JPS6140795A - 炭素数２〜４の有機酸およびその塩の微生物学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、微生物の作用により、炭素数２〜４のニトリ
ル化合物から対応する有機酸およびその塩の製造法に関
するものである。生成した有機酸とアンモニアは、通常
、有機酸アンモニウム塩の形で存在しているが、有機酸
アンモニウム塩は、はぼ理論量の強酸処理または熱分解
処理等により、有機酸として回収することが可能である
。炭素数２〜４の有機酸のうち、特にアクリル酸および
メタクリル酸は、アクリル酸メチルおよびメタクリル酸
メチルの合成原料としてばかりでなく、種々の高級エス
テルの原料としてもを用である。

（従来の技術） 従来、ニトリル化合物を、強酸を用い加水分解すれば、
有機酸となることはよく知られているが、同時に生成す
る廃酸の処理が大きな問題であった。

アクリル酸またはメタクリル酸の製造法に関しては、ア
クリロニトリルまたはメタクリロニトリルを強酸で加水
分解した場合のこうした問題点を解決すべく、プロピレ
ンまたはイソブチレンの２段階の気相酸化反応により、
アクロレインおよびメタクロレインを経由して製造する
方法が既に開発されている。しかし、この方法において
も高温反応であり、触媒の劣化と共に反応生成物の重合
が大きな問題点として残されており、さらに新規で工業
的に有利な製造方法の開発が望まれている。

一方、ニトリル化合物が微生物により資化ないしは分解
されることは、アセトニトリル等〔ジャ−ナル　オプ　
ファーメンテ−ジョン　テクノロジー（Ｊ、Ｆｅｒｍｅ
ｎｔ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、）　４７＠＋　　６３１−頁、
１９．６９年、同誌４９巻、１０１１頁、１９７１年）
、α−ヒドロキシイソバレロニトリル（ジャーナル　オ
プ　ファーメンテ−ジョン　テクノロジー５１巻、３９
３頁、１９７３年）、ベンゾニトリル〔バイオケミカル
　ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ）　　１６５＠＋　　３０９頁。

１９７７年）等が知られている。また、ニトリル化合物
の微生物学的加水分解による有機酸類の製造法として、
バチルス属、バタテリジウム属、ミクロコツカス属およ
びブレビバクテリウム属等の微生物を用いる方法（特公
昭５８−１５１２０）や、アクリロニトリルからアクリ
ル酸とアンモニアへ、アルスロバクタ−スペシース　Ｉ
−９を用いる反応（ジャーナル　オプ　ファーメンテ−
ジョン　テクノロジー５７巻、８頁、１９７９年）が知
られている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、バチルス属、バタテリジウム属、ミクロコツカ
ス属およびブレビバクテリウム属等の微生物を用いる方
法は、α−ヒドロキシニトリル類やアミノニトリル類に
対しては充分な加水分解活性を示すが、炭素数２〜４の
ニトリル、すなわち、アセトニトリル、プロピオニトリ
ル、ノルマルブチロニトリル、イソブチロニトリル、ア
クリロニトリルおよびメタクリロニトリルに対しては、
工業的な反応活性が認められていなかった。また、アル
スロバクタ−属の微生物を用いた場合には、培養時に使
用したニトリル化合物と同一のニトリル化合物で加水分
解を行なうときには、生成した有機酸が、さらに分解、
資化されて、消滅してしまうことがあり、反応生成物の
収率の低下が考えられた。

（問題点を解決するための手段）　　　　・本発明者ら
は、このような工業的な問題点の解決を目標にして、炭
素数２〜４のニトリル化合物を加水分解し、生成した有
機酸が分解、資化されて消滅しないようなニトリル化合
物加水分解活性を有する微生物の探索と培養および反応
条件の研究を鋭意行った結果、コリネバクテリウム属に
属する微生物の中から選ばれたニトリル化合物加水分解
活性を有する微生物を発見し、本発明を完成した。すな
わち、これらの微生物は、炭素数２〜４のニトリル化合
物に強い加水分解活性を示すと共に、反応生成物である
有機酸が分解、資化されて消滅しない性質を持つもので
ある。

本発明に用いられる微生物は、コリネバクテリウム　ニ
トリロフィラス（Ｃ’ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ
ｉｔｒｉｌｏｐｈｙｌｕｓ　ＡＴＣＣ２１４Ｌ　９）　
、コリネバクテリウム　スペシース　Ｂ−９６菌株およ
びコリネバクテリウム　スペシース　ｃ−９９菌株は、
それぞれアメリカン　タイプカルチャー　コ　　・レフ
シラン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＡＴＣＣ）ならびに微工研菌
寄第７７３３号および第７７３４号として寄託されてお
り、菌学的性質は以下に示すとおりである。なお、コリ
ネバクテリウム　ニトリロフィラス　ＡＴＣＣ２１４１
’９は、アセトニトリル等のニトリル化合物を資化分解
する微生物として分離されたもので、その性質はジャー
ナル　オブ　ファーメンテ−ジョンテクノロジー４７巻
、６３１頁、１９６９年に詳しく記載されている。

コリネバクテリウム　スペシース　Ｂ−９６菌株ａ　形
態 ■細胞の形および大きさ　　禅菌 ２．１〜２．４　Ｘ３．６〜５．５μｍ■細胞の多形性
の有無　　分枝状および球状で顕著な多形性を示す。

■運動性の有無　　　　　無 ■胞子の有無　　　　　　風 ■ダラム染色性　　　　　陽性 ■抗酸性　　　　　　　　無 ｂ　各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養　　円形、表面粗ζ金縁、中心突状
、ピンク色、表面平滑、バター状、不透明。

■肉汁寒天斜面培養　　生育中程度、糸状、表面は皺が
多い、ピンク色、***状、波状。

■肉汁液体培養　　　　厚いがもろい菌膜形成、透明ま
たはわずかに混濁、沈渣あり。

■肉汁、ゼラチン穿刺培養　　液化せず、上部で生育量
も良好。

■リドマスミルク　　　変化しない。

Ｃ生理学的性質 ■硝酸塩の還元　　　　　陰性 ■ＭＲテスト　　　　　　陰性 一■−ｖＰテスト　　　　　　陰性 ■インドールの生成　　゛陰性 ■硫化水素の生成　　　　陰性 ■デンプンの加水分解　　陰性 ■無機窒素源の利用　　　陽性 ■可溶性色素の生成　　　陰性　ただし、菌はピンク色
になる。

■ウレアーゼ　　　　　　陽性。

［相］カタラーゼ　　　　　　陽性 ■セルロースの加水分解　陰性 ■生育の範囲　　ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８゜温度
１８〜３９℃、好ましくは２３〜３６℃０酸素に対する
態度　　　好気性 ■＜）Ｈから酸およびガスの生成 酸の生成　　ガスの生成 ブドウ糖　　　　十　　　　　　　− 麦芽糖　　　　　＋　　　　　　− ショ糖　　　　　−− 乳糖　　　　　　−− コリネバクテリウム　スペシース　Ｂ−９９菌株ａ　形
態 ■細胞の形および大きさ　　桿菌 ０．７〜１．２　Ｘｌ、２〜１．７　μｍ■細胞の多形
性の有無　　分枝状で多形性を示す。

■運動性の有無　　　　　無 ■胞子の有無　　　　　　無 ■ダラム染色性　　　　　陽性 ■抗酸性　　　　　　　　無 ｂ　各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養　　円形、表面粗、金縁、中心突状
、うすいピンク色、表面平滑、バター状、不透明。

■肉汁寒天斜面培養　　生育、糸状、表面は皺が多い、
ピンク色、***状、波状。

■肉汁液体培養　　　　厚いがもろい菌膜形成、透明ま
たはわずかに混濁、沈渣。

■肉汁ゼラチン穿刺培養　　液化せず、上部で生育量も
良好。

■リドマスミルク　　　変化しない。

Ｃ生理学的性質 ■硝酸塩の還元　　　　　陰性 ■ＭＲテスト　　　　　　陰性 ■ｖｐテスト　　　　　　陰性 ■インドールの生成　　　陰性 ■硫化水素の生成　　　　陰性 ■デンプンの加水分解　　陰性 ■無機窒素源の利用　　　陽性 ■可溶性色素の生成　　　陰性　ただし、菌はピンク色
になる。

■ウレアーゼ　　　　　　陽性 ［株］カタラーゼ　　　　　　陽性 ■セルロースの加水分解　陰性 ＠生育の範囲　　ｐＨ５〜１０、好ましくは６〜８温度
１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃０ｆ１１素に対
する態度　　　好気性 ■糖から酸およびガスの生成 酸の生成　　ガスの生成 ブドウ糖　　　　　十　　　　　　　−麦芽糖　　　　
　＋　　　　　　− シー１糖　　　　　−− 乳糖　　　　　　−− 以上の菌学的性質をバージ−の細菌分類書（Ｂｅｒｇｙ
’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　　Ｄｅｔｅｒｍ、１ｎａ
ｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版（１９
７４）に基いて分類すると、Ｂ−９６菌株およびＣ−９
９菌株は、ダラム陽性、胞子形成能無、非抗酸性、好気
性で多形性を示す°桿菌であることから、コリネバクテ
リウム属に属する細菌であると決定した。コリネバクテ
リウム　ニトリロフィラス　ＡＴＣＣ２１４１９、Ｂ−
９６菌株、Ｃ−９９菌株は、スラントの外観や、生育条
件およびニトリル資化能などで差異がある。

これらの微生物は、工業技術院微生物工業技術研究所に
下記の番号で寄託されている。

菌株　　　　寄託番号　　　　　　　寄託日−Ｂ−９６
微工研菌寄第７７３３号　　昭和５９年７月２０日Ｃ−
９９同　　７７３４号　　　　同上また、持分＠５６−
１７９１８に記載されているコリネバクテリウムＮ−７
７１およびＮ−７７４菌株と、本発明に使用した微生物
とは、硝酸塩の還元能において明らかに異なっており、
異なった種の微生物と考えられる。　　゛ 本発明に使用される微生物の培養には、アセトニトリル
、イソブチロニトリル等の飽和ニトリル化合物を唯一の
炭素源、窒素源とするか、もしくはグルコース、アルド
ース等の炭素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム
等の窒素源に、飽和ニトリルを炭素源、窒素源として共
存させたものに、リン酸塩、力ｌナウム、鉄、マグネシ
ウム、マンガン、亜鉛等の無機栄養源等を適宜含有した
培地が用いられる。また、飽和ニトリル化合物を全く添
加しない培地を用いて培養し、培養途中に適宜ニトリル
化合物を添加して培養を続けることによって、ニトリル
化合物の加水分解活性を持った菌体を取得することがで
きる。培地のｐＨは通常５〜９、好ましくは６〜８、温
度は通常２０〜話℃、好ましくは２５〜３２℃で、１〜
５日間好気的に培養を行なう。

このようにして、得られた菌体培養物、それから分離し
た菌体およびその酵素抽出物を水またはリン酸バッファ
ー（たとえばｐＨ７〜８）などの緩衝液に懸濁し、これ
に炭素数２〜４のニトリル化合物を共存させれば、速や
かに加水分解反応が進行し、対応する有機酸とアンモロ
アを生成する。

すなわち、通常、前記微生物菌体１〜１０重景％および
二！・ジル化合物０．２〜１０重量％を含む水性懸濁液
を、温度５〜３５℃、ｐＨｓ〜１０の条件を用いて、１
０分ないしは２４時間反応させればよい。

また、反応に際して基質として用いるニトリル化合物は
、一般に生物毒性が強いので、反応系内の基質濃度は反
応を阻害しない程度の濃度にコントロールしつつ、逐次
添加することができる。かくして、炭素数２〜４のニト
リル化合物は、副生物であるアミド化合物の生成なしに
、はぼ１００％のモル収率で対応する有機酸とアンモニ
アに転換し、有機酸アンモニウム塩の高濃度水溶液゛と
して生成蓄積させることができる。

なお、上記反応には、菌体または酵素をたとえばアクリ
ルアミドゲルまたはアルギン酸カルシウム等を用いる通
常の固定化法にしたが９て固定化し、使用することもで
きる。

また、反応器型式に関しては゛、バッチ式、連続式また
は再使用式のいずれの型式を用いて行なうことも可能で
ある。

（発明の効果） 本発明は、ニトリル化合物の加水分解活性を有するコリ
ネバクテリウム属に属する微生物を用いることにより、
炭素数２〜４のニトリル化合物をほぼ１００％の収率・
で対応する有機酸とアンモニアに転換することを見出し
たもので、常温、常圧という温和な条件で反応が進行す
るため、重合ロスのない工業的にを利なニトリル化合物
の加水分解反応に応用できるものである。

（実施例） 次に、本発明を実施例により説明する。

実施例１ コリネバクテリウム　ニトリロフィラス　ＡＴＣＣ２１
４１９を下記のＡ培地を用い、２４時間３０℃で振盪培
養した後、集菌し、さらに、Ｂ培地を用いて、２４時間
３０℃で振盪培養した。

Δ培地　　　グルコース　　　　　１．０％肉エキス　
　　　　　°１．０％ ペプトン　　　　　　０．３％ 食塩　　　　　、０．１％ ｐ　）ｌ　　　　　　　　　７．Ｑ Ｂ培地　　　イソブチロニトリル　０．５　　％リン酸
第−カリウム　０．１　　％ 硫酸マグネシウム　　０．０５　　％ 硫酸第一鉄　　　　　ｏ、ｏｏｓ％ 硫酸マンガン　　　　０．００５％ 硫酸アンモニウム　　０，１　　％ 硝酸カリウム　　　　０．１　　％ ｐＨ７，０ 上記培養条件で増殖した菌体を遠心分離により集菌し、
乾燥菌体量として２重量％、メタクリローニトリル２重
量％、ｐＨ７，０リン酸バフフア一液９６重量％の反応
液を調合し、３０℃で反応を開始した。反応開始後３時
間でメタクリロニトリルは加水分解し、モル収率はぼ１
００％でメタクリル酸アンモニウム塩が生成していた。

また、メタクリルアミドの生成はほとんど見られなかっ
た。

なお、生成物の分析は、反応終了後、面体を遠心分離に
より除去し、ガスクロマトグラフ法によりメタクリル酸
、メタクリルアミドを、ネスラー法によりアンモニアを
それぞれ定量した。メタクリル酸アンモニウム塩は、ガ
スクロマトグラフ法ではメタクリル酸として検出された
。

実施例２ コリネバクテリウム°　ニトリロフィラス　ＡＴＣＣ２
１４１９を実施例１と同様な培養条件で培養した。アク
リロニトリル２重量％とする以外は、実施例１と同様な
反応条件で反応を開始したところ、反応開始後３０分で
アクリロニトリルは加水分解し、モル収率はぼ１００％
でアクリル酸アンモニウム塩が生成していた。また、ア
クリルアミドの生成はほとんど見られなかった。なお、
生成物の分析は、実施例１と同様に行った。

実施例３ コリネバクテリウム　ニトリロフィラス　ＡＴＣＣ２１
４１９を実施例１と同様な培養条件で培養した。アセト
ニトリル、プロピオニトリル、ノルマルブチロニトリル
およびイソブチロニトリルをそれぞれ２重量％とする以
外は、実施例１および２と同様な反応条件で反応を実施
し、単位菌体量および単位時間当りの反応活性を比較し
、結果を第１表に示した。なお、比活性はミリモル−生
成物／グラム−乾燥菌体量・時間で示した。

第１表 実施例４ コリネバクテリウム　スペシース　Ｂ−９６菌株を下記
のＣ培地を用い、２４時間３０℃で振盪培養した。

Ｃ培地　　グルコース　　　　　　１．０　　％肉エキ
ス　　　　　　　１．０　　％ ペプ・トン　　　　　　　　０．３　　％食塩　　　　
　　　　　０．１　　％ アセトニトリル　　　　０．５　　％ リン酸第−カリウム　　０．１　　％ 硫酸マグネシウム　　　０．０５　　％硫酸第一鉄　　
　　　　０．００５％ 硫酸マンガン　　　　　ｏ、ｏｏｓ％ 硫酸アンモニウム　　　０．１　　％ 硝酸カリウム　　　　　０．１　　％ ｐ　Ｈ６，０％ 上記培養条件で増殖した菌体を遠心分離により集菌し、
メタクリロニトリル、アクリロニトリルおよびアセトニ
トリルをそれぞれ２重量％とする以外は、実施例１と同
様な反応条件で反応を実施し、反応活性を比較した。結
果を第２表に示した。

実施例５ コリネバクテリウム　スペシース　Ｃ−９９１株を実施
例４と同様な培養条件で培養し、菌体を３）］製した。

メタクリロニトリル、アクリロニトリルおよびアセトニ
トリルを用いて、実施例４と同様の条件−によって反応
を行ない、反応活性を比較した。結果を第３表に示した
。

実施例６ 実施例１と同様にして調製したコリネバクテリウム　ニ
トリロフィラス　ＡＴＣＣ２１４１９の菌体を、乾燥重
量として２重量％となるようにｐＨ６，０の蒸溜水に懸
濁した。これにメタク°リロニトリルを３時間に２重世
％の割合で連続的に滴下し、３０℃で反応させた。１２
時間反応させた後、遠心分離により菌体を除去し澄明液
を得た。このもののメタクリル酸濃度を定量したところ
、９．７重量％の含有率であった。

実施例７ 実施例６で得られた反応液から、遠心分離法により菌体
を回収し、再びｐＨ６，０の蒸溜水に乾燥菌体量として
２重量％になるように懸濁して、実施例６と同様にメタ
クリロニトリルを連続的に滴下し、１２時間反応させた
。このような操作を合計５回繰り返したところ、第４表
の成績を得た。

（添加基質は１回の反応に対して８重量％）手続補正書 昭和５９年９月１９日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネバクテリウム属に属し、ニトリル化合物を加水分
   解する能力を有する微生物の作用により、炭素数２〜４
   のニトリル化合物から対応する有機酸とアンモニアを生
   成せしめることを特徴とする炭素数２〜４の有機酸およ
   びその塩の微生物学的製造法。