DE2631047C3

DE2631047C3 - Verfahren zum Herstellen von biologischen Proteinen Mikroorganismen der Art Prototheca

Info

Publication number: DE2631047C3
Application number: DE2631047A
Authority: DE
Inventors: Ludwig Rom Degen; Lamberto Monterotondo Formiconi; Antonio Rom Senni; Pasquale Mentana Zaffaroni
Original assignee: SnamProgetti SpA
Current assignee: Anic SpA
Priority date: 1975-07-10
Filing date: 1976-07-09
Publication date: 1978-06-08
Also published as: DK141760C; ZA763893B; FR2317355A1; DK141760B; NL175433B; AU1556476A; DE2631047A1; DE2631047B2; AU507816B2; DK311676A; FR2317355B1; NL7607713A; NL175433C; BE843992A; SU708997A3; ATA508976A; CH629372A5; LU75347A1; AT354966B; SE7607909L

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von biologischen Proteinen durch die Wirkung von Mikroorganismen der Art Prototheca, die aliphatische Alkohole mit niederem Molekulargewicht oxidieren.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren angewandten Mikroorganismen gehören zur Gruppe Prototheca.

Die Erfindung betrifft auch Proteinprodukte, die abgeleitet sind von Mikroorganismen, die als Nahrungszusatz für Menschen und Tiere angewandt werden können.

in der Literatur sind zahlreiche (Fermentations)-Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen angegeben, die proteinische Substanzen liefern. Es sind z. B. Verfahren zur Züchtung von Hefen auf Kohlenhydraten angegeben wie sie in Melasse enthalten sind, Sulfitbädern von Papiermühlen und n-Alkanfraktionen von leichtem Benzin. Ähnliche Verfahren sind auch zur Erzeugung von Biomassen mit Hilfe von Bakterien beschrieben.

Während des Fortschreitens des auf die Bildung von Hefen und Bakterien gerichteten Wachstums (Fermentation) tritt ein beachtlicher Wärmestau (heat-build up) auf, aufgrund der Oxidation des Substrates, der umso stärker ist, je niedriger der Oxidationsgrad des Substrates selbst ist.

Die Anwendung teilweise oxidierter Substrate verringert den Sauerstoffverbrauch und die Wärmeentwicklung. Ferner werden die Kühlkosten wesentlich verringert durch die Anwendung von Mikroorganismen, die bei hohen Temperaturen wachsen.

Bei vielen Verfahren zur Bildung von Biomassen kann eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln erforderlich werden, um unerwünschte Substratrückstände oder schädliche Verbindungen, wie hochmolekulare Kohlenwasserstoffe oder polycyclisch^ Kohlenwasserstoffe und ähnliches, zu entfernen.

Alkohole stellen Substrate dar, die sehr gut geeignet sind zur Bildung von Bioproteinen. Sie sind wasserlöslich, bereits teilweise oxidiert und werden in großtechnischem Maßstab in hoher Reinheit hergestellt. Von den aliphatischen Alkoholen werden in erster Linie Metha

nol und Äthanol angewandt

Wirtschaftliche Überlegungen machen es erforderlich, daß die Substrate fOr die Bildung von Bioproteinen billig sind.

Im Vergleich mit Abfallprodukten sind die Kosten für Äthanol verhältnismäßig hoch. Es ist daher erforderlich, daß das Substrat vollständig ausgenutzt wird.

Es ist Aufgabe der Erfindung, Stämme von heterotrophen Algen von der Art Prototheca zu züchten, die

ίο Äthanol als Substrat verwerten. Bei der Verwendung von Äthanol als Substrat werden zahlreiche Nachteile anderer Substrate vermieden. Natürlich ist Äthanol leicht zugänglich und kann als Nährstoff angewandt werden. Es treten keine Toxizitätsprobleme auf, da es in hoher Reinheit hergestellt wird, und außerdem ist Äthanol flüchtig, und möglicherweise noch vorhandene Reste können leicht während des Trocknens der Zellen entfernt werden. Ferner tritt kein Problem bezüglich der Verteilung des Substrats in dem Nährmedium auf, wie bei Polysacchariden und Kohlenwasserstoffen.

Die erfindungsgemäß angewandten Stämme besitzen darüber hinaus den Vorteil, daß sie bei Temperaturen bis zu 40⁰C, vorzugsweise bei 33 bis 37° C bei einem weiten pH-Bereich (pH 1,0 bis 8,0), vorzugsweise pH 3,0 bis 5,0 wachsen, eine Tatsache, die die Gefahr einer bakteriellen Infektion während des Wachstums verringert. Viele Mikroorganismen wachsen nicht in alkoholhaltigen Substraten, andere wachsen nur dann, wenn die Konzentrationen niedrig sind. Die erfindungsgemäß angewandten Stämme wachsen im Gegensatz dazu auch bei hohen Konzentrationen gut, und nur Konzentrationen über 4% hemmen das Wachstum.

Die erfindungsgemäßen Prototheca-Stämme wurden isoliert und ausgewählt aus Erdproben, die entnommen worden sind bei Harcourt, Nigeria, und werden bezeichnet dürr h die Nummern 855 A, 855 B und 855 C. Die Kultur- und physiologischen Charakteristika sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I
Züchtungs- und physiologische Charakteristika

A. Züchtungscharakteristika

Festes Medium (24 h)(Pepton-Glukose):
Durchmesser der Kolonien: 2 bis 3 mm,

brüchig, grob, opak, ohne Pigmente
Flüssiges Medium (24 h)(Pepton-Glukose):

Sediment, dünner Film

B. Charakteristika des Vegetationszyklus

Bildung von 2 bis 8 Aplanosporen (Endosporen)

Nach dem Aufbrechen der Mutterzelle wiederholen die Aplanosporen den Zyklus, und einige bilden Hypnosporen (»ruhende Zellen«)

C. Charakteristika der vegetativen Zellen

Spheroid oder ellipsoid mit einer Größe von 15 bis 25 χ 20 bis 30 μηι. Bildung von Aggregaten. Kern und Vorratsvakuolen (storage granules) gut sichtbar.

D. Geschlecht

Es wurde kein Sexualzyklus beobachtet.

E. Physiologische Eigenschaft

1) Ausnutzung verschiedener Kohlenstoffquellen a. fermentative Verwertung (zum Wachstum)

Glukose saue.*,

<^s ohne Gas,

langsam

Galaktose negativ

Sucrose neeativ

Maltose	negativ
Lactose	negativ
Raffinose	negativ
Melibiose	negativ
Inulin	negativ
Stärke	negativ
α-Methyl-D-glukosid	negativ

b. assimilative Verwertung von Kohlenstoffquellen

D-Glukose positiv

D-Galaktose negativ

Sucrose negativ

Fructose positiv

Maltose negativ

Lactose negativ

Raffinose negativ

Melibiose negativ

Inulin negativ

lösliche Stärke negativ

Λ-Methyl-D-glukosid negativ

L-Sorbose negativ

Salicin negativ

Arbutin negativ

Cellobiose negativ

Trealose negativ

Melizitose negativ

D-Xylose negativ

D-Arabinose negativ

L-Arabinose negativ

D-Ribose negativ

L-Rhamnose negativ

Methanol negativ

Äthanol positiv

n-Propanol positiv

Iso-propanol negativ

n-Butanol positiv

tert.-Butanol negativ

Cyclohexanol negativ

Glycerin positiv

Erythrit negativ

Ribit negativ

Dulcit negativ

D-Mannit negativ

Sorbit negativ

Inosit negativ

DL-Milchsäure negativ

Bernsteinsäure negativ

Citronensäure negativ

η-Paraffin positiv

2) Verwertung verschiedener Stickstoffquellen Ammonium, Nitrat und Harnstoff

3) Wachstumsfaktoren
erfordert Thiamin

4) Wachstum bei unterschiedlichen Temperaturen 4°C negativ bis 42° C positiv

54°C negativ

Arnold und Ahearn (Mycologia, Band 64, Seite 265, 1972) haben vor einiger Zeit einen Schlüssel zur Klassifizierung von Prototheca vorgeschlagen, nachdem die erfindungsgemäßen Stämme zur Gruppe der P. Zopfii-Arten gehören.

Die mit den Symbolen 855 A, B und C bezeichneten Stämme unterscheiden sich jedoch gegenüber der (15 Standardbeschreibung von P. Zopfii und gegenüber den in den Sammlungen vorhandenen Stämmen (wie von Prof. Liferri, Pavia erhalten, siehe Tabelle II).

Tabelle II	855 A	P. Zopfii	P. Zopfii (Literatur)
	negativ negativ positiv	positiv negativ negativ	positiv positiv
D-Galaktose iso-Pentanol Wachstum bei 42° C

Der Stamm 855 A (wilder Typ) kann so als stabile und definierte Variante der Spezies P. Zopfii angesehen werden. Es wird der Name Prototheca Zopfii, Var. Harcourt, vorgeschlagen, bei der in Tabelle I angegebenen Standardbeschreibung. Der Stamm wurde beim Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn hinterlegt und erhielt die Nummer CB 5 26 S. 75.

Die Zellen von Prototheca Zopfii, Var. Harcourt 855 A, wie sie erfindungsgemäß zur Bildung von Bioproteinen angewandt werden, werden in Kulturmedien gezüchtet, die bis zu 4% Äthanol als Kohlenstoffquelle, Stickstoffquellen, Mineralsalze und Wachstumsfaktoren enthalten. Thiamin kann als solches oder in Form von Maiswasser oder Melasse oder Hefeextrakt zugesetzt weiden. Das Äthanol als Kohlenstoffquelle kann auf einmal vor der Fermentation (Wachstum) oder in kleinen Anteilen während der Fermentation zugesetzt werden. Es ist jedoch bevorzugt, Äthanol kontinuierlich während der fortschreitenden Fermentation zuzusetzen, um eine vollständigere Verwertung zu ermöglichen.

Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von 15 bis 40⁰C, vorzugsweise 30 bis 38° C bei einem pH-Wert im Bereich von 1 bis 8, vorzugsweise von 3,0 bis 5,0 durchgeführt.

Nach dem oben beschriebenen Verfahren wird eine Ausbeute von 60 bis 70% (g trockene Biomasse/g Äthanol) erhalten bei einer Zellkonzentration in der Kultur von 20 bis 60 g/l.

Ein außergewöhnlicher Vorteil dieses Verfahrens ist die Anwendung von heterotrophen Algen von der Art Prototheca. Aufgrund ihrer Größe sind sie natürlich leicht gewinnbar.

Bei ansatzweisem Arbeiten werden die Zellen gewonnen durch Sedimentation oder Filtration nach vollständiger Fermentation. Das gleiche Verfahren wird angewandt, um die Biomasse bei kontinuierlichen Verfahren zu gewinnen.

Die auf diese Weise erhaltene und getrocknete Biomasse enthält ungefähr 50 bis 60% rohe Proteine zusammen mit Polysacchariden, Lipiden und Nucleinsäuren.

Erfindungsgemäß ist es möglich, Biomassen mit hohen Proteingehalten herzustellen durch Züchtung von heterotrophen Algen der Art Prototheca in einem einfachen Kulturmedium, das Äthanol als einzige Kohlenstoffquelle enthält.

Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

(NH₄J₂SO₄	■ H₂O	5 g/l
NaH₂PO₄		IO g/l
KH₂PO₄	H₂O	10 g/l
MgSO₄ · 7	H₂O	0,2 g/l
FeSO₄ 7	2 mg/1

ZnSO₄ - 7 H,O	2 mg/1
CaCI₂	2 mg/1
Hefeextrakt	500 mg/1
Lösung von Spuren
elementen I ** JO I	1 ml
Losung der Spurenelen CuSO₄ · 5 H₂O	nente besta 5 mg/1
H₃BO₃	500 mg/1
MnSO₄ · H₂O	500 mg/1
KJ	10 mg/1
CaCi₂ ■ 6 H₂O	10 mg/1
MoO₃	10 mg/!

Nach Einstellung des pH-Wertes auf 5,0 wurde das Medium in Mengen von jeweils 100-ml in 500-ml-Kolben gegeben und nach 30 Minuten langem Sterilisieren bei 116°C wurde 1% Äthanol (VoL/Vol.) zugegeben. Die Kolben wurden dann mit einer 3 Tage alten Kultur (30⁰C) des Stammes 855 A von einer Schräge beimpft, enthaltend das g'eiche Medium und 2% Agar-Agar, und anschließend unter Rühren (Orbital-Rührer) bei 220 UpM bei 30⁰C inkubiert. Nach 24 Stunden langer Inkubation wurden weitere 2% Äthanol zugegeben.

Die Ausbeute an trockenen Zellen nach 33 Stunden langer Inkubation betrug 18,7 g/l.

Beispiel 2

Es wurde eine Fermentation bei 40⁰C durchgeführt, wobei die anderen Bedingungen des Beispiels I nicht verändert wurden. Die Ausbeute an trockenen Zellen nach 48 Stunden langer Inkubation betrug 13,5 g/l.

Beispiel 3

Es wurde ein Kulturmedium wie in Beispiel 1 hergestellt, das jedoch anstelle von Hefeextrakt 1,5 g/l Maiswasser (C. S. L.) enthielt. Die Ausbeute, als Trockengewicht, nach 34 Stunden langer Fermentation unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen bei 35° C betrug 17,5 g/l.

ben, beimpft und 24 Stunden unter Rühren (800 UpM) bei 35°C inkubiert unter Einleiten von 0,5 Vol./ Vol. χ min. Luft.

Zwei Laborfermenter der in Beispiel 4 beschriebenen Art, enthaltend jeweils 101 des gleichen Kulturmediums und 1% Äthanol, wurden mit jeweils 1,5! dieser Vorkuitur beimpft. Die Fermenter wurden mit 1000 UpM gerührt und mit 0,5 VoL/Vol. χ min. belüftet. Die Fermentationstemperatur eines Fermenters betrug 30°C, die des anderen 35°C. Um den pH-Wert auf dem gewünschten Wert (ungefähr 4) zu halten, wurde ein Gemisch angewandt, bestehend aus 32%igem wäßrigem Ammoniak und 95%igem Äthanol im Verhältnis 20 :80. Durch Zugabe dieses Gemisches wurde nicht nur der pH-Wert auf einem optimalen Wert für das Wachstum gehalten, sondern auch die Kohlenstoffquelle automatisch zugegeben.

Nach 20 Stunden langer Inkubation betrüg die Konzentration an Biomasse 20,6 g/l (30⁰C) bzw. 21,3 g/l (35°C).

Die Rührgeschwindigkeit wurde dann auf 1500 UpM erhöht und mit 0,75 V0I./V0I. χ min belüftet. Nach weiteren 25 Stunden betrugen die Konzentrationen an Biomasse 53,2 g/l (30° C) bzw. 58,1 g/I (35"C).

Mit 2 I der 35°C-Kultur wurde ein dritter Fermenter der gleichen Art, enthaltend 10 I des gleichen Kulturmediums beimpft und ebenfalls bei 35°C unter Rühren mit 1500UpM und einer Luftzufuhr von 0,75 Vol./ Vol. χ min inkubiert. Nach 8 Stunden langer Inkubation erhöhte sich die Konzentration an Biomasse von 10,3 g/l auf 33,1 g/l.

Beispiel 6

In einem 16-l-Fermenter, der mit einem Turbinenrührer und 4 (antisloshing) Prallplatten versehen war und 7 I Medium enthielt, wurde eine Kultur des Stammes 855 A entsprechend Beispiel 4 hergestellt.

Für die kontinuierliche Fermentation wurde ein Nährmedium (Einspeislösung) hergestellt in der folgenden Zusammensetzung:

Beispiel 4

in kleine Laborfermenter, die mit einem Turbinenrührer und 4 (antisloshing) Prallplatten versehen waren und ein Volumen von 16 1 besaßen, wurden 10 I des Mediums entsprechend Beispiel 1 gegeben, mit dem einzigen Unterschied, daß die Konzentration an Phosphatsalzen 2 g/l anstelle von 10 g/l betrug. Nach 30 Minuten langem Sterilisieren bei 116⁰C wurden die Fermenter mit 10% einer 21 Stunden alten Kultur von dem Stamm 855 A in einem Kolben mit dem gleichen Medium wie in Beispiel 1 von 35°C beimpft. Die Züchtung wurde bei 35°C unter Rühren mit 1000 UpM und einer Belüftung von 0,5 Vol./Vol. χ min. durchgeführt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Soda während der ganzen Fermentationszeit auf 4,0 gehalten. Äthanol wurde zu Beginn (1 Vol.-%) und nach 24 Stunden (2 Vol.-%) zugegeben.

Nach 43 Stunden langer Fermentation wurden die Zellen auf Papier abfiltriert und nach dem Waschen mit Wasser bei 90⁰C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an trockenen Zellen betrug 50,5 g/l, enthaltend 52,56% rohe Proteine (N χ 6.25) und 4,73% Lipide.

Bei sp ie! 5

Ein Laborfermenter mit einem Volumen von 20 I, enthaltend 121 des in Beispiel 4 angewandten Kulturmediums, wurde, wie in diesem Beispiel angege

Na^HPO₄ · H₂O	2.0 g/l
KH₂PO₄	2,0 g/l
(NH₄J₂SO₄	5,0 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,2 g/l
FeSO₄ · 7 H₂O	22 mg/1
ZnSO. ■ 7 H₂O	20 mg/1
CaCl:	20 mg/1
Lösung von Spuren
elementen	2 ml/1
Hefeextrakt	0,5 g/l
Äthanol (S₀)	37,6 g/l

Das Medium (ohne Äthanol) wurde auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und 30 Minuten bei 116°C sterilisiert.

Mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit (D = μ) von 0,190 h-', 2000 UpM und einer Belüftung von 1,5 Vol./ Vol. χ min erhielt man die folgenden Ergebnisse:

S = Konzentration von Äthanol

in der Kultur 0,067 g/l
X = Konzentration von Biomasse

in der Kultur 25,12 g/l

Yiub = Ausbeute (g Biomasse/g Substrat) 0,66

P = Produktivität 4,8 g/l χ h

Die Biomasse wurde abzentrifugiert und nach Waschen mit Wasser wurde sie im Vakuumofen

getrocknet. Die Zusammensetzung der Biomasse ist in Tabelle III angegeben.

Tabelle III

Analysedaten der Biomasse von Prototheca Zopfii, Var. Harcourt 855 A

Feuchtigkeit 0,60%

Aschen 7,04%

N (Kjeldahl) 8,45%

Rohe Proteine (N χ 6,25) 52,62%

Protein (Biuret) 45,70%

Rohe Lipide 4,82%

Fettsäuren 3,08%

Lösliche Kohlenhydrate 11,96%

Rohe Fasern 2,50%

RNS 15,17%

DNS 0,42%

Elementaranalyse:

C = 46,10%
H = 6,71%
N = 8,32%

Prozentuale Zusammensetzung der Fettsäuren:
n-C_M 1,38%

n-C,6 29,12%

n-Ci„: 1*)

n-C,8

n-Ci» : I

n-C_ls:2

*) Doppelbindungen

0,90% 4,44% 28,46% 35,70%

Prozentuale Zusammensetzung der Aminosäuren (g/100 g trockener Biomasse)

Lysin	1,88
Histidin	0,779
Arginin	5,11
Aspartinsäure	3,03
Threonin	1,73
Serin	1,56
Glutaminsäure	4,85
Prolin	3,13
Glycin	1,98
Alanin	2.26
Valin	2,11
Methionin	0,83
Isoleucin	1,12
Leucin	2,95
Tyrosin	1,32
Phenylalanin	1,55
Tryptophan	0,23

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen von biologischen Proteinen durch Mikroorganismen der Art Prototheca, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Kulturmedium gewachsen sind, das Äthanol als einzige Kohlenstoffquelle enthält

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Kulturmedium gewachsen sind, in dem Äthanol in einer Menge bis zu 4 Gew.-% enthalten ist

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einer Temperatur von 15 bis 40°C, vorzugsweise 30 bis 38° C, durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einem pH-Wert zwischen 1 und 8, vorzugsweise zwischen 3 und 5 durchführt.

5. Verwendung der Mikroorganismen nach Anspruch 1 oder 2 zur Hersteilung von Bioproteinen.