DE2604697A1 - Antibiotika - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D503/00—Heterocyclic compounds containing 4-oxa-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxapenicillins, clavulanic acid derivatives; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
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Description
Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann - Dr. R. Koenigsberger Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipl.-lng. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun.
260A697
TELEX 529979 TELEGRAMME: ZUMPAT
8 MÜNCHEN 2.
.Antibiotics 2/3 12/10/DE
GIAJO LABORATORIES LIMITED, Greenford, Middlesex, England
Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, seine Salze und
ein Verfahren zu deren Herstellung in reiner 5Orm.
Es ist bekannt, daß bei der Fermentierung von Streptomyces
clavuligerus und insbesondere des Stammes ITREL 3585 eine Anzahl
von antibiotischen Substanzen gebildet wird. Die britische Patentschrift 1 315 177 beschreibt die Kultivierung von Streptomyees
clavuligerus, Stamm HURL 3585, bis zur Herstellung einer
wesentlichen Menge von zwei Antibiotika, die als Antibiotika A 16886 I und A 16886 II bezeichnet werden.
Es wurde nun gefunden, daß ein weiteres Antibiotikum aus diesem Organismus erhalten werden kann, nämlich (2R,5R,Z)-3~(2-Hydroxy-
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äthyliden)-7-oxo-4-oxa-1 -azabicyclo-/!?, 2, Q7-h.eptan-2-carbonsäure
der Pormel I
CH2OH
die im folgenden zweckmäßig als "Clavulansäure" ("clavulanic acid") bezeichnet wird. Die vorliegende Erfindung umfaßt diese
Verbindung und ihre Salze.
Erfindungsgemäße Salze umfassen die Alkalimetallsalze, z.B.
Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze; Erdalkalimetallsalze, z.B. Calcium-, Magnesium- und Bariumsalze; die Ammoniumsalze; und
Salze organischer Basen, beispielsweise Salze, die sich ableiten von primären, sekundären, tertiären, ff-quaternären Aminen, z.B.
mono-, di- oder tri-Alky!ammoniumsalze, wie Methy!ammonium- und
Tri^Äthylammoniumsalze und Salze heterocyclischer Basen, wie
Piperidiniumsalze.
Die Salze anorganischer Basen und die meisten Salze der organischen
Basen sind im allgemeinen in wässriger Lösung stabiler als die freie Clavulansäure. Die Salze können in Form von Solvaten
vorkommen, z.B. mit Wasser und/oder Kristallisationslösungsmittel.
Clavulansäure und ihre Salze wurden in einer Reinheit von mindestens
75 io und im allgemeinen mindestens 85 i>
erhalten, d.h. mit nicht über 25 i> und im allgemeinen nicht über 15 ^, bezogen
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auf das Gewicht, an Verunreinigungen und Isomeren, die von der Herstellung stammen.
Darüberhinaus war es möglich, nach den im folgenden beschriebenen
Techniken Clavulansäuresalze in sogar höherem Reinheitsgrad zu erhalten, -die im wesentlichen frei von Verunreinigungen und Isomeren
von der Produktion war und beispielsweise eine Reinheit von 98 io oder darüber aufwies, das heißt, weniger als 2 Gew.-^
an Verunreinigungen oder Isomeren von der Herstellung enthielt. Es wurden so Lithium clavulanat und verschiedene andere Clavulanatsalze
in kristalliner Form erhalten. Die Salze waren im wesentlichen rein, was ihre molaren Extinktionskoeffizienten, bestimmt
bei 259+1 mn in 0,1 m wässrigem Natriumhydroxid von mindestens
16 200 zeigten. Die molaren Drehungen ßQ-^ -Werte in wässriger
lösung betrugen mindestens +137°iySie freie Säure, hergestellt
aus ihren Salzen, zeigt einen Extinktionskoeffizienten E1^V1 in
■^•i PRQ -ητπι »Cm
0,1 m wässrigem Matriumhydroxi&Yvon 590 oder darüber und eine
spezifische optische Drehung [äj-^xn Dime thy lsu If oxid von etwa
+54°. Es ist ersichtlich, daß die Erzielung von Materialien dieses
Reinheitsgrades die Verwendung der Produkte in pharmazeutischen und veterinärmedizinischen Zusammensetzungen ermöglicht
und zur Anwendung der Materialien als Zwischenprodukte äußerst erwünscht ist.
Der hier verwendete Ausdruck "Reinheit" bezieht sich auf den Prozentsatz
an Clavulansäure und/oder deren Salz, bezogen auf die
vorhandenen Gesamtfeststoffe auf der Basis des Gewichts, jedoch ohne assoziiertes Wasser oder andere Lösungsmittel.
Clavulansäure und ihre Salze haben eine antibakterielle Wirksamkeit
gegenüber einem Bereich von gramnegativen und grampositiven Mikroorganismen, beispielsweise gegen Stämme von Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella '
eonnei,, Enterobacter cloacae, Klebsiella aerogenes, Proteus mi-.
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rabilis, Proteus morgaxiii, Serratia maroescens, Providencia
Species, Citrobacter koseri, Haemophilus influenzae und Bacteroides Species.
Species, Citrobacter koseri, Haemophilus influenzae und Bacteroides Species.
Clavulansäure und ihre Salze sind stabil gegen die Einwirkung
von ß-Iiactamasen, die von grampositiven Organismen erzeugt werden, beispielsweise solche, erzeugt von Staphylococcus aureus
und Bacillus cereus und gegen ß-Laetamasen, die von gramnegativen Organismen erzeugt werden, die in den Klassen I-Y, von
Richmond, M.H. und Sykes, R.B. (1973) beschrieben werden. ("The ß-lactamases of gram-negative bacteria and their possible physiological role", Advances in Microbial Physiology, 9, 31-88).
von ß-Iiactamasen, die von grampositiven Organismen erzeugt werden, beispielsweise solche, erzeugt von Staphylococcus aureus
und Bacillus cereus und gegen ß-Laetamasen, die von gramnegativen Organismen erzeugt werden, die in den Klassen I-Y, von
Richmond, M.H. und Sykes, R.B. (1973) beschrieben werden. ("The ß-lactamases of gram-negative bacteria and their possible physiological role", Advances in Microbial Physiology, 9, 31-88).
Clavulansäure und ihre Salze besitzen auch die Eähigkeit, ß-Lactamaseenzyme
zu inhibieren, die von grampositiven Organismen erzeugt werden, beispielsweise solche, die von Stämmen von Staphylococcus
aureus und Bacillus cereus erzeugt werden und auch die Enzyme der Klassen H-T aus gramnegativen Bakterien, erzeugt
von Organismen wie Stämmen von Proteus mirabilis, Escherichia
coli, Proteus morganii, Klebsiella aerogenes, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei und Haemophilus influenzae.
von Organismen wie Stämmen von Proteus mirabilis, Escherichia
coli, Proteus morganii, Klebsiella aerogenes, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei und Haemophilus influenzae.
Eine Anzahl der Enzyme der Klasse I werden auch inhibiert, beispielsweise
solche, die erzeugt werden von Stämmen von Bacteroides fragilis, Proteus vulgaris, Proteus morganii, Proteus rettgeri,
Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Providencia Species, und Hafnia alvei. So weisen Clavulansäure und ihre Salze die
Fähigkeit auf, ß-lactamaseempfindliche ß-Lactamantibiotika vor
der ß-Lactamasehydrolyse zu schützen.
Fähigkeit auf, ß-lactamaseempfindliche ß-Lactamantibiotika vor
der ß-Lactamasehydrolyse zu schützen.
Clavulansäure und ihre Salze sind interessant zur Anwendung in
Verbindung mit ß-lactamantibiotika, die empfindlich gegen ß-Laetamasen sowohl von grampositiven als auch von gramnegativen Organismen sind.
Verbindung mit ß-lactamantibiotika, die empfindlich gegen ß-Laetamasen sowohl von grampositiven als auch von gramnegativen Organismen sind.
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Im allgemeinen wird es bevorzugt, Clavulansäuresalze
mit einer Reinheit von mindestens 98 $, d.h. mit einem Gehalt
von weniger als 2 fo Verunreinigungen an Isomeren, die von der
Produktion stammen und sich von Lösungsmitteln unterscheiden, in Verbindung mit einem Breitspektrum-ß-Lactamantibiotikum, zu
verwenden.
Im allgemeinen können Clavulansäure und ihre Salze in Kombination
mit ß-Lactamantibiotika verwendet werden, die normalerweise entweder
oral oder parenteral verabreicht werden. Beispiele für oral absorbierbare Breitspektrum-ß-Lactamantibiotika umfassen
Cephalexin, Cephaloglycin, Ampicillin und Amoxycillin und ihre oral absorbierbaren Ester, z.B. die Acyloxymethyl- und Phthalidylester
und die oral absorbierbaren Ester von Carbenicillin und
Ticarcillin, z.B. die Indanyl- und Phenylester. Breitspektrum-ß-Lactamantibiotika,
die oral nicht absorbiert werden, umfassen Carbenicillin, Ticarcillin, Cephalothin, Cephaloridin, Cefazolin,
Cephacetril und Cephapirin. Beispiele für ß-Lactamantibiotika mit engem Spektrum sind Penicillin G- und Penicillin V.
Kombinationen von Clavulansäure und ihren Salzen mit beispielsweise
Penicillin G-, Penicillin Y, Ampicillin, Amoxycillin, Carbenicillajssyo&er
Ticarcillin zeigen eine synergistische Aktivität
gegen ß-Lactamase produzierende Stämme von Staphylococcus aureus. Kombinationen von Clavulansäure und ihren Salzen mit beispielsweise
Penicillin G, Penicillin V, Ampicillin, Amoxycillin, Carbenicillin, Ticarcillin, Cephalexin, Cephaloglycin, Cephalothin,
Cephaloridin, Cefazolin, Cephacetril und Cephapirin zeigen eine synergistische Aktivität gegen ß-lactamase-produzierende Stämme
von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Bacteroides fragilis,
Proteus morganii und Proteus vulgaris.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung werden daher pharmazeutische
Zusammensetzungen (einschließlich veterinärmedizinischer
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Zusannnensetzungen) geschaffen, die Clavulansäure oder bevorzugter
ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, z.B. das Natrium-Salz
dieser Säure und/oder ein Salz, das weniger als 2 fo an Verunreinigungen
oder Isomeren enthält, die von lösungsmitteln unterschiedlich sind und aus der Herstellung stammen, enthalten.
Aufgrund der vorstehend beschriebenen Schutzwirkung können die Zusammensetzungen vorteilhaft weitere ß-Lactamantibiotika enthalten.
Die Zusammensetzungen enthalten normalerweise auch einen pharmazeutischen, (einschließlich veterinärmedizinischen) !Träger
oder Exzipienteni
Die Zusammensetzungen können zur oralen, parenteralen, rectalen oder topischen Verabreichung formuliert werden.
Die Zusammensetzungen können beispielsweise die Form von Pulvern, Tabletten, Kapseln, Pastillen bzw. Bonbons, Lösungen und Sirups
einnehmen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, und können beispielsweise Stärke, Lactose, Talk, Magnesiumstearat, Gelatine,
destilliertes ¥asser und Suspendiermittel, Dispergiermittel, Emulgiermittel, geschmackgebende oder färbende Mittel enthalten.
Clavulansäure und ihre Salze können auch zur parenteralen Verabreichung
formuliert werden, wobei diese Verabreichungsmethode bevorzugt ist. Die Verbindungen können so in Ampullen zur Aufbereitung
vor der Anwendung formuliert werden, gegebenenfalls zusammen mit einer weiteren ß-Lactam-Antibiotikum-Verbindung.
Im allgemeinen beträgt das öewichtsverhältnis von Clavulansäure
oder ihrem Salz zu einem zu schützenden ß-Lactamantibiotikum 10:1 bis 1:10, bevorzugt 5:1 bis 1:5 und insbesondere 2:1 bis 1:2.
Hach einem weiteren Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren
zur Bekämpfung von Infektionen geschaffen, die durch grampositive und/oder gramnegative Organismen bewirkt v/erden, wobei eine
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wirksame Menge von Clavulansäure oder bevorzugt eines pharmazeutisch
verträglichen Salzes davon, wobei diese Säure und/oder das Salz davon weniger als 2 fo Terunreinigungen oder Isomere enthalten,
die von !lösungsmitteln unterschiedlich sind und von der Herstellung
stammen, an einen Menschen oder ein Tier entweder prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht werden.
Im allgemeinen wird das aktive Material aus den vorstehenden Gründen in Verbindung mit einem weiteren ß-Lactamantibiotikum
verabreicht.
Die Clavulansäure und/oder das Salz können an Erwachsene in Dosierungen
von 100 mg bis 6 g, 2 bis 4-mal täglich verabreicht werden. Enthält die Zusammensetzung ein weiteres ß-Lactamantibiotikum,
so beziehen sich die vorstehenden Mengen auf die Gesamtmenge des vorhandenen ß-Lactamantibiotikums. Die bevorzugte
Dosis für Clavulansäure und/oder deren Salz, allein oder in Verbindung mit einem weiteren ß-Lactamantibiotikum verabreicht,
liegt bei 250 mg bis 1 g, verabreicht 2- bis 4-mal täglich.
Eine weitere Anwendbarkeit für Clavulansäure und ihre Salze ist die Herstellung von Derivaten, wie Estern, beispielsweise durch
Reaktion der Säure mit einem Diazoalkan, wie Diazomethan oder eines Salzes der Säure mit einem Alkylhalogenid, z.B. Methyljodid.
Clavulansäure und ihre Salze können aus der Permentationsbrühe,
hergestellt durch Kultur gemäß dem britischen Patent 1 315 177,
eines Stammes von Streptomyces clavuligerus, z.B. des Stammes NRRL 3585, oder einer Mutante davon, isoliert werden, wobei die
Isolierung unter Anwendung von Fraktioniertechniken zur Entfernung unerwünschter Komponenten aus der Brühe, wie Proteine und
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Enzyme und insbesondere anderer ß-lactamantibiotika durchgeführt
wird. Jedoch ist eine derartige Reinigung unter Anwendung übli- ■
eher lechniken schwierig, insbesondere aufgrund des ähnlichen
Verhaltens der verschiedenen vorhandenen ß-lactamcarbonsäuren,
wie die Antibiotika A 16886 I und II, die vorstehend erwähnt wurden.
Es wurde nun gefunden, daß die Isolierung des Antibiotikums durch Umwandlung der Clavulansäure oder eines ihrer Salze in
Lithiumclavunalat und Ausfällung des letzteren, normalerweise in kristalliner Form, sehr erleichtert wird. Eine derartige Ausfällung
kann möglicherweise aufgrund einer überraschend hohen Affinität der CIavulanationen für Idthiumionen, mit einer geringen
oder unwesentlichen Kopräzipitation.von Verunreinigungen, insbesondere
von anderen ß-Lactamen, durchgeführt werden. Darüberhinaus kann durch direkte Isolierung eines Salzes, wobei die Umwandlung
von Clavulansäure in organische Derivate, wie Ester, mit anschließender erneuter Umwandlung in die Säure, z.B. durch
Reduktionstechniken, eine Umlagerung der Clavulansäure in Isomere verhindert werden. Es hat sich gezeigt, daß die reduktive Spaltung
von Estern der Clavulansäure bis zu 15 $>
an isomerem Material erzeugen kann.
Es sei festgestellt, daß in Fermentationsbrühen und anderen Lösungen,
die etwa bei neutralem pH-Wert vorliegen, Clavulansäure und Salze, die mit einem oder mehreren Kationen gebildet v/erden,
im Gleichgewicht vorliegen und Isolierarbeitsgänge häufig an Clavulansäure und/oder Salzen davon ausgeführt werden, je nachdem
pH-Wert und anderen Bedingungen. Im allgemeinen sind Clavulansäure und ihre Salze ziemlich instabil in wässrigen lösungen
außerhalb des pH-Bereiches 5,5 bis 8 und es ist daher während der nachstehenden Arbeitsgänge erwünscht, den pH-Wert innerhalb
dieses Bereiches und vorzugsweise in der ITähe von etwa 6,5 zu
halten, falls dies nicht anders angegeben wird.
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Entfernung von verschmutzenden Verunrei-
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nigungen aus Clavulansäure der Formel I und/oder einem Salz davon geschaffen, wobei die Säure und/oder das Salz mit einer
wässrigen ionischen Lithiumverbindung umgesetzt wird, wobei man eine wässrige lösung erhält, die Lithiumclavulanat enthält, das
anschließend ausgefällt wird, worauf die Ausfällung von dieser wässrigen lösung abgetrennt wird.
Tm allgemeinen ist die ionische Lithiumverbindung ein Salz. Bevorzugt
ist Iiithiumchlorid, jedoch sind Idthiumbromid, -jodid
oder -sulfat oder Lithiumcarboxylate, wie das Acetat, Propionat,
Pormiat, Benzoat oder Laetat, auch geeignet. Die Wahl des Salzes
kann von den anderen vorhandenen Materialien beeinflußt v/erden. Ist beispielsweise das ursprünglich vorhandene Clavulansäuresalz
das Bariumsalz, so kann es bevorzugt sein, Lithiumsulfat zu verwenden, um zunächst eine Ausfällung von Bariumsulfat, vor
der Ausfällung des Lithiumclavulanats zu bewirken.
Im allgemeinen ist·es bevorzugt, vor der Ausfällung eine Konzentration
von Lithiumclavulanat von mindestens 0,1 Gew.-$, vorzugsweise
mindestens 2 $ zu verwenden und höhere Konzentrationen, beispielsweise bis zu 12 /α oder sogar bis zu 20 $, bezogen auf
das Gewicht, ergeben natürlich größere prozentuale Gewinne.
Das ursprünglich vorhandene Salz der Clavulansäure, das gereinigt werden soll, kann beispielsweise ein Alkalimetallsalz,
(wie das Natrium- oder Kaliumsalz oder auch das Lithiumsalz, falls dieses als eine geringere Komponente des Clavulansäurematerials
vorliegt), ein Erdalkalimetallsalz (z.B. das Calcium-, Barium- oder Magnesiumsalz) oder das Salz einer organischen
Base, wie vorstehend beschrieben, oder ein Salz, gebildet mit einem basischen Ionenaustauscherharz, sein. Die gefundene Möglichkeit,
daß Lithiumclavulanat leicht in hohem Reinheitsgrad ausfällt, kann in verschiedener Weise ausgenutzt werden.
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Wach einer Ausführungsform des Verfahrens kann die -wässrige Lösung,
die Lithiumclavulanat enthält, auch eine ausreichende Menge einer ionischen Lithiumverbindung enthalten, gewöhnlich das Lithiumsalz,
das zur Bildung des Lithiumclavulanats verwendet wird, um letzteres durch Anheben der Konzentration der Lithiumionen
auszusalzen, so daß das Löslichkeitsprodukt von Lithiumclavulanat bei der jeweiligen Temperatur stark überschritten wird. Da das
Clavulanat bei niedrigen !Temperaturen geringer löslich ist, ist es im allgemeinen zweckmäßig, die Temperatur der Lösung zur maximalen
Ausfällung zu verringern, beispielsweise auf etwa 0-50C.
ein derartiges Aussalzen liegt die Konzentration der ionischen Lithiumverbindung in der wässrigen Lösung, die das Lithiumclavulanat
enthält, vorzugsweise im Bereich von 4 m bis 10 m, obwohl Konzentrationen bis zur Sättigung anwendbar sind; ein
besonders bevorzugter Bereich liegt bei 5 m bis 8 m.
Es kann vorteilhaft sein, nach Abtrennung eines ersten Anschusses von Lithiumclavulanat weiter zu konzentrieren, und eine
zweite Ausfällung zu gewinnen.
Die Lithiumclavulanat enthaltende Lösung kann einfach durch Auflösen
eines Salzes von Clavulansäure, das sich vom Lithiumsalz unterscheidet, beispielsweise eines Natrium-, Kalium-, Magnesium-,
Barium-, Calcium- oder Ammoniumsalzes, in einer wässrigen Lösung und Einbringen eines wasserlöslichen Lithiumsalzes, wie Lithiumchlorid,
gebildet werden. Im Ealle des Bariumsalzes kann die Anwendung
einer hohen Konzentration an Lithiumchlorid zu einer gewissen Kopräzipitation von Bariumchlorid mit dem Lithiumclavulanat
führen. Das Bariumchlorid kann jedoch leicht durch erneute Auflösung der Mischung in Wasser und Zugabe von Lithiumsulfat
zur Ausfällung von Bariumsulfat entfernt werden, das durch beispielsweise Filtrieren, gefolgt von einem Zusatz von Lithium-
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Chlorid, zur Ausfällung von reinem lithiumclavulanat, abgetrennt werden kann.
Nach einer besonders nützlichen Anwendung der Erfindung wird als
zunächst eingesetztes Salz der Clavulansäure ein Salz mit einem basischen Ionenaustauscherharz verwendet und dieses wird mit einer
wässrigen lösung eines lithiumsalzes in Kontakt gebracht, um eine wässrige lösung von lithiumclavulanat zu ergeben. Das Salz wird
normalerweise in Form einer Säule verwendet, die mit verunreinigter Clavulansäure und/oder einem Salz davon beladen v/ird und von
der eine wässrige lösung von lithiumclavulanat eluiert wird, unter Anwendung einer wässrigen lösung eines wasserlöslichen lithiumsalzes,
z.B. von lithiumchlorid. Das Harz wird normalerweise vor dem Eluieren gewaschen, beispielsweise mit Wasser.
Das Harz trägt im allgemeinen Amino- oder tertiäre Aminogruppen (schwach basisch) oder quaternäre Ammoniumgruppen (stark basisch).
iP olvamin—
Das Harz kann beispielsweise ein Polystyrol-, PlP^fTI^
üfolyaminj
p yy, yyfpy
üfolyamin-j
phenolisch-^Voder quervernetztes Dextranharz sein und kann makroreticulär oder mikroreticulär sein.
phenolisch-^Voder quervernetztes Dextranharz sein und kann makroreticulär oder mikroreticulär sein.
Der hier verwendete Ausdruck "Harz" soll zur Erleichterung auch Cellulosederivate und die vorstehenden Dextranderivate umfassen,
die sich von natürlich vorkommenden Polymeren herleiten. Typische schwach basische Ionenaustauscherharze umfassen Amberlite IRA68
(Mikroreticulär: Polyacrylat quervernetzt mit Diviny!benzol:
tertiäre Aminogruppen), Amberlite IEA93 (Makroreticulär: Polystyrol quervernetzt mit Diviny!benzol: tertiäre Aminogruppen),
jeweils Handelsprodukte der Rohm & Haas (U.K.) ltd.. Typische stark basische Ionenaustauscherharze umfassen Zerolit PP und
" Zerolit PP(iP) (Handelsprodukt der. Zerolit Co., ltd.).
Basische Ionenaustauscherharze liegen vorteilhaft in der Salzform vor, wenn sie mit der Verunreinigten Clavulansäure und/oder dem
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Salz in Eontakt gebracht werden; das Anion ist vorzugsweise das
gleiche wie das des als Eluiermittel verwendeten Lithiumsalzes, zweckmäßig das Chloridion, jedoch können unterschiedliche Anionen
ohne nennenswerte nachteilige Auswirkungen verwendet werden.
Die Konzentration der als Eluiermittel verwendeten wässrigen Irithiumsalze liegt vorzugsweise im Bereich von 0,02 m bis 8 m.
Jedoch ergeben die geringen Konzentrationen sehr verdünnte lösungen von Lithiumclavulanat und gestalten die anschließende
Ausfällung schwieriger. Im allgemeinen sind Konzentrationen im Bereich von 0,5 bis 2,5 m bevorzugt.
Während die Adsorptions-ZElutions-iEechniken zweckmäßig derart
durchgeführt werden, daß das gewünschte Produkt einer chromatographieartigen Abtrennung von anderem adsorbierten Material unterzogen
wird, hat es sich gezeigt, daß die nachfolgende Ausfällungsstufe derart wirksam zur Abtrennung von lithiumclavulanat von
unerwünschten Verunreinigungen ist, daß es gewöhnlich bevorzugt ist, die Kolonne unter Anwendung relativ hoher Konzentrationen
von lithiumsalz in dem Eluiermittel im wesentlichen abzustreifen. Dies ergibt ein enges Band von Clavulanat auf der Säule, das
in ein relativ geringes Tolumen von Eluat eluiert werden kann, wodurch die nachfolgende Ausfällung erleichtert wird.
Das Eluat enthält normalerweise das Lithiumsalz, z.B. Lithiumchlorid,
in einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2,5 m, wohingegen, wie vorstehend angezeigt, der Aussalzeffekt am wirksamsten
bei Konzentrationen im Bereich von 5 m bis 10m ist. Das Eluat wird daher bevorzugt konzentriert, beispielsweise durch
Verdampfen im Vakuum, z.B. um einen Eaktor von etwa 5. Die Löslichkeit
von Lithiumclavulanat in verschiedenen Konzentrationen von wässrigem Lithiumchlorid wird in der folgenden Tabelle angegeben:
(bei etwa 200C)
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- 13 Tabelle 1
Molarität von Löslichkeit von Lithiumclavu-
LiCl lanat in mg/ml (etwa)
2,5 23,5
3,75 10,2
5,0 . 4,1
6,25 1,8
7,5 0,8
Bei der vorstehenden Konzentrationsstufe wird vorzugsweise weiteres
Lithiumsalz zugesetzt, da das Lithiumclavulanat ebenfalls konzentriert wird und Verluste in der Mutterlauge so auf ein
Minimum herabgesetzt werden.
Um die Eluierung von adsorbierten Verunreinigungen von dem Harz
auf ein Minimum herabzusetzen, kann es vorteilhaft sein, in das Eluiermittel ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel
in hoher Konzentration einzubringen. Alternativ kann nach dem Eluieren in Abwesenheit eines derartigen Lösungsmittels, dieses
zu dem Eluat gefügt werden, um eluierte Verunreinigungen auszufällen
und die Ausfällung kann vor der Weiterbehandlung abgetrennt werden. Das Lösungsmittel kann beispielsweise ein Keton sein,
wie Aceton, ein Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Isopropylalkohol oder Xthylenglykol, ein Äther, wie Diozan oder Tetrahydrofuran,
oder ein substituiertes Amid, Imid oder ein Sulfoxidlösungsmittel,
wie Dimethylformamid oder Dimethy!sulfoxide Im
allgemeinen sind als derartige Lösungsmittel Alkohole bevorzugt, z. B. Äthanol oder Isopropylalkohol.
Mir eine derartige Abtrennung von unerwünschten Verunreinigungen
beträgt die bevorzugte Konzentration an Alkohol in dem Eluiermittel oder dem Eluat nach Zugabe des Alkohols 70 bis 97
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-U-
Ausfällnng von Lithiumclavulanat unter Anwendung eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels
Es sei festgestellt, daß, falls die Konzentration von mit Wasser
mischbarem organischem Lösungsmittel und Lithiumsalzen bei dem vorstehenden Arbeitsgang zu groß ist, das Lithiumclavulanat vorzeitig
ausgefällt werden kann. Es ist tatsächlich möglich, Lithiumclavulanat aus einer wässrigen Lösung durch Anwendung sehr hoher
Konzentrationen derartiger Lösungsmittel auszufällen, wodurch eine alternative Arbeitsweise geschaffen wird, die aus den Torteilen der selektiven Ausfällung von Lithiumclavulanat, wie vorstehend
angedeutet, Mutzen zieht. So können Clavulansäure und/oder ein Salz davon mit einem Lithiumsalz in einer relativ geringen
Konzentration in Kontakt gebracht werden, entweder durch Eluieren von einer Säule oder durch Auflösen der Salze in einer einzigen
Lösung, und die gewünschte Ausfällung wird ohne Konzentrieren durch Zusatz des mit Wasser mischbaren Lösungsmittels durchgeführt.
So sind beispielsweise Konzentrationen von Alkohol von mindestens 90 YoI.-$, vorzugsweise mindestens 95 $>, wirksam zur Ausfällung
von Lithiumclavulanat. Es kann notwendig sein, einen ersten Anschuß von Lithiumclavulanat zu gewinnen und anschließend im Vakuum
zu konzentrieren, z.B. etwa 4-fach, um einen zweiten Anschuß zu erzielen.
Herstellung von Salzen der Glavu!ansäure, mit einem Ionenaustauscherharz
Das vorstehend erwähnte, basische Ionenaustauscherharz kann mit der Clavulansäure und/oder dem Salz durch direkten Einsatz einer
Fermentationsbrühe,aus der das feste Material vorher entfernt wurde, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, beladen
werden. Diese Möglichkeit besteht aufgrund der beträcht-, liehen Reinigung, die durch den anschließenden Lithium-Ausfällungsschritt
bewirkt wird. Es kann jedoch bevorzugt sein, die Brühe nach der Entfernung von Feststoffen mit adsorbierender
Kohle zu behandeln, um die Clavulansäure und/oder das Salz
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zu adsorbieren· Dies hilft bei der Abtrennung anderer Salze von dem Clavulanat und vermeidet eine unerwünschte Beladung des basischen
Ionenaustauscherharzes mit unerwünschtem ionischem Material.
Im allgemeinen kann die geklärte Brühe durch ein Kohlebett, z.B. in einer Säule, geleitet werden, vorzugsweise unter Anwendung
einer gerade ausreichenden Aktivkohle bzw. Absorptionskohle, um die gewünschte Clavulansäure und/oder das Salz zu adsorbieren,
gewöhnlich in einer Menge von etwa 1 ToI.-Teil Kohle auf 3-10 VoI.-Teile
geklärte Brühe. Gewöhnliche Absorptionskohle ist geeignet
ubxL es besteht nicht die Notwendigkeit, hochaktiviertes Material
zu verwenden.
Die Absorptionskohle kann anschließend mit einem wässrigen mit Wasser mischbaren Lösungsmittel abgestreift werden, z.B. einem
Keton, wie Methyl-Äthy!keton, Methyl-Isobutylketon oder vorzugsweise
Aceton, vorteilhaft in einer Konzentration von 30 $>
bis 95 $> Keton, bevorzugt 50 bis 70 fo. Vor dem Abstreifen wird die
Kohle vorzugsweise gewaschen, beispielsweise mit Wasser, um restliche Brühekomponenten zu entfernen.
Eine weitere Variation der vorstehenden Arbeitsweise ist die Herstellung
eines Harz-Salzes von Clavulansäure, wie vorstehend beschrieben und seine Eluierung mit einem von einem lithiumsalz
unterschiedlichen Salz, z.B. einem Natrium-, Kalium-, Magnesiumoder Calciumsalz, beispielsweise einem Chlorid oder Acetat,
oder einem Ammonium- oder Pyridiniumsalz, z.B. Ammoniumformiat
oder -acetat oder Pyridinhy'drochlorid, um eine wässrige lösung des entsprechenden Clavulanats zu ergeben; ein Überschuß eines
wasserlöslichen lithiumsalzes kann anschließend zu dem Eluat
gefügt werden und lithiumclavulanat wird wie vorstehend beschrieben
ausgefällt.
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Mit Ausnahme der sehr genauen Eontrolle des pH-Wertes, kann
. . die Herstellung von Clavulansäure
auf übliche Weise erfolgen,
d.h.. durch Kultivieren des Streptomyces clavuligerus in
Anwesenheit von assimilierbaren Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und von Mineralsalzen. Die Kultivierung wird vorzugsweise
in submerger Kultur (Tauchkultur) unter, aeroben Bedingungen durchgeführt.
Assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralien können entweder durch einfache oder komplexe Nährmittel geliefert
werden. Quellen für Kohlenstoff umfassen im allgemeinen Glukose, Stärke, Glycerin, Melasse, Dextrin, Lactose oder Sucrose.
Quellen für Stickstoff umfassen im allgemeinen Sojabohnenmehl,
Maisquellflüssigkeiten (corn steep liquors), Distillers solubles (distillers solubles), Hefeextrakte, Baumwollsamenmehl, -Peptone,
Kasein oder Aminosäuregemische. Harnstoff oder andere Amide können auch verwendet werden.
Nähr-Mineralsalze, die in das Kulturmedium eingearbeitet werden
können, umfassen die allgemein verwendeten Salze, die dazu geeignet sind, Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Eisen-f Calcium-, Phosphat-,
Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen zu liefern.
Magnesium-, Zink-, Nickel-, Cobalt-, Mangan-,
Zur Steuerung von übermässigem Schäumen setzt man im allgemeinen ein Antischaummittel zu; dieses kann je nach Erfordernis in Intervallen
zugesetzt werden.
Die Kultivierung von Streptomyces clavuligerus wird im allgemeinen
bei einer Temperatur von 20 bis 370C, vorzugsweise von 25
bis 3O0C, durchgeführt und erfolgt bevorzugt unter Bewegung,
d.h. durch Schütteln oder auch Rühren und Belüften. Das Wachstumsmedium kann zunächst mit einer geringen Menge einer sporulier-
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ten Suspension des Mikroorganismus angeimpft werden. Um jedoch eine Wachstumsverzögerung zu vermeiden, kann ein vegetatives
Inoculum des Organismus durch Inoculieren einer geringen Menge von Kulturmedium mit der Sporenform des Organismus hergestellt
werden und das erhaltene vegetative Inoculum kann in das Fermentationsmedium
übergeführt werden oder vorzugsweise in eine Aufzuchtstufe, wo ein weiteres Wachstum stattfindet, bevor in
das Hauptfermentationsmedium übergeführt wird.
Der Mikroorganismus ist ein Stamm von Streptomyces clavuligerus.
Es wurde gefunden, daß sich der Stamm NERl 3585 und Mutanten davon als besonders zufriedenstellende Stämme für die Produktion
von Clavulansäure erweisen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Fermentation kann
daher eine Schrägkultur (slope) von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 oder eine Mutante davon zur Animpfung eines Mediums
verwendet werden, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, z.B. Sucrose oder G-lycerin, assimilierbaren Stickstoff, z.B.
Tryptone oder komplexe Mischungen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff, z.B. Distillery solubles und Hefeextrakte
und Nährmineralien enthält. Dieses Medium kann man bis zu 3 Tagen bei 25 bis 300C unter Rühren wachsen lassen.
Das so gebildete entwickelte Inoculum kann anschließend zum Animpfen
(in einer Menge bis zu etwa 10 ^) eines Nährmediums verwendet
werden, das ähnliche Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralien enthält. Die Fermentation wird
vorteilhaft bei 25 - 300C während 2 bis 10 Tagen unter Bewegen
und Belüftung in einem pH-Bereich von 6 bis 7,5 durchgeführt.
Bildung von Lithiumclavulanat und anderen Clavulanaten durch Extraktion einer phenolischen Lösung von Clavulansäure
Nach einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann die Li-
wässrige
thiumclavulanat enthaltendenLösung durch Extrahieren einer pheno-
thiumclavulanat enthaltendenLösung durch Extrahieren einer pheno-
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lischen lösung von Clavulansäure mit einer wässrigen lösung von
lithiumhydroxid erhalten werden, wobei die Ausfällung des lithiumclavulanats anschließend, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt
wird, vorzugsweise nach Entfernung von restlichem phenolischem lösungsmittel, durch Extrahieren der wässrigen lösung mit
einem mit Wasser nicht mischbaren lösungsmittel, wie Äther, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff.
Die vorstehende Technik kann auch zur Herstellung von anderen Salzen als den lithiumsalzen der Clavulansäure verwendet werden
durch Extrahieren der phenolischen lösung mit einer entsprechenden Base, z.B. einem Erdalkalimetallhydroxid, wie Calcium- oder
Bariumhydroxid. Eine Ausfällung, die sich bildet, z.B. Bariumsulfat, sollte entfernt werden und anschließend kann das Salz isoliert
werden, z.B. durch Gefriertrocknung. Die Reinigung durch Umwandlung in das lithiumsalz kann anschließend wie vorstehend
beschrieben durchgeführt werden.
Im allgemeinen wird die Extraktion des phenolischen lösungsmittels
vorzugsweise derart durchgeführt, daß sich eine wässrige Phase bei einem pH-Wert von etwa 6,5 ergibt.
Die phenolischen Extrakte können durch Extrahieren eines wässrigen
Eluats aus einem Entfärbungskohle- bzw. Aktivkohle- oder Harzadsorbat der vorstehend beschriebenen Art, mit einem phenolischen
lösungsmittel hergestellt ,werden, gewöhnlich nach Konzentrieren des Eluats und, falls gewünscht, nach Ausfällung von
unerwünschten organischen Verunreinigungen durch Zusatz von ein oder mehreren mit Wasser mischbaren organischen lösungsmitteln
und/oder Entfernung solcher Verunreinigungen durch Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren lösungsmittel.
So wird beispielsweise bei dieser Art von Arbeitsweise das Eluat
entweder mit Entfärbungskohle oder einem Harz vorteilhaft durch Verdampfen unter vermindertem Druck konzentriert. Im allgemeinen
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werden Arbeitsgänge während der Reinigung bevorzugt bei einem
pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 7,0, z.B. etwa 6,5, durchgeführt, um eine Zersetzung auf ein Minimum herabzusetzen. Das Eluatkann
anschließend weiter durch Ausfällen von unerwünschtem Material mit einem mit Wasser mischbaren Keton, wie Aceton, vorzugsweise
unter Bildung einer Ketonkonzentration von 50 bis 90 Volumen-^, bevorzugt etwa 85 %, gereinigVyUeir pH-Wert bei dieser Stufe
beträgt vorzugsweise etwa 6,5 und falls die wässrige Flüssigkeit bereits mit Wasser mischbares Keton enthält, wird dieses vorzugsweise
entfernt, um die pH-Wertmessung zu erleichtern. Der pH-Wert kann durch Zugabe einer Base, z.B. eines Alkalimetallhydroxide,
wie Natriumhydroxid, eingestellt werden.
Die weitere Reinigung kann durch eine Lösungsmittelextraktionsstufe
zur Entfernung von unerwünschten Komponenten erfolgen, z.B. durch Konzentrieren und Einstellen des pH-Wertes des Piltrats
der Ketonausfällung auf etwa 4 durch Zugabe einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure oder Chlorwasserstoffsäure und Extrahieren mit
n-Butanol oder einem flüssigen Alkohol mit höherem Molekulargewicht.
Zweckmäßig können 1 bis 8 Volumen Lösungsmittel verwendet werden·
Nach dieser Extraktion wird die wässrige Phase vorzugsweise bei
etwa pH-Wert 6,5 konzentriert und kann noch weiter durch Extrahieren des gewünschten Antibiotikums in ein phenolisches Lösungsmittel,
z.B. Phenol selbst oder ein Kresol, vorzugsweise nach Verringern des pH-Werts auf etwa 4, mit Mineralsäure, gereinigt
werden. Das phenolische Lösungsmittel enthält vorteilhaft eine Base, wie K",ET-Dimethy!anilin und ein mit Wasser nicht mischbares
lösungsmittel wie Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff. Die Extraktion wird vorteilhaft mehrfach unter Anwendung von etwa 2/3
Volumen Lösungsmittel für jede Extraktion durchgeführt. Die Extrakte können anschließend vereint werden und Wasser, vorzugsweise
etwa 1/15 des Lösungsmittelvolumens kann zur Bildung einer
separaten Phase zugesetzt werden. Das Antibiotikum kann anschlies-
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send durch Zugabe einer Base zu der wässrigen Schicht, vorzugsweise
eines Alkalimetallhydroxide, z.B. Lithiumhydroxid, oder eines Erdalkalimetallhydroxids, z.B. Barium- oder Calciumhydroxid,
bis auf einen pH-Wert von etwa 6,5, rückextrahiert v/erden. Die wässrige Schicht wird von der phenolischen Schicht abgetrennt
und der Rückextraktionsarbeitsgang wird vorteilhaft wiederholt, wonach die wässrigen Extrakte vereint werden. Bach der Abtrennung
von jeglichem Niederschlag, z.B. Bariumsulfat, kann jegliches zurückbleibende phenolische lösungsmittel aus der wässrigen Lösung
durch Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren lösungsmittel, wie Äther, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff
entfernt werden und zur Gewinnung des Antibiotikum-Salzes kann die wässrige Phase gefriergetrocknet oder sprühgetrocknet werden,
bei einem pH-Wert von 6,5.
Die weitere Reinigung kann nach üblichen Techniken, wie Chromatographie,
insbesondere unter Anwendung von Materialien wie Sephadex (Handelsprodukt der Pharmacia Ltd.) durchgeführt werden.
So kann das Antibiotikum, das in dieser Stufe normalerweise in Form eines Salzes vorliegt, z.B. in Form des Bariumsalzes,
auf eine Sephadexkolonne (z.B. Sephadex G- 15) aufgebracht und mit Wasser eluiert werden, wobei die Fraktionen, die eine beträchtliche
antibiotische Wirkung zeigen, vereint werden zur anschließenden Wiedergewinnung des Salzes, z.B. durch Gefriertrocknen.
Gereinigtes lithiumclavulanat, hergestellt nach der vorstehenden Arbeitsweise, kann in andere Salze durch Ionenaustausch, z.B.
unter Anwendung eines Ionenaustauscherharzes, umgewandelt werden. So kann beispielsweise das wässrige lithiumsalz auf ein Kationenaustauscherharz,
z.B. Bio Rad AG50X8 (Handelsprodukt der Bio Rad laboratories, Richmond, California) in der Kationenform aufgebracht
werden, wobei das Kation das des Clavulansäuresalzes, das gewünscht wird, z.B. Natrium oder Kalium, ist, worauf Eluieren,
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z.B. mit Wasser, folgt.
!Freie Clavulansäure kann durch. Ansäuern einer wässrigen Lösung
des Lithiumsalzes, vorzugsweise mit großer Ionenstärke, z.B. gesättigt mit natriumchlorid oder Ammoniumsulfat, in Anwesenheit
eines mit Wass^riinxschbaren Lösungsmittels für Clavulansäure,
beispielsweise eines Esterlösungsmittels, wie Äthylacetat, z.B. auf einen pH-Wert von etwa 2,6, gebildet werden. Palis notwendig,
kann die wässrige Phase mit weiterem Lösungsmittel extrahiert werden und die Lösungsmittel können vereint werden. Im allgemeinen
genügt jegliche Säure, die einen ausreichend niedrigen pH-Wert ergibt, zum Ansäuern, z.B. eine Mineralsäure, wie Chlorwasserst
off säure. Das Lösungsmittel kann anschließend unter Bildung der freien Säure, gewöhnlich in Form eines Öls, entfernt werden.
Die Lösung der freien Säure im mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel
kann zur Herstellung eines weiten Bereiches von Salzen durch Extraktion mit einer wässrigen Lösung einer geeigneten
Base und Isolieren des Salzes hieraus verwendet werden. Es kann notwendig sein, festes Material aus der wässrigen Phase vor der
Isolierung des Salzes abzufiltrieren.
Da die freie Säure ziemlich instabil ist, sollte sie vorzugsweise
sobald wie möglich nach ihrer Bildung verwendet werden, beispielsweise zur Herstellung von Salzen oder anderen Derivaten.
Die folgenden Herstellungsverfahren und Beispiele dienen zur Erläuterung
der Erfindung.
Die Clavulansäuregehalte von Verfahrensflüssigkeiten und Peststoffen
wurden gemessen durch:
1. U.V.-Spektroskopie
Wässrige Lösungen von Clavulansäure und ihren Salzen zeigen eine sehr geringe ÜY-Absorption bei über 230 nm und beispielsweise beträgt
der molare Extinktionskoeffizient £ bei 280 nm etwa 60.
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Durch Auflösen in Alkali jedoch entwickelt sich rasch eine intensive
IJY-Absorption bei A„_._ 259+1 und diese kann dazu ver-
JHgLjL *—
wendet werden, die Clavulansäure und/oder ihre Salze zu bewerten. Zur Bewertung wurden Peststoffe genau ausgewogen und in
einer verdünnten Hatriumhydroxidlösung (0,1 m) unter Bildung
eines bekannten Yolumens an Lösung entsprechend etwa 0,01 mg/ml Clavulansäure gelöst. Die optische Dichte der Lösung bei einem
Absorptionsmaximum bei oder bei etwa 259 mn wurde auf einem geeigneten Spektrophotometer gemessen. Die Reinheiten der Peststoffe
können berechnet werden unter der Annahme, daß der Wert <£ für Clavulansäure 16 700 beträgt. Molare Extinktionskoeffizienten
können aus den E..-Werten berechnet werden, d.h. den Extinktionskoeffizienten
für eine 1 $-ige Lösung in einer 1cm-Zelle.
Ia ähnlicher Weise wurden Ye rf ahrens flüssigkeit en, falls notwendig
nach Entfernung von organischen Lösungsmitteln, genau mit verdünnter Hatriumhydroxidlösung verdünnt, um ähnliche Konzentrationen
von Alkali und Clavulansäure zu ergeben, wenn die Clavulansäurekonzentration
in der Originalflüssigkeit wie vorstehend beschrieben bestimmt wurde. Die Werte für rohe Peststoffe und
Yerarbeitungsflüssigkeiten wurden auf die Absorption von Verunreinigungen hin unter Verwendung von Lösungen der gleichen Konzentration
in Wasser korrigiert.
2. Biologische Aktivität
Bestimmt durch Vergleich von Lösungen von Peststoffen von bekanntem
Clavulansäuregehalt im Agar-Schalen (agar cup plate) -Versuch gegen Acinetobacter sp., im wesentlichen nach der Methode
von Lees und Tootill (Lees, K.A. & Tootill, J.P.R., Analyst,
1955, 80, (947), 95-110; ibid 110-123; 80 (952), 531-535).
Alle Medien wurden vor der Fermentation mit Dampf destilliert.
Die Temperaturen sind in 0C angegeben.
Herstellungsverfahren 1 Herstellung des Bariumsalze3
Herstellungsverfahren 1 Herstellung des Bariumsalze3
a) Entwicklung des Inoculums
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10 mi steriles destilliertes Wasser wurden zu einer 14 Tage alten
Malz/Hefeextrakt-Agar-Schrägkultur von Streptomyces clavuligerus
KRRL 3585 gefügt und es wurde eine Suspension hergestellt.
Ein Teil von 1,5 ml dieser Suspension wurde zum Animpfen von 150 ml eines Mediums verwendet, das enthielt:
fo Gew./Vol.
Sucrose 2,0
Distillers1 solubles 1,5
Hefeextrakt 0,5
KgHPO. 0,02
Tryρton 0,5
Glycerin 1,0
und Wasser auf 100 f> in einem 2 1-Kolben (florence flask).
Dieser Kolben wurde 48 Stunden bei 220 U/min, bei 260C auf einem
Rotationsschüttler mit einem Auswurf von 5,08 cm (2 inch) inkubiert. 150 ml dieses Inoculums wurden zum Animpfen von 4 1 eines
Mediums verwendet, das enthielt:
fo Gew./Vol.
So^abohnenmehl 2,1
Distillers' solubles 0,52 -
Kaseinhydrolysat 0,52
Pe SO.'7H2O 0,01
lösliche Stärke 4,7
Glukose 0,78
und Wasser auf 100 fo in einem 5 1-Fermentationsgefäß mit Belüftung
(0,75 Vol/Vol/Min) und wurde bei 280C unter Rühren ge-.
halten (750 U/min )während 20 Stunden .
Rückstand erhalten bei der Destillation alkoholischer Flüssigkeiten
bzw. Getränke
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b) !fermentation
7»5 1 des 20-stiindigen Inoculums von (a) wurden in 150 1 eines Mediums eingeimpft, das enthielt:
<fo Gew. /ToI.
lösliche Stärke 4,7
Sojabohnenmehl 2,1
Distillers' solubles 0,52
Easeinhydrolysat 0,52
Glukose 0,78
PeSO4-7H2O 0,01
Polyglykol (P.2000: Dow Chemical Co.) 0,05
und Wasser auf 100 fo in einem 220 1-Gefäß. Es wurde 90 Stunden
bei 280C unter Belüften (2 Vol/Yol/Min) und Bewegen (350 U/min)
fermentiert.
c) Isolierung
Die gesamte Brühe der Stufe (b) wurde auf den pH-Wert 6,3 eingestellt
und durch Zentrifugieren geklärt. Die klare überstehende Flüssigkeit (89 1) wurde auf eine Säule, die Pittsburg CAL-Entfärbungskohle
(20 1) enthielt, aufgebracht.
Die Entfärbungskohle wurde mit 40 1 destilliertem Wasser gewaschen
und dann so trocken wie möglich von Flüssigkeit befreit. Die Entfärbungskohle wurde mit 10 1 Aceton und anschließend 40
90 $-igem wässrigem Aceton eluiert. 5x101 Eluatfraktionen
wurden gesammelt und jede Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons verdampft.
Die Fraktion 1 (5 1 wässrige Lösung) wurde durch Gefriertrocknen auf 2,2 1 konzentriert und es wurde Aceton auf eine Endkonzentration
von etwa 84 $> Aceton zugefügt. Zu der Fraktion 2 (0,5 1
wässrige lösung) wurde Aceton auf eine Endkonzentration von etwa 84 $>
Aceton gefügt. Die Fraktionen 1 und 2 wurden anschließend durch eine Filterhilfe (Celite 535) filtriert und die Filtrate
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wurden unter vermindertem Druck verdampft, um das Aceton zu
entfernen und die resultierenden wässrigen lösungen wurden vereint.
Die wässrigen Lösungen der !Fraktionen 3 bis 5 wurden vereint
und unter Bildung eines Peststoffs gefriergetrocknet. Die wässrige Iiösung der vereinten Fraktionen 1 und 2 wurde anschließend
zu dem Peststoff der vereinten Praktionen 3 und 5 gegeben, wobei man eine Lösung erhielt, die durch Gefriertrocknen auf 0,76 1
konzentriert wurde. Diese Lösung (pH 4) wurde sofort mit Butan-1-ol
extrahiert (1 χ 1,52 1, 5 x 380 ml).
Die wässrige Phase wurde nach Entfernen des Butanols durch Verdampfen
unter vermindertem Druck auf den pH-Wert 4,2 (von 5,6)
mit Schwefelsäure gebracht und mit einem gleichen Volumen von 72 fo wässrigem Phenol/]!T,lT-Dimethylanilin/[Detrachlorkohlenstoff
(53i5:15, bezogen auf das Volumen) extrahiert. Die Lösungsmittelschicht
wurde anschließend mit 500 ml wässrigem Bariumhydroxid extrahiert, wobei man eine wässrige Lösung vom pH-Wert 6,5 er- ,
hielt. Suspendiertes Bariumsulfat wurde durch Piltrieren entfernt und das Piltrat wirde mit Diäthyläther gewaschen und gefriergetrocknet,
wobei man 11,1 g festes Bariumsalz erhielt; e] 220.
Herstellungsverfahren 2
Herstellung des Bariumsalzes
Eine Fermentationsbrühe, die auf gleiche bzw. ähnliche Weise wie beim Herstellungsverfahren 1 (a) und (b) erhalten wurde, wurde
wie folgt hergestellt: 135 1 Permentationsbrühe vom pH-Wert 6,5
wurden auf einer Zentrifuge geklärt, wobei man 112 1 überstehende Flüssigkeit vom pH-Wert 6,3 erhielt. Diese wurde durch eine Säule
von 25 1 Pittsburg CAL-Entfärbungskohle geleitet und die Säule
wurde mit 50 1 Wasser durchgewaschen. 10 1 Aceton wurden langsam
auf das obere Ende des Bettes gegossen und es wurde mit dem Eluieren
begonnen. Anschließend folgten 60 1 90 $-iges wässriges Ace-"
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ton. Das Eluat wurde in Fraktionen (1x10 1, 2x25 1) gesammelt.
Jede fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Entfernung
des Acetons destilliert. Die zurückbleibende wässrige Lösung wurde mit 1 m-lfatriumhydroxid auf den pH-¥ert 6,0 eingestellt.
Die !Reaktionen wurden anschließend vereint und weiter auf 2,9 1
destilliert, in einen geeigneten Behälter überführt und mit den Waschlösungen des Behälters (Boiler) auf 3,3 1 gebracht. 17 1
Aceton und 500 g Gelite 535 wurden zu dem Konzentrat unter kräftigem Rühren gefügt. Die resultierende Suspension wurde filtriert
und der Kuchen wurde mit 4 1 85 ^-igem wässrigen Aceton gewaschen.
Das vereinte Hltrat und die Waschlösungen wurden unter vermindertem
Druck auf 4,0 1 destilliert. Der pH-Wert wurde von 5,65 auf 6,0 mit 1 m-Uatriumhydroxid eingestellt und es wurde weiter
destilliert, bis das Volumen 1,0 1 betrug. Das resultierende Konzentrat wurde mit 20 $-iger Schwefelsäure auf den pH-Wert 4,0
angesäuert und mit 4 x 750 ml und 1 χ 500 ml Butan-1-ol gewaschen.
Das gelöste Butan-1-ol wurde unter Yakuum aus der wässrigen Phase abdestilliert.
liach Einstellen des pH-Werts mit 20 ^-iger Schwefelsäure auf 4,2,
wurde das Konzentrat 3 χ mit einer Mischung von 265 ml verflüssigtem Phenol (B.P.), 75 ml Tetrachlorkohlenstoff und 25 ml U,N—
Dimethy!anilin extrahiert. Der pH-Wert wurde für jeden Extrakt
auf 4,2 eingestellt. Die vereinten Lösungsmittelextrakte wurden mit 250 ml Wasser gerührt und der pH-Wert wurde mit 70 ml gesättigtem
wässrigem Bariumhydroxid auf 6,5 eingestellt. Nach Trennung der Phasen wurde das Lösungsmittel mit 200 ml Wasser und
7 ml gesättigtem wässrigen Bariumhydroxid erneut extrahiert.
Die vereinten wässrigen Phasen wurden mit 3 x 200 ml Diäthyläther gewaschen, im Yakuum auf 200 ml verringert und gefriergetrocknet,
wobei man 29,4 g eines blaß-braunen Peststoffs erhielt; e] = 152.
ORIGINAL INSPECTED
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Herstellung eines Entfärbnngskohle- bzw. Aktivkohleeluats, das
Clavulansäure enthält
a) Entwicklung des Inoculums
10 ml steriles destilliertes Wasser wurden zu einer 14 Tage alten
Malz/Hefeextrakt-Agar-Schrägkultur von Streptomyces clavuligerus
ITRRIr 3585 gefügt und es wurde eine Suspension hergestellt.
Ein Teil von 2,0 ml dieser Suspension wurde zum Animpfen von 150 ml eines Mediums verwendet, das enthielt:
$> Gew./ToI.
Sucrose 2,0
Distillers' solubles 1,5
Hefeextrakt 0,5
KgHPOa . 0,02
Trypton 0,5
Glycerin 1,0
und Wasser auf 100 fo
Es wurde in einem 2 1-Kolben (florence flask) gearbeitet.
Der Kolben wurde 48 Stunden bei 260C auf einem Rotationsschüttler
inkubiert (5 cm Reichweite; 220 U/min).
Der Inhalt von 6 derartigen Kolben (insgesamt 900 ml) wurde zur Animpfung von sechs 5 l-3?ermentoren verwendet, die jeweils 4,5
eines Mediums enthielten, das enthielt:
$> Gew./Vol.
Sojamehl 2,1
. Distillers' solubles 0,52
Kaseinhydrolysat 0,52
Eisen-II-sulfat-Heptahydrat 0,01
609834/0977
lösliche Stärke 4,7
Glukose 0,78
Silikon- Antischaumemulsion 0,05 (Vol/Vol)
und Wasser auf 100 fo.
Die Permentoren wurden belüftet (0,67 Yol/Yol/Min) und bewegt
(750 U/min; zwei Flügelrührer von 7,5 cm Durchmesser), wobei 20 Stunden bei 280C gearbeitet wurde.
b) !Fermentation
25 1 Inoculum aus der 5 1-Fermentorstufe wurden zum Animpfen von
4-75 1 eines Mediums verwendet, das enthielt:
fo Gew./ToI.
Sojamehl 3,0
Eisen-II-sulfat-heptahydrat 0,01
K2HPO. 0,01
lösliche Stärke 4,7
Silikon-Antischaumemulsion 0,05 (Yol/Yol)
und Wasser auf 100 fo,
das in einem 700 1-Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl enthalten
war und mit 350 U/min (25 cm Durchmesser Rührer und vier 7,5 cm Leitbleche bzw. Trennwände) und mit 0,56 Yol/Yol/Min. belüftet
wurde. Die Fermentation wurde 92 Stunden bei 280C durchgeführt
und je nach Notwendigkeit wurde weiteres Antischaummittel
zugeeetzt. Die Fermentation wurde bei einem pH-Wert von 6,5 gehalten.
c) Isolierung
Die gesamte Brühe der Stufe (b) wurde mit starker Schwefelsäure auf den pH-Wert 5,45 eingestellt und auf einem Rotationstrommelfilter
mit einer Cellulosevorbesehichtung filtriert. Das Filtrat (430 1), das das Antibiotikum enthielt, wurde auf Entfärbungskohle
(Pittsburgh CALj 135 1) in Säulen adsorbiert. Die Aktivkohle wurde
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mit 90 1 Wasser gewaschen, um die filtrierte Brühe zu ersetzen und das Antibiotikum wurde mit wässrigem Aceton eluiert (60 $>
Tol/Yol; 180 1).
(i) Herstellung des Calciumsalzes
a) 8,83 g des rohen Bariumsalzes des Herstellungsverfahrens 2 wurden zu 50 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von (HHa )2 S04·
gefügt. 50 ml Äthylacetat wurden zugefügt und die Mischung wurde
gerührt, ein pH-Wert-Meßgerät wurde in die Mischung eingebracht und der pH-Wert wurde mit etwa 15 ml 1 m HgSO. von 6,8 auf 2,6
eingestellt. Die wässrige Lösung wurde von dem Äthylacetat abgetrennt und erneut mit einer frischen Portion von 50 ml Äthylacetat gerührt. Die beiden Äthylacetatextrakte wurden vereint,
100 ml destilliertes Wasser wurden zugesetzt und die Mischung wurde in Anwesenheit des pH-Meßgerätes gerührt. Etwa 40 ml einer
gesättigten Lösung .von Calciumhydroxid wurden zugesetzt, um den pH-Wert der Mischung auf 6,6 zu bringen. Die wässrige Lösung
wurde von dem Äthylacetat abgetrennt, durch eine Filterhilfe·, filtriert und gefriergetrocknet, wobei man 1,44 g festes Calciumsalz
erhielt.
b) Der Peststoff von (a) wurde in 15 ml destilliertem V/asser gelöst,
durch ein Millipor-Filter filtriert und auf eine Sephadex G15-Kolonne aufgebracht, die in Wasser gepackt war, um eine
Betthöhe von 152,4 cm (60 inch) und einen Durchmesser von 2,54 cm (1 inch) zu ergeben. Es wurde mit destilliertem Wasser eluiert
und es wurden Fraktionen von 20 ml gesammelt. Die Fraktionen wurden nach Dünnschichtchromatographie (Cellulose, Eastman-Kodak
6065-Platten; Lösungsmittel Acetonetril-Wasser, 7:3 Vol.) durch
Überlagern mit ETährmedium-Agar, das Staphylococcus aureus enthielt,
bewertet. Die Fraktionen 33-37 wurden vereint und unter Bildung von 490 mg gefriergetrocknet. Der Feststoff wurde über
P2O5 im Vakuum während.60 Stunden gehalten. Das Calciumsälz von
(b) hatte folgende Charakteristika:
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Der pEa-Wert der entsprechenden Säure erwies sich, als etwa 2,4
durch potentiometrische Titration des Salzes.
bei 220C, +44,9° (c = 0,287 g/100 ml Wasser).
Eine Probe von 0,00148 g wurde in 100 ml 0,1 m UaOH gelöst und zeigte ein Absorptionsmaximum (A-max) bei 258 nm mit einem e!J-
¥ert von etwa 550.
Das Infrarotspektrum in ITujöl einer Probe zeigte Absorptionsmaxima
bei den Wellenzahlen (em ):
| 3300 | s,br | 2330 | W | 1788 | S | 1692 m |
| 1604 | S | 1404 | S | 1305 | S | 1190-m |
| 1118 | m | 1082 | m | 1060 | m | 1042 m |
| 1012 | m | 992 | m | 968 | m | 892 m |
| 848 | W | 790 | W | 740 | m | 654 w |
(s, m und w bedeuten starke, mittlere bzw. schwache Intensität),
br = breit
Das gesamte Spektrum ist in der beigefügten Figur 3 aufgeführt.
Das gesamte Spektrum ist in der beigefügten Figur 3 aufgeführt.
Das protonenmagnetische Resonanzspektrum einer lösung der Probe
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in schwerem Wasser zeigte Gruppen von Peaks (IT-Werte), die
zentriert waren bei etwa 4,31, 5,10, 5,85, 6,46, 6,91.
Teile der Probe, gelöst in Wasser, wurden auf den Ausgangspunkt von entweder Eastman-Eodak Cellulose TL-Platten (plastic-backed,
EE 6065) oder Eastman-Eodak Siliciumdioxid TL-Platten (plasticbacked,
EE 6060) aufgebracht. Die Platten wurden mit lösungsmittel bei Raumtemperatur entwickelt und anschließend luftgetrocknet
und mit einem Agar-Uährmedium, das Staphylococcus aureus enthielt,
überlagert. Die Rf-Werte, berechnet als die Entfernung von dem Ausgangspunkt zum Zentrum jeder Zone des inhibierten Bakteriumwachstums*
dividiert durch die Entfernung von dem Ausgangspunkt zur Lösungsmittelfront, sind im folgenden für fünf Systeme aufgeführt:
Lösungsmittel
Propan-1-öl:Wasser (7:3) Butan-1-öl Essigsäure:Wasser (3:1:1)
Acetonitril:Wasser (7:3) Acetonitril-Wasser:Propan-2-ol (1:1:1)
Butan-1-öl Essigsäure:Wasser (3:1:1)
Teile der Probe wurden einer Ionophorese auf Whatman 541-Papier
während 1 Stunde bei 400 Volt angelegt an 20 cm, unterzogen. Die Aktivität, bestimmt durch Überlagerung des luftgetrockneten
Papiers mit Staphylococcus aureus enthaltendem Agar-Nährmedium'
hatte eine Mobilität, bezogen auf Cyanocobalamin, von 4,5 cm gegen die Anode beim pH-Wert 4,8 (0,01 m Acetat), pH 6,9 (0,01 m
Phosphat) und pH 9,5 (0,01 m Pyrophosphat).
| Träger | Rf |
| Cellulose | 0,60 |
| Cellulose | 0,64 |
| Cellulose | 0,68 |
| Cellulose | 0,87 |
| Silicium | 0,63 |
| dioxid |
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(ii) Herstellung des Lithiumsalzes
1 g Calciumsalz ( E^ = 590) rein, gemäß
UV-Bewertung), hergestellt wie ±n (i)(b) beschrieben, wurde in 10 ml Wasser gelöst und 10 ml einer gesättigten Lösung von Lithiumchlorid
in Wasser wurden zugefügt. Die Kristallisation trat ohne Kratzen oder .Animpfen auf. Fach dem Kühlen auf 0° wurden die
Kristalle filtriert, mit 5 ml Äthanol, 5 ml Aceton und 2 χ 5 ml Diäthyläther gewaschen. Die Kristalle wurden unter vermindertem
Druck (0,1 mmHg) über Siliciumdioxidgel 2 Stunden getrocknet, wobei man 495,5 mg festes Lithiumsalz erhielt. Dieses Salz hatte
folgende Eigenschaften:
gef.: (die Mittelwerte sind in Klammern angegeben): C 45,5, 45,8 (45,65); H 3,8, 3,8 (3,8); F 7,0, 7,2 (7,1); Li 3,2
Schwefel wurde nach der Methode von F.D. Cheronis & J.B. Entrikin (1947),-Semimicro Qualitative Analysis, Seite 93, Crowell, Hew
York, nicht entdeckt. Berechnet für C8HgITO5LLiAH2O: C 45,84;
H 4,05 ; F 6,68; Li 3,31 ^.
Der vorstehend aufgeführte Wert der Li-Analyse (3,2 fi) wurde
durch Atomabsorptions-Spektrophotometrie bestimmt.
Die Sulfatasche betrug
26,8 tfo, was berechnet als Li2SO. äquivalent 3,38 $ Lithium entspricht.
Der pKa-Wert der korrespondierenden Säure erwies sich durch potentiometrische
Titration des Salzes als etwa 2,3.
Die /ö/jj-Werte für eine 0,145 & (Gew. /VoI) wässrige Lösung bei
24° betrug +66,0°.
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Das UV-Absorptionsspektrum einer 0,00091 $£-igen Lösung in 0,1 m
Natriumhydroxid hatte ein Absorptionsmaximum (Tlmax) bei 258 mn
mit einem E^j-Wert von 788.
Das IR-Spektrum in ITujol zeigte Absorptionspeaks (cm~ ) bei etwa:
3420 (m) 1402 (s) 1200 (w) 1026 (m) 880 (w)
3012 (w) 1338 (tn) 1129 (m) 992 (m) 850 (w)
1765 (s) 1325 (s) 1101 (m) 976 (ra) 734 (m)
1683 (s) 1300 (m) 1062 (m) 950 (s) 708 (w)
1618 (s) 1224 (w) 1048 (s) .900 (ra)
Das gesamte Spektrum ist in der beigefügten Figur 1 aufgeführt.
Ein 100 MHz-kernmagnetisches Resonanzspektrum des Lithiumsalzes,
gelöst in schwerem Wasser, zeigte Peaks (t -Werte mit Multiplizitäten
und Kopplungskonstanten-Hz- in Klammern) zentriert bei etwa 4,26 (d,3), 5,05 (t,8), 5,06 (s), 5,81 (d,8), 6,43 (dd, 3
und 17) und 6,89 (d,17).
(s, d, dd, t und m = Singulett, Dublett, Doppeldublett, Triplett
bzw. Multiplett).
0,1 g Lithiumsalz, hergestellt in Beispiel 1 (ii) wurden in
1,0 ml Wasser gelöst und sorgfältig mit 19 ml Isopropanol verdünnt.
Das Produkt kristallisierte langsam bei 0° und wurde in
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zwei Anschüssen nach Absieden unter vermindertem Druck auf 5 ml
für den zweiten Anschuß gewonnen. Die Kristalle des Lithiumsalzes wurden über Siliciumdioxidgel im Vakuum 3 !Tage lang getrocknet
.
Erster Anschuß: 20,0 mg, 7tmov 259 mn, eJ = 814 in 0,1 m Fatrium
hydroxidlösung bei 10/Ug/ml.
Elementaranalyse ber. für CgHgFO5Li. 12
C 45,84, H 4,06, F 6,68 £ gef. C 46,2, 46,0 H 4,10, 3,85, N 6,8, 6,7
Zweiter Anschuß: 67,0 mg, \QT 259 nm, E^ = 800 in 0,1 η Natriumhydroxid
bei 10/Ug/ml.
Elementaranalyse ber. für CgH8FO5Li.
C 45,84, H 4,06, F 6,68, Li 3,31 56
gef. C 46,15, 46,5, H 3,9, 4,0, F 6,65, 6,5, Lithium 3,4 $> (Sulfatasche).
30 g des Bariumsalzes (ßl 274, hergestellt wie im Herstellungsverfahren
2) wurden in 40 ml Wasser gelöst und 300 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung wurden zugesetzt. Der pH-Wert der Lösung
wurde mit 23,0 ml 20 $-iger Schwefelsäure auf 2,3 eingestellt
und anschließend wurde mit 2 χ 300 ml Äthylacetat extrahiert.
200 ml Wasser wurden zu den vereinten Extrakten gefügt. Die Mischung wurde kräftig gerührt und 89,3 ml 1 m-Fatriumhydroxidlösung
wurden zugegeben, bis der pH-Wert 6,8 erreichte. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck auf
33 ml destilliert. 770 ml Butan-1-ol wurden zu dem wässrigen
Konzentrat gefügt und anschließend vermischt, erwärmt auf 4O0C
unter heftigem Schütteln. Unlösliches Material wurde abfiltriert und es wurde erneut mit Wasser:Butan-1-ol (1:23 Yol/Tol) bis alles
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aufgelöst war, extrahiert. Die vereinten Lösungen wurden über
Nacht auf 40C gekühlt. Der gebildete kristalline Peststoff wurde
durch Filtrieren gewonnen, mit Butan-1-ol und Aceton gewaschen
und an der Luft getrocknet, wobei man 3,34 g des Hatriumsalzes
erhielt (E^ 648).
2,92 g dieses Hatriumsalzes wurden in 20 ml Wasser gelöst und
filtriert. Das Filtrat wurde bei 0° gerührt und es wurden 20 ml bei 20° gesättigte Lithiumchloridlösung während 5 Minuten eingebracht.
Es wurde eine weitere Stunde gerührt und gekühlt, wonach die Kristalle durch Filtrieren gewonnen, mit 20 ml Äthanol, zweimal
20 ml Aceton und zweimal 25 ml Diäthyläther gewaschen wurden
und an der Luft unter Bildung von 2,275 g des Lithiumsalzes in Form von länglichen flachen Prismen (E«j = 770) getrocknet wurden.
7,99 g rohes Bariumsalz (e!} = 288), hergestellt wie im Herstellungsverfahren
2 beschrieben, wurden in 60 ml Wasser gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde anschließend portionsweise mit
4,0 g Lithiumsulfat unter Rühren bei Raumtemperatur versetzt, . bis sich kein Test mehr für Barium auf einer separaten Testplatte
mit Hatriumrhodizonat ergab. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren
geklärt und die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und unter vermindertem Druck auf etwa 35 ml abgesiedet.
9,0 g Lithiumchlorid wurden portionsweise unter Rühren und Kühlen zugesetzt; nach 1 Stunde bei 0° wurde das Lithiumsalz durch
Filtrieren gewonnen, mit 10 ml Äthanol, 2 χ 25 ml Aceton und
2 χ 20 ml Diäthyläther gewaschen und an der Luft im Filtertrichter
getrocknet, wobei man 1,590 g weiße Prismen erhielt (e!j =
790 ).
Herstellung des Natriumsalzes
, 3,5 g des wie in Beispiel 1 (ii) hergestellten Lithiumsalzes
, 3,5 g des wie in Beispiel 1 (ii) hergestellten Lithiumsalzes
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wurden in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine Säule
aufgebracht, die 50 ml AG50x8 Kationenaustauscherharz (Bio-Rad, Ha+; Korngröße 0,074-0,037 mm = 200-400 mesh) enthielt. Es wurde
mit Wasser eluiert und es wurden Fraktionen von 8 ml gesammelt. Die Fraktionen wurden nach Auftrag von Teilen auf Papier durch
Überlagerung mit Staphylococcus aureus enthaltendem Fähragar bewertet.
Aktive Fraktionen (4 bis 13) wurden vereint und gefriergetrocknet.
Der gefriergetrocknete Feststoff wurde in destilliertem Wasser unter Bildung von 19 ml lösung gelöst, mit 450 ml Butan-1-ol geschüttelt
und auf dem Wasserbad erwärmt, bis die lösung fast klar war. Die warme Lösung wurde durch ein Sinterfilter filtriert,
um gelben Feststoff zu entfernen und das Filtrat wurde 60 Stunden bei 40C gehalten. Die gebildeten Kristalle wurden filtriert, mit
2 χ 10 ml Butan-1-ol und anschließend 2 χ 10 ml Aceton gewaschen
und unter vermindertem Druck 1 Stunde bei 400C getrocknet, wobei
man 2,18 g Feststoff erhielt. Der Feststoff wurde aus Wasser-Butan-1-ol
(1:23,3 YoI.) wie beschrieben umkristallisiert. Die Kristalle wurden unter vermindertem Druck über Siliciumdioxidgel
1,5 Stunden bei 440C getrocknet, wobei man 1,8 g festes Natriumsalz
erhielt.
Der Feststoff war hygroskopisch. Er wurde mit Pistill und Mörser vermählen und konnte atmosphärisches V/asser bei 180C aufnehmen.
Nach der Aufnahme von etwa 22 fo (Gew/Gew) Wasser wurde ein Gleichgewicht
erreicht.
Dieses Salz hatte folgende Eigenschaften:
Elementaranalyse (des im Gleichgewicht befindlichen feuchten
Feststoffs)
ber. für C8HgO5IT Fa.4H2O
C 32,76, H 5,46, N 4,78, Na 7,8, Wasser 24,57
gef. (die Mittelwerte sind in Klammern angegeben) C 33,3, 33,2, (33,25); H 4,6, 4,6 (4,6); N 4,6, 4,7 (4,65);
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Na 7»3 (durch Absorptionsspektrophotometrie), 7,9 (ber. aus
der Sulfatasche); Wasser 21,95 $.
(1) Gefunden durch Atomabsorptionsspektrophotometrie:
7,3 + 0,2 io (dieser Wert ist unter der Elementaranalyse
veranschlagt)
(2) Unter der Annahme, daß die Sulfatasche Na2SO. ist, wurde der
Na-Gehalt als 7,9 $> berechnet.
Optische Drehung
Der /07-ry-Wert für eine 0,134 fo-±ge (Gew/Yol) wässrige Lösung bei
240C betrug +47°.
ültraviolettspektrum
Das UV-Absorptionsspektrum einer 0,00098 $-igen Lösung in 0,1 m
NaOH hatte ein Absorptionsmaximum (/Lmax) bei 258 nm mit einem
J von 555.
Das IR-Spektrum in Nujol zeigte Absorptionspeaks (cm ) bei etwa:
3400 s 1592 s 1288 m 1080 w 986 s 85Ow
3300 s 1396 s 1206 w 1060 m 967 m 802 w
1792 s 1348 m 1190 m 1048 m 945 w 753 m
1690 s 1310 s . 1138 m 1015 s 902 m
1665 m 1302 sh 1120 m 998 m .88Ow
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Das gesamte Spektrum ist in der beigefügten Figur 2 aufgeführt,
Das kernmagnetisclie Resonanz Spektrum einer Lösung in schwerem
Wasser zeigte Peakgruppen (T -Werte), zentriert bei etwa 4»28,
5,07, 5,82, 6,44 und 6,88.
3,0 g Lithiumsalz, hergestellt wie in Beispiel 1 (ii) wurden in 100 ml Wasser gelöst und durch eine Dowex 5OW χ 2-Säule (450 ml,
Ealiumzyklus) geleitet. Ein Vorlauf von 150 ml wurde verworfen.
Die nächsten 400 ml Eluat wurden gesammelt und unter vermindertem Druck auf 15 ml verdampft. . 340 ml Butan-1-ol wurden zugesetzt
und die Mischung wurde erwärmt und gut geschüttelt. Etwas unlöslicher Feststoff wurde abfiltriert. Das Ultra t wurde unter
vermindertem Druck auf 200 ml destilliert und anschließend über Hacht bei 40C stehengelassen. Die kristalline Ausscheidung wurde
abfiltriert, mit 2 χ 10 ml Butan-1-ol, 2 χ 50 ml Aceton und
2 χ 50 ml Diäthyläther gewaschen und schließlich im Yakuum-Exsiccator
bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhielt 2,34 g Kaliumsalz (e] = 704). Der E]-Wert wurde durch Auflösen von 7,1 mg des
Kaliumsalzes in 100 ml Wasser bestimmt. Diese Lösung wurde 1/10
mit 0,1 m Natriumhydroxid unter Bildung einer entgültigen Lösung von 7,1 /Ug/ml verdünnt.
ber. für.C8H8FO5K*1/4H2O C 39,7, H 3,5, Έ 5,8, K 16,2,
Wasser 1,96 $
gef. (die Mittelwerte sind in Klammern angegeben)
C 40,0, 40,14 (40,07); H 3,5, 3,55 (3,53); IST 6,0, 5,82, (5,91);
K (durch Absorptionsspektrophotometrie), 16,0 (durch Sulfatasche)
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15,9; Wasser 1,75, 1,95 (1,85) fo.
Der Za7]p -Wert für eine 0,276 $-ige (Gew/Yol) wässrige Lösung
betrug +58,4°.
Die Calcium-, Barium- und Magnesiumsalze der Clavulansäure wurden auf ähnliche Weise aus Lithiumclavulanat hergestellt und
zeigten e!J-Werte von 530, 576 bzw. 713.
500 mg des Lithiumsalzes, hergestellt wie in Beispiel 1 (ii), wurden zwischen 10 ml Äthylacetat und 10 ml gesättigtem wässrigen
Natriumchlorid aufgeteilt. 1 ml 2 η-Chlorwasserstoffsäure wurden zugesetzt und die Mischung wurde kurz geschüttelt. Die
wässrige Phase wurde abgetrennt, mit 10 ml Äthylacetat gewaschen und die vereinten organischen Extrakte wurden mit 15 ml gesättigtem
wässrigen Natriumchlorid gewaschen. Die resultierende organische Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet und fast zur
Trockne verdampft, wobei man die freie Säure als Öl (352 mg) erhielt, das etwa 0,5 Mol Äthylacetat enthielt. Die Verbindung
hatte folgende Chafakteristika:
Zo7g4(c 1,0; DMSO) + 54,5°, *-max einer 0,00098 fo-igen Lösung
in wässrigem 0,1 η NaOH = 258 mn (e!J 590), Infrarotpeaks in Nu-JoI
umfassen-3350, 1790 und 1722 cm~1, NMR-Peaks (DMSO-dg) umfassend
4,31 (d, 3 Hz), 4,99 (s), 5,23 (t, 7 Hz), 5,97 (d, 7 Hz), ^ 6,37 und 6,93 (dd, 3 und 17 Hz; d, 17 Hz); Peaks, zentriert bei
f 8,82, 8,00 und 5,95 zeigten, daß die Probe etwa 0,5 Mol Äthylacetat
pro Mol Clavulansäure enthielt. Diese Werte zeigen an, daß die Probe mindestens 85 Gew.-$>
Clavulansäure enthielt.
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Eine Säule von 240 ml Dowex 5OW wurde durch Behandeln mit Ammoniumsulfat
in den Ammoniumzyklus überführt und mit Wasser von Sulfat freigewaschen. 1,0 g lithiumsalz wurden in 15 ml Wasser
gelöst, auf die Säule aufgebracht und die Säule wurde mit Wasser entwickelt. Es wurden 25 ml Fraktionen entnommen und auf
die UV-Absorption in 0,1 η Natriumhydroxid untersucht. Aktive Fraktionen (4-7) wurden vereint und fast zur Trockne (2 ml)
unter vermindertem Druck destilliert und es wurden 85 ml n-Butanol
zugefügt. Die Mischung wurde sorgfältig bei 250G unter einem
Druck von 0,1 mm destilliert, bis ein kristallines Material ausfiel. Das Ammoniumsalz wurde durch Filtrieren gewonnen, mit sehr
wenig Äthanol und Aceton und schließlich mit Diäthyläther gewaschen und bei 0,1 mm 6 Stunden unter Bildung von 0,54 g fast weis-
D20)-Werte umfassen 4,27 (d, 3Hz), 5,08(s}5,09 (t, 7Hz), 5,84
(d, 7Hz), 6,43 (dd, 17Hz, 3Hz) und 6,89 (d, 17Hz). Analyse berechnet
für C8H8ITO5InI. C 44,4, H 5,6, Ή 13,0 fo,
gefunden C 44,4, H 5,6, IT 13,3 f<>.
Eine Spur von Wasser (0,6 fo) ergab sich durch die Karl Fischer-Analyse
.
Eine Säule von 200 ml Amberlite IR 120 H+ wurde durch Behandeln
mit 0,5 m Methylaminlösung in Wasser in die Methylammoniumform übergeführt. Es wurde mit Wasser zur Neutralität gewaschen und
3,0 g Methylammoniumchlorid in 10 ml Wasser wurden eingebracht. Die Säule wurde mit V/asser, frei von Chlorid, gewaschen und war
zur Anwendung bereit.
609834/09 7.7
1,50 g Lithiumsalz wurden in 15 ml Wasser gelöst und von oben
her in die Säule eingebracht. Die Säule wurde in Wasser entwikkelt
und es wurden Fraktionen von 25 ml entnommen.
Die !Fraktionen 3-7 v/urden vereint (161 ml mit Waschlösungen),
es wurde bei 35°/1,0 mm auf etwa 2 ml destilliert und 200 ml n-Butanol wurden zugesetzt. Die klare Lösung wurde unter gleichen
Bedingungen auf 20 ml destilliert, worauf eine Kristallisation erfolgte. Die Kristalle wurden durch Filtrieren nach 1 Stunde
bei 2° gewonnen, mit 2 ζ 15 ml Diäthyläther gewaschen und 3 Stunden
bei 1 mm getrocknet, wobei man 1,2 g des Methylaminsalzes
als Büschel von weißen länglichen Prismen erhielt. ÜJtC (c 0,23$
in Wasser) + 56,1°, /Imax (0,1 η Natriumhydroxid, 9,5/Ug/ml)
260 nm (έ\ 584); IR-Peaks in Nujol umfassen 2500, 1790, 1692,
1632 und 1576 cm; "C (8 fo D2O)-Werte umfassen 6,40 und 6,86
(dd, 17Hz; 3Hz : d, 17Hz), 4,24 (d, 3Hz), 5,06 (t, 7Hz), 5,78
(d, 7Hz), 5,08 (s), 7,42 (s).
Analyse berechnet für CqH14F2O5: C 47,0, H 6,1, H 12,2 $
gefunden 0 46,7, H 6,1, N 12,5 fo.
Eine Säule mit 200 ml Ionenaustauscherharz (Bio-Rad Laboratories,
AGr ^' 50W χ 2, in der H+-IOm! mit einer Korngröße von 0,149-0,074
mm =s 100-200 mesh) wurde mit einer Lösung von 75 ml Piperidin
in 1500 ml Wasser in die Piperidiniumform umgewandelt. Das Harz wurde mit V/asser zur Neutralität gewaschen und mit 3 g
Piperidiniumchlorid in 10 ml Wasser behandelt. Die Säule wurde mit Wasser, frei von Chlorid, gewaschen und war betriebsbereit.
1,50 g Lithiumsalz wurden am oberen Ende der Säule in 15 ml Wasser eingebracht und die Säule wurde in Wasser entwickelt, wobei
25 ml Fraktionen entnommen wurden. Die Fraktionen 3-6 wurden
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mit den Waschlösungen vereint (172 ml).
Die lösung wurde bis fast zur Trockne bei 35°/1,O mm verdampft
und reines Toluol wurde zugesetzt. Die ölige Suspension wurde unter vermindertem Druck wie vorstehend zur Trockne verdampft
und der erhaltene kristalline Feststoff wurde mit 90 ml Äthylacetat trituriert. Das kristalline Piperidiniumsalz wurde abfiltriert,
mit 3 x 30 ml Ithylaeetat gewaschen und das restliche
lösungsmittel wurde 3 Stunden bei 0,1 V1Sm entfernt, wobei man
1,775 g beinahe weißer Prismen erhielt, ÜÜ^ (c 0,35 # in Wasser)
+42,2°j λ-max (0,1 η Natriumhydroxid, 10/ug/ml) 259,5 mn
(e] 474); IR-Peaks in Hujöl umfassen 3380, 2540, 1782, 1682 und
1608 CnT1JtT(8 <fo D20)-Werte umfassen 6,90 (d, 17Hz), 6,44 (ad,3,
17Hz), 4,28 (d, 3Hz), 5,08 (s), 5,84 (d, 8Hz), 5,08 (t, 7Hz), 6,84 (komplexes Multiplett), 8,0-8,5 (komplexes Multiplett).
Analyse berechnet für C^3H20F2Oc.0
C 52,9, H 7,4, Ή 9,5 $
gefunden C 52,8, H 7,2, Ή 9,3 #.
Eine Säule mit Ionenaustauscherharz (Bio-Rad AG·' ' 5OW, wie in
Beispiel 10 beschrieben) wurde mit einer lösung von Triäthylamin in Wasser (0,5 n, 1,5 Liter) in die Triäthylammoniumform umgewandelt
und mit Wasser zur Neutralität gewaschen. Eine Lösung von 3 g Triäthylammoniumchlorid in 15 ml Wasser wurde in die
Kolonne eingebracht und die Säule wurde mit Wasser von Chlorid frei gewaschen und war bereit zur Anwendung.
1,5 g Lithiumsalz wurden von oben her mit 15 ml Wasser in die Säule eingebracht und die Säule wurde mit Wasser entwickelt, wobei
25 ml Fraktionen entnommen wurden. Die Fraktionen 4-9 wurden vereint (175 ml mit Waschlösungen).
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Die Lösung wurde unter vermindertem Druck (35°/1,O mm) destilliert, wobei man ein Öl erhielt, das 3 x mit Toluol unter den
gleichen Bedingungen durch Destillation konzentriert wurde. Die resultierenden Kristalle wurden unter 50 ml Ithylacetat aufgebrochen,
filtriert, zweimal mit je 20 ml Diäthylather gewaschen
und vom restlichen Lösungsmittel 3 Stunden bei 0,1 mm in einem Exsiccator befreit, wobei man 1,588 g des Triäthylammoniumsalzes
als beinahe weiße Prismen erhielt. /07^ (c 0,22 # in Wasser)
+ 44,3°, ^- max (0,1 η Natriumhydroxid, 9,7/ug/ml) 258 nm (ε] 485)*
IR-Peaks in Nujol umfassen 3250, 2080, 1784, 1700 und 1640 cm"1,
f (10 fo DgO)-¥erte umfassen 6,41 und 6,87 (dd, 17HzJ 3Hz: d 17Hz),
4,26 (d, 3Hz), 5,07 (t* 7Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,07 (s), 8,74 (t,
7Hz) und 6,78 (q, 7Hz).
Analyse berechnet für Oj4H24N2O5-I/4H2O: G 55,2, H 8,0, N 9,2 #
gefunden C 55,2, H 7,9, N 9,2 #.
Eine Probe des Entfärbungskohleeluats, hergestellt wie beim Herstellungsverfahren
3, wurde unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons konzentriert. Das resultierende Konzentrat (1.1,
enthaltend 1,28 g Clavulansäure, bestimmt durch Biountersuchung) wurde auf eine Säule von 100 ml IRA68-Harz (Ghloridzyklus) aufgebracht
. Die Säule wurde mit 300 ml Wasser gewaschen und mit
5 $-iger (Gew/Vol) wässriger Lithiumchloridlösung eluiert, wobei
das Eluat in !Fraktionen von 100 ml gesammelt wurde.
Die Fraktionen 1 und 2 wurden vereint (200 ml), unter vermindertem
Druck auf 40 ml verdampft und bei 40C über Nacht stehengelassen.
Die gebildeten Kristalle wurden abfiltriert, nacheinan-, der mit 10 ml Äthanol, 50 ml Aceton und 50 ml Diäthyläther gewaschen
und im Vakuum getrocknet, wobei man 530 mg eines weißen !Feststoffes erhielt (e!J 802), was eine 40,8 $-ige Ausbeute aus
dem Kohleeluat darstellt. Durch Zugabe eines gleichen Volumens an gesättigtem wässrigen Lithiumchlorid zu den Mutterlaugen, ge-
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2604637
folgt von Stehenlassen bei 4 C erhielt man einen zweiten Anschuß,
der wie vorstehend aufgearbeitet 178 mg (e] 740) ergab, .
was einer weiteren Ausbeute von 12,7 i° entspricht.
In einer Reihe von gleichen Untersuchungen wurden die Konzentration
des Lithiumchlorideluiermittels, des Ionenaustauscherharzes
und die Natur des eluierenden Eations und des G-egenanions variiert, wobei man die folgenden Ergebnisse erhielt:
Harz
Zyklus
Eluiermittel (Molarität)
Produktausbeute
Amberlite IRA 68
Amberlite IRA 68
Amberlite IRA 93
Amberlite IRA 93
Amberlyst A 21
Amberlite IRA 68
Amberlite IRA 68
Chlorid
Chlorid
Chlorid
Chlorid
Chlorid
Acetat φ
Pormiat φ
| Li thiumchl ο rid (0,5 m) |
750 | 51,8 |
| Lithiumchlorid (0,25 m) |
760 | 55,6 |
| Lithiumchlorid (1,0 m) |
560 | 50,3 |
| Lithiumchlorid (0,5 m) |
640 | 44,5 |
| Lithiumchlorid (1,0 m) |
630 | 54,3 |
| Lithiumacetat (0,5 m) |
660 | 56,8 |
| Ammoniumfοrmiat (0,5 m) |
520 | . 55,8 |
Produktausbeute bezogen auf das eingesetzte Eohleeluat
bei diesen Untersuchungen wurde das Lithiumsalz durch Eonzentrieren
der Eluate (x6) und Zusatz eines gleichen Volumens von 50 io (Gew/VoI) Lithiumchloridlösung hergestellt. Die resultierenden
Lithiumsalze wurden wie vorstehend aufgearbeitet,
Eine Probe von 4 1 von Kohleeluat, hergestellt wie im Herstellungsverfahren
3, wurde durch eine Säule von IRA68 (Chloridzyklus
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250 ml) nach unten geleitet, die anschließend mit Wasser (250 ml)
gewaschen wurde und mit 5 5>-iger (Gew/Yol) Lithiumchloridlösung
eluiert wurde. 200 ml des Eluats, die 73 $ der eingesetzten biologischen
Aktivität enthielten, wurden gewonnen. Eine Probe von 70 ml dieses Eluats wurde mit 5 Volumen von Propan-2-ol unter
Rühren behandelt, wobei man einen teerartigen Niederschlag erhielt.
Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und unter vermindertem Druck auf 7 ml konzentriert. Uach Stehen über !lacht
bei 4°C wurde das kristalline Produkt abfiltriert, nacheinander
mit Äthanol, Aceton und Diäthyläther gewaschen und im Yakuum
getrocknet. Durch biologische Bewertung wurde angenommen, daß der trockene Feststoff (870 mg) rein war und eine Ausbeute von
94- fo des Harz-Säulen-Eluats darstellte.
Eine Säule von 50 ml IRA68-Harz (Chloridzyklus) wurde mit 840 ml
Eohleeluat beschickt, v/ie in Herst. 3 hergestellt, mit 100 ml
Wasser gewaschen und mit 5 ^-igem (Gew/Yol) Lithiumchlorid in
Propan-2-ol:Wasser (5:1) eluiert. Die ersten fünf Bettvolumen wurden unter vermindertem Druck konzentriert und das Antibiotikum
wurde wie in Beispiel 13 kristallisiert. Der Feststoff wog 292 mg
(Biountersuchung 970 mg Idthiumelavulanat/mg Feststoff) und
stellte eine Ausbeute von 45 fo des Kohleeluats dar.
Eine Brühe wurde wie in Beispiel 3 fermentiert und filtriert und eine Probe der filtrierten Brühe von 1 1, die 0,43 g Clavulansäure
(biologische Untersuchung) enthielt, wurde durch eine Säule von 100 ml IRA93-Harz (Chloridzyklus) abwärts geleitet.
Die Säule wurde mit 200 ml verdünnter Essigsäure (0,25 m) und 750 ml Wasser gewaschen und mit 1 m wässriger Lithiumchloridlösung
eluiert. Die ersten 150 ml des Eluats, die 0,28 g Clavulansäure
enthielten (biologische Untersuchung) wurden unter vermindertem Druck auf 15 ml konzentriert und über Facht bei 40C gehalten.
Das Produkt wurde filtriert, nacheinander mit Äthanol
609834/0977
Aceton und Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet,
wobei man" 668 mg Feststoff (e] 245) erhielt, was einer Ausbeute
von der filtrierten Brühe von 47 f° entsprach.
Wie bei der Herstellung 3 wurde eine Brühe fermentiert und filtriert
und eine Probe der filtrierten Brühe (2 1), die 1,23 g Clavulansäure enthielt (biologische Untersuchung) wurde abwärts
durch eine Säule von 240 ml IRA93-Harz (Chloridzyklus) geleitet.
Die Säule wurde mit 500 ml Wasser, 400 ml Propan-2-ol :Wasser
(5:1) gewaschen und anschließend mit 5 $-igem (Gfew/Yol) Lithiumchlorid
in Propan-2-ol:Wasser (5:1) eluiert. Die ersten 970 ml des Eluats wurden unter vermindertem Druck auf 100 ml konzentriert
und 2 Tage bei 40C gehalten. Das Produkt wurde filtriert und wie
in Beispiel 15 gewaschen, wobei man 286 mg Feststoff (e] 662) erhielt,
was einer Ausbeute von der filtrierten Brühe von 19 f° entsprach.
Wie im Herstellungsverfahren 3 wurde eine Brühe fermentiert und filtriert und 500 ml des nitrate wurden auf 50 ml IRA93 (Chloridzyklus)
beladen. Die Säule wurde mit 50 ml Wasser und 100 ml 95 $-igem wässrigem Äthanol gewasohen, worauf mit Lithiumchlorid
(1 io Gew/Yol in 95 $ wässrigem Äthanol; 50 ml-Fraktionen) eluiert
wurde. Die Fraktionen 2 und 3 wurden vereint und unter vermindertem Druck bis zur beginnenden Auskristallisation eines
Feststoffs verdampft. Das Konzentrat:wurde 3/4 Stunden bei +40C
gekühlt und der Feststoff wurde auf einem Sinterfilter gesammelt. Der Feststoff wurde mit Äthanol, Aceton und Diäthyläther gewaschen
und 1 /2 Stunde bei Raumtemperatur in einem Yakuumofen getrocknet,
wobei man 89 mg Lithiumclavulanat (E^j 770) erhielt,
was 32 $>, bezogen auf die filtrierte Brühe, entsprach.
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5 1 des wie im Herstellungsverfahren 3 hergestellten Kohleeluats wurden abwärts durch ein Bettvolumen von 500 ml IRA68 im Chloridzyklus
mit einer Rate von 1 l/Stunde geleitet. Die Säule wurde mit 1 1 Wasser gewaschen und mit 0,5 m Uatriumchloridlösung eluiert.
Der erste Liter des Eiuats wurde durch Rotationsverdampf en
auf 90 ml konzentriert. Ein Teil des Konzentrats von 10 ml wurde mit 50ml Propan-2-ol unter Rühren behandelt. Die überstehende
!lösung wurde von der teerigen Ausfällung, die sich gebildet hatte,
ab dekantiert, durch Rotationsverdampf en auf ein Volumen von 3 ml eingeengt und mit 3 ml 30 $-iger (Gew/Vol) Lithiumchloridlösung
behandelt. Hach Stehen über ETacht bsi 40O wurde das Produkt filtriert,
nacheinander mit Äthanol, Aceton und Diäthylather gewaschen
und getrocknet, wobei man 280 mg eines weißen Pulvers vom e]J 770 erhielt.
2,0 g Lithiumclavulanat (e!J 667), hergestellt wie in Beispiel 15
beschrieben, mit anschließender Behandlung mit Isopropy!alkohol,
wurden in 16 ml Wasser gelöst und filtriert. 64 ml Äthanol wurden sorgfältig zugesetzt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur
1 Stunde gerührt. Der zunächst erhaltene Fiederschlag enthielt kein Lithiumclavulanat, was durch UV-Spektroskopie bestimmt wurde,
und wurde verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit 16 ml gesättigter Lithiumchloridlösung verdünnt und 2 1/2 Stunden zur
Kristallisation abgestellt. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gewonnen, trocken gesaugt, mit 2 χ 15 ml Aceton und 2 χ 20 ml
Diäthyläther gewaschen und im Vakuum auf konstantes Gewicht getrocknet
(1,350 g, e] = 735).
•Pharmazeutisches Beispiel 1
100 mg Lithiumclavulanat werden in 10 ml physilogischer Salzlösung
gelöst und sorgfältig mit einer Lösung von 100 mg Cephaloridin in 10 ml.physiologischer Salzlösung vermischt, wobei
609834/0977
Claims (1)
- — iJ7n —man eine zur Injektion geeignete Lösung erhält.Pharmazeutisches Beispiel 2Eine ähnliche Zusammensetzung wie im pharmazeutischen Beispiel 1 wurde hergestellt, jedoch wurde das Lithiumclavulanat durch 100 mg Hatriumclavulanat ersetzt.Pharmazeutisches Beispiel 5100 mg lithiumclavulanat wurden in 10 ml physiologischer Salzlösung gelöst und sorgfältig mit einer lösung von 100 mg Ampicillin in 10 ml physiologischer Salzlösung vermischt, wo"bei man eine zur Injektion geeignete Lösung erhielt.Der hier verwendete Stamm Streptomyces clavuligerus ITRRL 5585 ist bei united States Department of Agriculture, Peoria,, Illinois, USA, hinterlegt und ist der Öffentlichkeit frei zugänglich.609834/0977Patentansprüche· Verfahren zur Entfernung γοη Verunreinigungen aus Clavulansäure der Formel ICH2OHund/oder eines Salzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure und/oder das Salz mit einer wässrigen ionischen Lithiumverbindung umgesetzt wird, wobei man eine wässrige Lösung erhält, die Lithiumclavulanat enthält, das anschließend daraus ausgefällt wird, worauf der Niederschlag aus der wässrigen Lösung abgetrennt wird.2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausfällung von Lithiumclavulanat durch Einbringen in die das Mthiumclavulanat enthaltende wässrige Lösung einer ausreichenden Konzentration von einem wasserlöslichen Lithiumsalz, zur Aussalzung des Clavulanats durchgeführt wird.3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine ionische Lithiumverbindung verwendet, die mit dem wasserlöslichen Lithiumsalz identisch ist.4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß man als ionische Lithiumverbindung und/oder wasserlösliches Lithiumsalz Lithiumchlorid verwendet.609834/09775· Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als ionische Lithiumverbindung und/oder wasserlösliches Lithiumsalz Lithiumbromid, -;jodid oder -sulfat oder ein Lithiumcarboxylat verwendet.6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carboxylat Lithiumacetat, -propionat, -formiat, -benzoat oder -lactat verwendet.7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Ausfällung eine Konzentration an Lithiumclavulanat in der wässrigen Lösung von mindestens 0,1 (Jew.-$ verwendet.8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine molare Konzentration des wasserlöslichen Lithiumsalzes im Bereich von 4- m bis 10 m verwendet.9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Konzentration im Bereich von 5 m bis 8m einsetzt.10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Clavulansäuresalz das zunächst umgesetzt wird, ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz einsetzt.11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Clavulansäuresalz das Calciumsalz einsetzt.12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Salz der Clavulansäure das Bariumsalz verwendet.13· Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als zunächst umgesetztes Salz der Clavulansäure das Natrium-, Kalium eäer Magnesiumsalz oder ein Salz verwendet, das mit einem basischen lonenaustauscherharz gebildet wird.609834/097714. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein vom Lithiumsalz unterschiedliches Salz der Clavulansäure- in wässriger lösung einschließlich einer ausreichenden Menge von wasserlöslichem Lithiumsalz zum Aussalzen des Lithiumclavulanats löst.15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als zunächst umgesetztes Salz der Clavulansäure ein Salz verwendet, das mit einem basischen Ionenaustauscherharz gebildet wurde und das Harzsalz mit der wässrigen ionischen Lithiumverbindungkcniaktiert, wobei man ein wässriges Eluat erhält, das Lithiumclavulanat enthält, das von dem zurückbleibenden Harz abgetrennt wird.16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Lithiumclavulanat enthaltende Eluat, das auch überschüssige ionische Lithiumverbindung enthält, konzentriert wird, wobei die Konzentration der ionischen Lithiumverbindung ausreicht, um das Lithiumclavulanat auszusalzen.17. Verfahren gemäß Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel zu dem Eluat gefügt wird, um Verunreinigungen auszufällen, worauf die Ausfällung vor der Ausfällung des Lithiumclavulanats entfernt wird.18. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige ionische Lithiumverbindung als Eluiermittel verwendet, die ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthält, wodurch das Eluieren von Verunreinigungen von dem Harz unterdrückt wird.19. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausfällung von Lithiumclavulanat aus seiner wässrigen Lösung durch Anwesenheit von hohen Konzentrationen eines mit609834/0977-5t-Wasser mischbaren Lösungsmittels bewirkt.20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser mischbares organisches lösungsmittel einen Alkohol, ein Keton oder . Äther oder ein substituiertes Amid, Imid oder Sulfoxidlösungsmittel einsetzt.21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Isopropanol oder Äthanol einsetzt.22. Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser mischbares Lösungsmittel Isopropylalkohol oder Äthanol in einer Konzentration in dem Eluat von 70 bis 97 Yol-fo einsetzt.23. Verfahren gemäß Anspruch 19-, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser mischbares Lösungsmittel Isopropy!alkohol oder Äthanol in einer Konzentration von mindestens 90 Vol-$ einsetzt.24. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man das Salz der Clavulansäure mit einem basischen Ionenaustauscherharz durch Kontaktieren des Harzes mit einer Permentationsbrühe herstellt, die Clavulansäure und/oder ein Salz davon enthält.25. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man das Clavulansauresalz mit einem basischen Ionenaustauscherharz durch Kontaktieren des Harzes mit einem Eluat herstellt, das durch Eluieren eines Kohleadsorbats der Clavulansäure und/oder eines Salzes davon mit einem wässrigen mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gebildet wurde.609834/097726. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch, gekennzeichnet, daß man als wässriges mit Wasser mischbares Lösungsmittel wässriges Aceton einsetzt.27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aceton 30 bis 95 ?>-iges wässriges Aceton einsetzt.28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man das Adsorbenskohle-Adsorbat durch Eontaktieren der Kohle mit einer Fermentationsbrühe herstellt, die Clavulansäure und/oder ein Salz davon enthält.29. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Menge an Aktivkohle verwendet, die eben ausreicht, um die gesamte Clavulansäure und/oder ihr Salz zu adsorbieren.30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß man ein basisches Ionenaustauscherharz einsetzt, das tertiäre Aminogruppen oder quaternäre Aminogruppen enthält.31. Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß man als Harz ein Polystyrol-, Epoxy-polyphenolisches Polyamin, quervernetztes Dextran- oder Polyacrylatharz einsetzt.32. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine phenolische Lösung von Clavulansäure mit wässrigem Lithiumhydroxid extrahiert und das so gebildete Lithiumclavulanat aus dem so gebildeten wässrigen Extrakt isoliert.33· Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Clavulansäuresalz als Ausgangsmaterial verwendet, das durch Extrahieren einer phenolischen Lösung von Clavulansäure und/oder eines Salzes davon mit einer wässrigen Lösung einer Base unter Bildung eines wässrigen Extrakts hergestellt609834/0977wurde, der das Salz enthält.34. Verfahren gemäß Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion bei einem pH-Wert der wässrigen Phase von etwa 6,5 durchführt.35. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 32 bis 34» dadurch gekennzeichnet, daß man den wässrigen Extrakt mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel in Kontakt bringt, um das phenolische Lösungsmittel daraus zu entfernen.36. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 32 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß man die phenolische Lösung durch Kontaktieren von Adsorbenskohle oder einem basischen Ionenaustauscherharz mit einer Eermentationsbrühe herstellt, die Clavulansäure und/oder ein Salz davon enthält, die Clavulansäure oder ihr Salz mit einem wässrigen Eluiermittel eluiert, das Eluat konzentriert, falls gewünscht, unerwünschte organische Verunreinigungen durch Zusatz von einem oder mehreren mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln ausfällt und/oder solche Verunreinigungen durch Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel entfernt und anschließend die konzentrierte wässrige Lösung von Clavulansäure und/oder einem Salz davon mit einem phenolischen Lösungsmittel extrahiert.37. Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit Adsorbenskohle und das anschließende Eluieren nach der Verfahrensweise gemäß einem der Ansprüche 26 bis 29 durchführt.38. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 32 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß man Clavulansäure und/oder ein Salz davon einsetzt, die von einer Eermentationsbrühe stammen, die durch Kultivieren eines Stammes von Streptomyces609834/0977.5s.clavuligerus erhalten wurde und daß man das feste Material davon entfernt.39· Verfahren gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stamm Streptomyces clavuligerus HEEL 3585 oder eine Mutante davon einsetzt.40. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Clavulansäure und/oder ein Salz davon mit Adsorbenskohle oder einem Harz in Kontakt bringt, wobei die Adsorbenskohle oder das Harz in der Form einer Säule oder Kolonne vorliegen, auf die eine lösung der Clavulansäure und/oder eines Salzes davon aufgebracht wird.41. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lithiumclavulanat anschließend in ein anderes Salz der Clavulansäure umwandelt.42. Verfahren gemäß Anspruch 41» dadurch gekennzeichnet, daß man das Lithiumclavulanat in wässriger Lösung mit einem Kationenaustauscherharz in der Kationenform in Kontakt bringt, wobei dieses Kation das des gewünschten Salzes der Clavulansäure ist, worauf man das gewünschte Salz eluiert.43. Verfahren gemäß Anspruch 41 oder 42, dadurch gekennzeichnet,daß man als Salz der Clavulansäure ein Alkalimetallsalz, das sich vom Lithiumsalz unterscheidet, ein Erdalkalimetallsalz, ein Ammoniumsalz oder das Salz einer organischen Base der Clavulansäure verwendet.44· Verfahren gemäß Anspruch 41» dadurch gekennzeichnet, daß man als anderes Salz das Natrium- oder Kaliumsalz der Clavulansäure verwendet.45. Verfahren gemäß Anspruch 41» dadurch gekennzeichnet, daß man als· anderes Salz das Amm.onium-, Methylamin-, Iriäthylamin-609834/0977"- 55 -oder Piperidinsalz der Clavulansäure verwendet.4-6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lithiumclavulanat anschließend in Clavulansäure umwandelt.47· Verfahren gemäß Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lithiumclavulanat in wässriger Lösung mit hoher Ionenstärke in Anwesenheit eines organischen mit Wasser nicht
mischbaren Lösungsmittels ansäuert, wodurch man eine Lösung
der Clavulansäure in diesem Lösungsmittel erhält.48. Verfahren gemäß Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lösungsmittel aus der Lösung von Clavulansäure entfernt.49. Clavulansäure der Eormel I gemäß Anspruch 1 und deren Salze, die nicht mehr als 25 Gew.-^ an Verunreinigungen oder Isomeren enthalten, die sich von Lösungsmitteln unterscheiden und von der Herstellung stammen.50. Clavulansäure und ihre Salze gemäß Anspruch 49, die nicht
mehr als 15 Gew.-$> dieser Verunreinigungen oder Isomeren
enthalten.51. Clavulansäuresalze gemäß Anspruch 49, die nicht mehr als
2 Gew.-$ dieser Verunreinigungen enthalten.52. Clavulansäuresalze mit einem molaren Extinktionskoeffizienten bei 259 + 1 nm in 0,1 m wässrigem ITatriumhydroxid von
mindestens 16 200.53· Clavulansäuresalze mit einer molaren Drehung 3Hj\ ^31 wässriger Lösung von 137° +5°. .54. Clavulansäure mit einem E^j-Wert bei 259 + 1 nm in 0,1 m
wässrigem ITatriumhydroxid von 590 oder darüber.809834/097755. Clavulansäure mit einer spezifischen optischen Drehung fctjj) i*1 Dimethylsulfoxid von etwa 54°.56. Clavulansäure, hergestellt aus Lithiumclavulanat.57. Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Ammoniumsalze und Salze organischer Basen von Clavulansäure gemäß Anspruch 49.58. Mono-, Di- und Tri-Alkylaminsalze und Salze heteroeyclischer Basen von Clavulansäure gemäß Anspruch 49.59. Methylamin-, Triäthylamin- und Piperidinsalze von Clavulansäure in kristalliner· Form.60. Lithiumclavulanat in kristalliner Form.61. Ifithiumclavulanat mit dem Infrarotspektrum der beigefügten Figur 1.62. ITatriumc la vu lanat in kristalliner Form.63. Natriumclavulänat mit dem Infrarotspektrum der beigefügten Figur 2.64. Ealiumclavulanat in kristalliner Form.65. Caleiumclavulanat mit dem Infrarotspektrum der beigefügten Figur 3.66. Bariumclavulanat, hergestellt aus Lithiumclavulanat.67. Clavulansäure und ihre Salze, hergestellt gemäß einem der Verfahren gemäß Anspruch 41 bis 48.68. Pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzungen,60983 A/0977enthaltend Clavulansäure und/oder ein Salz davon mit nicht mehr als 2 Gewichtsprozent Verunreinigungen oder Isomeren, die keine Lösungsmittel sind und von der Herstellung stammen, zusammen mit einem pharmazeutischen oder veterinärmedizinischen Träger oder Exzipienten bzw. zusammen mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.69. Pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein weiteres ß-Lactamantibiotikum enthalten.70. Pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 68 oder 69 zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Infektionen durch grampositive und/oder gramnegative Organismen.71. Clavulansäure der Pormel I gemäß Anspruch 1 und deren Salze.72. Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure der Formel I gemäß Anspruch 1 und/oder deren Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces clavuligerus kultiviert und die Clavulansäure und/oder das Salz davon aus dem Kulturmedium gewinnt.609834/0977•ft·Leerseite
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