CH629532A5 - Verfahren zur herstellung von clavulansaeure und deren salze aus streptomyces jumonjinensis. - Google Patents
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Description
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure und deren Salze, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Stamm von Streptomyces jumonjinensis bebrütet und die Clavulansäure und deren Salze aus dem Kulturmedium isoliert.
Die Clavulansäure wird im erfindungsgemässen Verfahren am besten als festes Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Barium-, Aluminium-, Ammonium oder substituiertes Ammoniumsalz isoliert. Geeignete Ammoniumsalze sind primäre, sekundäre, tertiäre und quartäre Ammoniumsalze.
Vorzugsweise wird die Clavulansäure als festes Alkalimetallsalz, zsB. als Natrium- oder Kaliumsalz, isoliert.
Unter «festes Salz der Clavulansäure» werden kristalline und amorphe Salze der Clavulansäure bezeichnet. Besonders geeignet sind kristalline Salze, z. B. das Clavulansäure-Natrium-salz-tetrahydrat oder das kristalline Kalium- oder Lithiumsalz.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird vorzugsweise der Stamm Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 oder dessen besonders ergiebige Mutante bebrütet.
Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 ist am 17.2.1976 bei Baarn, Niederlande, als CBS 177.76 und am 9.9.1976 bei der Deutschen Sammmlung für Mikroorganismen DSM unter Nummer 747 hinterlegt worden, und seit dem 17.2.1976 der Öffentlichkeit frei zugängig.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird der die Clavulansäure produzierende Organismus in Gegenwart von assimilierbaren Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalzen wachsen gelassen. Dieses Wachstum kann in einem festen oder halbfesten Nährmedium oder in einem flüssigen Medium, in
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dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind, erfolgen. Die Kultur kann auf einer aeroben Fläche oder als Submerskultur stattfinden, wobei das Nährmedium aus komplexen Nährstoffen bestehen kann oder chemisch definiert ist.
In der BE-PS 804 341 sind die allgemeinen Bedingungen für die Bebrütung von Streptomyces jumonjinensis beschrieben.
Im erfindungsgemässen Verfahren sind komplexe Nährstoffe, wie Hefeextrakt oder Sojabohnenmehl, besonders geeignet.
Im erfindungsgemässen Verfahren kann das Kulturmedium 0,1 bis 10% einer komplexen organischen Stickstoffquelle, wie Hefeextrakt, Maisquellwasser, Pflanzenproteine, Samenproteine und Hydrolysate dieser Proteine, Milchprotein-Hydroly-sate, Fisch- und Fleischextrakte und deren Hydrolysate, wie Peptone, enthalten. Andererseits kann das Kulturmedium chemisch definierte Stickstoffquellen enthalten, wie Harnstoff, Ammoniumsalze, Amide, gewöhnliche Aminosäuren und deren Gemische, wie Valin, Asparagin, Glutaminsäure, Prolin und Phenylalanin. Kohlehydrate können dem Kulturmedium in einer Menge von 0,1 bis 5% als Kohlenstofflieferant zugesetzt werden, z. B. Stärke oder Stärke-Hydrolysate, wie Dextrin, Saccharose, Lactose und andere, Zucker, Glycerin und Glycerin-ester, oder Pflanzenöle oder Tierfette. Auch Carbonsäuren und deren Salze können als Kohlenstoffquelle für das Wachstum und die Produktion von ß-Lactamase-Hemmstoffen eingesetzt werden.
Gelegentlich ist es notwendig dem Kulturmedium ein Anti-schaummittel, wie Polyoxyäthylen-Polyoxypropylen-Polyoxy-äthylen-Polymerisat, zuzusetzen.
Als Mineralsalze geeignet sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Zinkchlorid, Eisen(III)-chlorid, Natriumsulfat, Eisen(II)-sulfat und Magnesiumsulfat sowie Natrium- und Kaliumsalze der Phosphorsäure, insbesondere wenn sie chemisch definiert sind. Calciumcarbonat kann als Calciumionenquelle oder zur Pufferung zugesetzt werden. Man kann dem Kulturmedium aber auch Salze von Spurenelementen, wie Nickel, Kobalt oder Mangan, und gegebenenfalls Vitamine zusetzen.
Unter «Mutante» wird hier jede Mutante des Stammes bezeichnet, gleichgültig ob sie spontan oder durch Einwirkung eines äusseren Mittels entstanden ist. Geeignete Verfahren zur Herstellung von Mutanten sind in der BE-PS 827 926 beschrieben.
Die Bebrütung von Streptomyces jumonjinensis erfolgt im allgemeinen in einem Temperaturbereich von 16 bis 35 °C, im allgemeinen 20 bis 32 °C, vorzugsweise 25 bis 30 °C, z. B. bei etwa 27 °C, und einem pH-Wert von 5 bis 8,5, insbesondere 6 bis 7,5.
Streptomyces jumonjinensis wird im allgemeinen in dem oben angegebenen Nährmedium in herkömmlichen Gefässen, wie konischen Glasflaschen, die durch Bewegung belüftet werden, bebrütet, z. B. in einem sich drehenden Schüttelapparat oder in belüfteten Fermentatoren, z. B. in einem Fermentator aus rostfreiem Stahl, der mit Leitblechen, einem Leitschaufel-rührer und einer Luftsprüheinrichtung ausgerüstet ist. Die Bebrütung kann aber auch kontinuierlich erfolgen.
Im erfindungsgemässen Verfahren beträgt der Ausgangs-pH-Wert im allgemeinen 7,0. Die maximale Ausbeute an Clavulansäure erhält man in 1 bis 10 Tagen bei 20 bis 32 °C, z. B. in 2 bis 5 Tagen.
Clavulansäure und deren Salze können aus dem Filtrat der Kulturbrühe nach verschiedenen Verfahren, wie in der BE-PS 827 926 beschrieben, extrahiert werden. Besonders geeignet sind die Lösungsmittelextraktion aus dem kalten, auf einen sauren pH-Wert eingestellten Kulturfiltrat und Verfahren, die auf der anionischpn Natur der Clavulansäure beruhen, wie die Verwendung von Anionenaustauscherharzen.
Vor der Extraktion können aus der Kulturbrühe die Zellen von Streptomyces jumonjinensis abgetrennt werden, entweder durch Filtrieren oder Zentrifugieren.
Bei der Lösungsmittelextraktion wird normalerweise das Kulturfiltrat gekühlt und der pH-Wert auf 2 bis 3 durch Zugabe von Säure gesenkt, wobei das Gemisch mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie n-Butylace-tat, Methylisobutylketon, n-Butanol oder Äthylacetat, vermischt wird. Die zur Verminderung des pH-Werts des Mediums verwendete Säure ist im allgemeinen eine Mineralsäure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure oder Phosphorsäure. n-Butanol ist für die Extraktion des angesäuerten Kulturfiltrats besonders geeignet.
Nach der Trennung der Phasen durch Zentrifugieren wird die Clavulansäure aus der Lösungsmittelphase in eine wässrige Natriumbicarbonatlösung, einen Kaliumhydrogenphosphatpuf-fer, einer Calciumcarbonatsuspension oder in Wasser extrahiert, wobei der pH-Wert etwa neutral ist, z. B. 7,0. Der wässrige Extrakt nach der Trennung der Phasen kann unter vermindertem Druck eingeengt und zu einem Rohprodukt gefriergetrocknet werden. Dieses rohe Clavulansäuresalz ist als trockener Feststoff bei -20 °C genügend stabil, um gelagert werden zu können.
Bei Verwendung von Anionenaustauscherharz wird normalerweise das Kulturfiltrat bei etwa neutralem oder schwach saurem pH-Wert, z. B. 6 bis 7, mit einem Bett eines schwach oder stark basischen Anionenaustauscherharzes in Berührung gebracht, bis das Harz gesättigt ist und die Clavulansäure aus dem Bett abläuft. Das Bett wird dann mit Wasser gewaschen und mit einer wässrigen Salzlösung, wie eines Alkalimetallchlorids, z. B. Natriumchlorid, eluiert. Die die Clavulansäure enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, eingeengt, entsalzen und gefriergetrocknet. Man erhält das Rohprodukt eines festen Clavulansäuresalzes.
Als schwach basisches Anionenaustauscherharz im erfindungsgemässen Verfahren ist ein vernetztes Polystyrol-Divinyl-benzol-Polymerisat mit aktiven Polyamingruppen, als stark basisches Anionenaustauscherharz ist ein vernetztes Polyvinyl-Divinylbenzol-Polymerisat mit aktiven quartären Ammoniumgruppen geeignet.
Im erfindungsgemässen Verfahren kann man aber auch das Kulturfiltrat bei einem etwa neutralen pH-Wert mit einer organischen Phase, in der ein wasserunlösliches Amin gelöst ist, extrahieren. Geeignete organische Lösungsmittel sind herkömmliche, mit Wasser nicht mischbare polare Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon und Trichloräthylen. Als Amine geeignet sind sekundäre oder tertiäre Amine, in denen ein Substituent ein langkettiger aliphatischer Rest, z. B. mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen, und der andere ein tertiärer Alkylrest ist, so dass das Molekül lipophil ist. Im erfindungsgemässen Verfahren ist ein flüssiges Anionenaustauscherharz (Amberlite LA2) als Amin besonders geeignet. Im allgemeinen wird das Amin in Form des Säureadditionssalzes eingesetzt. Nach der Extraktion befindet sich die Clavulansäure in der organischen Phase als Aminsalz. Die organische Phase wird dann vom Kulturfiltrat abgetrennt, die Clavulansäure kann in eine wässrige Lösung eines Alkalimetallsalzes, wie Natriumchlorid oder Natriumnitrat, extrahiert werden. Durch Gefriertrocknen erhält man dann das rohe Clavulansäuresalz.
Man kann die Clavulansäure aus dem Kulturfiltrat aber auch nach anderen herkömmlichen Verfahren, wie Adsorbtion auf Kohle, Ausfällen, Aussalzen und Molekularfiltration, isolieren. Diese Verfahren werden im allgemeinen in Kombination mit anderen Isolierverfahren verwendet.
Die Adsorption auf Kohle erfolgt im allgemeinen durch Leiten einer wässrigen Lösung des Kulturfiltrats über eine Kohlebett, z. B. durch eine Kohle enthaltende Kolonne. Das Kohlebett wird dann mit Wasser gewaschen und mit einem wässrigen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel eluiert, z. B. mit
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einem Keton, wie Aceton. Oft ist es günstig, die Säule zuerst diesen Zweck geeignete Ester sind der Benzylester oder mit Aceton und dann mit wässrigem Aceton zu eluieren. andere leicht hydrolysierbare Ester. Die rohe Clavulansäure
Gelegentlich ist es günstig, die Clavulansäure als schwer oder deren Salz kann für dieses Reinigungsverfahren entweder wasserlösliches Salz, z. B. als Lithiumsalz, herzustellen, wobei als Feststoff oder als Lösung, die im allgemeinen beträchtliche das Ausfällen und Aussalzen dann geeignet Methoden sind. Die s Mengen an organischen oder anorganischen Verunreinigun-Ausfällung erfolgt am besten durch Zugabe eines mit Wasser gen enthält, eingesetzt werden.
nicht mischbaren organischen Lösungsmittels zur wässrigen Zur Herstellung des Clavulansäureesters wird vorzugs-
Lösung des schwer wasserlöslichen Clavulansäuresalzes, z. B. weise ein Salz der Clavulansäure mit einem veresternden Mit-Clavulansäure-Lithiumsalz. So kann man ein Salz der Clavulan- tel, wie einem reaktiven Halogenid oder einem Sulfonsäure-säure mit einem Lithiumsalz behandeln, entweder durch Eluie- 'o ester, umgesetzt. Diese Reaktion erfolgt im allgemeinen in ren aus einer Kolonne oder durch Lösen der Salze in der glei- einem organischen Lösungsmittel mit einer hohen Dielektrizi-chen Lösung, und zu dieser Lösung ein mit Wasser nicht misch- tätskonstante, wie Dimethylformamid, Dimethylformamid/ bares Lösungsmittel zugeben, wobei das Clavulansäure- Aceton, Dimethylsulfoxid, N-Methylacetamid oder Hexa-
Lithiumsalz ausfällt. methylphosphoramid.
Clavulansäure-Lithiumsalz kann man aber auch aus einer 's Das Clavulansäuresalz kann aber auch in herkömmlicher wässrigen, das Clavulansäure-Lithiumsalz enthaltenden Lösung Weise in dem Lösungsmittel gelöst oder an ein polymeres in Gegenwart einer ionischen Lithiumverbindung aussalzen, Trägermittel gebunden werden. Geeignete Trägermittel sind wobei die Lithiumverbindung am besten das zur Herstellung stark basische Anionenaustauscherharze, insbesondere solche des Clavulansäure-Lithiumsalzes verwendete Lithiumsalz ist mit makroretikularer Struktur, die die Verwendung von nicht-und die Konzentration an Lithiumionen in der Lösung so 20 wässrigen Lösungsmittelsystemen erlauben. Das Clavulansäu-erhöht wird, dass die Löslichkeit des Clavulansäure-Lithiumsal- resalz kann aus dem Kulturfiltrat an das Harz adsorbieren, zes bei dieser Temperatur stark überschritten wird. Da Clavu- worauf das Harz in Dimethylformamid, das Natriumjodid und lansäure-Lithiumsalz bei niedrigen Temperaturen weniger lös- Benzylbromid enthält, suspendiert werden kann. Man kann die lieh ist, erfolgt das Aussalzen am besten bei niedriger Tempera- Clavulansäure aber auch wie bei einer Kolonne mit einer tur, z. B. bei 0 bis 5 °C. 25 Lösung von Natriumjodid in Dimethylformamid oder einem
Die weitere Reinigung der Clavulansäure-Rohprodukte Gemisch von Dimethylformamid und Aceton eluieren. Die Ciakann nach verschiedenen Verfahren erfolgen, die Ionenaustau- vulansäure in dem Eluat kann dann durch Zugabe von Benzyl-scher-Kolonnenchromatographie ist unter Verwendung von bromid verestert werden.
Polystyrol-Divinylbenzol-Polymerisaten mit quartären Ammo- Der gebildete unreine Clavulansäureester wird normaler-niumgruppen oder Diäthylaminocellulose besonders geeignet. 30 weise chromatographisch gereinigt, d. h. der Ester wird in
Eine mit Polystyrol-Divinylbenzol-Polymerisat beschickte einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, Methy-Kolonne kann durch Gradientenelution mit einer wässrigen Ienchlorid oder Chloroform, gelöst und über eine Säule von Lösung eines Salzes, wie Natriumchlorid, mit einem Gradien- Kieselgel oder einem Gelfiltrationsmittel, wie vernetztem Dex-ten von 0 bis 0,5 m, eluiert werden. Eine mit Diäthylaminoäthyl- tran, chromatographiert. Die aus der Säule ablaufenden Frak-cellulose vorzugsweise in 0,01 m Phosphatpuffer bei pH 7 35 tionen werden auf die Anwesenheit von Clavulansäureester beschickte Kolonne kann mit einer Salzlösung, im allgemeinen entweder anhand der synergistischen Eigenschaften oder mit einer Lösung eines Alkalimetallchlorids, z. B. 0 bis 0,2 m chemisch durch Umsetzen mit Triphenyltetrazoliumchlorid in Natriumchlorid in 0,01 m Phosphatpuffer, pH 7, eluiert werden. Kombination mit Dünnschichtchromatographie untersucht. Die aktiven Fraktionen können durch ihre Hemmwirkung auf Aktive Fraktionen werden vereinigt, das organische Lösungs-ß-Lactamase und ihre Aktivität im KAG-System erkannt wer- « mittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Der nach den (vgl. BE-PS 827 926; das KAG-System besteht aus mit Kleb- diesem Verfahren hergestellte Ester ist im allgemeinen von aus-siella aerogenes NCTC 418 beimpften und Penicillin G enthal- reichender Reinheit, man kann das Material jedoch noch erntenden Agarplatten). Die die Hauptmenge dieser Aktivität ent- mal chromatographieren.
haltenden Fraktionen werden gesammelt, unter vermindertem Der gereinigte Clavulansäureester wird gemäss der BE-PS
Druck eingeengt und entsalzt. 45 827 926 in die Clavulansäure oder deren Salz zurückverwan-
Die Trennung von Clavulansäure und/oder deren Salze von delt.
insbesondere anorganischen Salzen, aber auch von anderen Besonders geeignet ist die Hydrierung des Benzylesters.
Verunreinigungen, kann durch Adsorbieren der antibakteriel- Diese Reaktion erfolgt im allgemeinen in Gegenwart eines len Verbindungen auf ein lipophiles Harz, an dem anorganische Übergangsmetallkatalysators bei niedrigem oder mittlerem Salze nicht adsorbiert werden, erfolgen. Im erfindungsgemäs- so Wasserstoffdruck und bei hoher, Raum- oder erniedrigter Tem-sen Verfahren hat sich ein Polystyrol-Divinylbenzol-Copolyme- pera tur, z. B 0 bis 100 °C. Besonders geeignet ist ein schwach risat besonders bewährt; im allgemeinen wird das gewünschte überatmosphärischer Wasserstoffdruck bei annähernd Raum-Antibiotikum von der Kolonne mit Wasser oder wässrigen temperate (12 bis 20 °C). Die Reaktion wird im allgemeinen in
Alkanol eluiert, die erhaltene Lösung eingedampft und gefrier- einem herkömmlichen Lösungsmittel, wie einem niedern Alka-getrocknet. Das Produkt ist wesentlich reiner. Man kann die 55 noi, z. B. Äthanol, in Gegenwart von Palladium auf Kohle Clavulansäure und/oder deren Salze von den anorganischen durchgeführt.
Salzen aber auch durch Säulenchromatographie mit einem Erfolgt die Hydrierung in Gegenwart einer Base, so bildet
Gelfiltrationsmittel, wie vernetztes Dextrangel oder Poly- sich ein Salz der Clavulansäure, z. B. das Lithium-, Natrium-
acrylamidgel, trennen. oder Kaliumsalz bei Verwendung von Natrium- oder Kaliumhy-
Das aktive entsalzene Material kann durch Chromatogra- 60 drogencarbonat, Lithium-, Natrium- oder Kaliumcarbonat.
phie, z. B. auf einer Cellulosesäule, mit einem wässrigen alkoho- Die im erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Clavu-lischen Lösungsmittelsystem, z. B. Butanol/Äthanol/Wasser im lansäure oder deren Salz ist im allgemeinen von guter Reinheit, Volumverhältnis 4:1:5 (obere Phase) weiter gereinigt werden. z. B. mindestens 90%. Sie kann aber auch praktisch vollkommen
Im erfindungsgemässen Verfahren kann man die Clavulan- rein hergestellt werden.
säure und/oder deren Salze auch dadurch reinigen, dass man 65 Die Beispiele erläutern die Erfindung.
aus der rohen Clavulansäure oder deren Salz in herkömmlicher Weise den Ester bildet, diesen Ester reinigt und anschliessend Beispiel 1
die Clavulansäure oder deren Salz wieder zurückgewinnt. Für Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 werden 7 Tage
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bei 28 °C auf einem festen Schrägagar gezüchtet. Der Agar hat folgende Zusammensetzung:
Bestandteile
Menge (g/Liter)
Bacto-Hefe-Extrakt (Difco)
4,0
Bacto-Malz-Extrakt (Difco)
10,0
Bacto-Dextrose (Difco)
4,0
gelöst in destilliertem Wasser, das auf
pH 7,3 eingestellt wurde, dann versetzt
mit Bacto-Agar
20,0
Die Zellen werden von diesem Schrägagar abgekratzt und direkt zum Inokulieren von 100 ml Nährmedium in 500 ml fassenden, mit Schaumstoffstöpseln verschlossenen konischen Glasflaschen verwendet. Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:
Bestandteile
Menge (g/Liter)
Trypton (Oxoid) Hefe-Extrakt
5,0 3,0
zweiten Tag werden aus dem Gärmedium 5-ml-Proben unter sterilen Bedingungen entnommen und bei 2200 g 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird auf seine Hemmwirkung gegen ein Präparat von E.coli JT4-ß-Lactamase in einem Stan-5 dard-ß-Lactamase-Hemmtest untersucht (vgl. BE-PS 827 926).
Beispiel 2
Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 wird gemäss Beispiel 1 in Medium A gezüchtet. Dem Gärmedium werden unter io sterilen Bedingungen 5-ml-Proben in regelmässigen Abständen entnommen und bei 2200 g 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird nach folgenden Verfahren untersucht:
a) Die antibakterielle Aktivität gegen Klebsiella aerogenes A wird im Lochtest in einem Platten-Agardiffusionsversuch
15 bestimmt.
b) Die Aktivität im KAG-Agarplattensystem gemäss BE-PS 827 926 wird gemessen.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengefasst.
20 Tabelle: Aktivität des Überstands
Dauer der Gärung (Tage)
2 3 4 7
Das Medium wird vor dem Inokulieren in einem Autokla- 25 ven bei 1,05 kg/cm2 und bei 121 °C 15 Minuten sterilisiert. Das Nährmedium wird 65 Stunden bei 26 °C in einem Drehschüttel-apparat mit einem Hub von 2,54 cm und 240 UpM bebrütet.
Je 5 ml dieses Nährmediums werden zum Inokulieren von je 100 ml eines Gärmediums der folgenden Zusammensetzung in 30 500 ml fassenden, mit Schaumstoffstöpseln verschlossenen konischen Glasflaschen verwendet. Das Gärmedium hat folgende Zusammensetzung:
Bestandteile
Menge (g/Liter)
Medium A Glukose
Sojabohnenmehl CaCCb
Na2SC>4
C0CI26H2O
in destilliertem Wasser
Medium B Dextrin
Sojabohnenmehl Melasse NaHzP04 KCl in destilliertem Wasser
20 10 0,2 0,5 0,001
55 20 20 1,3 1,0
50
55
Zonendurchmesser (mm) bei Klebsiella aerogenes Zonendurchmesser (mm) im KAG-System
20,5 17,4 37,1 26,8
45
Medium C
Hefe-Extrakt (Oxoid) 10
getrocknetes lösliches Malzdestillat in destilliertem Wasser, das vor der Sterilisation auf pH 7 eingestellt wurde 20
(Das Sojabohnenmehl wird von der Firma British Arkady Co., Old Trafford, Manchester, das Malzdestillat von der Firma Thomas Brothwick Ltd., 69 Wellington Street, Glasgow und das Dextrin von der Firma C.P.C. Ltd., Trafford Park, Manchester bezogen.)
Jedes Gärmedium wird vor dem Inokulieren in einem Auto- 65 klaven bei 1,05 kg/cm2 und bei 121 °C 15 Minuten sterilisiert.
Die Medien werden bei 26 °C in einem Drehschüttelappa-rat mit einem Hub von 2,54 cm und bei 240 UpM bebrütet. Am
Am vierten Tag nach Beginn der Gärung werden Proben aus dem Medium auf 1 cm breite Streifen von Whatman-Nr. 1-Chromatographiepapier aufgebracht und über Nacht bei 4 °C mit folgenden Lösungsmittelsystemen chroma-tographiert: n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumverhältnis 4:1:5 (obere Phase), n-Butanol/Essigsäure/Wasser im Volumverhältnis 12:3:5. Die Streifen werden getrocknet und auf Agar-platten, die mit Klebsiella aerogenes NCTC 418 beimpft sind und Penicillin G enthalten (KAG-Platten) gelegt. Die Platten werden 16 Stunden bei 28 °C bebrütet, dann werden die Wachstumshemmzonen in beiden Lösungsmittelsystemen untersucht. Man erhält in beiden Systemen nur ein einzige Hemmzone, und zwar bei Rf 0,72 mit Butanol/Essigsäure/Wasser und bei Rf 0,25 mit Butanol/Äthanol/Wasser. Diese RrWerte sind mit denen einer authentischen Probe von Clavulansäure in den gleichen Systemen identisch.
Beispiel 3
Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 wird 7 Tage bei 26 °C auf festem Schrägagar in Roux-Flaschen gezüchtet. Das Medium besteht aus Bacto-Hefe-Malz-Extrakt-Agar (ISP-Medium 2 der Firma Difco Laboratoires, Detroit, Michigan, V.St.A.) und wird mit 100 ml sterilem entionisiertem Wasser, das 0,05% eines Netzmittels (Arylalkylpolyätheralkohol) enthält, versetzt. Die Oberfläche der Kultur wird abgekratzt, man erhält eine Suspension von Sporen und Mycélium. 100 ml dieser Suspension werden zum Inokulieren von 50 Liter Nährmedium in einem 90 Liter fassenden Fermentator aus rostfreiem Stahl, der mit Leitblechen ausgerüstet ist, verwendet. Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (g/Liter)
Trypton (Oxoid) Hefe-Extrakt (Oxoid) Antischaummittel in Leitungswasser
5,0 3,0 0,5
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(Das Antischaummittel besteht aus einer lOprozentigen Dispersion von Polyoxyäthylen-Polyoxypropylen-Polyoxyäthy-len-Polymerisat der Firma Ugine Kuhlmann Chemicals Ltd. in Sojabohnenöl der Firma British Oil & Cake Mills.)
Das Medium wird vor dem Inokulieren in dem Fermentator durch Dampf sterilisiert.
Nach dem Inokulieren wird das Nährmedium bei 26 °C während 48 Stunden mit einem Leitsclmifelrührer mit einem Durchmesser von 12,7 cm und 240 UpM gerührt und mit 50 Liter/Minute steriler Luft versorgt.
7,5 Liter dieses Nährmediums werden als Inokulum für 150 Gärmedium in einem 300 Liter fassenden Fermentator aus rostfreiem Stahl, der mit Leitblechen ausgerüstet ist, verwendet. Das Gärmedium hat folgende Zusammensetzung:
Bestandteile
Menge (g/Liter)
Glukose-monohydrat
20,0
Sojabohnenmehl
10,0
CaCÛ3
0,2
C0CI26H2O
0,001
Na2S04
0,5
Antischaummittel
0,5
in Leitungswasser
(Das Sojabohnenmehl stammt von der Firma British Arkady Co. Ltd., Old Trafford, Manchester.)
Als Antischaummittel wird wie im Nährmedium Polyoxyäthylen-Polyoxypropylen-Polyoxyäthylen-Polymerisat verwendet.
Das Medium wird im Fermentator vor dem Inokulieren durch Dampf sterilisiert.
Nach dem Inokulieren wird das Gärmedium mit einem Leit-schaufelrührer mit einem Durchmesser von 21,6 cm und 340 UpM gerührt, mit 150 Liter/Minute steriler Luft versorgt und-bei 26 °C 72 Stunden bebrütet.
Das Medium wird zentrifugiert, die klare Brühe (140 Liter) wird auf pH 6,2 eingestellt und bei einer Fliessgeschwindigkeit von 500 ml/Minute auf eine Säule mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz aufgegeben. Die Säule hat einen Durchmesser von 15 cm und ist auf eine Höhe von 130 cm mit einem vernetzten Polyvinyl-Dibenzol-Polymerisat mit aktiven quartären Ammoniumgruppen (der Firma Zerolit Ltd. U.K.) gefüllt. Die Säule wird bei einer Fliessgeschwindigkeit von 500 ml/Minute mit 15 Liter gekühltem entionisiertem Wasser gewaschen, dann bei einer Fliessgeschwindigkeit von 500 ml/Minute mit gekühlter 1 m wässriger Natriumchloridlösung eluiert. Es werden 4-Liter-Fraktionen gesammelt, wobei die Fraktionen mit dem Standardlochtest im KAG-Plattensystem untersucht werden. Die Fraktionen 2 bis 19 mit guter Aktivität im KAG-System werden vereinigt, auf pH 6,2 eingestellt, abgekühlt und bei einer Fliessgeschwindigkeit von 500 ml/Minute auf eine Anionenaustauschersäule aufgegeben. Die Säule hat einen Durchmesser von 30 cm und ist auf eine Höhe von 125 cm mit einem Polystyrol-Divinylbenzol-Polymerisat (der Firma Rohm & Haas, Philadelphia, V.St.A.) gefüllt. Die Kolonne wird mit 5 Liter gekühlter 1 m Natriumchloridlösung gewaschen und bei 5 °C und einer Fliessgeschwindigkeit von 500 ml/Minute mit entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 5-Liter-Fraktionen gesammelt, wobei gerade nach der Eluierung des Natriumchlorids aus der Kolonne begonnen wird. Die die Clavulansäure enthaltenden Fraktionen 3 bis 9 werden vereinigt.
Diese vereinigten Fraktionen (35 Liter) werden durch Umkehrosmose auf das lOfache eingeengt (De Danske Sukker-
fabrikker Laboratory Modell, Membrantyp 995). Dabei wird der Rückstand durch einen Tank aus rostfreiem Stahl geleitet, der mit einem Kühlsystem und einem Austrittsventil einer Ultrafiltrationseinheit ausgerüstet ist, das so eingestellt ist, dass s ein Differienzialdruck von 45 Atmosphären durch die 40 Membranen herrscht. Die Temperatur beträgt 2 bis 5 °C, die Lösung wird durch Zugabe von 2 n Salzsäure auf pH 6,8 ± 0,1 eingestellt. Das entstandene Konzentrat (3,5 Liter) wird zu einem braunen amorphen Feststoff getrocknet. Ausbeute: 34 g. 10 2 g dieses amorphen Feststoffs werden gemäss der BE-PS 827 926, Beispiel 17, gereinigt. Man erhält praktisch reines kristallines Clavulansäure-Natriumsalz-Tetrahydrat.
32 g des amorphen Feststoffs werden mit 10 ml Benzylbro-mid und 35 ml Dimethylformamid versetzt und 4 Stunden bei i5 Raumtemperatur gerührt Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt, man erhält einen halbfesten Rückstand, der mit 50 ml Äthylacetat versetzt wird. Eventuell vorhandene Feststoffe werden abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt, man erhält ein Öl, das in einem 2o Minimum von Cyclohexan/Chloroform im Verhältnis 1:1 gelöst wird und auf eine Ionenaustauscherkolonne aufgegeben wird. Die Kolonne hat einen Durchmesser von 3,8 cm und ist auf eine Höhe von 34 cm mit vernetztem Dextran (Sephadex LH20 der Firma Pharmacia Ltd.) in Cyclohexan/Chloroform im Verhält-25 nis 1:1 gefüllt. Die Kolonne wird mit Cyclohexan/Chloroform im Verhältnis 1:1 eluiert. Die ersten 150 ml des Eluats werden verworfen, dann werden 25-ml-Fraktionen gesammelt. Durch Aufbringen von 5-Mikroliter-Proben jeder Fraktion auf Kieselgel-Dünnschichtplatten, Entwickeln der Platten mit Cyclohe-30 xan/Äthylacetat im Verhältnis 1:1 und Besprühen mit Triphe-nyltetrazoliumchlorid-Reagens wird der Clavulansäure-benzyl-ester nachgewiesen. Der RrWert wird mit dem RrWert authentischer Proben von Clavulansäure-benzylester, die auf gleiche Weise chromatographiert wurden, verglichen. (Das Triphenyl-35 tetrazoliumchlorid-Reagens wird durch Vermischen von 1 Teil einer 4prozentigen methanolischen Triphenyltetrazoliumchlo-ridlösung mit 1 Teil In Natronlauge hergestellt.)
Die Fraktionen 30 bis 45, die den Clavulansäure-benzylester enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck zu 40 einem Öl eingeengt. Dieses Öl wird in einem Minimum von Cyclohexan/Äthylacetat im Verhältnis 1:1 gelöst und auf eine Kieselgelsäule aufgegeben. Die Säule hat einen Durchmesser von 2,5 cm und eine Höhe von 28 cm und ist mit Cyclohexan/ Äthylacetat im Verhältnis 1:1 equilibriert (Kieselgel H für die 45 Dünnschichtchromatographie der Firma Merck). Die Säule wird mit Cyclohexan/Äthylacetat im Verhältnis 1:1 eluiert, es werden 28 Fraktionen zu 7 ml, dann 15-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 31 bis 33 zeigen auf den Kieselgel-Dünnschichtchromatographie-Platten beim Besprühen mit Diphe-5o nyltetrazoliumchlorid-Reagens eine rote Farbe. Sie werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft.
Die NMR- und IR-Spektren dieses Öls sind mit den Spektren einer authentischen Probe von Clavulansäure-benzylester identisch.
55
Beispiel 4
0,5 g des nach Beispiel 3 hergestellten Clavulansäure-benzyl-esters in 20 ml Äthanol und 5 ml Wasser werden mit 0,13 g lOprozentigem Palladium auf Kohle und 0,15 g Natriumbicar-6o bonat 25 Minuten bei Raumtemperatur und atmosphärischem Wasserstoffdruck hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, mit Wasser und Äthanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft. Das Produkt, Clavulansäure^atriumsalz-tetrahydrat, wird aus Wasser/Aceton 65 umkristallisiert.
G
Claims (17)
1. Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure und deren Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Streptomyces jumonjinensis bebrütet und die Clavulansäure oder deren Salze aus dem Kulturmedium isoliert. s
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 bebrütet.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das feste Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, <o Magnesium-, Barium-, Aluminium-, Ammonium- oder substituierte Ammoniumsalz der Clavulansäure herstellt.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das kristalline Clavulansäure-natriumsalz-tetrahy-drat oder das kristalline Kalium- oder Lithiumsalz der Clavulan-15 säure herstellt.
5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Streptomyces jumonjinensis bebrütet, die Zellen aus der Kulturbrühe entfernt und aus dem Filtrat der Kulturbrühe die Clavulansäure oder deren Salz 20 extrahiert.
6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Clavulansäure oder deren Salz mit einem Lösungsmittel aus dem Filtrat des Kulturmediums extrahiert.
7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeich- 25 net, dass man das Filtrat des Kulturmediums abkühlt, den pH-Wert auf 2 bis 3 einstellt, die Clavulansäure zuerst in ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel extrahiert, daraus dann in eine wässrige Natriumbicarbonatlösung, einen Kaliumhydrogenphosphatpuffer, in eine Calciumcarbonatsus- 30 pension oder in Wasser bei etwa neutralem pH-Wert zurückextrahiert und die Clavulansäure oder deren Salz aus diesem wässrigen Extrakt isoliert.
8. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Filtrat des Kulturmediums mit einer ein was- 35 serunlösliches Amin enthaltenden organischen Phase in Berührung bringt, die Clavulansäure als Aminsalz in die organische Phase extrahiert, aus dieser Phase die Clavulansäure in eine wässrige Lösung eines Alkalimetallsalzes zurückextrahiert und aus dieser Lösung die Clavulansäure oder deren Salz isoliert. 40
9. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Clavulansäure oder deren Salz aus dem Filtrat des Kulturmediums nach Verfahren, die auf der anionischen Natur der Clavulansäure beruhen, extrahiert.
10. Verfahren nach Patentanspruch 1 und 9, dadurch 45 gekennzeichnet, dass man das Filtrat des Kulturmediums bei einem pH-Wert von 6 bis 7 so lange mit einem schwach oder stark basischen Anionenaustauscherharz kontaktiert, bis das Harz mit Clavulansäure gesättigt ist, das Harz mit einer wässrigen Salzlösung eluiert und aus dem Eluat das Salz der Clavulan- 50 säure isoliert.
11. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das wässrige Filtrat des Kulturmediums durch ein Kohlebett filtriert, dieses mit Wasser wäscht und mit einem wässrigen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel 55 eluiert.
12. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein schwer wasserlösliches Salz der Clavulansäure aussalzt oder ausfällt.
13. Verfahren nach Patentanspruch 1 und 12, dadurch 60 gekennzeichnet, dass man als schwer wasserlösliches Salz Cla-vulansäure-Lithiumsalz ausfällt.
14. Verfahren nach Patentanspruch 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Ausfällung des Salzes die wässrige Lösung eines schwer wasserlöslichen Salzes der Clavulan- 65 säure mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel versetzt.
15. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Lithiumsalz der Clavulansäure aus einer wässrigen, dieses Salz enthaltenden Lösung in Gegenwart einer ionischen Lithiumverbindung aussalzt, wobei die Lithiumverbindung das zur Herstellung des Clavulansäure-Lithiumsal-zes verwendete Lithiumsalz ist.
16. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Ester der rohen Clavulansäure herstellt, den Ester reinigt und daraus die Clavulansäure oder deren Salz zurückgewinnt.
17. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Clavulansäure oder deren Salz durch Ionenaustauscherchromatographie weiter reinigt.
Clavulansäure der Formel I, deren Salze und Ester sind wichtige antibakterielle Mittel
CÎJ20H
(I)
// 0
N
^02H
die gemäss der BE-PS 827 926 durch Bebrütung von Streptomyces clavuligerus hergestellt werden können.
Gemäss der BE-PS 804 341 produziert der Stamm Streptomyces jumonjinensis ein anderes bakterielles Mittel als Clavulansäure.
Es wurde nun jedoch festgestellt, dass bei der Bebrütung von Streptomyces jumonjinensis auch Clavulansäure produziert wird.
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