DK141099B - Fremgangsmåde til rensning af clavulansyre eller et salt deraf med en base. - Google Patents

Description

(S) (11) FREMLÆSGELSESSKRrFT 1 i|1 099 \£a/ DANMARK (81) Int.ci.3 c 07 D 498/04 «(21) Ansøgning nr. 498/76 (22) Indleverat den 6. fet). 1976 (23) Løbedag 6. f eb. 1976 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 1 ^ · J &Γ1 · 1 y DIREKTORATET FOR _ _ ^ t PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) P"°ritet begæret fra den

7. feb. 1975, 5409/75, GB

17. mar. 1975, 11076/75, GB

(71) GLAXO LABORATORIES LIMITED, Greenf ord, Middlesex, GB.

(72) Opfinder: Ian Dunlop Fleming, 24 Wheatley Way, Chalfont St. Peter, Buckinghamshire, GB: David Noble, "West Willows", Loch Island, Mar*= low, Buckinghamshire, GB: Hazel Mary Noble, "West Willows", Loch Island, Marlow, Buckinghamshire, GB: Wilfred Frank Wall, "Kllmar= nock", Bassetsbury Lane, High Wycombe, Buckinghamshire, GB.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Kontor for Industriel Eneret v. Svend Schønning.

(64) Fremgangsmåde til rensning af clavulansyre eller et salt deraf med en base.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til rensning af det antibiotiske stof clavulansyre eller salte deraf med baser.

Det vides at gæring af Streptomyces clavuligerus, navnlig stammen NRRL 3585, fører til dannelse af et antal antibiotiske stoffer, og britisk patentskrift nr. 1315177 beskriver dyrkning af denne stamme indtil der er frembragt en væsentlig mængde af to antibiotika, benævnt antibiotikum A 16886 I og A 16886 II.

Det har senere vist sig at der kan vindes yderligere et antibiotikum fra denne organisme, nemlig (2R,5R,Z)-3-(2-hydroxyætyliden)-

7-oxo-4-oxa-l-azabicyklo[3,2,0]-heptan-2-karboxylsyre med formel I

2 141099 ϊ^Ο ✓ ch9oh øy< V X Η H' 'C00H 1 og denne forbindelse kaldes her clavulansyre.

Clavulansyre og forskellige salte og estere deraf er beskrevet i dansk patentansøgning nr. 1672/75, og det er også beskrevet hvorledes der kan ske nogen rensning af materialet. Den bedste rensningsmetode der er anvist består i at man ud fra et salt danner benzylesteren af clavulansyre; denne ester renses derefter på konventionel måde og derpå frisættes syren derfra. Det har vist sig at der ved reduktiv spaltning af benzylclavulanat dannes 10-15% af en isomer som er inaktiv. Det bedste materiale der kan frembringes ved den kendte rensningsmetode indeholder således 10-15% af dette uønskede isomermateriale; materiale tilvejebragt i henhold til nævnte ansøgning og uden forestringsprocessen indeholder mindst 1/3 urenheder.

Det er opfindelsens formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til at rense clavulansyre og tilvejebringe denne syre eller salte deraf i en form væsentligt renere end det er muligt ved den kendte fremgangsmåde. Opfindelsen bygger på den overraskende iagttagelse at dette kan gennemføres over litiumsaltet, der har den i sammenligning med andre salte af clavulansyre enestående egenskab at det er tungt opløseligt og let udfældes i høj renhed, hvorefter det kan omdannes til andre salte.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved at clavulansyre og/eller et salt deraf med en base i rå eller uren form omsættes med en vandig ionisk litiumforbindelse undtagen litiumclavulanat til dannelse af en vandig opløsning indeholdende litiumclavulanat, der derefter udfældes derfra, hvorpå bundfaldet skilles fra den vandige opløsning indeholdende urenheder, hvorefter det isolerede litiumclavulanat om ønsket omdannes til et andet salt med en base eller til den fri clavulansyre.

3 1A1099

Som nævnt er det overraskende at netop litiumsaltet giver mulighed for en sådan rensning. Det er nemlig kendt fra eksempel 15 og 17 i ovennævnte DK-patentansøgning nr. 1672/75 at anbringe et råt kulturfiltrat indeholdende rå clavulansyre p& en kolonne af en svagt basisk ionbytterharpiks og derefter eluere den med natriumklorid. Der sker ikke herved nogen udkrystallisation af natrium-clavulanat, men dette salt vindes ved inddampning af eluatet. Der sker ikke herved nogen nævneværdig adskillelse fra urenheder, og det inddampede produkt har (ifølge nævnte eksempel 17) en renhed på ca. 1/3 af den bedste renhed angivet i eksemplerne i DK-patent-ansøgning nr. 1672/75. Hvis man derimod erstatter natriumklorid med litiumklorid som elueringsmiddel fra kolonnen af ionbytter-harpikssalt med clavulansyre, dannes der krystallinsk litium-clavulanat som udfældes og derved skilles fra urenheder. De andre alkalimetaller danner ikke sådanne krystallinske salte med clavulansyre.

Eksempler på urene salte der kan danne udgangsmateriale eller rene salte der kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er alkalimetalsalte som fx natrium-, kalium- og litiumsaltet; jordalkalimetalsalte som fx kalcium-, magnium- og bariumsaltet; ammoniumsaltet; og salte med organiske baser som fx salte afledet af primære, sekundære, tertiærer eller N-kvater-nære aminer, fx mono-, di- eller trialkylammoniumsalte såsom metylammoniumsaltet og triætylammoniumsaltet samt heterocykliske basesalte såsom piperidiniumsaltet.

Saltene med uorganiske baser og de fleste af saltene med organiske baser er i almindelighed mere stabile i vandig opløsning end fri clavulansyre. Saltene kan eksistere i form af solvater, dvs. med krystalvand eller et andet krystallisationsopløsningsmiddel.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det blevet muligt at vinde clavulansyresalte i meget høj renhedsgrad, i det væsentlige fri for urenheder og isomerer stammende fra produktionen og fx med renhed på 98% eller derover, dvs indeholdende under 2 vægt% urenheder eller isomerer stammende fra produktionen. Således er der fremstillet litiumclavulanat og adskillige andre clavulanat-salte i krystallinsk form. Disse salte var i det væsentlige rene som det fremgik af de molære ekstinktionskoefficienter, målt ved 259- 1 nm i 0,1M vandigt natriumhydroxyd, på mindst 16.200.'Vær- k i 2 4 dierne for den molære rotation, /M/ D i vandig opløsning var mindst + 137° +5°. Den fri syre, fremstillet ud fra saltene, har udvist 4 141099 Ί o/ en ekstinktionskoefficient, E^m i 0,1M vandigt natriumhy-droxyd ved 259 nm, på 590 eller derover og en specifik optisk rotation i dimetylsulfoxyd på ca. +54°. Det vil forstås at fremstilling af materiale med denne renhedsgrad gør det muligt at bruge produkterne i farmaceutiske og veterinære medicinske præparater, og også at en sådan renhed er meget ønskelig ved anvendelse af materialerne som mellemprodukter.

Udtrykket "renhed” i nærværende beskrivelse refererer til procenten af clavulansyre og/eller salt deraf, udtrykt i forhold til den samlede mængde tilstedeværende tørstof på vægtbasis, men uden hensyn til bundet vand eller andre bundne opløsningsmidler .

Clavulansyre og dens salte har antibakteriel virkning mod en række gramnegative og grampositive mikroorganismer, fx mod stammer af Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Enterobacter cloacae, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii, Serratia marcescens, arter af Frovidencia, Citrobacter koseri, Haemophilus influenzae og arter af Bacteroides.

Clavulansyre og dens salte er stabile mod indvirkning af 3-laktamaser frembragt af grampositive organismer, fx de der dannes af Staphylococcus aureus og Bacillus cereus, og mod de 3-laktamaser der frembringes af gramnegative organismer i klassen I— V beskrevet af M.H. Richmond og R.B. Sykes i afhandlingen for 1973 "The β-lactamases of gram-negative bacteria and their possible physiological role", Advances in Microbial Physiology, 9, 31-88.

Clavulansyre og dens salte har også evne til at inhi-bere β-laktamaseenzymer frembragt af grampositive organismer, fx dem der dannes af stammer af Staphylococcus aureus og Bacillus cereus og også de enzymer der klassificeres i klasse II til V fra gramnegative bakterier, dannet af sådanne organismer som stammer af Proteus mirabilis, Escherichia coli, Proteus morganii, Klebsiella aerogenes, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei og Haemophilus influenzae.

Et antal enzymer af klasse I inhiberes også, fx de der dannes af stammer af Bacteroides fragilis, Proteus vulgaris, 5 U1Q99

Proteus morganii, Proteus rettgeri, Enterobacter cloacae,

Citrobacter freundii, arter a£ Providencia og Hafnia alvei.

Således har clavulansyre og dens salte evne til at beskytte -β-laktamase-følsomme β-laktam^-antibiotika fra hydrolyse fremkaldt af β-laktamase.

Clavulansyre og dens salte er derfor egnet til brug i forbindelse med β-laktamr-antibiotika som er følsomme for β-lakta-maser både fra grampositive og fra gramnegative organismer.

Det foretrækkes i almindelighed at bruge salte af clavulansyre med renhed på mindst 98>£, dvs indeholdende under 2% urenheder eller isomerer stammende fra produktionen bortset fra opløsningsmidler, sammen med et bredspektret β-laktamr-antibiotikum.

I almindelighed kan clavulansyre og dens salte bruges i kombination med β-laktant-antibiotika der normalt indgives enten ad oral eller parenteral vej. Eksempler på oralt absorberede bredspektrede β-laktam-antibiotika er bl.a. cephalexin, cephaloglycin, ampicillin og amoxycillin og deres oralt absorberbare estere, fx acryloxymetyl- og phthalidylestere, samt de oralt absorberbare estere af karbenicillin og tikarcillin, fx indanyl- og fenyl-estrene. Bredspektrede β-laktam-anitbiotika der ikke er orait absorberbare er bl.a. karbenicillin, tikarcillin, cephalothin, cephaloridin, cefazolin, cephacetril og cephapirin. Eksempler på smalspektrede β-laktam-antibiotika er penicillin G og penicillin V.

Kombinationer af clavulansyre og dens salte med fx penicillin G, penicillin V og ampicillin, amoxycillin, karbenicillin, cephaloridin eller tikarcillin har vist synergistisk virkning mod β-laktamaseproducerende stammer af Staphylococcus aureus.

Kombinationer af clavulansyre og dens salte med fx penicillin G, penicillin V, ampicillin, amoxycillin, karbenicillin, titarcillin, cephalexin, cephaloglycin, cephalotin, cephaloridin, cefazolin, cephacetril eller cephapirin udviser synergistisk virkning med β-laktamaseproducerende stammer af Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Bacteroides fragilis, Proteus morganii og Proteus vulgaris.

6 U1039

Clavulansyren og/eller saltet deraf kan indgives til voksne mennesker i doser på fra 100 mg til 6 g, 2-4 gange om dagen. Hvis præparatet indeholder også et andet β-laktam-anti-biotikum, gælder de nævnte mængder for den samlede mængde tilstedeværende β-laktam-antikiotikum. Den foretrukne dosis af klavulansyre og/eller et salt deraf ved indgift alene eller sammen med et andet β-laktam-antibiotikum er 250 mg til 1 g, indgivet 2-4 gange om dagen.

Yderligere en anvendelse af clavulansyre og dens salte er til fremstilling af derivater såsom estere, fx ved omsætning af syre med en diazoalkan såsom diazometan eller et salt af syren med et alkylhalogenid, fx metyljodid.

Rensning af clavulansyre og dens salte

Clavulansyre og dens salte kan udvindes fra et gæringsmedium frembragt ved dyrkning i overensstemmelse med hvad der angives i britisk patentskrift nr. 1315177, af en stamme af Streptomyces cla-vuligerus, fx stammen NRRL 3585 ved en fraktioneringsteknik til fjernelse af uønskede bestanddele af næringsmediet såsom proteiner og enzymer og navnlig andre β-laktamantibiotika. Konventionel teknik er vanskelig, især på grund af den ensartede opførsel af de forskellige andre β-laktam-karboxylsyrer såsom de ovennævnte antibiotika A 16.886 I og II. Isoleringen lettes hvis man ifølge opfindelsen omdanner clavulansyre eller dens salte til litiumclavula-nat og udfælder dette, normalt i krystallinsk form. Denne udfældning kan gennemføres, muligvis på grund af en overraskende høj affinitet af glavulanationer til litiumioner, med ingen eller ingen væsentlig samtidig udfældning af urenheder, specielt andre β-laktamer. Herved kan man ved direkte isolation af et salt under undgåelse af omdannelse af clavulansyre til organiske derivater såsom estere med påfølgende genomdannelse til syren, fx ved en reduktionsteknik, undgå omlejring af klavulansyre til isomerer. Det er blevet iagttaget at reduktiv spaltning af estere af klavulansyre kan føre til frembringelse af så meget som 15% isomert materiale.

Det skal bemærkes at i gæringsmedier og andre opløsninger ved tilnærmelsesvis neutral pH vil clavulansyre og salte dannet med en eller flere kationer eksistere i ligevægt, og isolationsprocesser vil hyppigt blive udført på clavulansyre og/ 7 141099 eller salte deraf i afhængighed af pH-værdien og andre betingel

ser. I almindelighed er clavulansyre og dens'salte temmelig ustabile i vandig opløsning udenfor pH-området 5,5 til 8, og under de i det følgende beskrevne processer er det derfor ønskeligt at holde pH-værdien indenfor dette område, fortrinsvis nær ved ca. pH

6,5 med mindre andet er angivet.

Ifølge opfindelsen kan udfældningen af litiumclavulanat udføres ved at man i den vandige opløsning indeholdende litiuraclavula-nat indfører en tilstrækkelig koncentration af et vandopløseligt li-tiumsalt til at udsalte litiumclavulanatet. Dette er en særlig hurtig og effektiv udfældningsmetode, der omtales nærmere næste side.

Den ioniske litiumforbindelse er som regel et salt, og ifølge opfindelsen foretrækkes det at den og/eller det ovennævnte vandopløselige litiumsalt er litiumklorid. Dels er dette lettilgængeligt og billigt, dels har det vist sig at det giver særlig høj renhed.

Det er mest hensigtsmæssigt at bruge litiumklorid i begge tilfælde.

Også litiumbromid, litiumjodid eller litiumsulfat samt litiumkarb-oxylater såsom acetatet, propionatet, formiatet, benzoatet eller laktatet egner sig. Valget af salt kan påvirkes af andre tilstedeværende materialer, og hvis fx det oprindeligt tilstedeværende clavulansyresalt er bariumsaltet, kan det foretrækkes at bruge litiumsulfat til at bevirke en forudgående udfældning af bariumsulfat før udfældningen af litiumclavulanat.

I almindelighed foretrækkes det at koncentrationen af litiumclavulanat før udfældningen er mindst 0,1 vægt%, hensigtsmæssigt mindst 2%, og højere koncentrationer som fx op til 12% eller endog op til 20 vægt% giver naturligvis Større procentuelle udvindinger.

Det oprindeligt tilstedeværende salt af clavulansyre, som behøver rensning, kan fx være et alkalimetalsalt såsom natrium-saltet eller kaliumsaltet eller endog litiumsaltet hvis dette er til stede som en kvantitativt mindre bestanddel af klavulansyre-materialet, eller det kan være et. jordalkalimetalsalt som fx kalcium-, barium- eller magniumsaltet eller et salt med en organisk base som beskrevet foran, eller et salt dannet med en basisk ionbytterharpiks. Især foretrækkes alkalimetal- og jordalkali-metalsalte.

Det forhold at litiumclavulanat let udfældes i høj renhedsgrad kan udnyttes på flere forskellige måder.

141099 8

Udsaltning af litiumclavulanat

Som nævnt kan man i den vandige opløsning indeholdende litiumclavulanat indføre en tilstrækkelig mængde vandopløseligt litiumsalt, især det der bruges til dannelse af litiumclavulanat, til udsaltning af sidstnævnte; herved hæver man koncentrationen af litiumioner så at opløselighedsproduktet af litiumclavulanat ved den givne temperatur overskrides i høj grad. Da clavulanatet er mindre opløseligt ved lavere temperaturer er det normalt hensigtsmæssigt at nedsætte temperaturen af opløsningen for at bringe udfældningen til maximum, fx nedsætte temperaturen til omkring 0-5°C.

Ved en sådan udsaltning ligger koncentrationen af den ioniske litiumforbindelse i den vandige opløsning indeholdende litiumclavulanatet fortrinsvis i området 4M til 10M, men koncentrationer op til mætning er brugbare; et særligt foretrukket område er 5M til 8M.

Det kan være fordelagtigt efter at have indhøstet første udbytte af litiumclavulanat at koncentrere yderligere og indhøste et næste udbytte.

Omdannelse af andre ciavulanater til litiumclavulanat

Den opløsning som indeholder litiumclavulanat kan dannes simpelt hen ved at man opløser et andet salt af ciavulan-syre end litiumsaltet, fx natrium-, kalium-, magnium-, barium-, kalcium- eller ammoniumsaltet, i en vandig opløsning og deri inkorporerer et vandopløseligt litiumsalt såsom litiumklorid.

I tilfælde af bariumsaltet kan anvendelse af en høj koncentration af litiumklorid resultere i nogen samtidig udfældning af bariumklorid med litiumclavulanat. Bariumkloridet kan imidlertid let elimineres ved genopløsning af blandingen i vand og tilsætning af litiumsulfat for at udfælde bariumsulfat, der kan fjernes fx ved filtrering, efterfulgt af tilsætning af litiumklorid for at udfælde rent litiumclavulanat.

Dannelse af litiumclavulanat på en ionbytterharpiks

Det har ifølge opfindelsen vist sig at processen er særlig effektiv og giver et produkt med særlig høj renhed, hvis det salt af clavulansyre, der bruges som udgangsmateriale, er et salt med 9 141099 en basisk ionbytterharpiks, og at harpikssaltet bringes i kontakt med den vandige ioniske litiumforblndelBe i overskud til frembringelse af et vandigt eluat indeholdende litiumclavulanat som udsaltes af overskuddet af den ioniske litiumforbindelse og skilles fra tilbageværende harpiks. Harpiksen vil normalt blive anvendt i form af en kolonne på hvilken uren clavulansyre og/eller et salt deraf påføres, og hvorfra der elueres en vandig opløsning af litiumclavu-lanat under anvendelse af en vandig opløsning af et vandopløseligt litiumsalt som fx litiumklorid. Harpiksen vil normalt blive vasket, fx med vand, før elueringen.

Harpiksen vil i almindelighed indeholde primære, sekundære eller tertiære aminogrupper (svagt basisk) eller kvaternære ammoniumgrupper (stærkt basisk). Harpiksen kan fx være en polystyrenharpiks, polyakrylisk harpiks, epoxy-polyaminharpiks, fenolisk-polyaminharpiks eller tværbundet dekstranharpiks, og den kan være makroretikulær eller mikroretikulær.

Betegnelsen "harpiks"bruges her af praktiske grunde således at den også omfatter cellulosederivater og de foran nævnte dekstranderivater, der er afledet af naturligt forekonv-mende polymerer. Typiske svagt basiske ionbytterharpikser er bl.a. "Amberlite" IRA68 (mikroretikulær; polyakrylat tværbundet med divinylbenzen; tertiære aminogrupper) og "Amberlite" ILA93 (makroretikulær; polysturen tværbundet med divinylbenzen; tertiære aminogrupper). Typiske stærkt basiske ionbytterharpikser er bl.a. "Zerolit" FF og "Zerolit" FF (iP) ("Amberlite" og "Zerolit" er i Danmark indregistrerede varemærker).

Basiske ionbytterharpikser er med fordel i saltform når de bringes i kontakt med en uren klavulansyre og/eller et salt deraf; anionen er fortrinsvis den samme som i det litiumsalt der bruges som elueringsmiddel, hensigtsmæssigt kloridionen, men der kan også bruges anderledes anioner uden afgørende ugunstige virkninger.

Koncentrationen af det vandige litiumsalt der bruges som elueringsmiddel er fortrinsvis i området 0,02M til 8M, men de lavere koncentrationer giver dog meget tynde opløsninger af litiumclavulanat og gør den påfølgende udfældning vanskeligere.

I almindelighed foretrækkes det at bruge koncentrationer i området 0,5 til 2,5M.

141099 10

Selv anadsorptions/eluerings-teknik konventionelt udføres på en sådan måde at det ønskede produkt underkastes en separation af den kromatografiske type fra andre adsorberede materialer, bar det vist sig at det påfølgende trin med udfældning er så effektivt ved adskillelse af litiumclavulanat fra uønskede urenbeder, at det sædvanligvis må foretrækkes i det væsentlige at strippe lcciLannen ved at bruge forboldsvis bøje koncentrationer af litiumsalt i elueringsmidlet. Dette giver et smalt bånd af ciavu-lanat på kolonnen, der kan. elueres til et forholdsvis lille rumfang eluat, hvorved man letter den påfølgende udfældning.

Eluatet vil normalt indeholde litiumsaltet, fx litiumklorid i en koncentration i området 0,5 til 2,5M, mens som nævnt foran udsaltningsvirkningen er mest effektiv ved koncentrationer i området 5M til 10M. Det foretrækkes derfor at koncentrere eluatet, fx ved inddampning i vakuum, fx til ca. 1/5 af rumfanget. Opløseligbeden af litiumclavulanat ved ca. 20°C i forskellige koncentrationer af vandigt litiumklorid fremgår af nedenstående tabel:

Tabel 1

Molaritet af Opløseligbed af litium-

LiCl_ clavulanat, mg/ml (tilnærmet) 2.5 23,5 3,75 10,2 5,0 4,1 6,25 1,8 7.5 0,8

Det foran nævnte trin med koncentrering foretrækkes frem for tilsætning af yderligere litiumsalt, da litiumclavulanat også koncentreres og tab i moderluden derfor nedbringes.

Por at nedbringe eluering af adsorherede urenheder fra harpiksen kan ifølge opfindelsen den som elueringsmiddel anvendte vandige ioniske litiumforbindelse indeholde et vandblandbart organisk opløsningsmiddel. Herved opnås et særlig rent produkt. Det organiske opløsningsmiddel bruges helst i høj koncentration. Det er også muligt efter eluering under fravær af et sådant opløsningsmiddel at tilsætte det til eluatet for at udfælde eluerede urenheder, hvorefter det så- fil03* 11 ledes dannede bundfald fraskilles før videre behandling. Opløsningsmidlet kan fx være en keton såsom acetone, en alkohol såsom metanol, ætanol, isopropylalkohol eller ætylenglykol, en æter såsom dioxan eller tetrahydrofuran eller et substitueret amid-, imid- eller sulfoxyd-opløsningsmiddel såsom dimetylformamid eller dimetylsulf - )T oxyd. I almindelighed foretrækkes alkoholer som sådanne opløsnings-, midler, fx ætanol eller isopropylalkohol.

Til brug ved en sådan fraskillelse fra uønskede urenheder er den foretrukne koncentration af alkoholen i elueringsmidlet eller eluatet efter tilsætning af alkoholen dertil 70 til 97 rumfangs#.

Udfældning af litiumclavulanat ved h.jælp af et vandblandbart opløsningsmiddel

Det skal bemærkes at hvis koncentrationen af det vand-blandbare organiske opløsningsmiddel og litiumsalte i den netop beskrevne procedure er for høj, kan litiumclavulanatet blive udfældet for tidligt. Faktisk er det muligt at udfælde litiumclavulanat fra en vandig opløsning ved at bruge meget høje koncentrationer af sådanne opløsningsmidler, og dette betegner en alternativ udfældningsmetode der udnytter fordelene ved den ovenfor beskrevne selektive udfældning af litiumclavulanat. Således kan clavulansyre og/eller et salt deraf bringes i kontakt med et litiumsalt med en forholdsvis lav koncentration, enten ved eluering fra en kolonne eller ved opløsning af saltene i en enkelt opløsning, hvorefter den ønskede udfældning kan udføres uden koncentrering ved tilsætning af vandblandbart opløsningsmiddel. Således er fx koncentrationer af alkohol på mindst 90 rumfangs# fortrinsvis mindst 95#, effektive til udfældning af litiumclavulanat. Det kan være nødvendigt at indhøste et første udbytte af litiumclavulanat og derefter at koncentrere i vakuum, fx til 1/4 rumfang, for at opnå et andet udbytte.

Fremstilling af et salt af clavulansyre med en ionbytterharplks

Ifølge opfindelsen kan saltet af clavulansyre med den basiske ionbytterharpiks være dannet ved at harpiksen er bragt i kontakt med et gæringsmedium indeholdende clavulansyre og/eller et salt deraf. He.rved kan opnås god renhed på særlig økonomisk måde 141099 12 fordi der spares et adsorptions-/elueringstrin. Normalt er fast materiale fjernet i forvejen, fx ved filtrering eller centrifugering. Denne mulighed eksisterer på grund af den bemærkelsesværdige rensning der bevirkes af det påfølgende litium-fældningstrin. Ønskes meget høj renhed kan det ifølge opfindelsen opnås på særlig effektiv og simpel måde ved at man går frem som angivet i krav 7. I så fald kan ifølge opfindelsen trækuladsorbatet være vundet på simpel måde som angivet i krav 8. Man kan altså efter fjernelse af faste stoffer behandle næringsmediet med adsorberende trækul for at ad-sorbere clavulansyre og/eller saltet deraf; dette bidrager til at skille andre salte fra clavulanatet og undgå for kraftig belastning af den basiske ionbytterharpiks med uønsket ionisk materiale.

I almindelighed kan det klarede medium føres gennem et trækulleje, fx i en kolonne, fortrinsvis under anvendelse af lige netop tilstrækkelig meget trækul til at adsorbere al den ønskede clavulansyre og/eller salt deraf, sædvanligvis i et forhold på ca. 1 rumfangsdel trækul til 3-10 rumfangsdele klaret medium. Almindelige trækul er egnede, og det er ikke nødvendigt at bruge højaktiveret materiale.

Trækullene kan derefter strippes med et vandigt vandblandbart opløsningsmiddel, fx en keton såsom metylætylketon, metylisobutylketon eller fortrinsvis acetone, fordelagtigt ved en koncentration på fra 30 til 95% keton, fortrinsvis 50 til 70%.

Før stripningen vaskes trækullene fortrinsvis fx med vand, for at fjerne tilbageværende komponenter fra mediet.

En anden variation af den netop beskrevne fremgangsmåde består i at fremstille et harpikssalt af clavulansyre som beskrevet side 9. og at eluere dette med et andet salt end et litiumsalt, fx natriumsalt, kaliumsalt, magniumsalt eller kalciumsalt, fx et klorid eller acetat, eller et ammoniumsalt eller pyridinium-salt, fx ammoniumformiat eller -acetat eller pyridin-hydroklorid, til dannelse af en vandig opløsning af det tilsvarende klavulanat; overskud af et vandopløseligt litiumsalt kan derefter sættes til eluatet og litiumclavulanat udfældes som tidligere beskrevet.

U1099 13 Gæring af Streptomyces clavuligerus

Fremstilling af clavulansyre ud fra Streptomyces clavuligerus kan udføres på konventionel måde, dvs ved at dyrke Streptomyces clavuligerus i nærværelse af assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og mineralsalte. Dyrkningen udføres fortrinsvis i submers kultur under aerobe betingelser.

Assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og mineral kan foreligge i form af enten simple eller komplekse næringsstoffer. Kulstofkilder vil i almindelighed indbefatte sådanne stoffer som glukose, stivelse, glycerol, melasse, dekstrin, lak-tose eller sakkarose.

Kilder til nitrogen vil i almindelighed indbefatte soyabønnemel, majsstøbevand, det såkaldte "distillers solubles", gærekstrakt, bomuldsfrømel, pepton, kasein eller aminosyreblan-dinger. Man kan også bruge urinstof og andre amider.

Mineralnæringssalte som kan indgå i dyrkningsmediet indbefatter de almindeligt anvendte salte med evne til at give natrium-, kalium-, ammonium-, jern-, magnium-, zink-, nikkel-, kobolt-, mangan-, kalcium-, fosfat-, sulfat-, klorid- og karbonationer.

Der vil i almindelighed være et antiskumningsmiddel til stede for at kontrollere en for stærk skumning, og det kan tilsættes med mellemrum efter behov.

Dyrkning af Streptomyces clavuligerus vil i almindelighed blive gennemført ved en temperatur på 20 til 37°C, fortrinsvis ved 25 til 30°c, og det er ønskeligt at den finder sted under bevægelse af mediet,fx ved rystning, eller ved omrøring, samt under luftning. Dyrkningsmediet kan ved begyndelsen podes med en lille mængde suspension af sporuleret mikroorganisme, men for at undgå en vækstforsinkelse kan der tilberedes et vegetativt inokulum af organismen ved at man poder en lille mængde af et dyrkningsmedium med organismens sporeform, hvorefter det derved dannede vegetative inokulum kan overføres til gæringsmediet eller, fortrinsvis, til et udsædstrin hvor der finder yderligere vækst sted før overføringen til hoved-gæringsmediet.

Mikroorganismen er en stamme af Streptomyces clavuligerus. Det har vist sig at stammen NRRL 3585 og mutanter deraf er særligt tilfredsstillende stammer til fremstilling af clavulansyre. Ved 141099 14 en foretrukken udførelsesform for gæringsprocessen kan der derfor bruges en skråkultur af Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 eller en mutant deraf til at pode et medium indeholdende kilder til assimilerbart kulstof, fx sakkarose eller glycerol, assimi-lerbart nitrogen, fx trypton, eller komplekse blandinger af assimilerbart kulstof og nitrogen, fx "distiller’s solubles" (inddampet, opløselig rest fra alkoholgæring) og gærekstrakt, samt næringsmineraler. I dette medium kan man lade kulturen vokse i op til 3 døgn ved 25 til 30°C under omrøring.

Det således dannede inokulum kan derefter bruges til (i en mængde på op til ca. 10%) at pode et næringsmedium indeholdende lignende kilder til assimilerbart kulstof, nitrogen og mineraler. Det er ønskeligt at udføre denne gæring ved 25 til 30°C i 2 - 10 døgn under omrøring og luftning med en pH-værdi i · området 6,0 til 7,5-

Dannelse af litiumclavulanat og andre clavulanater ved ekstraktion af en fenolisk opløsning af clavulansyre_

Ved endnu en variation kan den vandige opløsning indeholdende litiumclavulanat vindes ved at man ekstraherer en fenolisk opløsning af clavulansyre med en vandig opløsning af litiumhydroxyd, hvorpå udfældning af litiumclavulanat så udføres som beskrevet foran, fortrinsvis efter fjernelse af tilbageværende fenolisk opløsningsmiddel ved ekstraktion af den vandige opløsning med et vandubland-bart opløsningsmiddel såsom æter, kloroform eller kulstoftetraklorid.

Denne teknik kan også bruges til at fremstille andre salte af clavulansyre end litiumsaltet ved at man ekstraherer den fenoli-ske opløsning med en passende base, fx jordalkalimetalhydroxyd såsom kalcium- eller bariumhydroxyd. Ethvert andet dannet bundfald, fx bariumsulfat, bør fjernes før udfældningen af clavulanatet, og clavula-natsaltet kan derefter isoleres, fx ved frysetørring. Rensning ved omdannelse til litiumsaltet kan derefter udføres som beskrevet foran.

I almindelighed udføres ekstraktionen af det fenoliske opløsningsmiddel fortrinsvis ved titrering af den vandige fase med en passende base, så der fremkommer en pH-værdi på ca. 6,5.

Den fenoliske ekstrakt kan fremstilles ved at man med et fenolisk opløsningsmiddel ekstraherer et vandigt eluat fra et trækul- eller harpiksadsorbat af den foran beskrevne slags, sædvanlig/is efter koncentrering af eluatet og evt. efter udfæld- 15 141099 ning af uønskede organiske urenheder ved tilsætning af et eller flere vandblandbare organiske opløsningsmidler og/eller fjernelse af sådanne urenheder ved ekstraktion med et vandublandbart opløsningsmiddel.

Ved denne type procedure kan det således være ønskeligt at koncentrere eluatet fra enten trækullet eller en harpiks ved inddampning under nedsat tryk. I almindelighed udføres behandlingen under rensningen fortrinsvis ved en pH-værdi i området 6,0-7,0, fx 6,5, for at nedbringe sønderdeling til et minimum. Eluatet kan derefter renses ved udfældning af uønsket materiale med en vandblandbar keton såsom acetone, .fortrinsvis så der kommer en koncentration af ketonen på 50 til 90 rumfangS/6, med fordel ca. 85$. pH-værdien ved dette trin er fortrinsvis ca. 6,5 og hvis den vandige væske allerede indeholder vandblandbar keton, fjernes denne fortrinsvis for at lette pH-målingen. pH-værdien kan reguleres ved tilsætning af en base, fx et alkalimetalhydroxyd såsom natrium-hydroxyd.

Yderligere rensning kan udføres ved et opløsningsmiddel ved ekstraktionstrin for at fjerne uønskede komponenter, fx ved koncentrering og regulering af pH-værdien af filtratet fra ketonudfældningen til ca. 4 ved tilsætning af en mineralsk syre såsom svovlsyre eller saltsyre, og ekstraktion med n-butanol eller en flydende alkohol med højere molekylvægt. Der kan praktisk anvendes 1 til 8 rumfang opløsningsmiddel.

Efter denne ekstraktion koncentreres den vandige fase fortrinsvis ved ca. pH 6,5, og den kan renses yderligere ved ekstraktion af det ønskede antibiotikum over i et fenolisk opløsningsmiddel, fx selve forbindelsen fenol eller en kresol, fortrinsvis efter nedsættelse af pH-værdien til ca. 4 med en mineralsyre. Det fenoliske opløsningsmiddel indeholder med fordel en base såsom Ν,Ν-dimetylanilin og et vandublandbart opløsningsmiddel såsom kloroform eller kulstoftetraklorid. Ekstraktionen udføres med fordel flere gange med anvendelse af ca. 2/3 rumfang opløsningsmiddel for hver ekstraktion. Ekstrakterne kan derefter forenes og der kan tilsættes vand, fortrinsvis ca. 1/15 af opløsningsmiddelrumfanget, for at danne en særskilt fase. Antibio-tiket kan derefter tilbageekstraheres ved tilsætning til det vandige lag af en base, fortrinsvis et alkalimetalhydroxyd som fx litiumhydroxyd, eller et jordalkalimetalhydroxyd som fx 141099 16 bariumhydroxyd eller kalciumhydroxyd, til en pH-værdi på ca. 6,5. Det vandige lag skilles fra det fenoliske lag og tilbageekstraktionsprocessen gentages fordelagtigt, hvorefter de vandige ekstrakter slås sammen. Efter fraskillelse af alle andre bundfald end clavulanat, fx bariumsulfat, kan evt. tilbageværende fenolisk opløsningsmiddel fjernes fra den vandige opløsning ved ekstraktion med et vandubland-bart opløsningsmiddel såsom æter, kloroform eller kulstoftetra-klorid, og til udvinding af saltet af antibiotiket kan den vandige fase frysetørres eller forstøvningstørres ved pH 6,5.

Yderligere rensning kan udføres ved konventionel teknik såsom kromatografi, navnlig ved anvendelse af sådanne materialer som "Sephadex" (et i Danmark indregistreret varemærke; et tværbundet dekstran). Således kan antibiotiket, der på dette trin normalt vil have foimaf et salt, fx bariumsalt, påføres en kolonne af "Sephadex!', fx "Sephadex" G 15, og elueres med vand, idet de fraktioner der indeholder væsentlig antibiotisk aktivitet forenes til påfølgende udvinding af et salt, fx ved frysetørring.

Omdannelse af litiumclavulanat til clavulansyre og andre salte

Renset litiumclavulanat fremstillet som beskrevet foran kan omdannes til andre salte ved ionbytningsprocesser, fx ved hjælp af en ionbytterharpiks. Således kan fx det vandige litiumsalt anbringes på en kationbytterharpiks, fx "Bio Rad" AG50X8 i kationform, idet kationen er den som ønskes i clavulansyresaltet, fx natrium eller kalium, efterfulgt af eluering, fx med vand.

Fri clavulansyre kan dannes ved syrning, fx til pH ca.

2,6, af en vandig opløsning af litiumsaltet, fortrinsvis med høj ionstyrke, fx mættet med natriumklorid eller ammoniumsulfat i nærværelse af et vandublandbart opløsningsmiddel for clavulansyre, fx et ester-opløsningsmiddel såsom ætylacetat. Om nødvendigt kan den vandige fase elcstraheres med yderligere opløsningsmiddel og ekstrakterne forenes. I almindelighed vil en hvilken som helst syre, der giver tilstrækkelig lav pH-værdi, egne sig til syrningen, fx en mineralsk syre såsom saltsyre. Opløsningsmidlet kan derefter fjernes til frembringelse af den fri syre, sædvanligvis i form af en olie.

17 141099

Opløsningen af den fri syre i det vandublandbare opløsningsmiddel kan bruges til at fremstille mange forskellige salte ......

ved ekstraktion med en vandig opløsning af vedkommende base og isolation af saltet derfra. Det kan være nødvendigt at filtrere fast materiale fra den vandige fase før man skrider til at isolere saltet.

Da den fri syre er forholdsvis ustabil, bør den fortrinsvis bruges så snart som muligt efter dannelse deraf, fx til fremstilling af salte eller andre derivater.

Clavulansyreindhold i procesvæsker og faste stoffer måltes ved: 1. Ultraviolet spektroskopi

Vandige opløsninger af klavulansyre og dens salte udviser meget lave uv-absorptioner ved over 230 nm, og fx den molære ekstinktionskoefficient ε ved 280 nm er ca. 60. Ved opløsning i base udvikler der sig imidlertid hurtigt en intens uv-absorption ved Xjjj 259^1, og den kan bruges til bestemmelse af klavulansyre og/eller dens salte. Til sådanne bestemmelser afvejes faste stoffer nøjagtigt og opløstes i tynd natriumhydroxyd (0,1M) til frembringelse af et kendt rumfang opløsning svarende til ca. 0,01 mg/kl klavulansure. Den optiske tæthed af opløsningen ved et absorp-tionsmaximum ved eller på ca. 259 nm måltes på et spek-trofotometer; faste urenheder kan beregnes under antagelse af at ε for ren clavulansyre er 16.700. Molære ekstinktionskoefficienter kan beregnes ud fra værdier, dvs ekstinktionskoefficienterae for en l#s opløsning i en lem celle. På tilsvarende måde blev procesvæsker, om nødvendigt efter fjernelse af organiske opløsningsmidler, fortyndet præcist med fortyndet natriumhydroxyd for at give lignende koncentrationer af alkali og clavulansyre, herudfra bestemtes clavulansyrekoncentrationen i den oprindelige væske på den ovenfor beskrevne måde. Værdier for rå faststoffer og procesvæsker blev korrigeret for absorption af urenheder ved hjælp af opløsninger af samme koncentration i vand.

2. Biologisk aktivitet bestemtes ved sammenligninger med opløsninger af faste stoffer med kendt clavulansyreindhold ved en agar-kop-piade-bestemmelsesmetode mod Acinetobacter sp. i det væsentlige en metoder der er angivet af Lees og Tootill (K.A. Lees og J.P.2, Tootill, Analyst, 1955, 80 (947), 95-110; smst. . 110-123; 80 (952), 531-535).

Alle medier blev dampsteriliseret før gæringen.

18 141-039

Udgangsmateriale 1 a) Podekulturudvikling 10 ml sterilt destilleret vand sattes til en 14 dage gammel skråkultur på malt/gærekstrakt-agar af Streptomyces clavuli-gerus NRKL 3585 og der fremstilledes en suspension.

En portion på 1,5 ml af denne suspension brugtes til podning af 150 ml af et medium indeholdende (udtrykt i % v/r, dvs således at forholdet mellem enheder af faste stoffer og væsker er som mellem g og ml : % v/r

Sakkarose 2,o distillers' solubles 1,5 gærekstrakt 0,5 K2HP04 0,02 trypton 0,5 glycerol 1,0 og vand til 100% i en 2 liters langhalset, rund, fladbundet kolbe.

Denne kolbe inkuberedes ved 26°C i 48 timer med 220 opm på en roterende ryster med et 5 cm slag. 150 ml af denne podekultur brugtes til podning af 4 liter af et medium indehol-dende: % v/r

Soyabønnemel 2, l distillers' solubles 0,52 kaseinhydrolysat 0,52

PeS04, 7H20 0,01 opløselig stivelse 4,7 glukose 0,78 og vand til 100# i en 5 liter stor gæringsbeholder med luftning (0,75 vol/vol/min), og holdtes på 28°C under omrøring (75o opir.) i 20 timer.

b) Gæring 7,5 liter af det 20 timer gamle inokulum fra afsnit (a) ovenfor podedes i 150 liter af et medium indeholdende: 19 1A10 9 9 % v/r

Opløselig stivelse 4,7 soyabønnemel 2,1 distillers' solubles 0,52 kaseinhydrolysat 0,52 glukose 0,78

FeS04, 7H20 0,01 polyglykol (P.2000 fra Dow

Chemical Co.) 0,05 og vand til 100% i en 220 liter stor beholder og der gæredes her i 90 timer ved 28°C under luftning (2 vol/vol/min) og omrøring (350 opm).

Fremstilling af bariumsalt

Et gæret medium vundet som beskrevet ovenfor rensedes på følgende måde: 135 liter gasringsmedium med pH 6,25 kiaredes på en centrifuge til frembringelse af en ovenstående væske i en mængde på 112 liter og med pH 6,3. Denne førtes gennem en kolonne 25 liter trækul (Pittsburgh CAL), og kolonnen gennemvaskedes med 50 liter vand. Der udhældtes forsigtigt 10 liter acetone i toppen af lejet og eluering påbegyndtes. Dette efterfulgtes af 60 liter 90%s vandig acetone. Eluatet opsamledes i fraktioner (1x10 liter, 2x25 liter).

Hver fraktion destilleredes under nedsat tryk for at fjerne acetone. Den tilbageværende vandige opløsning reguleredes til pH 6,0 med 1M natriumhydroxyd. Fraktionerne forenedes derefter og destilleredes yderligere til 2,9 liter, overførtes til en passende beholder og reguleredes op til 3,3 liter med vaskevæsker fra kogeren. Der sattes 17 liter acetone og 500 g filterhjælp "Celite" ® 535 til koncentratet under kraftig omrøring. Den resulterende suspension filtreredes og kagen vaskedes med 4 liter 85%s vandig-.acetone.

Filtratet og vaskevæskerne forenedes og kombinationen destilleredes under nedsat tryk til 4,0 liter. pH reguleredes fra 5,65 til 6,0 med 1M natriumhydroxyd, og destillationen fortsatte indtil rumfanget var 1,0 liter. Det resulterende koncentrat 20 141099 syrnedes til pH 4,0 med 20%s svovlsyre og vaskedes med 4 x 750 ml,og 1 x 500 ml butan-l-ol. Opløst butan-l-ol uddestilleredes af den vandige fase under vakuum.

Efter at være blevet reguleret til pH 4,2 med 20%s svovlsyre ekstraheredes koncentratet tre gange med en blanding af 265 ml flydendegjort fenol B.P. (dvs britisk farmakopékvalitet), 75 ml kulstoftetraklorid og 25 ml N,U-dimetylanilin. pH reguleredes til 4,2 for hver ekstrakt. De forenede opløsningsmiddelekstrakter omrørtes med 250 ml vand og pH reguleredes til 6,5 med 70 ml mættet vandigt bariumhydroxyd. Efter adskillelse af faserne genekstraheredes opløsningsmidlet med 200 ml vand og 7 ml mættet vandigt bariumhydroxyd.

De forenede vandige faser vaskedes med 3 x 200 ml diætylæter, reduceredes i vakuum til 200 ml og frysetørredes til 29,4 g lysebrunt fast stof. E^ = 152. Renhed under 25%.

Udgangsmateriale 2

Fremstilling af et trækulseluat indeholdende clavulansyre a) Udvikling af et inokulum 10 ml sterilt destilleret vand sattes til en 14 dage gammel skrålcultur af malt/gærekstrakt-agar af Streptomyces clavuligerus NRRL 3585, og der fremstilledes en suspension.

En portion på 2,0 ml af denne suspension brugtes til at pode 150 ml af et medium indeholdende % v/r sakkarose 2,0 distillers solubles 1,5 gærekstrakt 0,5 K2HP04 0,02 trypton 0,5 glycerol 1,0 og vand op til 100% i en 2 liters rund, langhalset, fladbundet kolbe.

Kolben inkuberedes ved 26°C i 48 timer på en roterende ryster (5 cm slag, 220 opm).

Indholdet af seks sådanne kolber, 90C ml ialt, brugtes til at pode seks 5 liter store fermentorer hver indeholdende 4,5 liter af et medium indeholdende 21 141099 % v/r soyabønnemel 2,i distillers solubles 0,52 kaseinhydrolysat0,52 ferrosulfat-heptahydrat 0,01 opløselig stivelse 4,7 glukose 0,78 silikone antiskumningsemulsion 0,05 rumfangs% og vand op til 100%.

Fermentorerne luftedes (0,67 vol/vol/min) og omrørtes (750 opm; to skovlhjul med 7,5 cm diameter) i 20 timer ved 28°C.

b) Gåring 25 liter inokulum fra 5 liters fermentertrinnet brugtes til at pode 475 liter medium indeholdende % v/r soyamel 3,0 ferrosulfat-heptahydrat 0,01 k2hpo4 0,01 opløselig stivelse 4,7 si1ikone-antiskumningsemulsion 0,05 rumfangs% vand indtil 100% alt i en 700 liter stor gæringsbeholder af rustfrit stål og under omrøring med 350 opm (skovlhjul med 25 cm diameter og fire 7,5 cm store prel.piader) og luftning (0,56 vol/vol/min). Gæringen udførtes ved 28°C i 92 timer og der tilsattes yderligere anti-skumningsmiddel efter behov. Gæringsmediet holdtes på pH6,5.

c) Isolation

Hele gæringsmediet fra trin (b) reguleredes til pH 5,45 med stærk svovlsyre og filtreredes på et roterende tromlefilter med celluloseovertræk. Filtratet, 430 liter, indeholdende antibio-tiket adsorberedes på 135 liter trækul (Pittsburgh CAL) i kolon ner. Trækullene vaskedes med 90 liter vand for at fortrænge det filtrerede medium, og antibiotiket elueredes med 180 liter 60%s vandig acetone.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det følgende belyses ved nogle udførelseseksempler.

141099 22

Eksempel 1 i) Fremstilling af kalciumsalt a) 8,83 g af råt bariumsalt (renhed <25%) fra udgangsmateriale 1 sattes til 50 ml mættet vandig opløsning af (NH^)2S0^. Der tilsattes 50 ml ætylacetat og blandingen omrørtes. Der indsattes et pH-prøveinstrument i blandingen og pH reguleredes fra 6,8 til 2,6 med ca. 15 ml 1M H^SO^ Den vandige opløsning skiltes fra ætylacetatet og omrørtes igen med en frisk portion ætylacetat, 50 ml. De to ætylacetatekstrakter forenedes, der tilsattes 100 ml destilleret vand og blandingen omrørtes i nærværelse af pH-prøveinstrumentet. Der tilsattes ca. 40 ml mættet opløsning af kalciumhydroxyd for at bringe blandingens pH-værdi til 6,6. Den vandige opløsning skiltes fra ætylacetatet, filtreredes gennem filterhjælp og frysetørredes, hvorved der fremkom 1,44 g fast kalciumsalt.

b) Det faste stof fra (a) opløstes i 15 ml destilleret vand, filtreredes gennem et milliporefilter og påførtes en kolonne indeholdende "Sephadex" G15, pakket i vand til et leje med en højde på ca. 150 cm og en diameter på 2,5 cm. Der foretoges eluering med destilleret vand og opsamledes fraktioner på 20 ml.

Fraktionerne bestemtes efter tyndlagskromatografering (tic; cellu-(§) (S) lose, "Eastman" "Kodak" 6065 plader; opløsningsmiddel acetonitril/ vand 7:3) ved overlejring med næringsagar indeholdende Staphylococcus aureus. Fraktionerne 33-37 forenedes og frysetørredes, hvorved der fremkom 490 mg. Det faste stof holdtes over PgO^ i vakuum i 60 timer. Kalciumsaltet fra dette eksempels afsnit (b) havde følgende karakteristika: pKa pKa-værdien for den tilsvarende syre fandtes at være ca. 2,4 ved potentiometrisk titrering af saltet.

Optisk drejning. hPd ved 22°C: + 44,9° (koncentration 0,287 g/ 100 ml vand).

UV-spektrum. En prøve på 0,00148 g, der var blevet opløst i 100 ml 0,1M NaOH, udviste absorptionsmaximum, Åmax, ved 258 nm med en E^-værdi på ca. 550.

IR-spelctrum. Det infrarøde spektrum for en prøve i nu jol udviste absorptionsmaxima ved bølgetal (cm-l) som følger: 23 141099 3300s,br 2330 v 1788s 1692 m 1604 s 1404 s 1305s 1190 m 1118 m 1082 m 1060m 1042 m 1012 m 992 m 968m 892 m 848 w 790 w 740m 654 w (s, m, br og w betegner henholdsvis stærk, middel, bred og svag intensitet).

Det fulde spektrum er vist i tegningensfigur 3.

NMR-spektrum. Det proton-kærnemagnetiske resonansspektrum i form af opløsning af prøven i tungt vand udviste grupper af toppe (t-værdier) centreret ved ca. 4,31, 5»10, 5,85, 6,46 og 6,91.

Tyndlagskromatografi. Fortioner af prøven, opløst i vand, påførtes på begyndelsen af enten "Eastman"-"Kodak" cellulose TL plader (med plastbagside, EK 6065) eller "Eastman"-Kodak" silica TL plader (med plastbagside, EiC 6060). Pladerne fremkaldtes med opløsningsmiddel ved stuetemperatur og lufttørredes derefter og blev overlejret med næringsagar indeholdende Staphylococcus aureus. Rf-vær-dier, beregnet som afstanden fra begyndelsen til midten af hver zone af inhiberet bakterievækst, divideret med afstanden fra begyndelsen til opløsningsmiddelfronten, angives nedenfor for fem.....

systemer.

Opløsningsmiddel bæremateriale Rf

Propan-l-ol/vand 7:3 cellulose 0,60 butan-l-ol/eddikesyre/vand 3:1:1 " 0,64 acetonitril/vand 7:3 * 0,68 acetonitril/vand/propan-2-ol 1:1:1 M 0,87 butanol-l-ol/eddikesyre/vand 3:1:1 silica 0,63

Papirionoforese. Portioner af prøven underkastedes ionoforese på "Whatman"^541 papir i 1 time med 400 volt påført over 20 cm. Aktiviteten, konstateret ved overlejring af det lufttørrede papir med næringsagar indeholdende Staphylococcus aureus, havde en mobilitet i forhold til cyanokobalamin på 4,5 cm henimod anoden ved pH 4,8 (0,OlM acetat), pH 6,9 (0,01M fosfat) og pH 9,5 (0,01M pyrofosfat).

24 tines 9 ii) Fremstilling af litiumsaltet 1 g af kalciumsaltet (E^ 590) fremstillet som angivet ovenfor i (i)(b) opløstes i 10 ml vand og der tilsattes 10 ml af en mættet opløsning af litiumklorid i vand. Krystallisation indtrådte uden skrabning eller podning. Efter afkøling til 0°C filtreredes krystallerne og vaskedes med 5 ml ætanol, 5 ml acetone og 2 x 5 ml diætylæter. Krystallerne tørredes under nedsat tryk til 0,1 mmHg. over silicagel i 2 timer hvorved der fremkom 495,5 mg fast litiumsalt. Dette salt havde renhed over 95% og følgende karakteristika: Elementær analyse. Fundne værdier (middelværdier anført i parentes): C 45,5, 45,8 (45,65); H 3,8, 3,8 (3,8); N 7,0, 7,2 (7,1);

Li 3,2$. Svovl blev ikke konstateret ved en metode angivet cif B.D. cheronis og J.B. Entrikin (1947) i Semimicko Qualitative Analysis side 93, Crowell, New York. Sammensætningen CgHgNO^Li, 1/41^0 fordrer C 45,84; H 4,06; N 6,68; Li 3,31$.

Den værdi for Li-analysen der er anført ovenfor, 3,2$, bestemtes ved atomabsorptionsspektrofotometri.Sulfateret aske var 26,8%, der beregnet som Li2S0^ er ækvivalent til 3,38$ litium.

pKa. pKa-værdien for den tilsvarende syre viste sig at være ca.

2,3 ved potentiometrisk titrering af saltet.

Optisk drejning. /α7ρ-vær dien for en 0,145¾ v/r vandig opløsning ved 24 °C var + 66,0°.

Ultraviolet spektrum. W-absorptionsspektret for en 0,00091$s opløsning i 0,1M natriumhydroxyd havde absorptionsmaximum (Amax) ved 258 nm med en E1-værdi på 788.

Infrarødt spektrum. IR-spektret i nujol udviste absorptionstoppe (cm-1) ved ca.: 3420 (m) 1402 (s) 1200 (w) 1026 (m) 880 (w) 3012 (w) 1338 (m) 1129 (m) 992 (m) 850 (w) 1765 (s) 1325 (s) 1101 (m) 976 (m) 734 (m) 1683 (s) 1300 (m) 1062 (m) 950 (s) 708 (w) 1618 (s) 1224 (w) 1048 (s) 900 (m)

Det fulde spektrum er vist i tegningens figur 1.

25 141099 NMR-spektrum. Et proton-kærnemagnetisk resonansspektrum ved 100 KHz for litiumsaltet i opløsning i tungt vand udviste toppe (''(/-værdier med multipler og koblingskonstanter, Hz, i parentes), centreret ved ca. 4,26 (d,3), 5,05 (t,8), 5,06 (s), 5,81 (d,8), 6,43 (dd, 3 og 17) og 6,89 (d,17).

Her betegner s, d, dd, t og m henholdsvis singlet, dublet, dobbelt dublet, triplet og multiplet.

iii) Omkrystalllsation af litiumsaltet 0,1 g af litiumsaltet fremstillet som ovenfor i (ii) opløstes i 1,0 ml vand og fortyndedes omhyggeligt med 19 ml isopropanol. Produktet krystalliserede langsomt ved 0°C og indhøstedes i to udbytter ved indkogning under nedsat tryk til 5 ml for andet udbyttes vedkommende. Krystallerne af litiumsaltet tørredes over silikagel i vakuum i 3 døgn.

Udbytte l. 20,0 mg λ____ 259 nm, = 814 i natriumhydroxydopløs-

Ώ13.Χ -L

ning (0,1M) ved 10 μg/ml.

Elementær analyse

Beregnet for CgHgNO^Li, 1/411,0: C 45,84 H 4,06 N 6,68

Pundet: C 46,2 H 4,10 46,0 3,85 N 6,8 6,7%.

Udbytte 2. 67,0 mg. \max 259 nm, E* = 800 i natriumhydroxyd (0,1N) ved lOpg/ml.

Elementær analyse

Beregnet for CgHgNO^i, 1/41^0: C 45,84 H 4,06 N 6,68, Li 3,31

Pundet: C 46,15 H 3,9 N 6,65 Li 3,4% (sulfateret aske) C 46,5 H 4,0 N 6,5

Eksempel 2 30 g af bariumsaltet (E* = 274; renhed <45%, fremstillet som udgangsmateriale 1) opløstes i 40 ml vand og der tilsattes 300 ml mættet ammoniumsulfatopløsning. Opløsningens pH-værdi reguleredes til 2,3 med 23,0 ml 20%s svovlsyre og ekstraheredes Ϊ41099 26 derefter med 2 x 300 ml ætylacetat. Der sattes 200 ml vand til de forenede ekstrakter. Blandingen omrørtes kraftigt og der tilsattes 89,3 ml 1M natriumhydroxydopløsning indtil pH-værdien nåede 6,8. Den vandige fase fraskiltes og destilleredes under nedsat tryk til 33 ml. Der sattes 770 ml butan-l-ol til det vandige koncentrat og derefter gennemblandedes der, opvarmedes til 40°C og rystedes kraftigt. Uopløseligt materiale frafiltreredes og genekstraheredes med vand/butan-l-ol 1:23 (rumfangsforhold) indtil alt opløste sig. De forenede opløsninger afkøledes til 4°C natten over. Det dannede krystallinske faste stof opsamledes ved filtrering, vaskedes med butan-l-ol og acetone og lufttørredes til 3,34 g af natriumsaltet (E^ = 648).

2,92 g af dette natriumsalt opløstes i 20 mi vand og filtreredes. Filtratet omrørtes ved 0°C mens der indførtes 20 ml litiumkloridopløsning (mættet ved 20°C) i løbet af 5 minutter. Omrøring og afkøling fortsattes i en time, hvorefter krystallerne indhøstedes ved filtrering, vaskedes med 20 ml ætanol, 2 x 20 ml acetone og 2 x 25 ml diætylæter og lufttørredes til frembringelse af 2,275 g af litiumsaltet som hvide, langagtige flade prismer (E^ = 770). Renhed over 90%.

Eksempel 3 7,99 g råt bariumsalt (eJ 288), renhed <45%, fremstillet som udgangsmateriale 1, opløstes i 60 ml vand og filtreredes. Filtratet behandledes portionsvis med 4,0 g litiumsulfat under omrøring ved stuetemperatur indtil der ikke fremkom reaktion for barium på en ydre testplade med natriumrhodizonat. Suspensionen klaredes.ved centrifugering og den ovenstående væske dekanteredes og indkogtes til ca. 35 ml under nedsat tryk. Der tilsattes portionsvis 9,0 g litiumklorid under omrøring og afkøling; efter l time ved 0°C indhøstedes litiumsaltet ved filtrering, vaskedes med 10 ml ætanol, 2 x 25 ml acetone og 2 x 20 ml diætylæter og lufttørredes i filtertragten til frembringelse af 1,590 g hvide prismer (E^ = 790). Litiumclavulanatets renhed >95%.

U1D99 27

Eksempel 4

Fremstilling af natriumsaltet 3,5 g af litiumsaltet fremstillet som i eksempel 1 (ii) opløstes i 20 ml destilleret vand og påførtes en kolonne indeholdende 50 ml "Bio-Rad" AG50x8 kationbytterharpiks (Na+; 200-400 mesh størrelse). Elueringen skete med vand og der opsaml edes fraktioner på 8 ml. Fraktionerne bestemtes efter påføring af portioner til papir ved overlejring med næringsagar indeholdende Staphylococcus aureus. Aktive fraktioner (4 til 13) forenedes og frysetørredes.

Det frysetørrede faststof opløstes i destilleret vand til 19 ml opløsning, den rystedes med 450 ml butan-l-ol og opvarmedes på et vandbad indtil opløsningen var næsten klar. Den varme opløsning filtreredes gennem et sinterfilter for at fjerne gult fast stof, og filtratet holdtes på 4°C i 60 timer. De derved dannede krystaller filtreredes, vaskedes med 2 x 10 il butan-l-ol og derefter med 2 x 10 ml acetone og tørredes under nedsat tryk ved 40°C i en time til 2,18 g fast stof. Det faste stof omkrystalliseredes fra vand/butan-l-ol 1:23,3 som beskrevet i eksempel 2. Krystallerne tørredes under nedsat tryk over silicagel ved 44°C i 1 1/2 time, og herved vandtes der 1,8 g fast natriumsalt.

Det faste stof var hygroskopisk. Det maledes med en støder i en morter og man lod det optage atmosfærisk vand ved 18°C. Efter at der var optaget ca. 22 vægt% vand nåedes der ligevægt.

Dette salt havde følgende karakteristika:

Elementær analyse af det ækvilibrerede fugtige faststof: Fundet (idet middelværdier anføres i parentes) C 33,3, 33,2 (33,25); H 4,6, 4,6 (4,6); N 4,6, 4,7 (4,65); Na 7,3 ( ved absorptions^· spektrofotometri), 7,9 (beregnet ud fra sulfateret aske); vand 21,95%. Sammensætningen CgHgO^N Na,4H20 fordrer C 32,76; H 5,46; N 4,78; Na 7,8; vand 24,57%.

Metal analyse 1) Fundet ved atomabsorptionsspektrofotometri: Na 7,3 + 0,2% (det er den værdi der er anført under elementæranalysen) 2) Under den antagelse af den sulfaterede aske er Na2S0^, beregnedes Na-indholdet til 7,9%.

28 141099

Optisk mejning. Æ7d -værdien for en 0,134% v/r vandig opløsning ved 24°C var +47°.

Ultraviolet spektrum. UV-absorptionsspektret for en 0,00098%s opløsning i 0,1M NaOH udviste absorptionsmaximum (λ^χ) ved 258 nm med en værdi for E^ på 555.

Infrarødt spektrum. IK-spektret i nujol udviste absorptionstoppe ( cm-1) ved ca.

3400 S 1592 S 1288 m 1080 ψ 986 s 850 V

3300 s 1396 s 1206 w 1060 m 967 m 802 v 1792 s 1348 m 1190 m 1048 m 945 .w 753 m 1690 S . 1310 s 1138 m 1015 s 902 m 1665 m 1302 sh 1120 m 998 m 880 v

Det fulde spektrum er vist i tegningens figur 2.

KMR-spelctrum. Det protonmagnetiske resonansspektrum fra en opløsning i tungt vand udviste grupper af toppe (T -værdier) centreret ved ca. 4,28, 5,07, 5,82, 6,44 og 6,88.

Eksempel 5

Fremstilling af kaliumsaltet 3,0 g af litiumsaltet, fremstillet som beskrevet i eksempel 1 (ii) opløstes i 100 ml vand og førtes gennem en 450 ml stor kolonne af "Dowex" 50W x 2 ionbytterharpiks i kaliumform ("Dowex" er et i Danmark indregistreret varemærke). Et forløb på 150 ml blev kasseret. De næste 400 ml eluat opsamledes og inddampedes til 15 ml under nedsat tryk. Der tilsattes 340 ml butan-l-ol og blandingen opvarmedes og rystedes godt..Noget uopløseligt fast stof frafiltreredes. Filtratet destilleredes under nedsat tryk til 200 ml og opbevaredes derefter ved 4°C natten over. Det krystallinske bundfald filtreredes, vaskedes med 2 x 10 ml butan-l-ol, 2 x 50 ml acetone og 2 x 50 ml diætyl-æter og tørredes til slut i en vakuum-désikkator ved stuetem-peratur. Udbytte 2,34 g kaliumsalt (E^ = 704). Værdien for E^ bestemtes ved at man opløste 7,1 mg af kaliumsaltet i 100 ml 1410*99 29 vand. Denne opløsning fortyndedes 1:10 med 0,1M natriumhydroxyd til en sluttelig opløsning på 7,1 pg/ml.

Elementær analyse Pundet (med middelværdier angivet i parentes): C 40,0, 40,14 (40,07); H 3,5, 3,55 (3,55); N 6,0, 5,82 (5,91)j I (ved absorptions-spektrofotometri) 16,0, (ved bestemmelse på sulfateret aske) 15,9; vand 1,75, 1,95 (1,85)$. Samensætningen CgHgN05K,l/4HgO fordrer C 39,7; H 3,5; N 5,8; K 16,2; vand 1,96¾.

Optisk drejning. Værdien af /cc^3 for en Q,2j6%s v/r vandig opløsning var 58,4°

Kalcium-, barium- og magniumsaltene af clavulansyre fremstilledes ud fra litiumclavulanat på lignende måde og viste sig at have E^-værdier på henholdsvis 53o, 576 og 713.

Eksempel 6

Fremstilling af fri clavulansyre 50C mg af litiumsaltet af clavulansyre, fremstillet som i eksempel l(ii), fordeltes mellem 10 ml ætylacetat dg 10 ml mættet vandigt natriumklorid. Der tilsattes 1 ml 2N saltsyré og blandingen rystedes kortvarigt. Den vandige fase fraskiltes og vaskedes med 10 ml ætylacetat og de forenede organiske ekstrakter vaskedes med 15 ml mættet vandigt natriumklorid. Den resulterende organiske opløsning tørredes over natriumsulfat og inddampedes næsten til tørhed, hvorved der vandtes 352 mg af den fri syre som en olie indeholdende ca. 0,5 mol ætylacetat. Forbindelsen havde følgende karakteristika: - 54,5° (c = l,o i DMSO); Afflax af en 0,00098£s opløsning i vandigt 0,1N NaOH er 258 nm (E-j- .= 590); infrarødt «.*] spektrum i nujol udviser toppe ved bl.a. 3350 1790 og 1722 cm ; NMR-toppe (DMSO-dg) indbefatter T4,31 (d, 3 Hz), 4,99 (s), 5,23 (t, 7 Hz), 5,97 (d, 7Hz), 6,37 og 6,93 (dd, 3 og 17 Hz; d, 17 Hz); toppe centreret vedf8,82, 8,00 og 5.,95 viste at prøven indeholdt ca. 0,5 mol ætylacetat per mol clavulansyre. Disse værdier viser at prøven indeholdt mindst 85 vægt^ clavulansyre.

30 »TMfl

Eksempel 7

Fremstilling af ammoniumsaltet

En kolonne på 240 ml af "Dowex" 50W omdannedes til ammoniumformen ved behandling med ammoniurnsulfat og vaskedes fri for sulfat med vand. 1,0 g af litiumsaltet af clavulansyre fremstillet som i eks. l(ii), opløstes i 15 ml vand og påførtes på kolonnen, og denne fremkaldt es med vand. Der blev udtaget fraktioner på 25 ml og de afprøvedes med hensyn til W-absorption i 0,1N natriumhydroxyd.

De aktive fraktioner (nr. 4-7) forenedes og destilleredes til næsten tørhed (2 ml) under nedsat tryk og der tilsattes 85 ml n-butanol. Blandingen destilleredes omhyggeligt ved 25°C under 0,1 mmHg-tryk indtil der udfældedes et krystallinsk materiale. Ammoniumsaltet indhøstedes ved filtrering, vaskedes med ganske lidt ætanol og acetone og vaskedes til slut med diætylæter og tørredes ved 0,1 mmHg i 6 timer hvorved der fremkom 0,54 g smudsighvide krystaller, = + 60,1° (c = 0,39% i vand); λ„„ -(0,1ΙΓ natriumhydroxyd, 8,8 μg/ml) 258 nm (E?* : 745); IH-spektre i nujol omfatter toppe ved 336o, 1780, 1700 og 1580 cm ; ?T-værdier (5% D^O) indbefatter 4,27 (d, 3Hz), 5,08 (s), 5,09 (t, 7 Hz), 5,84 (d, 7Hz), 6,43 (dd, 17 Hz, 3 Hz) og 6,89 (d, 17 Hz).

Beregnet for CgHgM^NH^ C 44,4, H 5,6, N 13,0. . ,

Fundet: . . C 44,4, H 5,6, N 13,3%.

Ved Karl Fischer analyse blev der konstateret spor af vand .(0,6%).

Eksempel 8

Fremstilling af metylaminsaltet

En kolonne på 200 ml af "Amberlite" 12-120 H+ omdannedes til metylammoniumformen ved behandling med 0,5M metylamin-opløsning i vand. Den vaskedes til neutralitet med vand og der indførtes 3,0 g metylammoniumklorid i 10 ml vand. Kolonnen vaskedes fri for klorid med vand og var så parat til brug.

1,50 g af litiumsaltet af clavulansyre, fremstillet som i eks. l(ii), opløstes i 15 ml vand og indførtes på toppen af kolonnen. Kolonnen fremkaldtes i vand og der opsamledes fraktioner på 25 ml.

UT099 31

Fraktioner nr. 3-7 forenedes ( 161 ml med vaskevæsker) og destilleredes ved 25°c/l,0 mmHg til ca. 2 ml, hvorpå der tilsattes 200 ml n-butanol. Den klare opløsning destilleredes under lignende betingelser til 20 ml, hvorved krystallisation fandt sted. Krystallerne indhøstedes ved filtrering efter en time ved 2°C, de vaskedes med 2 x 15 ml diætylæter og tørredes i 3 timer ved 1 mmHg til 1,2 g af metylaminsaltet som klynger af hvide, langstrakte prismer. /cc7^ = + 56,1° (c = 0,23% i vand); (0,IN natriumhydroxyd, 9,5 pg/ml) 260 nm (E?" = 584); IR- lUclX i.

spektret i nujol omfatter toppe ved 2500, 1790, 1692, 1632 og 1576 cm-1; 'T^-værdier (8% D2o) indbefatter 6,40 og 6,86 (dd, 17Hz, 3 Hz; d, 17 Hz), 4,24 (d, 3 Hz), 5,06 (t, 7 Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,08 (s), 7,42 (s). Beregnet for C^^O ; C 47,0, H 6,1,-» 12,2 fundet; C 46,7, H 6,1, N 12,5%.

Eksempel 9

Fremstilling af piperidinsaltet

En kolonne af ionbytterharpiks {200 ml fra "Bio-Rad" Laboratories, AG 50W x 2, 100-200 mesh H+ formen) omdannedes til piperidiniumformen med en opløsning af 75 ml piperidin i 1500 ml vand. Harpiksen vaskedes til neutralitet med vand og behandledes med 3 g piperidiniumklorid i 10 ml vand. Kolonnen vaskedes fri for klorid med vand og var parat til brug.

1,50 g litiumclavulanat, fremstillet som i eks. l{ii) indførtes på toppen af kolonnen i 15 ml vand og kolonnen fremkaldtes i vand idet der blev udtaget 25 ml store fraktioner. Fraktionerne nr.

3-6 forenedes med vaskevæsker og udgjorde herved 172 ml.

Opløsningen inddampedes til næsten tørhed ved 35°c/ 1,0 mmHg og der tilsattes rent toluen. Den olieagtige suspension inddampedes til tørhed under nedsat tryk som ovenfor og det derved vundne krystallinske faste stof tritureredes med 90 ml ætylacetat. Det krystålinske piperidiniumsaltindhøstedes ved filtrering og vaskedes med 3 x 30 ml ætylacetat og resterende opløsningsmiddel fjernedes ved 0,1 mmHg i løbet af 3 timer, hvorved der fremkom 1,775 g svagt smudsighvide prismer. = + 42,2° (c = 32 Τί1099 0. 35 % i vand) ; Xm:av = 0,1N natriumhydroxyd, 10 ug/ml) 259,5 nm (E:[ = 474); IR-spektrum. i nujol indbefatter toppe ved 3380, 2540, 1782, 1682 og 1608 cm-1;!I-værdier (8% D^o) indbefatter 6,90 (d, 17Hz), 6,44 (dd, 3 Hz og 17Hz); 4,28 (d, 3Hz), 5,08 (s), 5,84 (d, 8Hz), 5,08 (t, 7Hz), 6,84 (kompleks multiplet), 8,0-8,5 (kompleks multiplet)» Beregnet for C13H20N20,-, 0,6H20: C 52,9 H 7,4, N 9,5%. Fundet C 52,8, H 7,2, N 9,3%.

Eksempel 10

Fremstilling af triætylaminsalt

En kolonne af ionbytterharpiks ("Bio-Rad" 50W) som beskrevet i eksempel 9 omdannedes til triætylammoniumformen med en opløsning af triætylamin i vand (0,5N, 1,5 liter) og vaskedes til neutralitet med vand0 En opløsning af 3 g triætylam-moniumklorid i 15 ml vand indførtes på kolonnen, kolonnen vaskedes fri for klorid med vand og var klar til brug.

Derefter indførtes 1,5 g litiumclavulanat, frsnstillet son i eks. l(ii), på toppen af kolonnen i 15 ml vand og kolonnen fremkaldtes i vand, idet der blev udtaget 25 ml store fraktioner. Fraktionerne 4—9 blev forenet og udgjorde sammen med vaskevæskerne 175 ' ml.

Opløsningen indkogtes under nedsat tryk (35°c/l,0 mmHg) og gav en olie som indkogtes tre gange med toluen under de samme betingelser. De resulterende krystaller blev brudt op under 50 ml ætylacetat, indhøstedes ved filtrering, vaskedes med to gange 20 ml diætylæter og befriedes for tilbageværende opløsningsmiddel i en desikkator i 3 timer ved 0,1 mmHg, hvorved der vandtes 1, ^88 g af triætylammoniumsaltet som svagt smudsighvide prismer. /a7^5 = +44,3° (c = 0,22%, i vand); \max (0,1N natriumhydroxyd, 9.7 P-g/ml) 258 nm (E^ = 485); IR-spektrum i nujol indbefatter toppe ved 3250, 2080, 1784, 1700 og 1640 cm"’'1';’(.-værdier (10% D20) indbefatter 6,41 og 6,87 ( dd 17Hz, 3 Hz; d 17Hz), 4,26 (d, 3Hz), 5.07 (t, 7Hz), 5,78 (d, 7 Hz), 5,07 (s), 8,74 (t, 7Hz) og 6,78 (q, 7Hz). Beregnet for ,l/4H^0: C 55,2, H 8,0 N 9,2 fundet C 55,2 H 7,9, N 9,2%.

33 141099

Eksempel 11

En prøve af et trækulseluat fremstillet som i udgangsmateriale 2 koncentreredes vinder nedsat tryk for at fjerne acetonen. Det resulterende koncentrat (11; indeholdende 1,28 g clavulansyre bestemt ad biologisk vej) påførtes på en kolonne "Ariberlite" IRA68-harpiks (kloridformen; 100 ml). Kolonnen vaskedes med 300 ml vand og elueredes med 5% v/r vandig litiumkloridopløs-ning, idet eluatet opsamledes i fraktioner på 100 ml.

Fraktionerne nr. 1 og 2 forenedes (200 ml), inddanl·-pedes under nedsat tryk til 40 ml og henstod ved 4°C natten over. De dannede krystaller filtreredes, vaskedes successivt med 10 ml ætanol, 50 nil acetone og 50 ml diætylæter og tørredes i vakuum, hvorved der fremkom 530 mg hvidt fast stof (E^ = 802), renhed over 95%, repræsenterende et udbytte på 40,8% ud fra trækuls-eluatet. Tilsætning af et lige så stort rumfang mættet vandigt litiumklorid til moderluden efterfulgt af henstand ved 4°C gav et andet udbytte der ved oparbejdning som ovenfor androg 178 mg (E^ = 740), svarende til et yderligere udbytte på 12,7% med renhed ca. 90%.

Ved en række lignende forsøg varieredes koncentrationen af litiumklorid-elueringsmiddel, i onbyt t erharpik s en og arten af eluantens kation og den anion, hvorved der opnåedes resultater som angivet i nedenstående tabel.

141099 34

Harpiks Form Eluant E^ udbytte Renhed (molaritet) 1 % x "Amberlite" klorid litiumklorid 750 51.8 >90% IRA 68 (0f5M) "Amberlite" klorid litiumklorid 760 55,6 >90% IRA 68 ' (0,25M) "Amberlite" klorid litiumklorid 560 50,3 >65% IRA 93 (1,0M) "Amberlite" klorid litiumklorid 640 44,5 >75% IRA 93 (0,5M) "Amberlyst" klorid litiumklorid 630 54,3 >75% A 21 (1, OM) "Amberlite" acetat litiumacetat 660 56,8 >80% IRA 68 4 (0,5M) "Amberlite" formiat ammoniumformiat 520 55,8 >60% IRA 68 4 (0,5M) 3€ Produktudbytte baseret på indgående trækulseluat 4 Her fremstilledes litiumsaltet ved koncentrering af eluaterne til 1/6 rumfang og tilsætning af et lige så stort rumfang 50%s v/r litiumkloridopløsning. De resulterende litiumsalte oparbejdendes som foran beskrevet.

Eksempel 12

En prøve på 4 liter af trækulseluatet fremstillet som angivet i udgangsmateriale 2 førtes nedad mod en kolonne på 250 ml "fimber-lite" IRA68(kloridformen) og den vaskedes derefter med 250 ml vand og elueredes med 5%s v/r litiumkloridopløsning. Der opsamledes 200 ml eluat, indeholdende 73% af den indførte biologiske aktivitet En prøve på 70 ml af dette eluat behandledes med 5 rumfang propan- 2-ol under omrøring, og herved fremkom deret tjæreagtigt bundfald. Den ovenstående væske dekanteredes og koncentreredes under nedsat tryk til 7 ml. Efter henstand ved 4°C natten over filtreredes det krystallinske produkt og vaskedes successivt med ætanol, acetone og diætylæter før tørring i vakuum. Det tørre faste stof, 35 U19*9 870 mg, antoges ved biologisk bedømmelse at være over 95% rent, og det repræsenterede et udbytte på 94% fra harpikskolonneeluatet.

Eksempel 13 På en kolonne af 50 ml "Mberlite" IR&68 harpiks (kloridformen) påførtes der 840 ml trækulseluat, fremstillet som i udgangsmateriale 2, og det vaskedes med 100 ml vand og elueredes med 5$s v/r litiumklorid i propan-2-ol/vand 5:1. De første 5 rumfang af lejets størrelse koncentreredes under nedsat tryk og det antibiotiske stof krystalliseredes som i eksempel 12. Det faste stof vejede 292 mg (biologisk bedømmelse fundet til 970 pg litiumclavulanat pr. mg. faststof) og repræsenterede et udbytte på 45% fra trækulseluatet.

Eksempel 14

Et næringsmedium blev forgæret og filtreret som i udgangsmateriale 2 og en prøve på 1 liter af det filtrerede næringsmedium indeholdende 0,43 g clavulansyre (biologisk bestemmelse) førtes nedad gennem en kolonne på 100 ml "Amberlite" IRA93 harpiks (kloridformen). Kolonnen vaskedes med 200 ml fortyndet eddikesyre (0,25M) og 750 ml vand og elueredes med 1M vandig litiumkloridopløsning. De første 150 ml eluat, indeholdende 0,28 g litiumclavulanat (biologisk bestemmelse) koncentreredes under nedsat tryk til 15 ml og opbevaredes ved 4°C natten over. Produktet filtreredes, vaskedes successivt med ætanol, acetone og diætylæter og tørredes i luft til 668 mg fast stof (E^ = 245) repræsenterende et udbytte fra det filtrerede medium på 47%.

Renhed ca. 30%.

Eksempel 15

Et medium forgæredes og filtreredes som i udgangsmateriale 2 og en prøve på 2 liter filtreret næringsmedium indeholdende 1,23 g clavulansyre (biologisk bestemmelse) førtes ned 1414*99 36 gennem en kolonne på 240 ml "Amberlite" IRA93 (kloridformen).

Den vaskedes med 500 ml vand og 400 ml propan-2-ol/vand 5:1 og elueredes derefter med 5%s v/r litiumklorid i propan-2-ol/vand 5:1. De første 970 ml eluat koncentreredes under nedsat tryk til 100 ml og opbevaredes ved 4°C i to døgn. Produktet filtreredes og vaskedes som i eksempel 14og gav 286 mg fast stof (B-j^ = 662) repræsenterende et udbytte ud fra det filtrerede medium på 19%. Renhed over 80%.

Eksempel 16

Et næringsmedium forgæredes og filtreredes som i udgangsmateriale 2. 500 ml af filtratet anbragtes på en kolonne på 50 ml "Artt-berlite" IRA9 3 (k i or i df or men). Kolonnen vaskedes med 50 ml vand og 100 ml 95%s vandig ætanol før eluering med litiumklorid (l% v/r i 95%s vandig ætanol), idet der opsamledes fraktioner på 50 ml. Fraktionerne nr. 2 og 3 forenedes og inddampedes under nedsat tryk indtil der begyndte at udkrystallisere sig fast stof. Koncentratet afkøledes til +4°C i 3/4 time og det faste stof opsamledes på et sinterfilter. Det faste stof vaskedes med ætanol, acetone og diætylæter og tørredes i l/2 time ved stuetemperatur i en vakuumovn,. hvorved der vandtes 89 mg litiumelavulanat (E^ = 770), svarende til et udbytte på 32% fra det filtrerede medium. Renhed over 90%.

Eksempel 17 5 liter trækuleluat fremstillet som i udgangsmateriale 2 førtes nedad gennem en kolonne på 500 ml "Arriberlite" IRA68 i kloridformen med en hastighed på 1 liter pr. time. Kolonnen vaskedes med 1 liter vand og elueredes med 0,5M natriumkloridopløsning. Den første liter eluat koncentreredes på en roterende evaporator til 90 ml. En portion på 10 ml af koncentratet behandledes med 50 ml propan-2-oi under omrøring. Den ovenstående væske dekanteredes fra det derved dannede tjæreagtige bundfald, koncentreredes ved roterende inddampning til et rumfang på 3 ml og behandledes med 3 ml 30%s v/r litiumkloridopløsning. Efter henstand ved 4°C natten over frafiltreredes det dannede produkt, det vaskedes successivt med ætanol, acetone og diætylæter og tørredes til et hvidt pulver i en mængde på 280 mg og med E^ = 770. Benhed over 90%.

37 141099

Eksempel 18 2,0 g litium.ciavulan.at (E^ = 667; fremstillet som i eksempel 14 med efterfølgende behandling med isopropylalkohol) opløstes i 16 ml vand og filtreredes; der tilsattes omhyggeligt 64 ml ætanol og blandingen omrørt es ved stuetemperatur i en time.

Det først dannede bundfald indeholdt ikke noget litiumclavula-nat ved bestemmelse ved UV-spektroskopi, og det kasseredes. Den ovenstående væske fortyndedes med 16 ml mættet litiumkloridop-løsning og blev sat til side til krystallisation i 2 l/2 time. Krystallerne indhøstedes ved filtrering, sugedes tørre, vaskedes med 2 x 15 ml acetone og 2 x 20 ml diætylæter og tøir edes i vakuum til konstant vægt, nærmere betegnet 1,350 g. = 735.

Claims (6)

38 141090

1. Fremgangsmåde til rensning af clavulansyre med formlen H _j/4\ /Η OH pM 3>—< I \ 0^ S*'''», έτ "/coon eller et salt deraf med en base, kendetegnet ved at syren og/eller nævnte salt i rå eller uren form omsættes med en vandig ionisk litiumforbindelse undtagen litiumclavulanat til dannelse af en vandig opløsning indeholdende litiumclavulanat, der derefter udfældes derfra, hvorpå bundfaldet skilles fra den vandige opløsning indeholdende urenheder, hvorpå det isolerede litiumclavulanat om ønsket omdannes til et andet salt med en base eller til den fri clavulansyre.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at udfældningen af litiumclavulanat udføres ved at man i den vandige opløsning indeholdende litiumclavulanat indfører en tilstrækkelig koncentration af et vandopløseligt litiumsalt til at udsalte litiumclavulanatet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved at den ioniske litiumforbindelse og/eller det vandopløselige litiumsalt er litiumklorid.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved at det salt af clavulansyre, der anvendes som udgangsmateriale, er et salt dannet med en basisk ionby tterharpiks, og at harpikssaltet bringes i kontakt med den vandige ioniske litiumforbindelse i overskud til frembringelse af et vandigt eluat indeholdende litiumclavulanat som udsaltes af overskuddet af den ioniske litiumforbindelse og skilles fra tilbageværende harpiks.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved at den som elueringsmiddel anvendte vandige ioniske litiumforbindelse indeholder et vandblandbart organisk opløsningsmiddel.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved at saltet af clavulansyre med den basiske ionbytterharpiks er dannet ved at harpiksen er bragt i kontakt med et gæringsmedium indeholdende clavulansyre og/eller et salt deraf med en base.