Verdünnung Zonen größe |
1:10 | 26,5 mm |
1 | 1:10 | 29 mm | 9 | 1:5 | 26 mm |
2 | 1:10 | 29 mm | 10 | 1:5 | 28 mm |
3 | 1:10 | 28 mm | 11 | 1:5 | 27,5 mm |
4 | 1:10 | 27 mm | 12 | 1:5 | 25 mra |
5 | 1:10 | 26 mm | 13 | 1:5 | 25 ΐοΐΰ |
6 | 1:10 | 26 mm | 14 | 1:5 | 24j 5 mm |
7 | 1:10 | 15 | |||
8 | 16 |
Die obigen Eluatfraktionen 2 bis 16 wurden vereinigt und dao
Aceton durch Eindampfen im Vakuum auf ein Eiidvolumen von
17,4 Ltr. entfernt. Das Konzentrat von 17,4 Ltr. wurde durch Ammoniumhydroxyd auf pH 4,0 eingestellt und gefriergetrocknet,
wobei 620 g eines gereinigten Gemisches aus 7i3-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnaiTJoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbon3äure
und 7ß-(O-5-Aj'ilno-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-hydroxycinnaiBoylo.xymethyl)-7-methoxy-3~cephem-4-carbonsäure
erhalten wurde'. Dieses trockene Produkt besaß eine biologische Wirksamkeit von 320 mcg/ml für eine 25 mm Zone.
_- 18 10 9 8 82/18 8A
Stufe E; Abtrennung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3_(α-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
Eine Chromatographie-Kolonne von 2,5 cm (l inch) Durchmesser
wurde zu einer Betthöhe von 100 cm mit DEAE Sephadex A-25 Anionenaustauschharz in einem 0,5m-Ammoniumbromid und 0,05 m-Essigsäure
enthaltenden System gepackt. Das Gemisch aus 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(10,0 g) das in Stufe D erhalten worden war, wurde in 18 ml einer Lösung aus 0,5m-Ammoniumbromid und 0,05m-Essigsäure gelöst
und auf die Kolonne aufgegeben. Eluierlösung wurde durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von 80 ml/h gepumpt,und es
wurden 10 ml-Fraktionen Eluat maschinell gesammelt. Der
Eluatstrom wurde durch ein Differentialrefraktometer registriert. Die Refraktometerregistrierung zeigte Massenspitzen
bei den Rohren 19, 36, 79, 109 und 206. Scheiben-Plattenversuche gegen Proteus vulgaris (MB-838) erfolgten bei jeder
dritten Fraktion unter Verwendung von Scheiben von 13 mm Durchmesser, die auf pH 7,0 gepuffert waren. Die Zonendurchmesser
sind in der folgenden Tabelle aufgeführt: (Die Fraktionen 1 bis 66 ergaben beim Versuch Null)
- 19 -
109882/1884
14040
o&O
Fraktion Zonendurchmesser
Fraktion Zonendurchmesser
Fraktion Zonendurchmesser
69 | 18 mm |
72 | 24 |
75 | 26 |
78 | 31 |
81 | -- |
83 | 35 |
86 | • 37 |
89 | 38 |
92 | 38 |
95 | 40 + |
98 | 40 + |
101 | 40 + |
104 | 40 + |
107 | 40 + |
110 | 40 + |
113 | 40 |
116 | 38 |
119 | 33 |
122 125 128 131 134 137 140 150 160 170 180 183 186 189 192 195 198
201
29 28
27
26
24
21
20
18
20
29
35
38
40
40 +
40 +
40 +
40 +
40 +
204
207
210
213
216
219
222
225
228
231
234
237
240
243
246
249
252
40 +
40 +
40 +
40 +
40 +
40
38
35
32
31
27
24
23
19
17
Die Fraktionen 80 bis 133 wurden vereinigt und die Fraktionen 170 bis 230 wurden vereinigt.
Es erfolgte eine Wiederholung des obigen Versuchs, und die Fraktionen 82 bis 130 wurden vereinigt und die Fraktionen 180
bis 234 wurden vereinigt.
Die Fraktionen, welche die erste aktive Komponente aus den beiden obigen Versuchen enthielten, wurden vereinigt und auf
einem 100 ml-Bett aus Amberlite XAD-2 Harz adsorbiert. Das
Bett wurde mit einem Volumen Wasser gewaschen und dann mit drei Volumen eine 90 folge Lösung aus Methanol und Wasser
- 20 109882/18
eluiert. Das Methanol wurde durch Eindampfen im Vakuum entfernt
und das wässerige Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei 810 mg eines Produktes erhalten wurde, das als 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(of:-methoxy-p-hydroxycinnamoylmethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
identifiziert wurde. Die biologische Wirksamkeit dieses Produktes, bestimmt nach
der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris, betrug 18 /Ug/ml, wobei sich eine 25 mm Zone ergab. Analyse durch
Ultraviolettabsorption ergab die folgenden charakterisierenden Daten:
UV-Absorption in .0,In-HCl k mBV 305 E^0 nm 524
UV-Absorption in 0,In-NaOH J^ max 328 E$ 564
Stufe Έ: Abtrennung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyli-T-methoxy-„
^-cephem-^-carbonsäure
Die Fraktionen aus den beiden Versuchen auf Sephadex A-25, welche die zweite aktive Komponente enthielten, wurden vereinigt
und auf einem 100 ml-Bett aus Araberlite XAD-2 Harz adsorbiert.
Das Bett wurde mit einem Volumen Wasser gewaschen und dann mit drei Volumen einer 90 folgen lösung aus Methanol
und Wasser eluiert. Die angereicherten Eluate wurden vereinigt und Methanol wurde durch Eindampfen im Vakuum entfernt.
Das wässerige Konzentrat wurde gefriergetrocknet und ergab 720 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(la). Analyse durch Ultraviolettabsorption ergab folgende charakterisierende
Daten:
UV-Absorption in 0,In-HCl /( „ 287 mm E^ „ 432
Hi d λ .-L Olli
UV-Absorption in 0,In-NaOH/(max 280 mm Ef Qm 432
- 21 -1 09882/18 8 4
Beispiel 2
Abtrennung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
aus dem Antibiotikumgemisch
20,0 g des Gemisches nach Beispiel 5, Stufe D aus 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(la) und 7ß-(D-5-Amino~5-carboxyvaleramido)-3-(a-inethoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ib) wurde in 200 ml Wasser gelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde auf 3,5 eingestellt.
Diese Lösung wurde durch ein 200 ml-Bett aus Amberlite IRA-68 Anionenaustauschharz (Chloridzyklus) mit nachfolgender
Zugabe von 300 ml Waschwasser geleitet. Das Bett wurde dann mit 1 Ltr. 1 %iger (V/V) Ameisensäure in Wasser
eluiert. Daran schloß sich die Zugabe von zwei Portionen ver- dünnter Chlorwasserstoffsäure von pH 0,95 an. Die Beschickungslösung, die verbrauchte Lösung und Waschwasser und die Eluate
1, 2 und 3 wurden durch Papierelektrophorese bei pH 4,0 analysiert,
wobei der Versuch eine Stunde bei 1000 Volt Gleichstrom durchgeführt wurde. Das Papierchromatogramm wurde getrocknet,
gegenüber Ammoniak ausgesetzt, um die Säure zu neutralisieren und auf einer mit Proteus vulgaris (MB-838) beimpften
Mhragarplatte inkubiert. Die Prüfung nach 17-stündiger
Inkubierung bei' 370C ergab zwei Inhibierungszonen in dem
Beschickungsmaterial (in Richtung der Anode), lediglich eine einzige Komponente (leichter als die beiden) in der verbrauchten
Lösung und den Ameisensäureeluaten und eine einzige Komponente in dem zweiten Chlorwasserstoffsäureeluat, die der
schnelleren Komponente in der Beschickung entsprach. Die folgende Tabelle zeigt den Gesaintfeststoff und die biologischen
Versuchsdaten:
- 22 -
1Q98S2/1884
14040
Beschickung
Masse Volumen gesamte biolo- Produkt(e)
gische Einhei-
ten -
20 g 200 ml 60 000 Einhei- Ia und Ib
ten
verbrauchte Lösung und Waschlösung 11,15 g 500 ml
7 500 Einheiten ITd
Ameisensäure-
eluat 4,52 g 1000 ml 20 000 Einheiten Ib
erstes Chlorwas-
serstoffsäure-
eluat
500 ml
1 000 Einheiten —
zweites Chlorwasserstoff säureeluat 2,10 g 500 ml 10 000 Einheiten Ia
Diese Fraktionen wurden durch Adsorption auf Amberlite XAD-2
Harz gewonnen, um 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(amethoxy-p-sulfooxycinnan]oyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(la) abzutrennen und dieses wurde durch eine 50 $ige Lösung aus Methanol und Wasser eluiert, wobei praktisch
reines Produkt (Ia) erhalten wurde.
Abtrennung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy- i
p-s-ulfooxycinnamoyloxyiiiethyl)-7-n3ethoxy-3-cepheiD-4-carbonsäu- '
re aus dem Antibiotikumgemisch ' \
5,0 g eines gemäß Beispiel 1, Stufe D erhaltenen Gemisches aus j
7ß-(D-5-Airiino-5-carboxyvaleran]ido)-3-(cc-methoxy-p-sulfoox3'rcinnamo3'-lox3T!7etliyl)-"7-me&ioxy-3-cephen!-4-carbonsäure
(la) und | 7ß~(D-5-Anino-5-carboxyvaleramido)-(a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-rjethox3'-_3_eephem-4-carbonsäure
(Ib) wurden in . · 2Ό ml einer 20 ^igen Lösung aus Aceton und Wasser gelöst und ί
der pH-V/ort auf 4,0 eingestellt. Diese Lösung wurde auf ein
Bett aus Amberlite XAD-2 Adsorbens von 5 era Durchmesser χ 100 cm
Höhe in 20 c/>iger Aceton und Wasserlösung aufgegeben. Eine Lö- \
- 2.3 -
109882/188Λ
14040
sung aus 20 % Aceton und Wasser wurde durch das Bett mit einer
Geschwindigkeit von 880 ml/h gepumpt, und es wurden 20 ml-Fraktionen
automatisch gesammelt.
Scheiten-Plattenversuche gegen Proteus vulgaris (MB-838) erfolgten
hei jeder dritten Fraktion unter Verwendung von Scheihen von 6,3 mm (0,25 inch). Die Zonendurchmesser sind im fol-
genden | aufgeführt: | messer | 0 | 8 | Fraktion | Zonen | Fraktion | Zonendurch |
Fraktion Zonendurch- | 1 O mm | . 8 | durch | messer ! | ||||
±ii mm OO |
8 | messer | ||||||
C.C. 25 OQ |
131 | 0 | 221 | 18 | ||||
1-41 | 31 35 7A |
134 | 0 | 224 | 18 | |||
44 | pU OP. |
137 | 0 | 227 | . 18 | |||
47 | on | 140 | 8 | 230 | 17 | |||
50 | c. I 25 24 OT, |
143 | 11 | 233 | 17 | |||
53 |
C.L·
on |
146 | 13 | 236 | 15 | |||
56 | cX) ~\ Ω |
149 | 13 | 239 | 15 -j | |||
59 | iy | 152 | 15 | 242 | 15 I | |||
62 | J.D -I Λ |
155 | 15 | 245 | 15 | |||
65 | J~4 13 13 η 1Z - |
158 | 16 | 248 | 14 ι | |||
68 | -I Λ | 161 | 17 | 251 | 14 | |||
71 | i-4 | 164 | 18 | 254 | 14 ! | |||
74 | J-P | 167 | 17 | 257 | 13 ; | |||
77 | 13 | 170 | 18 | 260 | 13 | |||
80 | 11 | 173 | 20 | 263 | 12 : | |||
83 | 10 | 176 | 21 | 266 | 12 ! | |||
86 | 9 | 179 | 21 | 269 | 12 : | |||
89 | 182 | 21 | 272 | 11 | ||||
83 | 185 | 21 | 275 | 11 | ||||
95 | 188 | 22 | 278 | 10 | ||||
98 | 191 | 23 | 281 | 10 | ||||
101 | 194 | 23 | 284 | 9 | ||||
104 | 197 | 23 | 287 | 8 | ||||
107 | 200 | 22 | 290 | o ..: | ||||
110 | 203 | 24 | 293 | 0 | ||||
113 | 206 | 24 | 296 | 0 | ||||
116 | 209 | 24 | 299 | 0 | ||||
119 | 212 | 24 | 302 | 0 | ||||
122 | 215 | 24 | ||||||
125" | 218 | 19 | 330 | 0 | ||||
128 |
24 -
09882/18 8
Die Fraktionen 44 bis 90 wurden vereinigt, Aceton wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt und das wässerige Konzentrat wurde
gefriergetrocknet, wobei 3,3 g rohe 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(la) erhalten wurden.
Die Fraktionen 150 bis 225 wurden vereinigt und nach ähnlicher Behandlung erhielt man 700 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ib).
Eine Wiederholung des obigen Versuches ergab 3,1 g rohe 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oi;-niethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(la) und 400 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ib). -
Die beiden Mengen an 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(amethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(la) die nach dem obigen Verfahren erhalten wur^
den, wurden vereinigt und die 6,4 g des Materials wurden auf ein Bett aus Amberlite XAD-2 Adsorbens von 5 cm Durchmesser
χ 100 cm Höhe in einer 5 $igen lösung aus Methanol und Wasser
aufgegeben. Eine 5 $ige Methanol- und Wasserlösung wurde durch das Bett mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 880 ml/h
gepumpt, und es wurden 20 ml-Fraktionen automatisch gesammelt. 287 Fraktionen wurden gesammelt und jede vierte Fraktion wurde
nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris (MB-838) unter Verwendung von Scheiben von 6,3 mm (0,25 inch)
untersucht. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle
aufgeführt. Die Fraktionen 1 bis 50 wurden nicht untersucht .
109882/1384
14040 | Zonengröße | Fraktion | 2132357 | Zonengröße |
Fraktion | 23 mm | 115 | 20 | |
51 | 26 | 119 | 20 | |
55 | 23 | 123 | 19 | |
59 | 18 | 127 | 18 | |
63 | 12 | 131 | 19 | |
67 | 0 | 155 | 16 | |
71 | 0 | 139 | 17 | |
75 | 0 | 143 | 15 | |
79 | 7 | 147 | 16 | |
83 | 9 | 151 | 15 | |
87 | 13 | 155 | 13 | |
91 | 19 | 159 | 11 | |
95 | 21 | 163 | 9 | |
99 | 22 | 167 | 0 | |
103 | 22 | 171 | 0 | |
107 | 21 | 287 | 0 | |
111 | ||||
Die Fraktionen 95 "bis 159 wurden vereinigt, das Methanol wurde
im Vakuum abgedampft und das wässerige Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei 700 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido
)-3-(a~meth.oxy-p-sulfooxycinnamoyloxyinet]iyl)-7-met]ioxy-3~
cephem-4-carbonsäure (la) erhalten wurden. Das Ultraviolettspektrum
von 7ß-(D-5--Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a~methoxyp-sulfooxycinnamoyloxyiaethyl)-7-methoxy-3-cephera-4-carbonsäure
(la) ergab folgende Adsorptionsdaten: · ·
UV-Adsorption in 0,In-HCl λ max 285 E^ cm 160
UV-Adsorption in 0,In-UaOH imax 277 E^ cm 166
Bei der Prüfung mit Scheiben von 13 mm (0,5 inoh) DurchraesBer
nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris ergab '-die
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(a-methoxy~p-Bulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ia)-
-_26 - :
Ϊ0988 2/188 4
Probe eine 25 nan Zone "bei 88 mcg/ml und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalerainido)-3-(o:-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-car'bonsäure
(Ib) ergab eine 25 mm Zone j
bei 167 mcg/ml.
Beispiel 4
Gereinigtes Gemisch aus 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-metlioxy-3-cephem-4-carbonsäure
und 7ß-(D-5-Amino-5-carTboxyvaleramido)-3-to:-
methoxy-p-hydroxycinnamoylox^ethy^^-methoxy^-cepheiil··^-
carbonsäure
Das 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cepliem-4-carbonsäure
1 und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxy-p-hydroxy- ■,
cinnaiDoyloxymethyl)-7-methoxy~3-cephem-4-carbonsäure enthaltende
Konzentrat nach Beispiel 1, Stufe B wurde auf 1500 g -j DEAE Sephadex A-25 Anionenaustauschharz unter ansatzweisem '
Rühren während 16 Stunden bei 0° bis 50C adsorbiert. Das Harz ■
wurde abfiltriert, mit drei 20 Ltr.-Portionen kaltem Wasser '
gewaschen und dann in eine Kolonne gegeben. Das Antibiotikumgemisch wurde durch Eluierung mit 3 tigern Ammoniurachlorid in
70 tigern wässerigem Methanol gewonnen, und es wurden 3,8 Ltr.-Fraktionen
gesammelt. Die aktiven !Fraktionen 3 bis 7 wurden vereinigt und unter Vakuum konzentriert, wobei ein 3>8 Ltr.-Anteil
erhalten wurde, der 625 g !Feststoffe enthielt. Dieser Anteil (3,8 Ltr.) wurde auf eine 20 Ltr.-Kolonne mit
Dowex 50 X 2 Harz (Wasserstoffzyklus) gegeben. Die Kolonne
wurde mit Wasser bei 50 ml/Min, entwickelt und es wurden 2 Ltr.-Fraktionen des ausströmenden Gutes gesammelt und untersucht.
Die wirksamen Fraktionen 6 bis 33 wurden vereinigt, zu 4 Ltr. durch Eindampfen im Vakuum konzentriert und gefriergetrocknet,
v:obei 41 g eines gereinigten Gemisches aus '7ß-(D-5-Ajaino-5-carbcxyvalera.Eiicio)-3-(«-methoxy-p-sulfooxyc.irmamoyloyyristhyl)-7-iaethoxy-3-cepheffi-4-carbonsaure
ur-d 7ß- (D-5-Ai:i.ii2G- ^-carboiiyvalera:; Iuο )-3- (a-metlioxy-p-hyd:» o:-:ycinnamoylj.xy:;;c
!:hyl)-7--Tnethoxy--"~':cT;];-r;;:»4-cai-bonEäure r-rhaltcn
wurden. - 27 -
109882/18 8 Λ BAD ORIGINAL
Scheiben-Plattenversuche gegen Proteus vulgaris (MB-838)
erfolgten mit dem Ausgangskonzentrat und mit dem gereinigten Gemisch. Mit dem Ausgangskonzentrat wurde eine
25 mm-Zone bei 0,30 mg/ml erhalten. Das gereinigte Gemisch ergab eine 25 mm-Zone bei 0,033 mg/ml.
erfolgten mit dem Ausgangskonzentrat und mit dem gereinigten Gemisch. Mit dem Ausgangskonzentrat wurde eine
25 mm-Zone bei 0,30 mg/ml erhalten. Das gereinigte Gemisch ergab eine 25 mm-Zone bei 0,033 mg/ml.
Die Verbindungen (I) der Erfindung wurden mit dem 5-Amino-5-carboxyvaleramido-Anteil
in der ß-Konfiguration mit Bezug auf den Cephemkern beschrieben. Diese Bezeichnung basiert
auf zur Zeit zur Verfügung stehenden Informationen, jedoch soll keine Bindung an die räumliche Konfiguration bestehen für den Fall, daß durch spätere Informationen nachgewiesen wird, daß sie unkorrekt ist.
auf zur Zeit zur Verfügung stehenden Informationen, jedoch soll keine Bindung an die räumliche Konfiguration bestehen für den Fall, daß durch spätere Informationen nachgewiesen wird, daß sie unkorrekt ist.
- 28 -
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Claims (20)
14040 3
Patentansprüche
Verfahren zur Gewinnung und Reinigung eines Antibiotikumgemisches,
das 7S-(I>-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-.methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-
4-carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-Came thoxy-p-hydroxyc innamoyl oxymethyl )-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
enthält sowie zur Trennung der beiden Komponenten voneinander, dadurch gekennzeichnet, daß eine verunreinigte
Lösung des Gemisches mit einem Anionen- oder Kationenaustauschharz oder mit einem nicht-ionischen Polymeren
in Berührung gebracht wird, das Adsorbat mit einem Lo-. sungsmittel eluiert wird, die Eluate gesammelt und die aktiven
Fraktionen vereinigt werden und das so erhaltene gereinigte Gemisch entweder isoliert oder gegebenenfalls in seine
Hauptbestandteile durch chromatographische Mittel getrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Anionenaustauschharz ein von Dextran abgeleitetes
Anionenaustauschharz in seiner Chloridform oder ein von einem Acrylcopolymeren abgeleitetes Anionenaustauschharz
verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Anionenaustauschharz ein von einem vernetzten Acrylcopolymeren,
das ein schwach-basisches tertiäres Amin aufweist, abgeleitetes Anionenaustauschharz verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als nicht-ionisches Polymeres ein vernetzter Polystyrol-
- 29 109882/1884
14040
polymersorbent verwendet wird.
5. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, j
daß ein Kationenaustauschharz verwendet wird, das aus am j
Kern betindlichen Sulfonsäuregruppen, die mit einer Styrol-\
Divinylbenzolmatrix verknüpft sind, aufgetaut ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Eluierlösung Wasser, eine wässerige alkoholische
Lösung, eine wässerige alkoholische Lösung eines oder mehrerer Salze oder eine wässerige Lösung einer Mineralsäure
verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Eluierlösungsmittel eine Lösung aus lm-Natriunmitrat
und O,lm-lSFatriumacetat verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
* t
daß die Fermentationsbrühe des verunreinigten Antibiotikum-; gemisches einen pH-Wert von etwa 2 Ms 7 aufweist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das so erhaltene verunreinigte Gemisch in seine Komponenten
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-inethoxyp-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-niethoxy-3-cephein-4-carbonsäure
und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-hydr
oxycinnamoyl oxyme thyl)-7-methoxy-3-c ephem-4-c art» onsäure
getrennt wird, indem das Gemisch mit einem Anionenaustauschharz
in Berührung gebracht wird oder mit einem schwach basischen Ionenaustauschharz unter sauren Bedingungen
in Berührung gebfacht wird oder mit nicht-ioniscliem
vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht wird und anschließend das erhaltene Adsorbat mit einem Lösungsmittel
eluiert wird und zwei Eluatfraktionen, welche die beiden höchsten Antibiotilaunkonzentratiöneii enthalten,
gewonnen werden.
- 30 _-
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10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet,
daß als Anionenaustauschharz ein stark hydrophiles oder ein schwach-basisches Anionenaustauschharz unter sauren Bedingungen verwendet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß die erste Eluatfraktion, welche die erste Konzentration an Antibiotikum enthält, mit einem nicht-ionischen
vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht wird und mit einer wässerigen alkoholischen lösung unter
Erhalt von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure eluiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Eluatfraktion, welche die zweite Konzentration an Antibiotikum enthält, mit einem nicht-ionischen
vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht wird und mit einer alkoholischen wässerigen lösung unter
Erhalt von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure eluiert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch mit einem von Dextran in seiner Chloridform
abgeleiteten Anionenaustauschharz in Berührung gebracht wird.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Eluatfraktion mit einem nicht-ionischen vernetzten
Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht wird. ■
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch, gekennzeichnet,
daß die zweite Eluatfraktion mit einem nicht-ionischen vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht wird,
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14040 $
16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
daß als Eluiennittel eine Lösung aus Methanol und Wasser
verwendet wird.
17. Verfahren nach Anspruch 1 zur Trennung und Reinigung; von 7ß-(B-5-Amino-5-carboxyvalerajnido)-3-(a-methoxy-p-sulfo- ·
oxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure aus einem Antibiotikumgemisch, dadurch gekennzeichnet, daß ein
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy~3-cephem-4-carbonsäure
und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-car'bonsäure
enthaltendes Gemisch mit einem Anionenaustauschharz in Berührung gebracht wird, das Adsorbat mit einem Lösungsmittel
eluiert wird, die Eluatfraktionen gesammelt werden, die Fraktionen mit einem nicht-ionischen vernetzten Polystyrolpolymersorbent
in Berührung gebracht werden und die Adsorbate mit einer wässerigen alkoholischen Lösung eluiert werden.
18. Verfahren nach Anspruch 17} dadurch gekennzeichnet,
daß als Anionenaustauschharz ein vernetztes Aerylcopolymeres, das ein schwach-basisches tertiäres Amin enthält,
verwendet wird.
19. Verfahren zur Gewinnung und Reinigung eines Antibiotikumgemisches,
das 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(a-iriethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
und 7ß-(D-5~Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(«- methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-inethoxy-3-cepliem-4-carbonsäure
aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß eine verunreinigte Lösung dieses Geraisches mit einem Anionen- oder
Kationenaustauschharz oder mit einem nicht-ionischen Polymeren in Berührung gebracht wird, das Adsorbat mit einem
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Lösungsmittel eluiert wird, die Eluate gesammelt werden
und die aktiven Fraktionen vereinigt werden.
20. Verfahren zur Trennung von 7ß-(D^-Amino-S-carboxy- ι
valeramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7- j
meth.oxy-3-cephem-4-carbonsäure und 7ß-(D^-Amino-S-carboxy- !
valeramido)-3-(ct-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
aus einem dieselben enthal- j tenden Gemisch, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch mit ;
einem Anionenaustauschharz oder mit einem nicht-ionischen vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht
wird, das Adsorbat mit einem Lösungsmittel eluiert wird, die Eluatfraktion, welche die beiden höchsten Konzentrationen
an Antibiotikum enthält, gewonnen wird, die !"raktionen
mit einem nicht-ionischen vernetzten Polystyrolpolymersorbent in Berührung gebracht werden und die Adsorbate
mit einem Lösungsmittel unter Erhalt der gewünschten Produkte eluiert werden.
- 33 -
1 09882/1884
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US3887549A (en) * | 1971-11-19 | 1975-06-03 | Merck & Co Inc | Process for preparing 7-acylamido-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid, esters and salts |
US3852277A (en) * | 1972-08-02 | 1974-12-03 | Merck & Co Inc | 3-{8 ({60 -methoxy-4-substituted cinnamoyl)oxymethyl{9 -7-acylamidoceph-3-em-4-carboxylic acids |
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