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Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von l-Glutaminsäure durch Fermentation.
In der österr. Patentschrift Nr. 200544 ist ein Verfahren zur direkten Herstellung und Anreicherung von 1-Glutaminsäure in einem Substrat beschrieben, nach welchem Mikroorganismen kultiviert werden, die zwei spezifisch biochemische Erfordernisse erfüllen.
Eines davon ist die Fähigkeit des Mikroorganismenstammes, < x-Ketoglutarsäure aus zuckerhaltigen Stoffen zu bilden und das zweite Erfordernis ist eine starke l-Glutaminsäure- Dehydrogenase-Aktivität des Stammes, besonders dessen starke Aktivität gegen reduktive Aminierung von K-Ketoglutarsäure bei der erwähnten enzymatischen Reaktion. Diese beiden Bedingungen erfüllt ein Stamm von Micrococcus glutamicus ATCC No. 13. 032 und beim Verfahren gemäss der österr. Patentschrift Nr. 200544 wird ein Stamm von Micrococcus glutamicus ATCC No. 13. 032 zur direkten Herstellung von l-Glutaminsäure verwendet.
In dieser Patentschrift wird auch zum Ausdruck gebracht, dass die Fermentationsbedingungen die Ausbeute weitgehend beeinflussen und dass der pH-Wert des Kulturmediums stets im Bereich von 6, 0 bis 9, 0 gehalten werden soll, was durch geeignete Überwachung der Fermentation, z. B. durch Zusatz neutralisierend wirkender Stoffe zum Fermentationsmedium erzielt werden kann.
Es wurde nun festgestellt, dass ausser der Erfüllung der erwähnten beiden biochemischen Erfordernisse durch den verwendeten Stamm
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Vermehrung der Mikroorganismen überwacht werden muss, um die Ausbeute an 1-Glutaminsäure noch weiter zu steigern.
Es ist leicht einzusehen, dass bei einem Fermentationstypus, wie er durch die 1-Glutaminsäure-Fermentation repräsentiert wird, die Substrate verschiedenen biochemischen Abbau- und Synthesevorgängen unterworfen werden. Um eine hohe Säureausbeute zu erzielen, ist eine dementsprechend verständnisvolle Beeinflussung der Fermentation erforderlich. Es wurde gefunden, dass für diese Zwecke die Verwendung vitaminloser Stämme vorteilhaft ist.
Es ist allgemein bekannt, dass verschiedene Stämme von Mikroorganismen für ihr Wachstum besonders Vitamine oder Aminosäuren brauchen.
Solche Stämme zeigen bei Zusatz von Vitaminen oder Aminosäuren zum Kulturmedium in der Regel ein rasches Wachstum. Dementsprechend kann bei Verwendung derartiger Stämme die Vermehrung der Mikroorganismen und damit auch die enzymatische Aktivität einer Zellpopulation dadurch geregelt werden, dass der erforderliche Vitamin-oder Aminosäurespiegel durch geeignete Ergänzung auf der erforderlichen Höhe gehalten wird. Auf diese Weise kann der Fermentationsfortschritt in gewünschter Weise beeinflusst werden.
Die Verwendung von Biotin als Wachstumsbeschleuniger für Mikroorganismen ist bekannt (H. Haehn :"Biochemie der Gärungen", 1952, S. 165).
Durch Untersuchung wurde der Vitaminbedarf einzelner Stämme festgestellt. Es wurde gefunden, dass Biotin verlangende Stämme für die oben erwähnten Zwecke geeignet sind. Die biochemische Funktion des Biotins ist zwar noch sehr aufklärungsbedürftig, aber es ist im Hinblick auf die Feststellung in den nachfolgend angeführten Publikationen anzunehmen, dass die Wirkung des Biotins bei der l-Glutaminsäure- Fermentation eine besonders wichtige Rolle spielt : Arch. Sei. Physiol. 7,85 (1953) ; J. Sei.
Ind. Research 13 B, 110 (1954) ; J. B. C. 177, 125 (1949). Diese Berichte zeigen, dass Biotin an der Dissoziation und der Synthese von Protein beteiligt ist. Ferner sei verwiesen auf : Arch.
Biochem. Biophys. 55,307 (1955) ; J. B. C. 212, 217 (1955) ; Trans. N. Y. Acad. Sei. 15,159 (1953) ; Physiol. Revs. 21, 1 (1941). Diese Berichte zeigen, dass Biotin mit dem Zuckermetabolismus in enger Beziehung steht, besonders mit der Bindung und Entbindung von Kohlendioxyd.
In Übereinstimmung damit bietet die Verwendung eines Biotin verlangende, Stammes und die Überwachung der Biotingehalte im Kulturmedium bei einem so komplizierten biochemischen Vorgang, wie es die l-GlutaminsäureFermentation ist, eine sehr vorteilhafte Handhabe zur Regelung des Fermentationsvorganges.
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Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure durch Fermentation besteht nun im wesentlichen darin, dass ein Stamm von Micrococcus glutamicus ATCC No. 13. 058 in einem Kohlehydrat, Stickstoff verbindungen, sowie gegebenenfalls anorganische Salze enthaltenden Substrat kultiviert wird, wobei dem Substrat eine Biotinmenge von 0, 5 bis 5 y/1 zugesetzt und der pH-Wert des Substrates durch Zusatz neutralisierend wirkender Agentien zwischen 6 und 9 gehalten wird, wonach die gebildete 1-Glutaminsäure in bekannter Weise vom Substrat abgetrennt wird. Der Micrococcus glutamicus ATCC No. 13. 058 unterscheidet sich von dem in der österr.
Patentschrift Nr. 200544 beschriebenen Micrococcus glutamicus No. 13. 032 lediglich durch einen verschiedenen Biotinbedarf.
Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt die direkte Herstellung von 1-Glutaminsäure in sehr hoher Ausbeute.
Das für das erfindungsgemässe Verfahren verwendete Substrat kann verschiedene Zusam- mensetzungen aufweisen. Der Kohlehydratanteil dieses Substrates kann beispielsweise aus Glukose, Fruktose, Mannose, Sukrose, Maltose, Stärkehydrolysaten, Melasse usw., oder aus Gemischen zweier oder mehrerer dieser Substanzen bestehen.
Der Stickstoff kann im Substrat in Form von Ammoniak, Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumazetat, anderer anorganischer oder organischer Ammoniumsalze, sowie in Form von Peptonen, Fleischextrakten, Getreideweiche, hydrolysiertem Kasein, Fischmehl, digeriertem Fischmehl, Sojabohnenmehl oder digeriertem Sojabohnenmehl od. dgl. vorliegen. Als im Substrat enthaltene anorganische Salze, können beispielsweise Monokaliumphosphat, Dikaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Ferrosulfat, Mangansulfat, Natriumchlorid, Kaliumsulfat od. dgl. verwendet werden.
Biotin ist, wie bekannt, in verschiedenen natürlich vorkommenden Substanzen, wie beispielsweise in Eidottern, in Leber, Nieren, Hefe, Milch, Melasse, sowie deren Extrakten, Hydrolysaten und Digesten enthalten und im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens kann dem Substrat sowohl Reinbiotin zugesetzt werden, als auch die eben genannten Substanzen bzw.
Extrakte, Hydrolysate und Digeste.
Die Temperatur, auf welcher das Substrat während der Kultivierung gehalten wird, liegt zweckmässig zwischen 28 und 33 C. Das erfindungsgemässe Verfahren kann sowohl als Schüttelkultur, als auch als Submerskultur durchgeführt werden. Die Abtrennung der 1-Glutaminsäure vom Substrat, kann nach 2-5 Tagen erfolgen.
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Wert wird erfindungsgemäss zwischen 6 und 9 gehalten u. zw. durch Zugabe von neutralisierend wirkenden Stoffen, wie beispielsweise Ammoniak, Harnstoff, Ammoniumsalzen und Alkalihydroxyd.
Nach vollendeter Fermentation werden die Zellen durch Filtration abgetrennt und das Filtrat wird unter reduziertem Druck konzentriert. Das auf diese Weise erhaltene Konzentrat wird mittels 5-n Salzsäure auf einen pH-Wert von 3, 2 eingestellt und dann in der Kälte stehen gelassen, wobei sich Rohkristalle von 1-Glutaminsäure ausscheiden.
Zur Abscheidung der 1-Glutaminsäure oder deren Salze, können auch andere bekannte Verfahren, wie beispielsweise eine Abtrennung mittels Ionenaustauschharzen angewandt werden.
Die nachfolgenden praktischen Beispiele dienen zur näheren Erläuterung des Gegenstandes der Erfindung.
Beispiel 1 :
Zusammensetzung des Substrates :
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<tb>
<tb> , <SEP> 0 <SEP>
<tb> Glukose <SEP> 10
<tb> K2HP04......................... <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> MgSO,. <SEP> 7H2O.........,.......... <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> FeSO <SEP> !. <SEP> 7H2O.................,... <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP>
<tb> MnS04. <SEP> 4H2O................,... <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP>
<tb>
Diesem Substrat wurde Biotin in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Für die Teste wurde Micrococcus glutamicus ATCC 13. 058 verwendet. Dieser Micriciccus unterscheidet sich von dem in der österr.
Patentschrift Nr. 200544 genannten Micrococcus ATCC No. 13. 032 nur hinsichtlich des Biotinbedarfes, hat aber praktisch die gleichen morphologischen, physiologischen und sonstigen Eigenschaften wie der letztere, wozu auf die ausführlichen Angaben in der genannten Patentschrift hingewiesen sei. Die 1-Glutaminsäure- bildung wurde bei verschiedenem Biotinspiegel mittels Schüttelkultur untersucht. Tabelle I zeigt die Ergebnisse nach dreitägiger Kultivierung bei 28 C. Der pH-Wert des Kulturmediums wurde durch zeitweisen Zusatz von Harnstoff zwischen 6, 5 und 8, 5 gehalten.
Tabelle I
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<tb>
<tb> irocMnBiotingehalt <SEP> 1-Glutaminsaure <SEP> zellgewicht
<tb> MD <SEP> (mg'cm') <SEP> (mg <SEP> 10 <SEP> cm') <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5- <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 20, <SEP> 5 <SEP> 10-25 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 0- <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 37, <SEP> 5 <SEP> 25-60 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 5- <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 17, <SEP> 0 <SEP> 60-120 <SEP>
<tb> 5, <SEP> 0- <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> 120-180 <SEP>
<tb> 7, <SEP> 5-10, <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 3 <SEP> 180-220 <SEP>
<tb>
Aus dieser Tabelle geht hervor, dass das Zellgewicht mit der Zunahme des Biotingehaltes steigt, während die Menge der gebildeten 1-Glutaminsäure dem Zellgewicht nicht proportional ist.
Bei einer bestimmten Zellvermehrung gibt es aber ein Optimum für die 1-Glutaminsäurebildung. Wird daher der Biotinspiegel in geeigneter Weise eingestellt, so ergibt sich eine hohe Ausbeute an 1-Glutaminsäure. Dies ist bei einem Biotingehalt von etwa 0, 5-51, 1 der Fall.
Beispiel 2 :
In einem 2 Gew.-% Glukose, 1 Gew.-% Pepton, 0, 5 Gew. - 0 Fleischextrakt und 0, 25
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Gew.-% Natriumchlorid enthaltenden und einen pH-Wert von 7, 0 bis 7, 2 aufweisenden Ansatzsubstrat wurde bei einer Temperatur von 28 C eine Kultur von Micrococcus glutamicus Nr. 541 (ATCC 13. 058) in Schüttelkultur gezüchtet. Es wurden hiezu 250 cm3 Kolben mit 30 cm3 Substrat verwendet.
Das eigentliche Fermentationssubstrat wies die folgende Zusammensetzung auf.
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<tb>
<tb> gr
<tb> Glukose <SEP> 100
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> ..................... <SEP> 3
<tb> K2HPO4 <SEP> ...................... <SEP> 1
<tb> KH2PO4 <SEP> ......................... <SEP> 1
<tb> MgSO4.7H2O <SEP> .................... <SEP> 0,25
<tb> FeSO4.7H2O <SEP> ......................... <SEP> 0,01
<tb> MnSO4.4H2O <SEP> ....................... <SEP> 0,01
<tb>
Diese Substanzen wurden in einen Kolben gebracht und dieser wurde mit Wasser auf 11 aufgefüllt.
Diesem Fermentationssubstrat wurde nun Biotin in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt.
Hiezu wurde das Fermentationssubstrat in 30 cm3 Anteile aufgeteilt, von welchen jeder in einen 250 cm3 Kolben gebracht wurde. Das Substrat wurde in einem Autoklaven 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 1100 C sterilisiert.
Dem sterilisierten Fermentationssubstrat wurden 3 cm3 des Ansatzsubstrates zugesetzt und die Fermentation aerob submers in einer Schüttelvorrichtung durchgeführt.
In Abständen von ungefähr 4-6 Stunden wurden dem Substrat 0, 5-1, 0 cm3 grosse Portionen einer 10% igen Harnstofflösung zugesetzt, um den pH-Wert des Substrates zwischen 6-9 zu halten.
Die folgende Tabelle II zeigt die Konzentration von Glutaminsäure im Substrat nach bestimmten Zeitabständen, nach Fermentationsbeginn.
Tabelle II
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<tb>
<tb> 1-Glutaminsäurekonzentration <SEP> (mg/cm'')
<tb> Stunden <SEP> nach <SEP>
<tb> Fermentationsbeginn <SEP> : <SEP> 24 <SEP> 48 <SEP> 72 <SEP> 96
<tb> Biotinzusatz <SEP> (riz
<tb> 0 <SEP> (Kontrolle) <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 16, <SEP> 5 <SEP> 18, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 18, <SEP> 0 <SEP> 22, <SEP> 0 <SEP> 21, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 5 <SEP> 22, <SEP> 5 <SEP> 42, <SEP> 4 <SEP> 41, <SEP> 8 <SEP> 40, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 18, <SEP> 5 <SEP> 32, <SEP> 4 <SEP> 31, <SEP> 6 <SEP> 27, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 7, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 10, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Wie aus dieser Tabelle leicht ersichtlich ist,
war die l-Glutaminsäurebildung beim Kontrollexperiment nur gering und erfolgte nur langsam, während sie bei denjenigen Versuchen, welche mit der erfindungsgemässen optimalen Biotinmenge durchgeführt wurden, rasch und bei grosser Ausbeute erfolgte.
Beispiel 3 :
Es wurde wie in Beispiel 2 verfahren, nur dass an Stelle von Glukose 10 Gew.-% Maltose verwendet wurden. Bei Zusatz von 3, 0 y 11 an Biotin, wurde nach einer Fermentationsdauer von 96 Stunden eine 1-Glutaminsäurekonzentration von 31, 0 ing/cm3 erzielt.
Beispiel 4 :
Es wurde wie in Beispiel 2 angegeben vorgegangen, nur dass an Stelle von Reinbiotin 1 Gew.Prozent Hefeextrakt zugesetzt wurde. Nach einer Fermentationsdauer von 48 Stunden wurde eine Konzentration von 22, 4 mg Glutaminsäure/cm Substrat erreicht.
Beispiel 5 :
Es wurde wie in Beispiel 2 angegeben vorgegangen, nur dass an Stelle von Reinbiotin 1 Gew.-% Rohrzuckermelasse verwendet wurde.
Nach 48stündiger Fermentationsdauer wurde eine Konzentration von 24, mg l-Glutamin- säurefcm3 Substrat erhalten.
Beispiel 6 :
Es wurde wie in Beispiel 2 vorgegangen, nur dass hiebei 2, 5 y Biotin/1 einem Substrat mit der folgenden Zusammensetzung zugesetzt wurde :
Stärkehydrolysat 1000 cm3
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<tb>
<tb> gr
<tb> (NH4)2HPO4................. <SEP> 1
<tb> (NH4)H2PO4 <SEP> .................. <SEP> 1
<tb> MgSO4. <SEP> 7H2O <SEP> ................... <SEP> 0,5
<tb> MnSO4.4H2O <SEP> ................. <SEP> 1
<tb> K2SO4 <SEP> ........................ <SEP> 1
<tb>
Das Stärkehydrolysat wurde in der folgenden Weise hergestellt. 15 kg reiner Stärke wurden 801 Wasser zugesetzt und es wurde eine Säurehydrolyse durch Zusatz von 213 cm3 Schwefelsäure mit einem spezifischen Gewicht von 1, 8 eingeleitet und 30 Minuten lang bei einem Druck von l kgJcm2 durchgeführt.
Nach Durchführung der Hydrolyse wurde die entstandene Mischung mit Wasser auf 100 1 aufgefüllt und dann durch Zusatz von wässeriger Ammoniaklösung (mit einem Gehalt von 28, 8% NH3) mit einem spezifischen Gewicht von 0, 9 neutralisiert. Die auf diese Weise erhaltene Flüssigkeit enthielt 13 Gew.-% Glukose.
Diesem Substrat wurden 2, 5 y Biotin/1 zugesetzt und nach 48stündiger Fermentation erhielt man eine Konzentration von 44 mg l-Gluta- minsäure/cm3 Substrat.
Bei jedem der vorstehenden Beispiele kann an Stelle von Harnstoff zur Einstellung des pH-Wertes des Substrates auf Werte zwischen 6-9 auch Ammoniak, sowie Ammoniumverbindungen, wie beispielsweise NHOH, (NH,), CO, usw. oder Alkalihydroxyd verwendet werden.
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