CN1772912B

CN1772912B - 生物催化生产羟基乙酸

Info

Publication number: CN1772912B
Application number: CN2004100681409A
Authority: CN
Inventors: 薛建萍; 罗积杏; 李还宝; 于军华; 朱健; 许弘; 沈寅初
Original assignee: SHANGHAI PESTICIDE RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: SHANGHAI PESTICIDE RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2004-11-12
Filing date: 2004-11-12
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2024-11-12
Also published as: CN1772912A

Abstract

本发明公开了一种生物催化生产羟基乙酸的方法。本方法以羟基乙腈为起始原料，以通过发酵培养乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887而得到的具有腈水解活性的微生物酶为催化剂，在一定条件下水解反应，得到产物羟基乙酸。本方法具有反应条件温和、工艺路线简单、无污染、可连续工业化生产的显著特点。

Description

生物催化生产羟基乙酸

技术领域

本发明属生物化工技术领域，具体涉及一种生物催化生产羟基乙酸的方法。

背景技术

羟基乙酸又名乙醇酸或甘醇酸，是一种大吨位生产的精细有机化工原料，具有广泛的用途。可应用于粘结剂、生产降解聚合物、金属清洁剂、电镀助剂、奶制品容器清洁剂、染色助剂、水井清洁剂、建筑、纺织、洗涤剂、制药、农药、鞣革等，其衍生物，如醇酐(醚)、盐、酯是许多精细有机化工产品的原料，像羟基乙酸锌，羟基乙酸丁酯已被用于汽车底漆的生产。羟基乙酸在锅炉清洗剂的生产中被大量使用，其中最有代表性的是羟基乙酸与甲酸的混合物用于超临界锅炉水垢的清除，效果很好，已成为国际上通行的标准方法。聚羟基乙酸或称为聚乙交酯是结构最简单的线性脂肪族聚酯，是体内可降解的最早商品化的一个聚合物产品，应用于医学工程材料和高分子降解材料等许多领域。

目前工业上生产羟基乙酸主要为化学合成，方法有：氯乙酸水解法，氯乙酸在强碱性条件下水解生成羟基乙酸，该法存在着原料消耗高、产品收率低、产品精制复杂等缺点，而且腐蚀和污染严重；甲醛羰化法，美国杜邦公司首创的工业化生产乙醇酸方法，此方法需要高压、液体酸催化，对设备要求很高、腐蚀严重，最终产品的分离、精制复杂，催化剂不能重复利用，污染也严重；草酸的电解还原法，20世纪90年代实现工业化，该法能耗高、产物复杂、生产羟基乙酸的成本高；羟基乙腈酸水解法，羟基乙腈水溶液在硫酸、磷酸、硝酸或混合酸酸存在时水解，经萃取、脱盐、反萃、脱水等过程得到产品。

有文献提议应用生物催化方法合成羟基乙酸，因为生物催化法具有选择性好、产品纯度高、反应条件温和等优点。专利U.S.3,940,316公开了具有腈水解活性的微生物Bacillus，Bacteridium，Micrococcus及Brevibacterium催化腈化合物水解合成酸的方法，把羟基乙腈作为其中的一个底物；专利JP 09028390报道利用Rhodococcus或Gordona腈水解酶催化羟乙腈水解合成羟基乙酸；专利U.S.6,037,155利用微生物Variovorax spp.和Arthrobacter NSSC104催化羟基腈水解合成相应的羟基酸，把羟基乙腈列为其中的一个底物；专利U.S.6,416,980利用Acidovorax facilis 72W及其变异株的水解酶合成羟基乙酸，产物浓度可以累积达1M。这些酶转化方法所显示出的优越性，为替代化学方法展示了良好前景，但这些反应累积的产物浓度还不高，无工业化生产方面的报道，技术水平满足不了工业化生产的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，从而提供一种生物催化生产羟基乙酸的方法，具体为通过发酵培养乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887而得到的腈水解酶来催化羟基乙腈的水解反应而得到产物羟基乙酸，反应式如下：

Figure DEST_PATH_GA20190385200410068140901D00011

为达到上述目的，本发明的具体实施过程如下：

一、制备生物催化剂腈水解酶

(1)我们从上海金山地区的含腈废水中选育得到一个菌株，，并于2003年1月20日提交中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)保藏，分类命名为乳酪短杆菌，拉丁文名称为Brevibacterium casei，保藏号为CGMCC No.0887。我们对该菌种进行摇瓶培养或上发酵罐培养，得到发酵液；

摇瓶培养：在三角瓶中装入适量的培养基(10-70％)，灭菌后接入一定量的菌种(1-10％)，在20-40℃下，旋转式摇床(100-300rpm)中培养30-120小时，得到发酵液，除去琼脂备用。

其中，摇瓶培养基组成(％)：葡萄糖：1-2.0；酵母膏：0.2-1；NaCl：0.05-0.15；K₂HPO₄：0.05-0.3；MgSO₄·7H₂O：0.01-0.3；琼脂：2.0，pH为7.0-7.5。

上罐发酵培养：在种子罐中装入适量的种子培养基(10-70％)，灭菌后接入一定量的菌种(1-10％)，在温度20-40℃，搅拌转速100-300rpm的条件下培养30-120小时，得到种子液，在50L-20m³的发酵罐中装入适量的发酵培养基(40-70％)，实罐消毒后接入2-30％的种子液，在通气量1∶0.2-1∶1，搅拌转速50-400rpm，罐压0.03-0.06MPa，温度20-40℃的条件下，发酵培养30-200小时，获得含酶的发酵液。

其中，上罐发酵培养组成：

种子培养基组成(％)：葡萄糖：0.5-2.0；酵母膏：0.2-1；KH₂PO₄：0.05-0.3；K₂HPO₄：0.05-0.3；MgSO₄·7H₂O：0.01-0.3；pH6.5-7.5。

发酵培养基组成：葡萄糖：1.0-2.5；酵母膏：0.2-1；K2HPO4：0.03-0.1；KH2PO4：0.03-0.1；MgSO4·7H2O：诱导剂I：0.01-0.5；诱导剂II：0.01-0.5；生长素：0.1-2；pH6.5-7.5。诱导剂I可以是己内酰胺、苯甲腈、苯乙腈、β-内酰胺、丙烯腈、正丁腈、戊二腈、烟腈、丁内酰胺、α-氨基戊二酸内酰胺、十二内酰胺、己二腈、乙腈或异丁腈等，诱导剂II可以是尿素、蛋白胨、牛肉膏、麦芽抽提物或玉米浆等，生长素可以是CoCl₂、FeCl₃、FeCl₂、半胱氨酸、MnSO4、CuCl₂、天冬酰胺、甘氨酸、ZnSO4、苯硫酚、乙硫醇、硫代乙醇酸、α，β-二硫代甘油、噻枯唑或甲硫氨酸等。

(2)发酵液再通过离心或膜过滤***进行酶细胞收集，然后制备生物催化剂；

酶细胞收集：发酵液在分离因素≥5000的条件下离心，弃去上清液，细胞用去离子水洗涤后再离心，收集浓缩的湿细胞液；或者发酵液用膜过滤***进行膜分离过滤，并加入2-3倍发酵液体积的去离子水洗涤，收集浓缩的湿细胞液，其中的膜过滤***可以是中空纤维膜或卷式膜或陶瓷膜或超滤膜或Ultra-flo。

制备生物催化剂：收集的含酶细胞可以直接用作催化剂；或通过常规方法如海藻酸钠包埋法等固定化后用作催化剂；或将细胞用常规方法如超声波等破碎后得到的细胞破碎液用作催化剂；或离心除去细胞碎片后酶清液直接用作催化剂；或将经过提纯得到的粗酶或纯度更高的酶蛋白用作催化剂。

二、生物催化水解反应：

羟基乙腈生物催化水解反应，包括底物前处理和水解反应两个步骤。

(1)底物羟基乙腈的前处理：用强碱或碱性碳酸盐如NaOH、KOH、Ba(OH)、Ca(OH)₂、Ca(HCO₃)₂或CaCO₃)中和，或用强碱或弱碱阴离子树脂如D201型、D202型或D301型，至pH6-8。

(2)羟基乙腈水溶液的生物催化水解反应：在水或磷酸缓冲液或水-有机介质或微水有机反应介质中加入生物催化剂，加入底物后进行反应，pH控制在2.0-10.0之间，反应温度控制在0-70℃之间，搅拌速度控制在50-500rpm之间。反应方式可以是批式反应或者连续反应，在批式反应中底物可一次性加入，或者间歇分多次加入，或者流加，底物浓度控制在0-50％(wt％)。反应时间根据反应的具体情况而定，反应结束时应保证底物浓度尽可能低，这可以通过停止加料后延长反应时间，或通过补加少量生物催化剂反应一段时间来达到这一要求。在连续反应中，底物可一次性加入，或者间歇分多次加入，或者流加，在任何时刻都必须保证底物的加入量不会使反应液中的底物浓度≥50％(wt％)，当产物浓度累积达到一定值≥10％(wt％，以羟基乙酸计)时，可以通过膜过滤***一次性，或者分多次间歇地，或者连续地分流出反应清液，优选为连续分流方法，同时可一次性，或者间歇分多次地，或者连续地补加反应介质和底物，优选为连续补加方法，并根据反应的情况，可一次性，或者间歇分多次地，或者连续地定量补加新的生物催化剂，以保证反应可连续进行。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，下面通过实施例予以进一步说明。

以下实施例中所列的百分比浓度均为重量百分比。

酶活定义：1小时内将一微克的羟基乙腈转化为羟基乙酸所需要的酶量，单位微克/小时。

实施例1

分别配制摇瓶发酵培养基A、B、C，其中培养基组成如下：

A：葡萄糖1.0％，酵母膏0.2％，NaCl0.05％，K₂HPO₄0.05％，MgSO₄·7H₂O0.3％，琼脂2.0％，pH7.0；

B：葡萄糖1.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.10％，K₂HPO₄0.15％，MgSO₄·7H₂O0.15％，琼脂2.0％，pH7.2；

C：葡萄糖2.0％，酵母膏1.0％，NaCl0.15％，K₂HPO₄0.30％，MgSO₄·7H₂O0.01％，琼脂2.0％，pH7.5；

分别将以上配制好的培养基以30mL一份倒入250mL的三角瓶内，于高压灭菌器中120℃灭菌20分钟。冷却后分别接种乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)保藏菌种到各培养基中，于28℃，250rpm转速下震荡培养96小时。培养结束后，分别收集发酵液，取10ml，加入1ml羟基乙腈，反应10分钟，加入5M盐酸溶液，终止反应，HPLC(岛津公司LC-10A)测定羟基乙酸的量，计算酶活(下同)，结果列于表1。

表1

实施例2

配制种子培养基，其组成为：葡萄糖0.6％，酵母膏0.2％，K₂HPO₄0.05％，KH₂PO₄0.05％，MgSO₄·7H₂O0.05％，pH7.2；

再分别配制发酵培养基A、B、C、D，培养基组成为：

A：葡萄糖1.0％，酵母膏0.2％，K₂HPO₄0.03％，KH₂PO₄0.05％，MgSO₄·7H₂O0.05％， β-内酰胺0.05％，尿素0.5％，CoCl₂ 0.1％，pH7.0；

B：葡萄糖1.5％，酵母膏0.5％，K₂HPO₄0.05％，KH₂PO₄0.10％，MgSO₄·7H₂O0.03％，己二腈0.2％，蛋白胨0.35％，半胱氨酸0.5％，pH7.5；

C：葡萄糖2.0％，酵母膏0.8％，K₂HPO₄0.08％，KH₂PO₄0.03％，MgSO₄·7H₂O0.10％，α-氨基戊二酸内酰胺0.4％，牛肉膏0.15％，天冬酰胺1.0％，pH6.5；

D：葡萄糖2.5％，酵母膏1.0％，K₂HPO₄0.10％，KH₂PO₄0.08％，MgSO₄·7H₂O0.08％，烟腈0.5％，玉米浆0.05％，硫代乙醇酸2.0％，pH7.2；

在5L种子罐中装入种子培养基70％，灭菌后接入一茄子瓶的菌种，在温度28℃，搅拌转速400rpm的条件下培养48小时，得到种子液，在50L³的发酵罐中装入发酵培养基A、B、C、D各70％，实罐消毒后接入10％的种子液，在通气量1∶0.5，搅拌转速300rpm，罐压0.05Mpa，温度28℃的条件下，发酵培养48小时。发酵培养结束后，分别收集发酵液，测定酶活，结果列于表2。

表2

实施例3

按实施例2方法得到的发酵液3.5L，分别用低温高速离心，在6℃和15000rpm转速下冷冻离心15分钟或中空纤维膜过滤，流量180mLmin^-1，压力0.8Kg/cm²；或卷式膜过滤，流量180mLmin^-1，压力16Kg/cm²；或陶瓷膜过滤，流量180mLmin^-1，压力4Kg/cm²；或Ultra-flo过滤，流量180mLmin^-1，压力3Kg/cm²。并分别用4L去离子水洗涤细胞，收集浓缩细胞液，取一定量，用去离子水稀释恢复至原发酵液体积，测定酶活，结果列于表4

表2

实施例4

按实施例2方法得到的发酵液，按实施例3的中空纤维膜过滤方法，洗涤浓缩4倍，得到的浓缩细胞进一步处理，得到不同形式的具有腈水解酶活性的生物催化剂。①、取浓缩细胞与3.2％的海藻酸钠混合均匀后，注入到0.2M的CaCL₂溶液中进行凝胶化包埋，制得固定化细胞。②、取浓缩细胞用超声波细胞破碎器将细胞破碎，条件800W、温度8℃、每次破碎体积100mL，累计超声时间1小时，得到细胞破碎液。③、取②的细胞破碎液于15000g、6℃下离心，收集上清液，得到无细胞酶液。④、取③的上清液经过不同浓度硫酸铵盐析，收集20-50％饱和度下的沉淀组份，置于pH7.0的10mM磷酸钾缓冲液中透析24小时，然后再在纯水透析24小时，得到粗酶液，经过冷冻真空干燥后即得到粗酶粉。⑤、取④的粗酶粉用经过pH7.0的10mM磷酸钾缓冲液预平衡过的DEAE-Sephadex柱处理，用含0-0.6M氯化钾的pH7.0的10mM磷酸钾缓冲液梯度洗脱，收集具有腈水解酶活性的组份，于纯水中充分透析脱盐，即得纯度相对较高的酶溶液，经过冷冻真空干燥后即得到酶粉。用去离子水将各种不同形式的生物催化剂恢复至初始发酵液体积，测定酶活，结果列于表3。

表3

催化剂形式	发酵液	细胞液	固定化细胞液	细胞破碎液	无细胞酶液	粗酶液	酶液
								酶活(×10⁴ UmL^-1·hr^-1)	7.5428	6.788	4.526	6.1092	4.88736	2.930	1.759

实施例5

取羟基乙腈水溶液(pH≤2.5，浓度50％)100mL，滴加浓氢氧化钠中和，使pH≈7.0，置于低温下备用；取相同的羟基乙腈水溶液100mL，滴加浓碳酸钠中和，使pH≈7.0，置于低温下备用；取相同的羟基乙腈水溶液100mL，上树脂柱脱酸处理，φ3×50的玻璃柱装有250mL的D202强碱阴离子树脂，弃去初试阶段流出液，收集底物流出液，浓度45％，pH＞6.0，置于低温下备用；按同样的方法用D301弱碱阴离子树脂处理底物，收集底物流出液，浓度46％，pH＞6.0，置于低温下备用。按实施例3的中空纤维膜过滤方法处理得到的浓缩细胞液用做催化剂，浓缩细胞用去离子水恢复至原体积，分别取100mL，各加入1％(wt％，按体积100mL计算)的前述不同方式处理过的羟基乙腈，于30℃和200rpm条件下振荡反应30分钟，HPLC色谱分析(岛津公司LC-10A，下同)，结果如表4。

表4

实施例6

按实施例4的方法得到的细胞破碎液，用去离子水将细胞破碎液恢复至初试发酵液体积，分别取50mL，加入2％经过氢氧化钠中和处理的底物(wt％，按体积50mL计算)，于不同温度，200rpm的转速下振荡反应，反应30分钟后，HPLC色谱分析结果如表5。

表5

实施例7

按实施例4的方法得到的细胞液，用去离子水将细胞液恢复至初始发酵液体积，取1.5L于2L的三口反应瓶中，加入0.5％经过氢氧化钠中和处理的羟基乙腈溶液(wt％，按体积1.5L计算)，于28℃水浴温度和150rpm搅拌转速条件下反应，间歇加入底物，当底物浓度低于0.1％时，按0.5％加入底物，反应68小时，底物累计加入次数55次，共加入412.5g，约825mL，反应后底物残留浓度＜0.05％，转化率＞99.0％，终产物浓度3.13M，羟基乙酸产率＞98.0％。

实施例8

按实施例4的方法得到的细胞液，用去离子水将细胞液恢复至初始发酵液体积，取2.0L于3L的三口反应瓶中，用蠕动泵加入经过氢氧化钠中和处理的羟基乙腈溶液，流加速率约8-15mLmin^-1，于30℃水浴温度和200rpm搅拌转速条件下反应，跟踪分析，根据底物浓度的高低调节流加速率，保证底物浓度≤0.6％，当产物累积浓度达到3.0M左右时，停止加料，继续反应使底物消耗完，当底物残留浓度＜0.05％时终止反应，整个反应过程时间56小时，转化率＞99.0％，终产物浓度3.47M，羟基乙酸产率＞98.0％。

实施例9

配制种子培养基，其组成为：葡萄糖0.6％，酵母膏0.4％，K₂HPO₄0.05％，KH₂PO₄0.05％，MgSO₄·7H₂O0.05％，pH7.2。再配制发酵培养基，其组成为：葡萄糖2％，酵母膏0.4％，K₂HPO₄0.05％，KH₂PO₄0.05％，MgSO₄·7H₂O0.05％，诱导剂I 0.1％，诱导剂II 0.5％，生长素0.5％，罐压0.05Mpa，pH7.2。在5L种子罐中装入种子培养基70％，灭菌后接入一茄子瓶的菌种，在温度28℃，搅拌转速400rpm的条件下培养48小时，得到种子液。在50L的发酵罐中装入发酵培养基70％，实罐消毒后接入10％的种子液，在通气量1∶0.5，搅拌转速300rpm，罐压0.05Mpa，温度28℃的条件下，发酵培养48小时。发酵培养结束后，分别收集发酵液，用平板超滤膜过滤，两倍去离子水洗涤，收集浓缩细胞，去离子水稀释至原体积，向带有膜分离器的10L的反应器中加入细胞液6L，夹套水浴温度30℃，搅拌转速300rpm，用蠕动泵泵入经过氢氧化钠中和处理的羟基乙腈溶液，流加速率约8-15mLmin^-1，HPLC色谱跟踪分析，根据底物浓度的高低调节流加速率，保证底物浓度在0.5％左右，当产物累积浓度达到15％(2.0M)左右时，停止加料，继续反应一段时间使底物消耗完，当底物浓度＜0.05％时，通过膜过滤***滤出反应清液，然后向反应器补加去离子水，重新流加底物，继续反应，并根据反应情况随时补加浓缩细胞，如此连续反应不断得到含产物的反应清液，得到的含有产物羟基乙酸的反应清液。

本发明采用生物催化的方法生产羟基乙酸，利用腈水解酶将羟基乙腈转化为相应的酸，其操作过程简单、反应条件温和、环境污染小、可工业化连续生产。

本发明与现有的方法相比，具有明显的特点和进步：产酶菌株为从自然源筛选得到的新菌株，现鉴定为乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)，其保藏号为CGMCC No.0887，经过长期的育种工作，酶活力已达10万单位/毫升发酵液；在催化剂生产中引入膜分离技术，使生产可以连续化进行；反应选择性好、原料利用率高、对环境污染小、生产成本低；产物累积浓度高，可工业化实施生产。

Claims

1.一种生物催化生产羟基乙酸的方法，包括通过腈水解酶来催化羟基乙腈的水解反应而得到羟基乙酸，其特征在于所述的腈水解酶是通过发酵培养乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887而得到的。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的腈水解酶是将发酵培养得到的发酵液通过离心或膜过滤***进行酶细胞收集而得到的。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的膜过滤***是中空纤维膜或卷式膜或陶瓷膜或超滤膜过滤***。

4.如权利要求3所述的方法，所述超滤膜过滤***为Ultra-flo过滤***。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的羟基乙腈在水解反应前先进行前处理，即用强碱或碱性碳酸盐中和，或用强碱或弱碱阴离子树脂处理，至pH6-8。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的强碱选自：NaOH、Ca(OH)₂、Ba(OH)₂或KOH。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的碱性碳酸盐选自：CaCO₃、Na₂CO₃、NaHCO₃或Ca(HCO₃)₂。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的强碱或弱碱阴离子树脂选自：D201型、D202型或D301型。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的水解反应的条件如下：温度为0-70℃，pH为2-10，底物羟基乙腈的浓度控制在0～50％(wt％)，其中底物羟基乙腈的浓度不为0％(wt％)。

10.一种用于生物催化生产羟基乙酸的乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)，其特征在于保藏号为CGMCC No.0887。