WO2005095626A1 - 固定化生体触媒およびそれを用いた有機酸塩の製造方法 - Google Patents

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organic acid
biocatalyst
producing
acid salt
aqueous solution
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PCT/JP2005/005799
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Youichi Kobayashi
Masahiro Yokoyama
Ryosuke Mizui
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Nippon Soda Co., Ltd.
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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an organic acid salt by using a hydrolysis action of an immobilized biocatalyst.
  • the organic acid salt produced according to the present invention is used as it is or, if necessary, converted into the corresponding organic acid for use in industrial raw materials, agricultural and pharmaceutical raw materials, feed additives and the like.
  • the present invention also provides a method for preparing an immobilized biocatalyst.
  • the immobilized biocatalyst produced by the present invention is used for applications such as production of various useful substances, wastewater treatment and environmental purification.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 58-15120
  • Patent Document 2 JP-A-04-40898
  • Patent Document 3 JP-A-03-62391
  • Patent document 4 International publication 00-27809 pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Methods in ENZYMOLOGY 135, 175-189
  • the present inventors have found that when converting nitrile or amide to the corresponding organic acid ammonium, As a result of intensive studies on the preparation method of the immobilized biocatalyst that can be used, when the biocatalyst is entrapped and immobilized with an alginate gel, a cationic amine such as a primary amine or a secondary amamine is contained in its constituent unit.
  • the method of contacting the polymer simultaneously with the polyvalent metal ion or after contacting the polymer with the polyvalent metal ion does not cause a decrease in the activity of the biocatalyst at the time of preparation and prevents the catalyst from being used and washed.
  • the present invention has been completed by finding an industrially advantageous method for preparing a biocatalyst which does not require the occasional addition of polyvalent metal ions such as Ca ions irrespective of the concentration of the organic acid ammonium.
  • the biocatalyst is mixed with an aqueous alginate solution, and the mixed solution is contacted with an aqueous solution containing a cationic polymer having a primary amine or a secondary amine in a constituent unit and a polyvalent metal ion to form a gel.
  • an immobilized biocatalyst or by contacting the mixture with an aqueous solution containing a polyvalent metal ion to form a gel and then contacting with a cationic polymer having a primary or secondary amine in the constituent unit
  • a process for producing an organic acid salt which comprises recovering the organic acid ammonium.
  • the present invention provides a gel catalyst by mixing a biocatalyst with an aqueous alginate solution and bringing the mixed solution into contact with an aqueous solution containing a cationic polymer having a primary amine or a secondary amine as a constituent unit and a polyvalent metal ion.
  • a gel catalyst by mixing a biocatalyst with an aqueous alginate solution and bringing the mixed solution into contact with an aqueous solution containing a cationic polymer having a primary amine or a secondary amine as a constituent unit and a polyvalent metal ion.
  • the immobilized biocatalyst is prepared, and then, in a solvent containing the immobilized biocatalyst, the tolyl or amide is converted to the corresponding organic acid ammonium without supplying the polyvalent metal ion. And recovering the organic acid ammonium salt.
  • X- represents a monovalent anion, and n represents an integer of 10 to 4000
  • X- represents a monovalent anion
  • k and m are integers of 1 to 10
  • n is an integer of 10 to 4000.
  • X- represents a monovalent anion
  • n represents an integer of 10 to 4000
  • a cationic polymer having a secondary amine or a secondary amine is a mixture of the polymer represented by the above formula 1, 2, or 3 and polyethyleneimine. Method for producing acid salt.
  • the biocatalyst is derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter, the genus Variovorax, the genus Pseudonocardia, or the genus Rhodococcus.
  • the method for producing an organic acid salt according to (4) is derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter, the genus Variovorax, the genus Pseudonocardia, or the genus Rhodococcus.
  • the biocatalyst is characterized by being Arthrobacter sp. NS (Arthrobacter sp.) NSSC104, earth mouth Bacter sp. NS (Arthrobacter sp.) NSSC204 or Pseudonocardia thermophila JCM3095 ( (1) The method for producing an organic acid salt according to (8)
  • an organic acid ammonium - ⁇ concentration arm is characterized in that 5 wt 0/0 above (1) to a manufacturing method of an organic acid salt according to (6).
  • a method for preparing an immobilized biocatalyst comprising the steps of:
  • aqueous solutions of alginate used in the present invention include aqueous solutions of sodium alginate, potassium alginate, and ammonium alginate.
  • the cationic polymer used in the present invention may be any polymer that contains a primary amine or a secondary amine in its constituent unit. Homopolymers represented by the formula, copolymers represented by the above formula 2, polyethylenimine and chitosan can be mentioned. These cationic polymers can be used in combination of two or more kinds. More specifically, Nittobo's PAS series, PAA series, etc. can be exemplified.
  • the monovalent anion used in the present invention includes, but is not limited to, Cl-, OH- and the like.
  • Polyvalent metal ions used in the present invention include calcium ions, strontium ions, norium ions, aluminum ions and the like.
  • alginate gel used in the present invention examples include hydrogels formed by calcium alginate, strontium alginate, barium alginate, aluminum alginate and the like.
  • the -tolyl used in the present invention includes ratato-tolyl, mandero-tolyl, 2-hydroxy
  • Examples of the amide used in the present invention include lactamide, mandelamide, 2-hydroxy-1-methylthiobutyramide, and 2-amino-4-methylthiobutyramide.
  • the organic acid salt produced in the present invention includes ammonium salts such as lactic acid, mandelic acid, 2-hydroxy-4-methylthiobutanoic acid and methionine, sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts and the like. Is mentioned.
  • the biocatalyst used in the present invention is not particularly limited as long as it is a cell having an activity of converting a -tolyl or amide compound into a corresponding organic acid ammonium or a treated product thereof.
  • Genus and among these, in particular, earth bacterium _ _ ⁇ sp (Arthrobacter sp.) NSSC104 (FERM BP-5829), earth port pacta ⁇ _ ⁇ sp (Arthrobacter sp.) NSSC204 (FERM BP) — 7662), Variovorax paradoxus IAM12374, Pseudonocardia thermoph ila) JCM3095 can be suitably exemplified. Further, there may be mentioned cells of a recombinant organism obtained by introducing a gene sequence encoding -tolylase, amidase or -tolylhydratase contained in these cells into another kind of cell. Examples of the processed product include a cell extract or -tolylase, nitrile hydratase or amidase purified from the extract.
  • the immobilization of the biocatalyst is performed as follows. First, cells collected from a culture solution obtained by culturing the above microorganisms by centrifugation or membrane separation are suspended in an aqueous solution containing a water-soluble alginate such as sodium alginate. Is continuously dropped into an aqueous solution containing a polyvalent metal ion such as a calcium ion, a strontium ion, a barium ion or an aluminum ion, and the above-mentioned cationic polymer to obtain a bead-shaped molded product.
  • a polyvalent metal ion such as a calcium ion, a strontium ion, a barium ion or an aluminum ion
  • the molded article may be obtained in an aqueous solution containing only the polyvalent metal ion and then immersed in an aqueous solution containing the cationic polymer.
  • a valent metal ion may be contained.
  • it can be formed into a plate, rod, thread, or the like, and then cut and used as necessary.
  • the thus obtained immobilized biocatalyst was treated with nitrile or acetonitrile as it was or after being washed with an aqueous solvent. It can be subjected to a conversion reaction to the corresponding organic acid ammonium by contacting with the midi conjugate.
  • Alginates used in preparing the immobilized biocatalyst include sodium alginate, potassium alginate, and alginate alginate, which have a concentration of 0.1 to 0.1% before gelling. Can be used in the range of 10% by weight. The cell concentration before gelation can be used in the range of 0.01 to 15% by weight as the dry weight of the cells.
  • the inner diameter of the injection needle, pores, etc. for forming the droplets should be within the range of 0.05 to 5 mm.
  • An industrial method such as flow, mechanical vibration or mechanical shear may be used.
  • the polyvalent metal used for geli-dani is selected from the group consisting of canoleshmi-d, strontium-d, norium-d, aluminum ion, and the like. Used as an aqueous solution.
  • Gel is a force generated simultaneously with contact with polyvalent metal ions. In order to increase the strength of the gel, it is better to contact these polyvalent metal ions for at least 30 minutes, preferably 2 hours to 5 days.
  • a higher temperature during gel formation has the effect of shortening the contact time, but is usually selected in the range of 4 to 60 ° C in consideration of the stability of the biocatalyst.
  • the pH at the time of gel formation should be determined in consideration of the stability of the biocatalyst.
  • Normal pH3 ⁇ Power selected in the range of L1 Avoid chitosan aggregation only when chitosan is used as the cationic polymer
  • the pH is preferably adjusted to 7 or less.
  • the amount of the aqueous solution of the polyvalent metal salt used when the gel is formed into beads is sufficient as long as the droplets to be dropped do not come into contact with each other before being formed into beads.
  • 0.5-: LOO double capacity is used.
  • the concentration of the cationic polymer at the time of forming the gel can be generally used in the range of 10 ppm to 10% by weight, preferably 20 ppm to 1% by weight.
  • the concentration of the cationic polymer can be generally used in the range of 10 ppm to 10% by weight, preferably 20 ppm to 1% by weight, and the immersion time is A force in the range of 30 minutes or more, preferably 2 hours to 5 days, a treatment temperature of 4 to 60 ° C. and a pH of 3 to 11 is also selected.
  • the pH is preferably adjusted to 7 or less in order to avoid aggregation of chitosan.
  • the size of the prepared beads changes depending on the salt concentration, pH, temperature conditions, etc.
  • the thus obtained immobilized biocatalysts are physically stable even at a polyvalent metal ion concentration of less than 10 mM, and have an alginate gel force.
  • a force capable of depriving polyvalent metal ions. Rubonate, phosphate and sulfate. Force that can be used even in the presence of a salt When using a method of simultaneously contacting a polyvalent metal ion and a cationic polymer to perform gelling, contacting the cationic polymer after gelling with a polyvalent metal ion An immobilized biocatalyst having better physical stability than the method can be obtained.
  • the production of an organic acid salt using the immobilized biocatalyst prepared as described above is performed as follows.
  • the immobilized biocatalyst is added to water or an aqueous solution of an organic acid corresponding to the desired organic acid salt, and the pH is adjusted as necessary.
  • the addition of the compound causes the accumulation of the ammonium salt.
  • the reaction can be stopped and the batch reaction for separating the immobilized biocatalyst from the product can be repeated, but the organic reaction can be continued while adding the substrate.
  • the recovery of the reaction solution and the supply of water are performed in parallel, so that the aqueous solution of the organic acid ammonium in a certain range can be continuously produced.
  • the resulting continuous reaction may be carried out using a column reactor or a stirred tank reactor.
  • the reaction temperature may be kept constant, but the biocatalyst may be changed within a stable range for the purpose of maintaining a constant production rate.
  • the substrate concentration may be changed so that the substrate supply rate is maintained at a constant value.However, it is sufficient to maintain the substrate supply rate at a constant value. To avoid this, an additional biocatalyst can be added.
  • Organic acid ammonium - ⁇ amount of fixed I ⁇ member catalyst in the production of beam can be performed in the range of the reaction solution to 50 by weight at a ratio of wet weight for weight 0/0.
  • the reaction is carried out at a pH of 3 to 12, preferably 5 to L1.
  • the temperature of the reaction may be selected in the range from 4 to 70 ° C.
  • the concentration of the substrate can be in the range of 0.001% by weight to the saturation concentration, and the concentration of the formed organic acid ammonium salt can be in the range of 1% by weight to the saturation concentration, preferably 5% by weight to the saturation concentration. You can do it.
  • the reaction solution may contain salts such as carboxylate, phosphate, sulfate, etc., in addition to the produced organic acid ammonium salt.
  • the desired organic acid salt can be prepared from the obtained aqueous solution of organic acid ammonium by adding a corresponding base and distilling off ammonia. At this time, the aqueous solution of organic acid ammonium may be concentrated in advance.
  • the base to be added may be selected according to the target organic acid salt, and examples thereof include sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, and magnesium hydroxide. In addition, Sidani calcium, calcium carbonate, Sidani magnesium or magnesium carbonate may be used.
  • the target organic acid salt can be obtained under industrially advantageous conditions by virtue of the nitrile or amido ligating properties.
  • Yeast extract 0.5%, glucose 0.5%, dipotassium hydrogen phosphate 0.1%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, salt 0.1%, magnesium sulfate heptahydrate 0.02%, and 3 ml of a medium containing 0.001% of ferrous sulfate was placed in a test tube and sterilized at 121 ° C for 20 minutes.
  • 200 ml of a medium having the following composition was placed in a 1000 ml baffled Erlenmeyer flask.
  • One platinum loop of Arthrobacter NSSC204 strain was inoculated into the above-mentioned test tube, and cultured at 33 ° C. with shaking. Then, 2 ml of the culture was inoculated into the above-mentioned Erlenmeyer flask with a baffle, and then transferred. Shaking culture was performed at 33 ° C for days.
  • the cells were collected as a pellet by centrifuging the obtained culture solution, and suspended in ion-exchange water to obtain a 20-ml cell suspension.
  • 0.357 g of sodium alginate was dissolved in 50 ml of water and mixed with 20 ml of the cell suspension to obtain a cell-sodium alginate mixed solution.
  • the piping was connected so that this mixed solution could be dropped from the tip of the injection needle (22G) using a tubing pump.
  • Calcium chloride dihydrate 5 5.
  • the fixed immobilized cell body catalyst (equivalent to 3.3 g in terms of dry weight) obtained in Example 1 was placed in a ⁇ four-necked flask, and water was added to make 55.5 ml.
  • the four-necked flask was equipped with a stirring blade, a pH sensor, a raw material supply pipe, a reaction liquid recovery pipe with a filter, a pH adjustment liquid supply pipe, a replenishment water supply pipe, and a water level sensor.
  • the flask was placed in a constant temperature water bath at 25 ° C., and stirring was performed at a speed of 60 rpm.
  • the pH sensor is connected to a pH controller, and the pH is automatically adjusted to 7.0 to 7.5 by supplying 0.5% ammonia water from the pH adjustment liquid supply pipe with a pump controlled by the pH controller.
  • the raw material 2-hydroxy-4-methylthiop-mouth-tolyl
  • the reaction solution was continuously collected through a reaction solution collection tube by a metering pump.
  • the water level sensor is installed so that it can detect that the liquid volume in the flask has changed from the initial liquid volume (65 ml), and the replenishing water is supplied by a pump linked to the water level sensor, so that the reaction solution is removed from the flask.
  • the liquid level was set so as to maintain a constant height even when the liquid was discharged.
  • the continuous reaction was performed as follows. As a first step, the water level and pH controls were not activated, and the raw material-tolyl was continuously added at a rate of 4 gZh. When the water level sensor-detects the liquid level, the raw material - tolyl are 12. 5 g feed, 2-hydroxy-4-methylthiobutanoate ammoxidation reaction liquid - ⁇ beam concentration had reached 20 weight 0/0. Then, control of the water level and pH was started, and a continuous reaction was started in which the reaction solution was continuously withdrawn at a rate of 15 gZh while adding the starting material-tolyl at a rate of 3 gZh.
  • reaction solution components The analysis of the reaction solution components is as follows It went to. After sampling 0.1 ml of the reaction solution and diluting 100 times with water, high performance liquid chromatography (column: Tosoh ODS-80TS 4.6 mm XI 50 mm, eluent: 0.1% (V / V) TFA- 20% (VZV) acetonitrile aqueous solution, flow rate: lmlZmin, column temperature: 40 ° C). A calibration curve was prepared using known concentrations of 2-hydroxy-4-methylthiobutyrate-tolyl and ammonium 2-hydroxy-1-methylthiobutanoate, and the peak area force of each diluted sample was analyzed. Calculated.
  • FIG. 1 shows the results of a continuous reaction for 46 days. During this time, the immobilized cell catalyst beads were physically stable, and beads collapsed and cell leakage was not observed.
  • Example 2 As in Example 2, except that the addition of polyallylamine hydrochloride was omitted, the immobilized Idani germ cell catalyst (equivalent to 3.3 g in terms of dry weight) prepared in the same manner as in Example 1 was used. Continuous production of ammonium 2-hydroxy-4-methylthiobutanoate was attempted by the method described above. As a first step of continuous reaction, a state that does not actuate the control of the water level and P H, the raw material - was continuously added tri Le at a rate of 4GZh. Approximately one hour later, the leakage of cells from the immobilized cell catalyst began to be observed, and after one hour, the shape of the immobilized cell catalyst began to collapse. The sol was turned into sol and the viscosity of the reaction solution increased, making it impossible to continue the continuous reaction.
  • the activity of the biocatalyst is not reduced at the time of its preparation, and at the time of its use or washing.
  • the desired organic acid salt can be obtained under industrially advantageous conditions by using an immobilized biocatalyst that does not require the addition of polyvalent metal ions such as Ca ions, regardless of the presence or absence of the organic acid ammonium. be able to.

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Abstract

【課題】　Ｃａイオン等の多価金属イオン塩濃度が低く有機酸アンモニウムが大量に存在する条件下で、アルギン酸ゲルにより包括固定化された生体触媒の加水分解により、ニトリル又はアミドを加水分解することよりなる有機酸塩の製造方法を提供する。 【解決手段】　構成単位に一級アミンまたは二級アミンを有するカチオン性ポリマー及びアルギン酸塩により包括固定化された生体触媒の加水分解活性を利用して、多価金属イオンを供給することなくニトリル又はアミドを対応する有機酸アンモニウムに変換することを特徴とする有機酸塩の製造方法。

Description

明 細 書
固定ィ匕生体触媒およびそれを用いた有機酸塩の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は固定化生体触媒の加水分解作用を用いて有機酸塩を製造する方法に関 する。本発明により製造される有機酸塩はそのままあるいは必要に応じて対応する有 機酸に変換されて工業原料、農医薬原料、飼料添加物等の用途に利用される。また 、本発明は固定化生体触媒を調製する方法を提供する。本発明により製造される固 定化生体触媒は各種有用物質の生産、排水処理並びに環境浄化等の用途に利用 される。
背景技術
[0002] 生体触媒の加水分解作用を利用した有機酸塩の製造方法としては、二トリル化合 物を加水分解する方法 (たとえば、特許文献 1〜3参照）、アミド化合物を加水分解す る方法 (たとえば、特許文献 4参照）などが知られている。これらの方法では、二トリル またはアミドの加水分解によって直接アンモ-ゥム塩が得られることが知られている。
[0003] 生体触媒を用いて物質生産を行なう場合、生産物と生体触媒の分離が容易に行な える利点から、固定化された生体触媒を用いることが一般的である。生体触媒の固定 化には数多くの方法が知られているが、生体触媒の性質、原料'生産物の物性など に応じて最適なものが選択される。例えばアルギン酸カルシウムゲルを用いた包括 固定化法は、安価で容易に行なえるのみならず、生体触媒にとって温和な固定ィ匕条 件固定ィ匕を選択できるため、生体触媒の活性を効率的に利用できる利点があること から、広汎に利用されている（たとえば、非特許文献 1参照)。
[0004] 特許文献 1：特公昭 58 - 15120号公報
特許文献 2 :特開平 04— 40898号公報
特許文献 3：特開平 03— 62391号公報
特許文献 4：国際公開 00— 27809号パンフレット
非特許文献 1 : Methods in ENZYMOLOGY 135卷、 175〜189ページ
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0005] ところが有機酸塩の製造にアルギン酸カルシウムゲルで包括固定ィ匕された生体触 媒を用いる場合は必ずしも工業的に有利ではない。その理由として、アルギン酸カル シゥムゲルがその強度を維持するために Caイオン等の多価金属イオンを必要とする 性質を有することが挙げられる。すなわち多くの有機酸は Caと不溶性の塩を形成す る性質があり、またジカルボン酸やアミノ酸のようにキレート作用を有する場合もある ため、製造工程において 10〜： LOOmM濃度の Caイオンを補給する必要があり、その ため場合によっては後で Caを除去する工程が必要になるだけでなく Caに由来する 廃棄物が発生するなど工業的に問題がある。また、固定化担体に含まれる生産物を 回収する工程においても Ca等の添カ卩が必要であり、同様の問題が生じる。アルギン 酸ゲルの強度を維持 ·強化するために、生体触媒をアルギン酸 Caによって包括固定 ィ匕した後に、ポリエチレンィミンでイオン的に結合させる方法 (Methods in
ENZYMOLOGY 135卷、 175〜189ページ）、ポリアリルアミン等でイオン的に結合さ せる方法 (Material Science & Engineering,し： Biomimetic and Supramolecular Systems C13卷、 1 2号、 59〜63頁、 2000年）が知られているが、その方法により 調製された固定ィ匕生体触媒を二トリル又はアミドを加水分解する工程のように塩濃度 の高 、有機酸アンモ-ゥムが存在する条件下で、なおかつ Caイオンを添加すること なく適用した例は知られていない。また、ポリエチレンィミンと結合させた後でグルタ ルアルデヒドによる架橋反応を行なう方法（Biotechnology Letters第 3卷、 393ぺー ジ、 1981年）や、あら力じめ過ヨウ素酸で酸化されたアルギン酸カルシウムを用いて 生体触媒を包括固定ィ匕した後に、酸ィ匕アルギン酸のアルデヒド基にポリエチレンイミ ンを架橋結合させる方法（Biotechnology Letters第 3卷、 393ページ、 1981年）が知 られており、これらの方法では塩濃度が高い場合でも共有結合によりゲル強度が維 持されるものの、アルデヒド基または過ヨウ素酸により生体触媒の活性が低下する場 合が多 、ため、生体触媒の活性を効率的に利用できるアルギン酸カルシウムゲルの 利点が失われる結果となる。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、二トリルまたはアミドを対応する有機酸アンモ-ゥムに変換する際に 用いることができる固定ィ匕生体触媒の調製方法について鋭意検討した結果、生体触 媒をアルギン酸ゲルにより包括固定ィ匕する際に、一級アミンまたは二級ァミンがその 構成単位に含まれるようなカチオン性ポリマーを多価金属イオンと同時に接触させる か又は多価金属イオンと接触させた後で接触させる方法を用いることにより、調製時 に生体触媒の活性低下を引き起すことがなぐかつその使用時および洗浄時に有機 酸アンモ-ゥムの濃度にかかわらず Caイオン等の多価金属イオンを添加する必要が ない、工業的に有利な生体触媒の調製方法を見出して本発明を完成させた。
すなわち本発明は、生体触媒をアルギン酸塩水溶液と混合し、該混合液を構成単 位に一級アミンまたは二級アミンを有するカチオン性ポリマー及び多価金属イオンを 含む水溶液と接触させてゲル化することにより固定化生体触媒を調製するか、若しく は該混合液を多価金属イオンを含む水溶液と接触させてゲル化させた後に構成単 位に一級アミンまたは二級アミンを有するカチオン性ポリマーと接触させることにより 固定化生体触媒を調製し、次 ヽで該固定化生体触媒を含む溶媒中で多価金属ィォ ンを供給することなく-トリル又はアミドを対応する有機酸アンモ-ゥムに変換し、該 有機酸アンモ-ゥムを回収することを特徴とする有機酸塩の製造方法を提供する。ま た本発明は、生体触媒をアルギン酸塩水溶液と混合し、該混合液を構成単位に一 級ァミンまたは二級アミンを有するカチオン性ポリマー及び多価金属イオンを含む水 溶液と接触させてゲルィ匕することを特徴とする固定ィ匕生体触媒の調製方法を提供す る。
より具体的に本発明は
(1)生体触媒をアルギン酸塩水溶液と混合し、該混合液を構成単位に一級アミンま たは二級アミンを有するカチオン性ポリマー及び多価金属イオンを含む水溶液と接 触させてゲル化することにより固定化生体触媒を調製するか、若しくは該混合液を多 価金属イオンを含む水溶液と接触させてゲル化させた後に構成単位に一級アミンま たは二級アミンを有するカチオン性ポリマーと接触させることにより固定ィ匕生体触媒を 調製し、次 ヽで該固定化生体触媒を含む溶媒中で多価金属イオンを供給することな く-トリル又はアミドを対応する有機酸アンモ-ゥムに変換し、該有機酸アンモ-ゥム を回収することを特徴とする有機酸塩の製造方法。 (2)—級アミンまたは二級アミンを有するカチオン性ポリマ
式 1
[化 1]
Figure imgf000005_0001
(式中、 X-は一価の陰イオンを表わし、 nは 10〜4000の整数を表わす) または、
式 2
[化 2]
Figure imgf000005_0002
(式中、 X-は一価の陰イオンを表わし、 k、 mは 1〜10の整数、 nは 10〜4000の整数 を表わすブロックまたはランダムポリマー）
または、
式 3
[化 3]
(3)
Figure imgf000005_0003
(式中、 X-は一価の陰イオンを表わし、 nは 10〜4000の整数を表わす）
により表わされるポリマー、キトサンまたはポリエチレンィミン力 選択されるものである ことを特徴とする（1)に記載の有機酸塩の製造方法。
(3)—級アミンまたは二級アミンを有するカチオン性ポリマー力 前記式 1、式 2また は式 3で表わされるポリマーとポリエチレンィミンの混合物であることを特徴とする（1) に記載の有機酸塩の製造方法。
(4)生体触媒が-トリラーゼ、二トリルヒドラターゼ又はアミダーゼ活性を有する生体 触媒であることを特徴とする（1)〜（3)に記載の有機酸塩の製造方法。
(5)生体触媒がアースロバクタ一（Arthrobacter)属、バリオボラタス (Variovorax)属、 シユードノカノレディァ (Pseudonocardia)属、又はロドコッカス (Rhodococcus)属に属す る微生物由来のものであることを特徴とする（1)〜 (4)に記載の有機酸塩の製造方法
(6)生体触媒がアースロバクタ一'エスピー（Arthrobacter sp.) NSSC104、アース口 バクタ一.エスピー（Arthrobacter sp.) NSSC204又はシユードノカルディア ·サーモ フイラ（Pseudonocardia thermophila)JCM3095であることを特徴とする（1)〜（8)に 記載の有機酸塩の製造方法
(7)有機酸アンモ-ゥムの濃度が 5重量0 /0以上であることを特徴とする（1)〜（6)に 記載の有機酸塩の製造方法。
(8) 有機酸塩が 2—アミノ酸または 2—ヒドロキシ酸の塩であることを特徴とする（1) 〜（7)に記載の有機酸塩の製造方法。
(9) 有機酸塩カ^チォニン又は 2—ヒドロキシー4ーメチルチオブタン酸の塩である ことを特徴とする（1)〜 (8)に記載の有機酸塩の製造方法。
(10) -トリル又はアミドを対応する有機酸アンモ-ゥムに変換する反応において、二 トリル又はアミドの供給と変換された有機酸アンモ-ゥムの回収を連続的に行なうこと を特徴とする（1)〜（9)に記載の有機酸塩の製造方法。
(11) -トリル又はアミドを対応する有機酸アンモ-ゥムに変換する反応において、反 応液の多価金属イオン濃度が 10mM未満であることを特徴とする（1)〜（10)に記載 の有機酸塩の製造方法。 (12) -トリル又はアミドを対応する有機酸アンモ-ゥムに変換するに際し、水溶液中 にカルボン酸塩、リン酸塩または硫酸塩が含まれていることを特徴とする（1)〜（11) に記載の有機酸塩の製造方法。
(13)生体触媒をアルギン酸塩水溶液と混合し、該混合液を構成単位に一級アミンま たは二級アミンを有するカチオン性ポリマー及び多価金属イオンを含む水溶液と接 触させてゲル化することを特徴とする固定化生体触媒の調製方法。
である。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明で使用されるアルギン酸塩の水溶液としては、アルギン酸ナトリウム、アルギ ン酸カリウム、アルギン酸アンモ-ゥムの水溶液等が挙げられる。
[0009] 本発明で使用されるカチオン性ポリマーとしては、一級アミンまたは二級ァミンがそ の構成単位に含まれるようなポリマーであればよぐ力かるカチオン性ポリマーとして は前記式 1または 3で表わされるホモポリマー、前記式 2で表わされるコポリマー、ポリ エチレンィミン及びキトサンを挙げることができる。これらのカチオン性ポリマーは 2種 類以上組み合わせて用いることができる。より具体的には日東紡社製の PASシリー ズ、 PAAシリーズ等を例示することができる
本発明で使用される一価の陰イオンは限定されるものではないが Cl-、OH-等が挙 げられる。
[0010] 本発明で使用される多価金属イオンとしてはカルシウムイオン、ストロンチウムィォ ン、ノ リウムイオン、アルミニウムイオン等が挙げられる。
[0011] 本発明で使用されるアルギン酸ゲルとしてはアルギン酸カルシウム、アルギン酸スト ロンチウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸アルミニウム等によって形成される含水 ゲルが挙げられる。
[0012] 本発明で使用される-トリルとしてはラタト-トリル、マンデロ-トリル、 2 ヒドロキシ
4ーメチルチオブチ口-トリル、 2 ァミノ 4ーメチルチオブチ口-トリルなどが挙 げられる。
[0013] 本発明で使用されるアミドとしてはラクトアミド、マンデルアミド、 2 ヒドロキシ一 4— メチルチオブチルアミド、 2 アミノー 4ーメチルチオブチルアミドなどが挙げられる。 [0014] 本発明で製造される有機酸塩としては乳酸、マンデル酸、 2—ヒドロキシー4ーメチ ルチオブタン酸、メチォニンなどのアンモ-ゥム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシ ゥム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。
[0015] 本発明で使用される生体触媒としては-トリル又はアミド化合物を対応する有機酸 アンモニゥムに変換する活性を有する細胞またはその処理物であれば特に制限され るものではなぐ力かる細胞としては-トリラーゼ活性、二トリルヒドラターゼ活性又はァ ミダーゼ活性を有する細胞が挙げられ、例えばアースロバクタ一（Arthrobacter)属、 ノ リオボラタス (Variovorax)属、シユードノカノレディァ (Pseudonocardia)属、ロドコッカ ス（Rhodococcus)属に属する微生物を挙げることができ、これらの中でも特にアース ロバクタ■ _ ·エスピー（Arthrobacter sp.) NSSC104 (FERM BP— 5829)、アース口 パクタ^ _ ·エスピー（Arthrobacter sp.) NSSC204 (FERM BP— 7662)、バリオボラ タスパラドキサス（Variovorax paradoxus) IAM12374,シユードノカルディア'サーモ フイラ（Pseudonocardia thermophila)JCM3095を好適に例示することができる。また 、これらの細胞に含まれる-トリラーゼ、アミダーゼまたは-トリルヒドラターゼをコード する遺伝子配列を別種の細胞に導入して得られる組換え生物の細胞を挙げることが できる。またその処理物としては細胞抽出物もしくは該抽出物より精製された-トリラ ーゼ、二トリルヒドラターゼまたはアミダーゼが挙げられる。
[0016] 生体触媒の固定ィ匕は次のように行なわれる。まず上記の微生物等を培養して得ら れる培養液より遠心分離法または膜分離法を用いて集められた細胞を、アルギン酸 ナトリウム等の水溶性アルギン酸塩を含む水溶液に懸濁し、その懸濁液を注射針等 の先端または細孔力 カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンまたは アルミニウムイオン等の多価金属イオンおよび上記カチオン性ポリマーを含む水溶液 に連続的に滴下してビーズ状の成形物を得る。または別法としてまず上記の多価金 属イオンのみを含む水溶液中で成形物を得た後で上記カチオン性ポリマーを含む 水溶液に浸漬してもよぐその際カチオン性ポリマーを含む浸漬液に多価金属イオン が含まれていてもよい。また、ビーズ状に成形する以外に、板状、棒状または糸状等 に成形した後に必要に応じて裁断して使用することもできる。こうして得られた固定ィ匕 生体触媒は 、ずれもそのままあるいは水性溶媒で洗浄された後で、二トリルまたはァ ミドィ匕合物と接触させることにより対応する有機酸アンモ-ゥムへの変換反応に供す ることがでさる。
固定化生体触媒を調製する際に使用されるアルギン酸塩としてはアルギン酸ナトリ ゥム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモ-ゥム等を挙げることができ、それらはゲ ルイ匕させる前における濃度として 0. 1〜10重量％の範囲で使用できる。ゲル化前に おける細胞濃度は、細胞の乾燥重量として、 0. 01〜15重量％の範囲で使用できる 。ゲルをビーズ状に成形する場合の液滴を作成する注射針、細孔等の内径は 0. 05 〜5mmの範囲であれば良ぐそのほかに滴下される液滴の径を調整するために気 流、機械的振動又は機械的せん断等による工業的方法を用いても良い。ゲルィ匕のた めに用いる多価金属ィ才ンはカノレシゥムィ才ン、ストロンチウムィ才ン、ノ リウムィ才ン 、アルミニウムイオン等力 選択され、通常 0. 01〜1M濃度のそれらの塩ィ匕物の水 溶液として用いられる。ゲルは多価金属イオンとの接触と同時に生成する力 ゲルの 強度を高めるために 30分間以上、好ましくは 2時間〜 5日間これらの多価金属イオン と接触させる方がょ ヽ。ゲル生成時の温度は高 、方が接触時間を短縮できる効果が あるが、生体触媒の安定性を考慮して通常 4〜60°Cの範囲で選択される。ゲル生成 時の pHについても生体触媒の安定性を考慮して決めれば良ぐ通常 pH3〜： L 1の範 囲で選択される力 カチオン性ポリマーとしてキトサンを用いる場合に限り、キトサンの 凝集を回避するために pH7以下とすることが好ま 、。ゲルをビーズ状に成形する場 合に使用される多価金属塩水溶液の量は滴下される液滴がビーズ状に成形される 前に互いに接触しない程度の量であれば良ぐ滴下液量の 0. 5〜： LOO倍容量が用 いられる。ゲルの生成時におけるカチオン性ポリマーの濃度は通常 10ppm〜10重 量％、好ましくは 20ppm〜l重量％の範囲で使用できる。またゲル生成後にカチォ ン性ポリマーを含む水溶液で浸漬処理を行なう場合、カチオン性ポリマーの濃度は 通常 10ppm〜10重量％、好ましくは 20ppm〜l重量％の範囲で使用でき、浸漬処 理の時間は 30分以上、好ましくは 2時間〜 5日間、処理温度は 4〜60°C、 pHは 3〜11 の範囲力も選択される。但しカチオン性ポリマーとしてキトサンを用いる場合に限り、 キトサンの凝集を回避するために pH7以下とすることが好ま 、。調製されたビーズ は含水ゲルの性質力も塩濃度、 pH、温度条件等によりそのサイズが変化するが、触 媒反応に用いる際の直径として 0. l〜5mm、好ましくは 0. 5〜3mmの範囲で使用 される。こうして得られる固定ィ匕生体触媒はいずれも多価金属イオン濃度が 10mM未 満でも物理的に安定であり、アルギン酸ゲル力 多価金属イオンを奪う作用のある力 ルボン酸塩、リン酸塩および硫酸塩の存在下でも使用することができる力 多価金属 イオンとカチオン性ポリマーに同時に接触させてゲルイ匕させる方法を用いる場合は、 多価金属イオンでゲルィ匕させた後でカチオン性ポリマーと接触させる方法よりも物理 的安定性に優る固定ィ匕生体触媒を得ることができる。
上記のように調製された固定ィ匕生体触媒による有機酸塩の生産は次のように行な われる。固定化生体触媒を水または目的の有機酸塩に対応する有機酸アンモ-ゥ 水溶液中に添加し、必要に応じて pHの調整を行ないつつ基質として目的の有機酸 塩に対応する-トリル又はアミド化合物を添加することによりアンモ-ゥム塩を蓄積さ せる。有機酸アンモ-ゥムが所定の濃度に達した後は、反応を停止して固定化生体 触媒を生成物から分離する回分反応を反復して行なうこともできるが、基質の添加を 続けながら有機酸アンモニゥム濃度と反応液の液量が大きく変動しな 、ように、反応 液の回収と水の供給を並行して行なうことにより、一定範囲の濃度の有機酸アンモ- ゥム水溶液を連続的に得る連続反応を、カラム型リアクターまたは攪拌槽型リアクタ 一を用いて行なってもよい。このとき、反応温度は一定に保ってもよいが、一定の生 産速度を維持する目的で生体触媒が安定な範囲で変化させてもよい。基質濃度は 一定の値を維持するように基質供給速度を変化させても良いが、一定の基質供給速 度を維持しても良ぐその場合生体触媒活性の低下に伴う生産物濃度の低下を避け るために、固定ィ匕生体触媒の追加を行なうこともできる。有機酸アンモ-ゥムの生産 における固定ィ匕生体触媒の添加量は反応液量に対する湿重量の割合で 1〜50重 量0 /0の範囲で行なうことができる。反応液の pHは 3〜12、好ましくは 5〜： L 1の範囲で 行なわれる。反応の温度は 4〜70°Cの範囲で選択されてよい。基質濃度は 0. 001 重量％〜飽和濃度の範囲で行なうことができ、生成する有機酸アンモ-ゥム塩の濃 度は 1重量％〜飽和濃度、好ましくは 5重量％〜飽和濃度の範囲で行なうことができ る。反応液には生産される有機酸アンモ-ゥム以外に、カルボン酸塩、リン酸塩、硫 酸塩等の塩類が含まれて 、てもよ!/、。 得られた有機酸アンモ-ゥム水溶液からの目的とする有機酸塩の調製は、対応す る塩基を添加してアンモニアを留去させることによって行なうことができる。このとき有 機酸アンモ-ゥム水溶液は予め濃縮しておいてもよい。添加する塩基としては目的と する有機酸塩に応じて選択すればよいが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸 化カルシウムまたは水酸ィ匕マグネシウムなどを挙げることができる。そのほか、酸ィ匕カ ルシゥム、炭酸カルシウム、酸ィ匕マグネシウムまたは炭酸マグネシウムなどを用いても よい。力べして、二トリルまたはアミドィ匕合物力も工業的に有利な条件で目的の有機酸 塩を得ることができる。
[0019] 以下に本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例 1
[0020] (NSSC204株の培養）
酵母エキス 0. 5%、グルコース 0. 5%、リン酸水素二カリウム 0. 1%、リン酸二水素 カリウム 0. 1%、食塩 0. 1%、硫酸マグネシウム 7水塩 0. 02%、及び硫酸第一鉄 0. 001%を含む培地 3mlを試験管にとり 121°Cで 20分間滅菌した。下記の組成の培地 200mlを 1000ml容量のバッフル付き三角フラスコに入れた。アースロバクタ一（ Arthrobacter) NSSC204株を前記の試験管に一白金耳植菌し、 33°Cでー晚振盪 培養した後、その培養液 2mlを前記のバッフル付き三角フラスコに植え継ぎ、さら〖こ 4 日間 33°Cで振盪培養した。
コーンスチープリカー 2. 0% (濾過滅菌）
スクロース 1. 0% (121°Cで 20分間滅菌）
2—ァミノべンゾ-トリル 0. 03% (121°Cで 20分間滅菌）
pH 7. 2 (2N苛性ソーダで調整）
[0021] (固定化菌体触媒の調製）
得られた培養液を遠心分離することによって菌体をペレットとして回収し、イオン交 換水に懸濁して 20mlの菌体懸濁液を得た。 0. 357gのアルギン酸ナトリウムを 50ml の水に溶解し、 20mlの菌体懸濁液と混合して菌体—アルギン酸ナトリウム混合液を 得た。この混合液がチュービングポンプにより注射針（22G)の先端から滴下できるよ うに配管した。塩化カルシウム二水塩 5. 15gを 500ml容量のビーカーにとり、イオン 交換水 350mlで溶解し、 20%ポリアリルアミン塩酸塩（日東紡製 PAA— H— HC1) 0 . 88gを加えた後、 2N水酸化ナトリウム水溶液 0. 1mlをカ卩えて pH7とした。そのビー カーに撹拌羽根を入れ、前記の注射針の下方 10cmの位置に水面が来るようにビー カーを配置した。ビーカーの液温を 25°Cに保ち、撹拌羽根を lOOrpmで回転させな がら、チュービングポンプの流速を 2mlZminに設定して、菌体ーアルギン酸ナトリウ ム混合液を注射針の先端力 ビーカー内に滴下させてビーズ状の固定ィ匕菌体触媒 を得た。滴下終了後、液温を 25°Cに保ちながら撹拌を 20時間継続し、次いでガラス 濾過器で固定化菌体触媒を回収した。
実施例 2
2 ヒドロキシ 4ーメチルチオブタン酸アンモ-ゥムの連続生産
実施例 1で得られた固定ィ匕菌体触媒 (乾燥重量として 3. 3g相当分)を ΙΟΟπ 四口 フラスコに入れ、水を加えて 55. 5mlとした。四口フラスコに撹拌羽根、 pHセンサー、 原料供給管、フィルター付き反応液回収管、 pH調整液供給管、補充水供給管及び 水位センサーを取り付けた。フラスコを 25°Cの恒温水槽に入れ、 60rpmの速度で撹 拌を行なえるようにした。 pHセンサーは pHコントローラと接続し、 pHコントローラに制 御されたポンプで pH調整液供給管から 0. 5%アンモニア水を供給することによって pHが 7. 0〜7. 5に自動調整するように設定した。原料の 2 ヒドロキシー 4 メチル チォプチ口-トリルは定量ポンプにより原料供給管から四口フラスコ内に連続添加さ れるようにした。反応液は定量ポンプにより反応液回収管を通して連続的に回収され るようにした。水位センサーはフラスコ内の液量が初期の液量（65ml)から変動したこ とを検知できるように設置し、水位センサーに連動したポンプで補充水を供給するこ とによって反応液がフラスコ内から排出されても液面が一定の高さを保つように設定 した。連続反応は次のように行なった。第一段階として、水位と pHのコントロールを作 動させない状態とし、原料-トリルを 4gZhの速度で連続的に添加した。水位センサ 一が液面を検出した時、原料-トリルは 12. 5g供給され、反応液の 2 ヒドロキシー4 ーメチルチオブタン酸アンモ-ゥムの濃度は 20重量0 /0に達していた。次いで、水位と pHのコントロールを開始し、原料-トリルを 3gZhの速度で添カ卩しながら反応液を 15 gZhの速度で連続的に抜きとる連続反応を開始した。反応液成分の分析は次のよう に行なった。反応液 0. 1mlをサンプリングし、水で 100倍希釈した後、高速液体クロ マトグラフィー（カラム：東ソー製 ODS— 80TS 4. 6mm X I 50mm、溶離液： 0. 1% (V/V)TFA- 20% (VZV)ァセトニトリル水溶液、流速： lmlZmin、カラム温度： 40°C)を行なった。既知濃度の 2 ヒドロキシー4ーメチルチオブチ口-トリル及び 2 —ヒドロキシ一 4—メチルチオブタン酸アンモ-ゥムを用 ヽて検量線を作成し、希釈サ ンプルを分析したときの各ピーク面積力 各成分濃度を算出した。連続反応開始後 4 時間後の反応液中の原料-トリル濃度は 0. 5重量％、生成物 2 ヒドロキシー 4ーメ チルチオブタン酸アンモ-ゥムの濃度は 20重量％だつた。次 、で 4時間毎に反応液 の成分濃度を測定し、原料二トリル濃度を一定に保っために原料二トリル供給速度 の比例制御を行な!、、生成物濃度を保っために反応液の抜取り速度の比例制御を 行なった。図 1に 46日間の連続反応の結果を示した。この間、固定化菌体触媒ビー ズは物理的に安定で、ビーズの崩壊 '菌体の漏洩は共に観察されな力つた。
[0023] (比較例 1)ポリアリルアミン塩酸塩非添加条件で作成した固定ィ匕菌体触媒を用いた 2 ーヒドロキシー 4ーメチルチオブタン酸アンモニゥムの連続生産
[0024] ポリアリルアミン塩酸塩の添加を省略すること以外は実施例 1と同様の方法で調製 した固定ィ匕菌体触媒 (乾燥重量として 3. 3g相当分)を用いて、実施例 2と同様の方 法で 2 ヒドロキシ 4ーメチルチオブタン酸アンモニゥムの連続生産を試みた。連続 反応の第一段階として、水位と PHのコントロールを作動させない状態とし、原料-トリ ルを 4gZhの速度で連続的に添加した。約 1時間後、固定化菌体触媒より菌体の漏 出が観察され始め、さらに 1時間後、固定ィ匕菌体触媒の形状が崩れ始め、さらに 1時 間後には、固定化菌体触媒のゾル化が進み反応液の粘度が上昇して連続反応を継 続することが不可能になった。
産業上の利用可能性
[0025] 本発明によれば、二トリルまたはアミドを対応する有機酸アンモ-ゥムに変換する際 に、その調製時に生体触媒の活性低下を引き起すことがなぐかつその使用時また は洗浄時に有機酸アンモ-ゥムの有無にかかわらず Caイオン等の多価金属イオンを 添加する必要がない固定ィ匕生体触媒を用いることにより、工業的に有利な条件で目 的の有機酸塩を得ることができる。 図面の簡単な説明
[図 1]固定ィ匕菌体を用 V、た 2 ヒドロキシ 4ーメチルチオブタン酸アンモ-ゥムの連 続生産の図 HMBN : 2 ヒドロキシー4ーメチルチオブチ口-トリル HMBA: 2 ヒド 口キシ— 4 メチルチオブタン酸アンモ-ゥム 生産速度： 2 ヒドロキシ— 4 メチル チォブタン酸アンモ-ゥムの 1時間当たりの生成量 (g/h)

Claims

請求の範囲
[1] 生体触媒をアルギン酸塩水溶液と混合し、該混合液を構成単位に一級アミンまた は二級アミンを有するカチオン性ポリマー及び多価金属イオンを含む水溶液と接触 させてゲル化することにより固定化生体触媒を調製するか、若しくは該混合液を多価 金属イオンを含む水溶液と接触させてゲル化させた後に構成単位に一級アミンまた は二級アミンを有するカチオン性ポリマーと接触させることにより固定ィ匕生体触媒を 調製し、次 ヽで該固定化生体触媒を含む溶媒中で多価金属イオンを供給することな く-トリル又はアミドを対応する有機酸アンモ-ゥムに変換し、該有機酸アンモ-ゥム を回収することを特徴とする有機酸塩の製造方法。
[2] 一級アミンまたは二級アミンを有するカチオン性ポリマーが、
式 1
[化 4]
Figure imgf000015_0001
(式中、 X-は一価の陰イオンを表わし、 ηは 10〜4000の整数を表わす) または、
式 2
[化 5]
Figure imgf000015_0002
(式中、 X-は一価の陰イオンを表わし、 k、 mは 1〜10の整数、 nは 10〜4000の整数 を表わすブロックまたはランダムポリマー）
または、
式 3
[化 6]
Figure imgf000016_0001
(式中、 X-は一価の陰イオンを表わし、 nは 10〜4000の整数を表わす）
により表わされるポリマー、キトサンまたはポリエチレンィミン力 選択されるものである ことを特徴とする請求項 1に記載の有機酸塩の製造方法。
[3] 一級アミンまたは二級アミンを有するカチオン性ポリマー力 前記式 1、式 2または 式 3で表わされるポリマーとポリエチレンィミンの混合物であることを特徴とする請求項
1に記載の有機酸塩の製造方法。
[4] 生体触媒が-トリラーゼ、二トリルヒドラターゼ又はアミダーゼ活性を有する生体触 媒であることを特徴とする請求項 1〜3に記載の有機酸塩の製造方法。
[5] 生体触媒がアースロバクタ一（Arthrobacter)属、バリオボラタス（Variovorax)属、シ ユードノカノレディァ (Pseudonocardia)属、又はロドコッカス (Rhodococcus)属に属する 微生物由来のものであることを特徴とする請求項 1〜4に記載の有機酸塩の製造方 法。
[6] 生体触媒がアースロバクタ一'エスピー（Arthrobacter sp.) NSSC104、アースロバ クタ一.エスピー（Arthrobacter sp.) NSSC204又はシユードノカルディア ·サーモフィ ラ（Pseudonocardia thermophila)JCM3095であることを特徴とする請求項 1〜5に記 載の有機酸塩の製造方法。
[7] 有機酸アンモ-ゥムの濃度力 重量％以上であることを特徴とする請求項 1〜6に記 載の有機酸塩の製造方法。
[8] 有機酸塩が 2—アミノ酸または 2—ヒドロキシ酸の塩であることを特徴とする請求項 1
〜7に記載の有機酸塩の製造方法。
[9] 有機酸塩カ^チォニン又は 2—ヒドロキシ - 4—メチルチオブタン酸の塩であること を特徴とする請求項 1〜8に記載の有機酸塩の製造方法。
[10] 二トリル又はアミドを対応する有機酸アンモ-ゥムに変換する反応において、二トリ ル又はアミドの供給と変換された有機酸アンモ-ゥムの回収を連続的に行なうことを 特徴とする請求項 1〜9に記載の有機酸塩の製造方法。
[11] 二トリル又はアミドを対応する有機酸アンモ-ゥムに変換する反応において、反応 液の多価金属イオン濃度が 10mM未満であることを特徴とする請求項 1〜10に記載 の有機酸塩の製造方法。
[12] 二トリル又はアミドを対応する有機酸アンモ-ゥムに変換するに際し、水溶液中に力 ルボン酸塩、リン酸塩または硫酸塩が含まれて 、ることを特徴とする請求項 1〜 11に 記載の有機酸塩の製造方法。
[13] 生体触媒をアルギン酸塩水溶液と混合し、該混合液を構成単位に一級アミンまた は二級アミンを有するカチオン性ポリマー及び多価金属イオンを含む水溶液と接触 させてゲル化することを特徴とする固定化生体触媒の調製方法。
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