DE1467761A1 - Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums - Google Patents

Description

American Cyanaiaid Company„ Wayne, Hew Jersey,YoSt_QA<

Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibiotikum und "betrifft seine Herstellung durch mikrobiologische Fermentation oder durch Gärung rait Hilfe eines Mäher noeh nicht beschriebenen Vertreters des Genus Strepto rnycess, Streptomyces osarosporus n_es_a (nova specius)^ Verfahren zu seiner Gewinnung und Konsentrierung aus rohen Lösungen und Verfahren zu seiner Reinigung.»

Der Rahmen der Erfindung umfaßt das Antibiotikum in verdünnten Formen, als rohe Konzentrate und in reinen kristallinen Formen* Die neuen. Produkte sind gegen eine große Zahl von Mikroorganismen_B darunter grampoaitivaiBakterien, wirksam-, Das neue Antibiotikum unterscheide sieh von den bereits beschriebenen Antibiotika dureh seine Wirkungen

auf bestimmte Mikroorganismen? sowie durch seine oherülsahen und physikalischen Eigenschaften^

Das neue Antibiotikum« das im folgenden als RA =-6950ß bezeichnet "wird* "bildet sich "bei der Züchtung von Streptötfiyces oehrosporus n.,s-, unter gesteuerten Bedingungen,. Die neue Species Streptomyces oekrosporus wurde aus einer aus "Venezuela stammenden Bodenprobe isolierte ΕΙηα lebensfähige Kultur des Organismus ist beim Culture Collection Laboratory,. Northern Utilization Research and Development lM?i.sion_t United States Departmend of Agriculture* Peoria,. Illiomois hinterlegt und vrarde von dieser Stelle mater der Besolohnung HRRIi 35 i46 in die ständige Sammlung aufgenommen»

Im folgenden wird eine allgemeine Beschreibung ^on Strepteiayces ochrosporus auf Grundlage der beobachteten diagnostischen Merkmale gegeben« Die unterstrichenen Farbenbezeichnungen sind dem "Color Harmony Manual", Third Edition f; 194-8) entnommen«.

Wachstum .

Mäßig bis gut auf den meisten Medien; schwach auf Csapek-Lösung und Anorganische" Salze- Btärke-Agars ο

BAD ORIGINAL 809811/1 100

Liiftuvivc?;' weiB biß geIbIioh mit Sporenbildung, in gelblichen Selii-.ttiori-ii.geiV von. Parchment(1 i/2 Uh) ?>i»3.-gamentfa'i?öen Ma Xslln-w ΐ5:πΛ ti i>u) QjeXbgetont) Ma Ivcry (2 dl)·.} el.f eabeiii. Sporoafeiie.mrg S'di^aitb. bis ßsllöig auf rersfairieäeiien Medieri-> Sehr sohwF.c-ho 'bis keine Sporonbüdimg auf Osapek-Lösung;, Beimett- -_:. Hiekey·-- imd-Tyesaer-p C?ax-yajal-Ano3?gaiiisc}ie Salze-Stärke- und Haferflockeii-Agar,

Gelblich bis gelblich-braun bis. bräunlich, auf den meisten Medien und in schwichen "bis mäßigen Mengeno

Farbe aar/Unterseite

In gelblichen bis bräunlichen Schattierungen "auf den aten ISedienO -

Ygrgühiedene physioloaische Reaktionen

Hediiaiert 'Ii träte suMitrit eni -mäßige Gelatine^erf lUasigungi chromogen auf Pepton·-Eisenagayo. Kohlenetoff^uellenverwer-·.

tung nach Pridham et^a!.. fjoBaet, 56s 107-114 (194S)Jy gute bis mäßige Verv/ertung 'von d FrUOtOSe₀ el·-Mannit₄, d-Trehaloee_y

■-Λ-ί· Λ-ι-

bad ofüq_INAl

d-Xylose₉ Hextrosej, Dextran«, lactose und Salicin; schlechte bis keine Verwertung iron Adonitolj, 1.-Arabinose. _s .!-Inosit _s,

■dHMeXezitose« 1=-lliamno:se_? d-Melibiose und. d-Baffinose₀

Morphologie .

Sporen in langen gewellten{flexu0Us)Ketten<, Sporen elliptisch bis länglich,, 0_g3 - 0,4 ix-±" 0,7 bis O₉9^a; und glattwandig (dureh Elektronenmikroskopie bestimmt)ο

Streptomyees oehrosporus ist ein Vertreter der gelbsporigen Streptomyceten nach Tresner und Backus, £"System of Color Wheels für Streptomyeete faxonomy¹¹» Applo Microbiol,. 11s355 ■ 538 < 1963)] ο Hach Priäham et» al« [ⁿA Guide for the Classifica tion of Streptsimyeetea According to Selected Groups¹¹« Applo Hierobiol» 6-52=79, (1958)j sind die Spsrenketten vom Typ rectus-flexibilis (IP)₀ leim TTergleich des neuen Organismus nach diesen, sowie anderen beständigen und für die Taxonomie brauehbarm Merkmalen iait bekannten Species mit ähnliehen Eigenschaften stellt« er sich als eine neue Species heraus _β In Übereinstimmung mit guten nomenkiatoriaehen Gepflogenheiten ward« dafür das binomische Spithetum StreptonQTöes oöhrosporus koS_o zur Beschreibung seiner gelblichen

Sporenbildung gewählt»

icritisohe li€€aiig der Cmltureigenschaften und der physiolcr

gischen und morphologischen Merkmale des Organismus wurde nach Züchtung auf verschiedenen Medien ₉ darunter den iron Pridham et»al_O4) [ⁿA Selection of Fedia for Maintenance and !Paxonomie Study of Streptomyces"„ .Antibiotics Annual , (Ί956--1957), S_n 947 ζ 955) empfohleiien durchgeführtJ>ie einzelnen Be= obaehtungen sind in den folgenden Tabellen I_y II III und IT angegebene unterstrichene Parbbezeichnungen sind dem "Color Harmony Manual"

80^81i/Vi

Tabelle X

809811/110D

Kultureigenschaften von Streptomycea ochro8T>orus URRL 3146

Inkubation Temperatur

Tage 28⁰C

Medium

Wachstum

Luftmycel und/oder Sporen

lößliches Pigment

Farbe der

Unterseite

Bemerkungen

Czapek-Lösung
Agar

8öhwach Luftmycel dünn weiß, Sporenbildung sehr schwach

keines

weißlich

Tomatenmark-Agar

mäßig Luftmycel weiß bis

gelblich β wird perga^«. mentfarben(i i/2 db) in Sporulationsgebieten« Sporenbildung mäßig gelblich; sshwach

honig-gold

(2

Sektoren·^

'bildung

Bennett-Agar

mäßig

Luftmycel weißlich» sehr

dünn»

wird gelblich in Sporu-

lationssonen» Sporula-

tion sehr schwach« gelblieh5 schwach

s iiat farben (3 le)·

gefaltet und knittrig

eoeetf/1100.

Medium

Wachs tm

Kiekiy«* und saenerA

mäßig

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Sporen

und/oder

lösliches Pigment

farbe
U

_v wird

{1 ba) in

gelblish

lbt

achwach

weißliche

bliher in E

gelblieh-braunj

p
bieten

Sektoren»"

gefaltet

'knittrig

Agar

■■lrtiftmyö«l sehr spärlish illih Bpnisa von

r Sporulatioa in

bräunlich .,,

tisffeaim

(5 pi: gsialtst

galblieh-weiB , . widpeafgaaaentfaiban (T 1/2 db) in Sporulationessonea/

Sporulatiott mäßig ' *■

gelblich-braun;

tabelle I (Fortsetzung)

Medium

Wachstum

!tuttmycel und/oder Sporen

lösliches Pigment

Farbe der Bemerkungen Unterseite

Tomatenmark»

Hafermehl^Agar mäßig

Luftmycei gelblichweiß, wird elfenbeinfarben (2db) In Sporu·= lationssonen« Sporulation mäßig.

gelblich-braun
mäßig

hellbraun (4 ng)

Hefeextraet-Ägar mäßig

y weißlich wird elfenbeinfarben (2 db) in Sporulations«

sonaxSporalation massig

gelblich-braun

dunlcel-loh farben (4 )

Sektoren

Anorganische Salze- _e„_w„„_v
Stärke-Agar schwach

Üuftmycel sehr spar·=- lich₇welßlleho Keine Sporulation

keines

gewürs« braun

(5 ni)

Höferflocken-Agar

gut

IfUftmyeel
weißlich. Keine Sporulation

bräunlich

mäßig

.efbraun (5 pl)'

Tabelle IX
809811/1100 Micromorphologie von Streptomyoea oehrosporua noSoHRRl· 3146

Sporen«- Sporen· Sporen-

Luftmycel und/oder sporentragende Strukturen Gestalt Grosse Oberfläche

Asparagin- Sporenträger in langen» gewellten (flexuoua) Sporen el- O »3-0 #4 al Sporenober-

τ»^*ν._Λβ« a„_ö~ Ketten liptisch ' fläche glatt

Bextrose-Agar _{bis länge} % (bestimmt durch

lieh _n rj _{Λ Q} . ■ Elektronen«

o»7-o_?9/U microgfco^

pie) ο

cn

Tabelle XII

809811/1100 Verschiedene Physiologische Reaktionen, yon Stregtoinygfea

Medium

Xncubationsdauer

Wachstum

Organische Hl trat» Brühe	7	Tage
Organische Mtrat- Brühe	14	Tage
Gelatine	7;	Tage
Gelatine	14	Tage
Pepton-Sisen- Agar	24	Stunden

stark

starfe

sehv/ach

säßig

Physiologisch© Reaktion

Nitrats au Mtritea reduziert

Nitrats zu Hitritcn

schwache Verflüssigung mäßige Verflüssigung OhrosiO'gen

CD

ö⁵) £

Tabelle. IV

Kehlens tpf f^ttellen-

Streptomyces ©ehrosporus HHUL 3146

Inirabat ion - 10 Tage Temperatur - 28⁰G

Xöhlenstoffquelle

Verwertung *

Adonital

Dextran d-iruetose i-Inosit Lactose d-Mannit

d-Melibiose d-Haffinose 1-Hhafflnose Sallcin

Saccharose

d~Ta?ehalose d-Xyloae Dextrose Blindprobe

2 3 1

0 0

0 3 3

3 ö

* 3 s gute Verwertung
2 β mäßige Verwesung

1 * schlechte Verwertung 0 » keine Verwertung

809811/11

Zur Erzeugung des neuen Antibiotikums ist die Erfindung je« doch keineswegs auf diesen besonderen Organismus oder auf Organismen beschränkt, die den beschriebenen Wachstums* und mikroskopisch feststellbaren Eigenschaften_s die nur der Erläuterung dienen» vollkommen entsprechen· Vielmehr wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß auch die Verwendung von Mutanten, die aus dem beschriebenen Organismus durch verschiedene Maßnahmen, beispielsweise Eöntgenbestrahlung,,!TV~Be~ strahlung, Stickstofflost und Einwirkung von Phagen er« halten werden, im Rahmen der Erfindung liegt«.

Paa ffermentationsverfahren oder die gärung

Sie Züchtung des Organismus S. oohrosporue kann in einer

großen Ansahl von flüssigen Kulturmedien durchgeführt werden

j . ■-■■»■

Medien, die zur Erzeugung des neuen Antibiotikums geeignet eind, enthalten eine assimilierbare KohlenstoffQuelle, zum ' Beispiel Stärke» Zucker, Melassen oderÖlyeerini eine assind* lierbare Stiokßtoffg.ttf3.1e» äsuai Beisgiiel Protein, Proteinhy* j drolysat* Polypeptide, AsiinoeäureiUder MaiBquellwasser; und .' anorganische Anionen und Kationen» aum Beispiel ICaliws, Ha- *' trium,0alcittin_f Sulfat, Phosphat oder Chlorid·. Die Versorgung mit SptiTönlleaenten» «um Beispijil Sor*.. Molybdäft und Kupfer kwk ift ip'yg ψ on Verunreinigttttgen anderer Bestandteil der

809811/1100

.Medien erfolgen. Die Belüftung in Senke und Kolben geschieht. durch Aufdrücken steriler luft änssch das oder auf die Oberfläche des Fermentations- oder Gärmediums» Für weiteres Bewegen oder Rühren in dea Tanks wird durch einen mechanischen führer gesorgte Bei Bedarf kann man einen Entschäumer» zum Beispiel 1 # Geta» decanol in Specköl zugeben. ^v

Schuttelkolbeninokulat oder -iErofkulturen

Fermerfationen oder Gärungen von S. ochrosporus in Sohüttelkolben werden gewöhnlich so durchgeführt, da0 man 100 ml steriles flüssiges Medium in 500 ml Kolben durch Abspülen einer Schrägagarkultur inokuliert oder beimpft» Man kann folgendes Medium verwenden:

Melasse 20 Gramm

Glucose 10 Gramm

Baotopepton 5 Gramm

Wasser bis 1000 Milliliter

Die Kolben werden bei einer Temperatur von 25 - 29⁰O, vorzugsweise von 28⁰O inkubiert und auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung 48 bis 72 Stunden» gewöhnlich 72 Stunden lang intensiv bewegte Diese 100 ml Inokula oder Impfkulturea werden zum Inokulieren oder Beimpfen von 1 !-Ansätzen des gleichen Mediums in 19 1 (5 gallon)«-Behältern verwendet« Nach geeignetem Inkubieren dieser Inokular-Ansätae werr

8098It/1100

1H

den sie zum Beimpfen von fermentationstanka verwendetο

fermentation In kleinen Tanks

Zur Herstellung des Antibiotikums in Fermentationstanks kann man folgende Fermentations- oder Nährmedium verwendent

Soyabohnenmehl 10 Gramm

Glucose 10.Gramm

Natriumchlorid 5 Gramm

Prograsöl 5 Gramm

Oalciumcarbonat . 1 Gramm

Wasser Via 1000 Milliliter

Jeder Tank wird mit etwa 3 $ von wie oben hergestellten Impfkulturen inokuliert» Me Belüftung erfolgt mit einer Geschwindigkeit von 0,7 1 steriler Iiuft pro Mt er Nährflüssigkeit und pro Minute, und die G-ärmischung wird durch

ι eine mit 750 bis 850 tfpm laufende Rührvorrichtung bewegt* Die Temperatur wird bei 25 - 2%°G₉ gewöhnlich bei 28°0 ge- halten. Die Gärung wird gewöhnlich etwa 48 Stunden lang

! fortgesetzt» und danach wird diese Impfkultür zum Beimpfen eines großen Gärtanke verwendetο

809811/1100

Fermentation in großen Tanks

Man verwendet das gleiche Fermentationsmedium wie oben* Jeder Tank wird mit etwa 5 $ Inokulum, wie es aus der Fermentation in dem kleinen Tank erhalten wird, beimpfte Die Belüftung wird bei einer Geschwindigkeit von O₉ 75 1 steriler Luft pro Liter Mährflüssigkeit und pro Minute durchgeführt» Die Mischung wird durch eten Rührer mit etwa 100 Upa bewegt« Die Temperatur wird wie oben eingehalten und die fermentation 20 bis 30 Stunden lang durchgeführt» Dann wird aur Gewinnung des Produkts aufgearbeitet.

Bei einigen Kulturen wurde gefunden, daß man den Zeitpunkt, zu dem man mit der Aufarbeitung beginnt, . genau einhalten muß, z.B, nach 24 - 5$ Stunden, da die Ausbeute abnimmt, wenn man dieIndentationnoch länger weitergehen läBt« ^ä

Reinigungsverfahren

f ■ . , ■ -' ■

"*■■■""·,■■■

Nachdem 4ie Fermentation beendet ist, wird die das erfindungegemäß erhältliche Antibiotikum enthaltende Gärmaische abfiltriefrt» vorzugsweise bei etwa pH 7,0, um das Kfycel au entfernen* Man kann Diatomeenerde oder eine bellebfgi» andere Übliche fiiterhilf* verwenden» um die F^tratiön zu erleiohterno GöwÖhnlioh wird fler Myoelkuchen mit Wasser gewaschen und

. 809811/1100

~ 16

und das Waschwasser mit dem Pil trat vereinigte Danach kann man das Antibiotikum nach Üblichen Verfahren gewinnen.

Man kann das Antibiotikum aus dem FiItrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels zum Beispiel Äthylacetat, bei etwa pH 7*0 extrahieren. Der Extrakt wird gewöhnlich im Vakuum auf etwa 1 # dee ursprünglichen Volumens eingeengt. Man filtriert das Konzentrat langsam in eine geeignete Menge Petroläther und erhält einen gummiartigen Niederschlag, der beim Verdampfen des Lösungsmittels die Komponenten B^ und Sg in roher Form liefert.

Die Abtrennung und Reinigung der beiden Komponenten kann man dureh Saulenverteilungeohromatographie erreichen« Ben roheö S_A und ßg enthaltenden festen Blickst ana löst man in einer Mindteta&nge der unteren Bm β · eines Löaungsmiitelsysteme, das aus Gyolohtxan, Dioxan und Wasser in Yolumenverhältniesen von 2 f 3 i 2 besteht und beschickt damit eine Säule, die mit Diatome«n*rde gefüllt und aur Hafte ihras Gewichts rait der unteren Phea© des gleichen LöaungemittelaysteHa befeuchtet iet.Die Kolonne wird dann mit der oberen Phase entwickelt, ü» (lis

_ίΑ «iwüneohten antibiotischen Aktivitäten Q_A vmA ß± »a _,,_ _T,

; Elü&te iwiaohtn dem 1,0- und ^,0-fachen des AitfnlütilMrfpltdßens

i .".-..■" (ß_A) und Ewiiohen dam 5,8 U*

^ ftiMuouiuflfv*wiiiuB I⁰TI' «ΐφΑ-UVU IkU eVb&'VUI.tiOU V ««.Uli WP JKfPWPBBWATi* · ' · ■{.;

Aüfnahmttolunitüb (ß_B) werden in getrennten GefäBen

λ "..... ^ßAD OßiG/NAi.

809811/1100-

. Bann engt man die Eluate jeweils im Vakuum ein und löst die erhaltenen Rückstände getrennt in einem Mindestvolumen Diäthyläther* Die Komponente fl_A kristallisiert aus dieser Lösung nach mehrstündigem Stehen bei Zimmertemperatur aus und wird durch filtration gewonnen^ Die Komponente ßg kann durch Zugaben der Diäthylätherlösung zu Petroläther (30 - 75^qO) gefällt werden. ß_B kann weiter gereinigt werden, indem man es durch eine Säule mit säuregewaschener Diatomeenerde schickt, die bis zur Hälfte ihres Gewichts mit der unteren Phase eines aus Äthylacetat, Petroläther, Aceton und Wasser in den Volumenverhältnis sen 0,05 ί 3 ! 2 ! 1 bestehenden Löaimgsmittelsystems befeuchtet ist« Die Kolonne wird mit der oberen Phase des gleichen Systems entwickelt, wobei das Eluat zwischen dem 14»O- bis 20,0-fachen des Aufnahmevolumens der Säule aufgefangen wird» Diese Fraktion wird im Vakuum eingeengt und der erhaltene Rückstand in Diäthyläther gelöst, woraus die reine Komponente ß_B auskristallisiert werden kann» Die τ&ίηβ Komponente ß-g ist eng mit der Komponente H^ verwandt, unterscheidet sich aber von dieser in mehreren Bigenechaften.

Dae erfindungegemäß erhältliche neue Antibiotikum enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff _f Sauerstoff, Stickstoff, und Schwefel im wesentlichen in folgenden Mengen in Qewiohts^t

809811/1100

	^Komponente	ßgKomponente
Kohlenstoff	49e76	49,36
Wasserstoff	5838	5*73
Sauerstoff	35,44	34,74
Stickstoff	3,80	3,73
Schwefel	4*52	4«44

Im folgenden werden verschiedene physikalische Eigenschaften der Komponente S^ angegeben?

berechnetes Molekulargewicht 687 - 715 Schmelzpunktι 122 - 124⁰O

An Sauerstoff gebundene Methylgruppen in Prozent 2,42 (als CHHU) und an Kohlenstoff gebundene Methylgruppen in Prozent (6_#86 (als CH,). Es sind keine Methylgruppen an ein Stickstoffatom gebunden«, An Sauerstoff gebundene Aoetylgruppen in Prozent 11,20. Optische !Drehung

° -58°(* 3°) (0-0,985 in Methanol)_β

Ultraviolettmaxima treten auf beil

236 ψ (Btcm ^e210>

277 n» (Bt^ * 135)

^/. 1cm

322 mu (B]^_m « 130) in Xthanol

sosat t/t 100

- ig·-

Ein Infrarot-Abaorptionsspektrun der Komponente ß^ in einem KBr-Preßling wird auf übliche Weise hergestellt= Es seigt charakteristische Absorptionen im Infraratgebiet des Spektrums bei folgenden Wellenlängen (in Mikron) : 3*00/3*07, 3₉45,> 4*92» 5,75, 5,90, 6,,1O_x, 6,15, 6,34_P 6„75, 6,90* 7*30, 7,40, 7„52, 7',75, 8,00, 8,65, 8,90, 9,10* 9,75/10,20, 11,00, 11,8O₉ 12,25, 12,80, 13,40, 14,40«

Die Infrartoabsorptionskurve ist in Figo 1 der beigefügten Diagramme gezeigt?

Nachstehend werden verschiedene physikalische Eigenschaften der Komponente ß_ß aufgeführt« An Sauerstoff gebundene Methylgruppen in Prozent 2,42 (als GHj) und an Kohlenstoff gebundene Methyl« gruppen in Prozent 7,03 (als OHj)₀ An Sauerstoff gebundene Acetylgruppen in Prozent 11 ₉ 46ο

Der Schmelzpunkt von BA<~6950ß_B ist nicht scharf« Er erweicht bei 125°O und scheint eich bei etwa 145^ÖÖ au «ersetzen· Optische DrehungM²⁵° ^β *^⁰° <- ³°^{)ί0 β} °»^{9t9 in} Methanol).

Ultraviolettmaxima treten auf bei:

800114/1100

- 20 204 mjtt (B]J₁₁- 323)

277 ma (BiJ_n- 160)

320 ma (B]J_n- 145) in Äthanol

Sin IrirarotabsorptionsSpektrum der Komponente ßg in einem KBr~Preßling wurde auf übliche Weise hergestellte Es zeigt ' charakteristische Absorptionen im Infrarotgebiet des Spektrums bei folgenden Wellenlängen (in Mikron): 2*95, 3?42* 4*88, 5,75, 5,99, 6,15* 6,33, 6,70, 6*90, 7.30,-7,50, 7,75, 7,95_P 8,85, 9,05, 9,50, 9,70« 10,15, 11,00, 11,75, 12,25, 12,90, 13,35, 14,4O₀

Die Infrarotabsorptionskurve von HA~6950ß_s iet in Fig* 3 der bei· gefügten Zeichnungen dargestellt.

RÄ-695Oß zeigt die folgenden Rf-Werte in dan nachstehend aufgeführten LöBungsmittslsyetemen, wobei Bacillus eubtilis bei pH 6,0

ale Detektororganismus verwendet wurde..

809811/1100

" IiUaungsmittelayetem

0_#20 n~Heptan 200 Seile

Tetrahydrofuran 50 Teile

n~Amylacetat 50 Teile

0,2 m Essigsäure 200 Teile

O₄,89 n-Amylacetat 100 Teile

Dibutyläther 30 Teile

Essigsäure 5 Teile

Waaser 50 Teile

Die Löslichkeit des RA~6950ß~Komplexes nimmt im allgemeinen mit steigender Polarität dee Löaungsmittels zu. Die Antibiotika sind unlöslich in Hexan und Wasser; mäßig löslich, in Xthern» sum Beispiel Diäthyl- oder Diisopropylätherj und aind leicht löslich in den meiaten üblichen organischen Lösungs mitteln, zum Beispiel Methanol, Aceton, Dimethyisulfoxyd,

Chloroform, Methylenchlorid, Dimethylformamid* Siaeasig, Benzol und Äthylacetat ο Die Komponenten des HA«-695Oflk Komplexes reduzieren TetrazoliumealBe* entfärben wässriges Eermanganat und setzen aus dem Hatriumazid-Jodreagena Stickstoff frei»

Die magnetischen Protonenreaonantspektren der erfindungs-

gemä0 erhältlichen Antibiotika werden mit einem Varian A-6Q-Spectrometer bei 60 Megaherte in üblicher Weise durch Auflösen in Deutero-Ohloroform₉ das Tetramethylsilan ala inneren

8Q98f1/t

-■ 22 -

. Standard enthält» hergestellt« Die Verbindung O^ seigt ein charakteristisches komplexes Absorptionsbild für das die bei folgenden Frequenzen» ausgedrückt in GPS (cycles par second) Einheiten* auftretenden Hauptabsorptionan kemisseichnend ainds 829, 595, 455₃ 406, 400, 316, 295, 282, 275, 268, 250,, 243,· 224, 208, 195_f-19O, HO, 121, 114, 64, 56_O

Das Kernresoiianaspektrura von RA=695Oß» ist in Figo 2 der bei-

gefügten Zeichnungen dargestellt?

Die Komponente ßg aeigt ein charakteristischeα komplexes Absorptionsbild für das die bei den folgenden Frequenzen_f ausgedrückt in ÖPS-Einhelten (cycles per second) auftretenden Haupt-absorptionen kennzeichnend sinds 830« 595» 48O₉ 450» 410* 402, 313» 30O₉ 290, 28O₄, .265, 242, 22O₉ 207» 195, i90„ 175* 125, 115» 75» Das Kernt'esonanzspsktruBi ron ΗΔ--·695Οβ« ist in Figo 4 der beigefügten Zeichnungen dargestellt-

Beide Komponenten ß^ und ß_B sind von anderen Antibiotika durch die oben angegebenen charakteriatiööhei). Werte und durch ihre antimikrobiell Aktivität deutlich verschieden* Die airfcimikrobielle Aktivität der beiden Komponenten in vitro ist ±n den nachstehenden Tabellen aufgeführt, die die minimale inhibierende Konzentration angeben^ die sur Hemmung des Wachstums beispielhafter Mikroorganismen auf einem Mhrmediuia erforderlich ist,

BAD OHIQINAL

809811/1 TOO

Tabelle V.

Mffcobacterium amegmatis ATCO 607

Minimale inhibierende Konzentrationen . _ (Miprogramm pro mlo) '

EA~695Oß_A *
pH 6,0
0,2

RA-695Oß_B pH 6,0 6_e2

StaphylpcoccuB aureua ÄTCG 6538P 0,8

StreptococcuB faeoalis • ATGC 8043 0,8

BBcherichia cpli ATOC 9637

Proteus vulgaria ATCO 9484 50
3,1

100

12_S5

Pseudomonaa aeruginqsa ATCC 10145 50

Salmonella

Led· An« Ind» 50

8098 11 /IiOO

Tabelle VI

146776

fs.ecal.la

Ai¹CC 8043

nielithämolytiach Nr₀ 11

O₉ 39

0,39

BA-695Oß_Ä HA

12,5

0,78

Streptococcus Bp.,, ß hämolytisch Nr.80

Streptococcua y Kirby- Iaolat Nr, 154

S tr ep t o_L c σ ocua ftyogenee, .Kirby-Ieolat ITr₀ 158

Str"eptocoocua pyogenes.,·, NY-5

Sarclna lutea ATOG 9341

0,39

12,5

>25

.6,2

O₅ 78

Staphylococcus aureiia 4050B122-3

Staphylococcua aureua

0,2

6,.2

4050B122.-7	aureua	0	«2	6	,2	1	,39	1
Staphylococcua		0	»2	6	92	0		1
4050B122-9	aureu3						,39
Staphylococcua		0	,2	12		0
4050B122-10

Staphylococcua aureua 4050B122--11

0,2

12,5

0,39

80 98 1 1/1 1 0.0

copy |bad gfugjnäl

§,.Il (Fortsetzung)

BAD

80981 t/1 tOO

RA--695Oß_A

StaphylocoGCua aurnua 0,39 4050Β122-Ί3

6,2

t,56

.51aphylpeoccus auraua 0,2 4050B122«H

StaphylocooGus aureua O₉2 Boae, AiDGC 14154

Staphylococcua aureua 0*2 Smith, ATGO 13709

Staphylocoocua aureua 0_s2 Kr* 69

6,2

6,2

0,39

0,39

Or 39

0,39

6,2

6,2

ψ - . ■ ■

U67761

26

Die Komponenten ß^ und ß_ß sind gegen zahlreiche gram» positive Mikroorganismen, zum Beispiel Staphylokokken land Streptokokken wirksame Die neuen Antibiotika sind daher als therapeutische Mittel zur Behandlung von Baktorienin-· fektionen bei Mensehen und SJieren* die dureh solche Mikroorganismen verursacht werden, geeignet;. Die neuen Antibiotika können zur Bekämpfung solcher Infektionen durch örtliche Anwendung oder parenterale Verabreichung vex^endet werden. ·

Die Eignung dieser Antibiotika läßt sich durch ihre Fähig keit zur Bekämpfung von letalen Systeminfektionen bei Mäusen nächweisen· RA~6950ß_A zeigt eine hohe antibakterielle Wirk •amkeit in vivo bei Mäusen gegen Staphylococcus aureu»,Stamm Smith« Staphylococcus aureus, Stamm Hose und Streptococcus pyogenes, 0-203* wenn es als Einzeldosis an Gruppen von weiblichen Mäusen ^Carworth !Farms Qf~t) mit einem Gewicht von et·= · im 20 g verabreicht wird, die intraperitoneal mit einer letalen > Dötie dieser Bakterien in ΙΟ"², 10"' und 10"⁵-Verdünnungen

in 5ryptiöaee-Soye^Bruhe(f SP) einer 5 sttindigen !PSP Blut-

^t j Kt&tar infieier* nerdeii« Bio tledingungen» untern denen

Witisxmg gegen für Menschen pathogene Organismen bei Mäusen geprüft wurden, indizieren eine ausreichende Aktivität

i ·

■ %

labelle 1ΓΙΙ Teranachaulicht die antibakterielle in vivo &*τ ,Komponente» R&-6950ß_A und

liif * t/i

Tabelle VXI ■

Antibakterielle Aktivität von Wi--6950«^ iiv

X'rräf -System

Stamm

Smith

Dosierung mg/kg Köi'pe rgöw i ckt

64-0

320

160

80

40

2,5 1,25

7·\$ιΊ der

Überlcliey«

SoOcD.^«

20/20

0/10

aahl

18/20 26/30

25/30

16/30

16/30

5/30

0/10

Staphylococcus

f Stamm

.t C-203

80

40 20 10

80 40

Antibakteriell© Aktivität von RA-695Oß_B in YIvo

7/10 9/10

9/10 2/10

8/10 7/10

.Prüf »-System
S t aphylo coeeiiB

Smith

DoierHg mg/kg Körpergewicht

80 40 20 10

* S₀OoD₁, - Binzeldoeis oral
** SoSoCe - ^inaeldoais subcutan

Zahl der Gesami» Überlebenden/ sahl

Triak't'iv

3/10 1/10

1/10

~ 28 ~ ■ ■

SSiatliohe infizierten,- nicht behandelten Kontrolltiere starben

Innerhalb eines Tages.,

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie au beschränken_e

Beispiel 1

Inokulumherstellung

Ein typischess, zur erfindungsgemäßen mikrobiologischen Gärung verwendete Medium ist folgendesϊ

Melasse 20 Gramm

Glucose 10 Gramm

Bactopepton 5 Gramm

Wasser bis 1000 Milliliter

Bine Agarschrägkultur von So ochrosporus wurde abgespülte Die dabei ablaufende Flüssigkeit wurde zum Beimpfen von 100 ml des oben genannten Mediums in einem 500 ml-Kolben verwendet«. Der Kolben wurde auf eine hin- und hergehende Schüttelvorrichtung gebracht und 72 Stunden bei 28⁰C kräftig bewegte PIe erhaltene Kolbenimpfkultür wurde in einen 19 1 "(5 gallon) ^e,-mentationsbehälter alls Glas/■ der- 1 1 steriles Medium "enthielt»

ft

... 29

übergeführt * Währefüä der etwa 48 Stunden laiig durchgeführten Z-Uchtung wurde der Fermentationsbehälter mit steriler Iiiift · Belüftet _β Dann wurde der Inhalt sum Beimpfen des Fermentationstanks verwendet»

Beispiel 2

.Fermentation
Bin Grärmedium wurde nach folgender Formel hergestellt s

Soyabohnenmehl 10 G-reiara

Glucose 10 Grassa

Natriumchlorid 5 Gramm

Prograsol 5 Gramm

Calciumcarbonat 1 Gramm

Wasser bis 1000 Milliliter

Das Fermentationsmedium wurde 45 bis βθ Minuten bei 120°0 mit Dampf von 1₉05 Atmosphären{25 pounda) Druck sterilisierte Der pH-Wert des Mediums vor und nach Sterilisieren lag zwischen 7»0 und 7₉5° 50 1 steriles Medium in einem 40 !-Fermentationstank wurden mit 1 1 Inokulum^- wie qb in Beispiel 1 "besehrieben ist9 beimpft, u^.d die Fermentation wurde 48 Stunden lang¹ bei 28^DG durehgeführto Die Belüftung erfolgte bei einer Geschwindigkeit you Op? steriler Luft pro Liter Medium pro Minute« Das Medium wurde durch eine bei etwa 800 Upa betriebenen Rühr-vorrichtung bewegt« Am Snde dieser Zeit mirden dife 30 1 Gär- "

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maische zum Beimpfen von 1000 1 des "beschriebenen Mediums in einem 1500 l· Fermentationstank verwendet? Di© Fermentation wurde 25 Stunden bei 28°0 weitergeführte Das Medium wurde durch eine bei 100 Upm betriebene Hülirvorriobtung bewegt und die Belüftung erfolgte mit einer Geschwindigkeit von O₅75 1 steriler Luft pro Idter Brühe pro Minute« Mach beendeter Fermentationszeit wurde zur Gewinnung des Produkts aufgearbeitete

Beispiel 3 Isolierung

Die 1000 1 Grärmaisehe wurden auf pH I₉O eingestellt* und Diatomeenerde wurde in einer Menge von etwa 2 Gawiek&s^ dieses Volumens zugegeben» Dann wurde die Mischung filtriert und der Filterkuchen mit 100 1 Wasser gewaschene Der Filterrückstand wurde verworfen., Waschwasser und Filtrat wui'den vereinigt, und die erhaltene Lösung wurde mit Äthylacetat (500 · ml Xthylacetat pro 1000 ml Filtrat) mit Hilfe einer Gegenström Vorrichtung (Xthylacetat 11,5" Γ = 3 gallon pro Minute? liltrat 23 1 ^s 6 gallon pro Minute) extrahiertο Der Ithyiaeetatextrakt wurde auf 500 ml konzentriert und das Konzentrat

langsam durch Filterpapier in etwa 3000 ml Patroläther (30 - 75°C5 unter Rühren filtriert« Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum lieferte einen guminiartigeii Feststoff« der die antibiotische Aktivität enthielt (etwa 100 g Feststoff)_β

BADORJGINAL 809811/1100

Bine geeignete Menge dieses Produkts , nämlich 10 g"· wurde in einer Miniraalmenge Aceton gelöst vuoSl dann ^:ίηϊΐ· etwa 50 g Diatoiae'enerde verseistο Me "belädene Matomeemerda wurde .von Aceton befreit» mit der unteren Pliaae ^: eines Lösungsmittelsystems , das aus"Oyclönexan_t Biöxan ^ι und Wasser in den Volumemrerhältnissen 2 s 3 f 2 bestand, angefeuchtet und auf eine Kolonne, die aus 1000 g Diatomeenerde bestand und bis zur Hälfte ihres G-ewiehts mit der unteren Phse des gleichen Lösungsiaittelsystems "befeuchtet war» aufgegeben, Bann wurde die Säute mit der oberen Phase entwickelt, um die gewünschte antibiotische Aktivität zu eluierem Das Eluat zwischen dem 1_p0 - bis 3siO»faciiäide's Auf nähme vo lumens der Säule und swi sehen dem 3s>8^ bis 7»6-fachen des Aufnahmevolumens wurde'-in getrennten Behältern aufgefangene Die einzelnen Eluate wurden dann im Vakuum eingeengt und die erhaltenen !Rückstände jeweils in der Minimalmenge Diäthylather gelöste Die Komponente ß» kristallisierte aua dieser Lösung nach mehrstündigem Stehen bei Zimmertemperatur ais« Die Komponente ß-g konnte dureh Zugeben der Diäthylätherlösung zu Petroläther gefällt werden. Eine weitere

Reinigung von ßg ließ durch Säulehohromatographie

.8098 1 1/1 100

erzielen_e Die Austeilte an ß^ "betrug 2_s5..g, die Ausbeute an ß-n 1?5 go Die chemische Analyse dieses Produkts und seine anderen ehemisehen₉ physikalischen und "biologischen Eigenschaften wurden bereits beschriebene

Beispiel 4 Reinigung von B₁,

2 g von nach Beispiel 3 hergestellter Komponente Eg wurden wie in Beispiel 3 beschrieben auf eine Kolonne aufgegeben, die 200 g säuregewaschender Diatomeenerde enthielt und bis zur

aus

Hälfte von dessen Gewicht mit der unteren Phase einesÄthyl*· acetat, Petroläther, Aceton und Wasser in den Volumen-Verhältnissen 0_e05 ! 3s 2 : 1 bestehenden Lösungsmittelsystems befeutet war» Die Kolonne wurde mit der oberen Phase des gleichen Systems entwickelt und das Eluat sswischen dem 14*0- bis 20_e0-fachen des Aufnahmevolumens der Säule wurde aufgefangen. Diese Eluatfraktion wurde im Vakuum eingeengt und der erhaltene !Rückstand in einer Minimalmenge Diäthyläther gelöste Die Lösung wurde bei Zimmertemperatur einige Stunden stehen gelassen, bis sich reines Q^ abschied_o Die Kristalle wurden abfiltriert und mit Diäthyläther gewaschen» Die Ausbeute- an ßp betrug 1,4 g₀ Die chemische Analyse dieses Produkts und seine anderen chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften wurden bereits beschrieben.

Claims (1)

1. dadurch gekennzeichnet, daß man in ein wässriges ifähr-

   von
   medium, das assimilierbare/Quellen Kohlehydrat, Stickstoff und anorganischen Sanlzen enthält_s unter 3ttbmersen aeroben Bedingungen Streptomyees oehrosporus inokuliert und darin suchtet* bis das Medium eine weeeixtliehe anti · biotische Aktivität durch Bildung von Antibiotikum RA--695OB. mit folgenden Eigeneehaften aufweist s Schmelzpunkt 122 - 124°C; Analysenwerte! Kohlenstoff 49*76 <f°₉ Wasserstoff 5_S38?£, Sauerstoff 35»44 $s> Stickstoff 3*80 ^₅, Schwefel 4,52 ^ optische Drehung fdj ²^ ° - 58° (^ 3 } (C=Os985 in Methanol); Ültraviolett-Maxima: 236 mi

   Äthanol; Infrarotspektrum wie in der beigefügten Figo 1 anggeben; magnetisches Protonenresonanzspektrum wie in der beigefügten 3?ig» 2 angegeben; und/oder von Anti=' biotikum HA-695Oß_s mit folgenden Eigenschaften aufweist: Analysenwerte: Kohlenstoff 49i.36$„ Wasserstoff 5 Sauerstoff 34,74 $₉ Stickstoff 3»73 $>$ Schwefel 4,44^; optische Drehung W²| a ^60° {* 3°) (C » 0,919 in Me thanol); Ultraviolett ^Maxima s 204 m» (B^_1n « 323),

   m»

   236 mu (B^- 235), 277 mu .(B^_0n- 160), 320 ψ (bJJ_b- 1Φ5 in Xthanol; Infrarotspektrum wie in der beigefügten Fig'{.

   809811/1100

   angegeben; magnetisches Protönenreaonanzspaktruai wie in der beigefügten Figo 4 angegeben»

   2„ Verfahren naeh Anspruch I₉ dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung 24 bis 36 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 35°G durohfuhrt.

   3c Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gelcennaeiöhnet, aaß

   man die Komponenten RA-69500^ lind RA-6950ßj» aurch Säulen· verteilungschromatographie trennt_β

   4« Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zu-aamniensetaung, die als wesentlichem antibakteriöllos Mittel eine naeh dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellte? Verbindung in Mischung mit einem pharmaseutischen Träger enthältο

   BAD 809811/1100