DE2444849A1 - Verfahren zur herstellung organischer saeuren durch biologische hydrolyse - Google Patents

Verfahren zur herstellung organischer saeuren durch biologische hydrolyse

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Description

Aqence Nationale de Valorisation de la Recherche
(ANVAR)
Neuilly sur Seine, Prankreich
Verfahren zur Herstellung organischer Säuren durch biologische Hydrolyse
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von organischen Säuren durch biologische Hydrolyse der entsprechenden Nitrile, das insbesondere für die Herstellung von razemischer Milchsäure von Bedeutung ist.
Es ist schon vorgeschlagen worden, für die Herstellung organischer Säuren von großer wirtschaftlicher Bedeutung, wie beispielsweise Milchsäure und allgemein Aminosäuren, die entsprechenden Nitrile chemisch zu hydrolysieren. Dieses Verfahren ist jedoch nicht immer anwendbar, insbesondere weil gewisse Nitrile sich der chemischen Hydrolyse widersetzen. In diesem Fall muß man einen Umweg wählen. Beispielsweise kann man im Falle der Aminosäuren den Umweg über das Hydantoin erwägen. Dieses Verfahren ist zwar durchführbar, für die Technik aber zu umständlich. In anderen Fällen ist das Produkt der chemischen Hydrolyse nur schwer von den übrigen Bestandteilen des Reakrionsmediums abzutrennen.
S09831/0762
24U849
Aufgabe der Erfindung ist daher ein Verfahren, nach dem praktisch alle Nitrile hydrolysiert werden können, und zwar unter milden Bedingungen, was von besonderem Interesse ist, wenn man empfindliche Verbindungen zu behandeln hat, und wobei das Verfahren selbst außerordentlich leicht durchführbar ist und die Abtrennung der gebildeten Säure von dem Reaktionsmedium ohne Schwierigkeiten erfolgen kann.
Gemäß der Erfindung stellt man eine organische Säure aus dem entsprechenden Nitril her, indem man dieses Nitril in wäßriger Lösung der Einwirkung von Bakterien mit Nitrxlasewirkung unterwirft und dann die Bakterienmasse von der Säurelösung abtrennt. Die in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Bakterien mit Nitrxlasewirkung werden aus den Arten Bacillus, Bacteridium im Sinne, von Prevot, Mikrokokkus und Brevibacterium im Sinne von Bergey gewählt.
Vorzugsweise werden die Bakterien unter den Stämmen gewählt, die in der "Collection de la Chaire de Genetique de l'Ecole Nationale Superieure Agronomique de Montpellier unter den Nummern R 332, R 340, R 341, A 111, B 222, A 112, A 13, A 141, A 142, B 211, B 212, B 221, C 211, R 21, R 22, R 311, R 312, R 331 hinterlegt sind und die in den Tabellen I und II zusammengestellten morpholigisehen und physiologischen Eigenschaften haben.
Die Lösung des Nitrils wird vorzugsweise auf ein schwach basisches pH eingestellt, beispielsweise mit Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxyd oder Ammoniak, bevor sie der Einwirkung der Bakterien unterworfen wird.
In dem Verfahren gemäß der Erfindung werden die Stämme mit Nitrxlasewirkung nach ihrer Züchtung auf einem Nährmedium in der wäßrigen Lösung des Nitrils suspendiert, wonach sie dieses innerhalb einiger Stunden hydrolysieren. Das pH der Lösung wird
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schwach basisch (beispielsweise pH 8) oder neutral gehalten. Um die Hydrolyse zu Ende zu führen, ist es manchmal notwendig, das pH der Lösung nach etwa einer Stunde schwach sauer zu machen.
Nach Beendigung der Hydrolyse, d.h. im allgemeinen nach einigen Stunden, werden die Bakterien nach irgendeiner für biologische Verfahren bekannten Methode, beispielsweise durch Zentrifugieren, entfernt. Die Säure ihrerseits wird nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Extrahieren, Fällung usw., von der Lösung abgetrennt.
Bei einer bevorzugten Durchfuhrungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung werden die Bakterienstämme mit Nitrilasewirkung gezüchtet, indem man ein Medium, das Hefe/Kohlenstoff-Difco 1,17%, Acetonitril 0,1%, Gelatine (gelose) 2,5% enthält, in sterilen Petrischalen mit verschiedenen Keimquellen, wie Erde, Wasser oder Industrieabfällen, beimpft. Die sich bildenden Kolonien werden isoliert, wonach die Kulturen durch Verdünnen und Ausbreiten auf dem gleichen Medium gereinigt werden. Die so erhaltenen Bakterien werden untersucht.
Die in dieser Weise gezüchteten Bakterien können auf einem Medium, das Mineralstoffe, Ammoniak, Vitamine und Glukose enthält, beispielsweise glukosiertem Hefestickstoff-Difco, konserviert werden.
Die Nitrilase-wirkung der nach dem obigen Verfahren gezüchteten Stamme ist sehr allgemein. D.h. die hier beschriebenen Stämme können nahezu ohne Unterschied die folgenden Verbindungsarten hydrolysieren:
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einfache Nitrile, wie Acetonitril?
- ä-Aminonitrile, wie er-Aminopropionitril, ot-Amino- -methylthiobutyronitril, ot-Aminobutyronitril, Aminoacetonitril;
- ot-Hydroxynitrile, wie Lactonitril, Hyäroxyacetonitril? ß-Aminonitrile, wie Amino-3-propionitril;
- Dinitrile, wie Malonitrilj
- α-ungesättigte Nitrile, wie Acrylnitril;
- ct-Benzolnitrile,wie Homoveratrums äur eni tr il (3,4-Dimethoxyphenylessigsäure).
Nach dem oben beschriebenen Verfahren wurden 18 Stämme isoliert, die eine besonders interessante Nitrilaseaktivität besitzen, so daß sie zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung verwendet werden können. Diese Stämme besitzen die folgenden Eigenschaften :
Gramppsitiv; Alkohol/Säure-Reeisten» negativ.
- Ausgesprochene Aerobiosej katalasepositiv.
- Verwertung von Glukose, Rohrzucker, Maltose und Laktose auf oxydativem Weg ohne Erzeugung von Gas und ohne Ansäuerung. Kein Stamm bildet Alkohol.Hydrolysiert Stärke nicht, wächst aber Ί*ί Kartoffel.
Test auf Peststellung von Tyrosinase auf Kartoffel negativ.
- Vitaminbedarf.
- Keine Hydrolyse der Gelatine.
- Wachstum auf Ammoniak und auf Nitraten als einziger Stickstof fguelle.
- Kein Infreiheitsetzen von Schwefelwasserstoff. Kein Wachstum in Gegenwart von tibersalzener Brühe.
Alle Stämme ergeben Ammoniak bei der Züchtung auf Nitraten» ausgenommen die Stämme B 221, B 211, B 212 und C 211 ergeben sie u.a. Nitrite. Der Stamm B 222 setzt aus Nitraten Gase in Freiheit.
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Tabelle I Morphologische Eigenschaften
Zeil-Stamm Spore Beweglichkeit morpholocri e
R 332 + schwach . Stäbchen
(1,8-3,6)μ χ 0,9μ
R 340 +
R 341 +
A 111
B 222
A 112
A 13
A 141
A 142
B 211
B 212
B 221
C 211
Stäbchen 2,7μ χ 0,9μ
Stäbchen 2,7μ χ 0,9μ
- Kokken
0,9 bis 1,8μ
+ Stäbchen
(3,6-4,5)μ χ 0,9μ
schwach Stäbchen
(1,8-3,6)μ χ 0,9μ
schwach Stäbchen 2,2μ χ 0,9μ
Stäbchen (1,8-3,6)μ χ 0,9μ
Stäbchen (3,6-4,5)μ χ 0,9μ
Stäbchen 1,8μ χ 0,9μ
Stäbchen 3,6μ χ 0,9μ
schwach Stäbchen
(3,6-4)μ χ 0,9μ
schwach Stäbchen
(3,6-8,1)μ χ 0,9μ Morphologie der Kolonien
kreisförmig, glatt, konvex, rötlich, glatter Rand
kreisförmig, klein, weiß, diffuser Rand
Strähnen, sehr granulös, weiß, eben
kreisförmig, klein, "faltig, konvex, rötlich, gelappter Rand
kreisförmig, klein, von gelb-oranger Farbe
klein, trüb, erhaben, gelappter Rand, rötlich orange
kreisförmig, glatt, trüb, orange-rötlich, glatter Rand
klein, fast eben, trüb, granulös, orangerötlich, gelappter Rand
kreisförmig, glatt, trüb, orange, glatter Rand
kreisförmig, gewölbt, klein, glatt, rötlich, glatter Rand
kreisförmig, gewölbt, glatt, rötlich, glatter Rand
kreisförmig, stark gelappt , erhaben, von gelb-oranger Farbe
kreisförmig, glatt, glänzend, rötlich, glatter Rand
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Tabelle I (Forts.)
Stamm SP°re Beweglichkeit
R 21
R 22
R 311
R 312
R 331
Stäbchen 5,4μ χ Ο,9μ
schwach Stäbchen 2,7μ χ 0,9μ
schwach Stäbchen
(1,8-3,6)μ χ 0,9μ
Stäbchen (4,5-9)μ χ 0,9μ
Stäbchen 4,5μ χ 0,9μ Morphologie der Kolonien
kreisförmig , eben, rötlich, granulös, leicht gelappter Rand
kreisförmig, glatt, orange, erhaben, glatter Rand
kreisförmig, gelb, erhaben, glatter Rand
kreisförmig, konvex, gelb, glatter Rand
kreisförmig, rötlich, eben, diffus und trüb
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Tabelle II
Wesentliche physioloqische Eigenschaften
Test-
Zitronen-
Eiweiß-
stamms ^sr^1^
R 332
R 340 + +
R 341 - +
A 111 - + + wenig
B 222 + +
A 112 - + +
A 13 - +
A 141 - +
A 142 - + +
B 211 - + +
B 212 - - + +
B 221 - + +
C 211 - +
R 21 - + +
R 22 - + +
R 311 - ■ + +
R 312 - + wenig
R 331 - + - +
optimales
PH
6,5 6,5 6,0 6,5 6,0 6,5 6,0 6,5 6,0 6,5 6,0 6,5 6,0 7,5 6,0 6,0 6,0 6,0
Acetyl-
methylcarbinol" erzeugung
stark
schwach
schwach schwach schwach stark
schwach
Die Stämme C 211, R 312, B 222, A 111, R 341, R 340 und R 332 sind im Centraal Bureau voor Schiramelcultures (Holland) hinterlegt unter den Nummern:
C 211 ; CBS
R 312 ! CBS 717-73
B 222 : CBS
A 111 : CBS
R 341 j CBS
R 340 ; CBS
R 332 ! CBS
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Der Stamm R 332 stammt von der Art Bacillus, besitzt jedoch eine schwache proteolytische Wirkung. Die Stämme 340 und R 341 sind dem Stamm Bacteridium im Sinne von Prevot ähnlich. Die übrigen Stämme sind asporiseh» Der Stamm A 111 ist ein Micrococcus. Alle anderen Stämme sind der Art Brevibacterium inr Sinne von Bergey verwandt. Der Stamm B 222 ist dem Brevibacterium imperiale sehr nahe verwandt.
Obwohl in einigen Fällen (beispielsweise beim Homoveratrumsäurenitril) die geringe Wasserlöslichkeit des Nitrile ein Problem darstellt, behindert sie die Nitrilasewirkung der in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendbaren Bakterien nicht beträchtlich.
Ein Vorteil des Verfahrens gemäß der Erfindung liegt darin, daß die bei Beendigung des Verfahrens noch aktiven Bakterien zurückgeführt werden können, so daß in gewissem Ausmaß halbkontinuierlich gearbeitet werden kann und damit der notwend ige Zusatz an Kaliumcarbonat und Ammoniak zu Beginn der folgenden Umsetzung gesenkt wird.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Die gemäß der Erfindung verwendeten Stämme können auf billigen Medien gezüchtet werden. Insbesondere können als Kohlenstoffquelle die Hexadecane oder die "Gasöle" verwendet werden (was die Deparaffinierung der Gasöle ermöglicht),oder Laktoserum kann als vollständiges Medium verwendet werden.
Die folgenden Beispiele wurden alle mit dem Stamm R 312, hinterlegt in der "Collection de la Chaire Genetique de 1'Ecole Nationale Superieure Agronomique de Montpellier"
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und außerdem im Centraal voor Schimmelcultures (Holland) unter der Nummer CBS 717-73 hinterlegt. Diese Beispiele sollen insbesondere die unspezifische Wirkung der gezüchteten Stä mme zeigen. Aus diesem Grund wurden sie alle mit dem Stamm R 312 durchgeführt. Fast alle Stämme eignen sich aber für die Durchführung der unten beschriebenen Hydrolyen.
Beispiel 1 Herstellung von razemischer Milchsäure
Der Stamm R 312 wird auf einem Medium, das als Kohlenstoffquelle Glukose enthält, gezüchtet. Nach dem Wachsen werden die Zellen abzentrifugiert, mit physiologischem Wasser gewaschen und dann in einem Reaktionsmedium suspendiert, daß aus einer Lösung von 10 Gew.-% von durch chemische Synthese erhaltenem Laktonitril besteht. Der pH-Wert wird mit Kaliumcarbonat oder Ammoniak auf eingestellt. Die Bakterienzellen, die etwa 20 bis 40 g Trockenmasse je Liter bilden, bewirken die vollständige Hydrolyse des Nitrils innerhalb von 2 bis 3 Stunden bei 25 C unter Bewegen. Sie werden dann durch Zentrifugieren abgetrennt. Die überstehende Lösung enthält das Ammoniumlaktat, das durch Trocknen in quantitativer Ausbeute erhalten werden kann. Das Produkt kann für viele Zwecke als solches verwendet werden, beispielsweise als Enthärtungsmittel für Waschflüssigkeiten. Die Milchsäure kann auch nach jeder anderen bekannten Methode gewonnen werden. Beispielsweise kann man nach Ansäuern eine kontinuierliche Extraktion mit Äthyläther oder irgendeinem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel durchführen und auch damit eine quantitative Ausbeute erzielen. Diese Milchsäure wird einerseits in der Nahrungsmittelindustrie, andererseits in der chemischen oder pharmazeutischen Industrie verwendet.
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Beispiel 2 Modifikation des Verfahrens von Beispiel 1
In diesem Verfahren wird das Laktonitril in situ durch Einwirkenlassen einer wäßrigen Acetaldehydlosung auf eine gleichmolare wäßrige Cyanwasserstofflösung in den gleichen Konzentrationen wie oben synthetisiert. Das pH der Lösung wird durch Zugabe von konzentriertem Ammoniak auf ungefähr 5 eingestellt, um die Umsetzung ablaufen zu lassen. Dann wird in einer zweiten Stude das pH der Lösung mit Ammoniak auf 8 eingestellt, die Bakterienzellen werden in einer Menge von 20 bis 40 g Trockengewicht je Liter in dem Medium suspendiert, und die Hydrolyse erfolgt in zwei bis drei Stunden wie in dem vorhergehenden Beispiel .
Beispiel 3 Herstellung von Glykokoll
Wie in den vohergehenden Beispielen wird der Stamm R 312 auf einem Medium, das als Kohlenstoffquelle Glucose enthält, gezüchtet. Nach dem Wachsen werden die Zellen abzentrifugiert, mit physiologischem Wasser gewaschen und dann in einem Reaktionsmedium, das eine wäßrige Lösung von 6% Glyzinnitril (in der Form des Chlorhydrats)ist, suspendiert. Das pH der Lösung wird mit Kaliumcarbonat oder Ammoniak auf etwa 8 eingestellt. Die Bakterienzellen, die 60 bis 80 g Trockenmasse je Liter bilden, bewirken die vollständige Umwandlung des Nitrile in Säure in etwa 5 Stunden bei 25 C, wobei das pH eine Stunde lang bei 8 und die folgenden 4 Stunden bei 7 gehalten wird.
Die Zellen werden dann abzentrifugiert, und von der verbleibenden Lösung wird das Glykokoll gefällt, indem man die Lösung auf 1/5 ihres Volumens einengt und in der Kälte Methanol zusetzt.
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Beispiel 4 Herstellung von razemischem g-Alanin
Der Stamm R 312 wird auf einem Medium, das als Kohlenstoffquelle Glucose enthält, gezüchtet. Nach dem Wachsen werden die Zellen abzentrifugiert, mit physiologischem Wasser gewaschen und dann in einem Reaktionsmedium, das aus einer wäßrigen Lösung von 5 Gew.-% des Chlorhydrats von ct-Aminopropionitril besteht, suspendiert. Das pH wird auf 8 eingestellt und zwei Stunden auf diesem Wert gehalten. Die Bakterienzellen, die in einer Menge von 20 bis 40 g Trockenmasse je Liter anwesend sind, bewirken eine vollständige Hydrolyse der Lösung
ο
in zwei bis drei Stunden bei 25 C unter Bewegen. Nach Abzentrifugieren der Zellen enthält die Lösung etwa 40 g ct-Alanin je Liter, das nach bekannten Methoden gewonnen werden kann.
Beispiel 5 Herstellung von ß-Alanin
Der Stamm R 312 wird wie oben gezüchtet und gewonnen. Er wird in dem Reaktionsmedium, das aus einer wäßrigen Lösung von Amino-3-propionitril von 5 Gew.-% besteht, suspendiert. Das pH wird auf 8 eingestellt und 30 Minuten auf diesem Wert gehalten. Dann wird das pH auf 7 gesenkt und für fünf Stunden !bei 25°C unter Bewegen auf diesem Wert gehalten. Die Bakterienzellen, die 60 bis 80 g Trockenmasse je Liter bilden, bewirken unter diesen Bedingungen eii e vollständige Hydrolyse. Nach Abtrennen der Zellen durch Zentrifugieren enthält die Lösung etwa 60 g/l ß-Alanin, das nach bekannten Methoden gewonnen werden kann.
Beispiel 6 Herstellung von razemischem Methionin
Der Stamm R 312 wird gezüchtet und gewonnen, wie oben beschrieben.
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Er wird in einem Reaktionsmedium, das aus einer wäßrigen 6%-igen Lösung von a-Amino- methylthiobutyronitril besteht, suspendiert. Das pH wird auf 8 eingestellt. Die Bakterienzellen, die iner Menge von 20 bis 40 g Trockenmasse je Liter anwesend sind, bewirken die Hydrolyse innerhalb von drei Stunden bei 25°C unter Beilegen. Nach Abtrennen der Zellen durch Zentrifugieren wird die Lösung auf 1/3 ihres Volumens eingee ngt, und das pH wird auf 7 eingestellt. Das Methionin fällt aus. Die Ausbeute beträgt etwa 80%.
Beispiel 7
Wie in Beispiel 2 kann das a-Amino- -methylthiobutyronitril in situ aus Methylmercaptopropionaldehyd, Ammoniak und Alkalicyanid in stöchiometrischen Verhältnissen hergestellt werden. Nach Beendigung der Umsetzung werden die Bakterien suspendiert, und es wird weiter verfahren wie in Beispiel 6.
Es müssen noch einige Bemerkungen zum Reaktionsgleichgewicht angefügt werden, um der Toxizität der Cyanide Rechnung zu tragen.
Im Falle daß das hydrolysierte Nitril mit der Blausäure ins Gleichgewicht kommt:
Einerseits sind die gemssenen Konstanten in jedem Fall sehr günstig für das Nitril.
Andererseits wird durch die Hydrolyse das Gleichgewicht in Richtung des vollständigen Verbrauchs des in dem Medium anwesenden Cyanide verschoben.
Nichtsdestoweniger muß die Konzentration an Cyanid in den gebildeten Produkten dauernd überwacht werden, um jeden Zufall
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auszuschalten, da eine Abweichung von den stöchiometrischen Verhältnissen zu Beginn der Umsetzung immer möglich ist.
Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung kann also leine große Anzahl von Nitrilen unter milden Bedingungen in einem einfachen ReaTctionsmedium hydrolysiert werden, und es können in quantitativen Ausbeuten sehr reine Verbindungen erhalten werden.
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Claims (10)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung organischer Säuren durch Hydrolyse der entsprechenden Nitrile, dadurch gekennzeichnet, daß man das Nitril in wäßriger Lösung der Einwirkung von Bakterien mit Nitrilasewirkung unterwirft.
2. Verfahen nach Anspruch 1, dadurch gekennezeichnet, daß die Bakterien der Art Bacillus, Bacteridium im Sinne von Prevot, Mikrokokkus und Brevibakterium im Sinne von Bergey sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien solche der Stämme Nr. R 332, R 340, R 341, A 111, B 222, A 112, A 13, A 141, A 142, B 211, B 212, B 221, C 211, R 21, R 22, R 311, R 312, R 331, hinterlegt in der Chaire de Genetique de l'Ecole Nationale Superieure Agronomique de Montpellier, die die in den Tabellen I und II angegebenen morphologischen und physiologischen Eigenschaften haben, sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, daurch gekennzeichnet, daß man einen der folgenden Stämme verwendet:
C 211: CBS
R 312 : CBS 717-73
B 222 : CBS
A 111 : CBS
R 341 : CBS
R 340 : CBS
R 332 : CBS
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
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gekennzeichnet, daß man in neutraler oder basischer Lösung arbeitet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Nitril der Wirkung der Bakterie unterwirft, indem man eine Kultur der Bakterien in einer wärßgen Lösung des Nitrils suspendiert.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das pH der Lösung wenigstens einmal während des Verlaufs der Umsetzung ändert.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem empfindlich konstanten pH arbeitet.
9. Verfahen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Beendigung der Umsetzung die Bakter ienmase von de r Lösung abzentrifugiert.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2 sowie 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man gezüchtete Bakterien verwendet, die sich auf einem Medium, das 1,17% Hefekohelnstoff-Difco, 0,1% Acetonitril und 2,5% Gelatine (gelose) enthält, entwickeln.
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