DE2209018C2

DE2209018C2 - Glycopeptid-Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid und dieses enthaltendes Tierfuttermittel

Info

Publication number: DE2209018C2
Application number: DE2209018A
Authority: DE
Inventors: Donald Clifford Canberra DeLong; Robert L. New Rose Ind. Hamill; William Max Indianapolis Ind. Stark
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1971-02-25
Filing date: 1972-02-25
Publication date: 1982-12-23
Also published as: FR2126415B1; SU417925A3; NL175196C; CS167970B2; GB1345676A; IE36094B1; JPS5749181B2; SU403133A3; PH9416A; YU35621B; FR2126415A1; JPS5592660A; DD96507A5; SE379053B; CH567572A5; CY896A; AT315368B; AU463037B2; IL38693A; DK137863B

Description

Erfindungsgegenstand ist sowohl das im Anspruch 1 angegebene Glycopeptid-Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid wie auch das im Anspruch 2 genannte Tierfuttermittel.

Die rationelle Produktion tierischer Proteine für den menschlichen Verzehr ist in der Landwirtschaft ein ständiges Problem. Es gibt daher bereits viele Mittel, darunter zahlreiche Antibiotica, die bei ihrer Verwen-

O	₂N-



J I



-CH = C-C-CH =
N ι
HN NHR₂ C Μ
Il NH

dung als Wirkstoffe in Futtermitteln zu einer Steigerung der Gewichtszunahme und Verbesserung der Futterverwertung bei Nutztieren, insbesondere bei wachsenden Küken und Schweinen beitragen.

Aus DE-PS 12 28 501 ist die Verwendung von antibiotisch wirksamen Bis-(5-nitrofurfuryliden)-acetonguanylhydrazonen oder deren Säureadditionssalzen, insbesondere deren Hydrochloriden, der Formel

worin Ri ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder eine niedere Alkylgruppe, R₂ ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe, X eine saure Gruppe und η die Zahl 1, 2 oder 3 bedeuten, wobei η für 1 steht, wenn X der Rest einer einbasischen Säure ist, η für 1 oder 2 steht, wenn X der Rest einer zweibasischen Säure ist, und π für 1, 2 oder 3 steht, wenn X der Rest einer dreibasischen Säure ist, als mit den üblichen ernährungsmäßig ausgeglichenen Futter- oder Mischfuttermitteln, insbesondere Geflügelfuttermitteln, oder mit dem Trinkwasser in Mengen von etwa 5 bis 500 mg, insbesondere 10 bis 100 mg, je Kilogramm Futtermittel verabreichbares Beifuttermittel bekannt ist. Ein Wirkstoff gemäß obiger Formel, worin Ri und R₂JeWeUs Wasserstoff bedeutet, η für 1 steht und X Chlor darstellt, befindet sich als Wachstumsfaktor, der beispielsweise dem Futter von Hühnern oder Schweinen beigemischt wird, unter der Bezeichnung NITROVIN (PESON oder PAYZONE) im Handel.

Weitere als Wachstumsfaktoren bei Nutztieren bekannte Antibiotica sind beispielsweise die unter den Bezeichnungen Monensin. Payzone, Tylosin, Poxarsone oder Bacitracin im Handel erhältlichen Produkte.

Die die bekannten Wachstumsfaktoren enthaltenden Futtermittelzusätze sind bezüglich ihrer Wirksamkeit jedoch nicht immer befriedigend. Aufgabe der Erfin-

dung ist daher die Bereitstellung eines neuen Antibioticums, das sich im Vergleich zu den bekannten Produkten durch eine verbesserte Wirksamkeit hinsichtlich der Futterverwertung und der erzielbaren Gewichtszunahme bei Nutztieren, insbesondere Küken, auszeichnet.

Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch das aus den Ansprüchen hervorgehende Glycopeptid-Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid und das dieses als Wirkstoff enthaltende Tierfuttermittel gelöst.

Die besondere Wirksamkeit dieses Antibioticums im Vergleich zu den oben erwähnten und als Wachstumsfaktoren bekannten Antibiotica geht aus der später folgenden Tabelle 111 hervor, deren Daten die mit dem vorliegenden Mittel bei der Behandlung von Küken

erzielbare wesentlich höhere Gewichtszunahme als mit den bekannten Handelsprodukten deutlich machen.

Das Glycopeptid-Antibioticum-A-4696 wird durch Züchten des Microorganismus Actinoplanes sp. ATCC 23342 in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen erzeugt. Das Antibioticum wird aus der filtrierten Fermentationsflüssigkeit durch Adsorption an ein aktiviertes Adsorbens und Eluieren mit einem sauren Lösungsmittel abgetrennt.

Als gereinigte kristalline Substanz laßt sich das Antibioticum-A-4696 durch Adsorption an einem angesäuerten chromatographischen Adsorbens und Eluieren mit einem sauren Lösungsmittel gewinnen. Das Antibioticum-A-4696 wird dann in einer wäßrigen Methanollösung in das erfindungsgemiße Hydrochloridsalz überführt und durch Zusatz von Aceton und Abfiltrieren des entstandenen Niederschlags als reines kristallines Salz erhalten.

Das Glycopeptid-Antibioticum-A^ege-Hydrochlorid ist eine fs;t>lose kristalline Verbindung mit einem Schmelzpunkt von über 220⁰C. Es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Aceton, Äther, Chloroform, Pyridin, Benzol und aliphatischen Kohlenwasserstoffen. Es ist in Lösung über einen pH-Bereich von etwa 1,0 bis etwa 10,0 bei Temperaturen bis zu etwa 27°C sehr beständig.

Die elektrometrische Titration von A-4696-Hydrochlorid in Wasser oder in einer Mischung aus Dimethylformamid und Wasser (2:1), ergibt eine Kurve, die sich im Bereich von pH 6,0 bis 13,0 einer geraden Linie mit einer Steigung von etwa 0,14 nähert.

Ein Mittelwert aus mehreren Microanalysen ergibt für A-4696-Hydrochlorid etwa folgende Elementarzusammensetzung in %: C 51,33; H 5,79; N 5,46;O 30,96;Cl 6,72. Das aus dem osmotischen Dampfdruck bestimmte Molekulargewicht beträgt 1158.

Der spezifische Drehwert ([alpha]o) von A-4696-Hydrochlorid bei 25°C beträgt -42,3° (C= 1, H₂O). .

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von A-4696-Hydrochlorid in sauren und neutralen Lösungen zeigt ein einziges Absorptionsmaximum bei 276 nm mit einem Extinktionskoeffizienten E J^, von 45. In basischer Lösung zeigt A-4696-Hydrochlorid ein einziges Absorptionsmaximum bei 300 nm mit einem Extinktionskoeffizienten E !cn. von 65.

Das Infrarotabsorptionsspektrum von A-4696-Hydrochlorid in einer Mineralölanreibung zeigt Fi g. 1 der beigefügten Zeichnung. Im Bereich von 2,0 bis 15,0 Micron lassen sich folgende Absorptionsmaxima unterscheiden: 3,0. 5,8, 5,9, 6,03, 6,15, 6,28, 6,63, 6,85, 7,27, 7,75, 8,1,8,25,8,9,9,t, 9,9,10,1 Micron.

Das papierchromatographische Profil von A-4696-Hydrochlorid zeigen die in der folgenden Tabelle I angegebenen Rf-Werte. Die Werte wurden in jedem Fall mit Whatman-Papier Nr. 1 und dem angegebenen Lösungsmittelsystem erhalten. Dier Lage des Antibioticums auf dem Chromatogramm wurde durch Bioautographie mit Bacillus subtilis als Testorganismus ermittelt.

Lösungsmittelsystem

Rr-Werte*)

9
10
11

0,74 0,87 0,59 0,77

*) Der Rf-Wert ist als das Verhältnis der von dem Antibioticum von der Ursprungsstelle aus zurückgeiegten Strecke zu der Strecke, die die Lösungsmittelfront von der Ursprjngsstelle aus zurückgelegt hat, definiert.

Erläuterung der Lösungsmittelsysteme:

1. Mit Butanol gesättigtes Wasser plus 1% p-Toluolsulfonsäure.

2. Mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser plus 1% p-ToluolsuIfonsäure.

3. Mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser plus 1 % p-Toluolsulfonsäure und 1 °/o Piperidin.

4. Wasser/Methanol/Aceton (12:3:1). Die Lösung wird mit NH₄OH auf pH 10,5 eingestellt und dann wird mit H3PO4 auf pH 7,5 vermindert.

5. Methanol/0,1 nHCl(3:l).

6. 1% Methylisobutylketon plus 0,;Ί% NH₄OH in Wasser.

7. 7% Natriumchlorid plus 2,5% Methylisobutylketon in Wasser.

8. 10% Propanol in Wasser.

9. Butanol/Äthanol/Wasser (150 : 15 : 13,5)

10. Propanol Pyridin/Essigsäure/Wasser (15:10:3:12)

11. Wasser/Äthanol/Essigsäure (70 : 24 :6).

Tabelle I

Papierchromatographie von A-4696-Hydrochlorid

Lösungsmittelsystem

Das neue Antibioticum-Hydrochlorid nach der Erfindung hat hemmende Wirkung auf das Wachstum vieler Microorganismen, die für Menschen, Tiere und Pflanzen pathogen sind, und ist deshalb zur Unterdrükkung des Wachstums solcher Microorganismen vorteilhaft. Die Konzentrationen, in denen A-4696-HydrochIorid das Wachstum verschiedener beispielhafter Microorganismen hemmt, sind unten in Tabelle II angegeben. Die Hemmkonzentrationen wurden entweder mit dem Agarverdünnungstest oder dem Brüheverdünnungstest ermittelt und sind als minimale Hemmkonzentration (MIC) in Mcrogramm pro ml (mcg./ml.) angegeben. (Die angewandte Bestimmungsmethode ist in Tabelle Il durch die Buchstaben »ad« für Agarverdünnungstests bzw. »bd« für Brüheverdünnungstesl bezeichnet).

Bei dem Agarverdünnungstest wird der Testorganismus auf Agarplatten, die verschiedene Konzentrationen A-4696-Hydrochlorid in dem Agar enthalten, aufgestri-

chen oder in diese injiziert. Die Testplatten werden 48

Rf-Werte*) Stunden bei 37°C inkubiert. Die MIC entspricht der

Platte mit der niedrigsten Konzentration des Antibioti-

cums, mit der das Wachstum des Testorganismus gehemmt wird.

Bei dem Brüheverdünnungstest wird eine Reihe von Rcagensgläsern, die Nährbrühe und verschiedene Konzentrationen an A-4696-Hydrochlorid enthalten, mit dem Testorganismus beimpft und 24 Stunden bei 37⁰C inkubierl. Die MIC entspricht dem Reagensglas mit der niedrigsten Antibioticumkonzentr3tion, bei der kein Wachstum vorhanden ist.

0,88
0,72
0,80
0,59
0,35
0,77
0.80

Tabelle II

Testorganismus	Minimale
	Hemmkonzen
	tration
	(mcg/ml)
Staphylococcus aureus 3055	12,5 ad
	6,25 bd
Bacillus subtilis	0,78 ad
Mycobacterium avium	0,4 ad
Streptococcus faecalis	3,12 ad
Trichophyton mentagrophytes	0,2 ad
Vibrio coü	12,5 bd
Mycoplasma gallisepticum	50,0 bd
Staphylococcus aureus (penicillin-	10,0 bd
resistent)
Staphylococcus aureus (methicillin-	5,0 bd
resistent)
Diplococcus pneumoniae	3,12 bd
Clostridium perfringens	1,25 bd
Clostridium tetani	2,5 bd
Corynebacterium gravis	1,25 bd
Lactobacillis casei	>100ad
Leuconostoc citrovorum	>100ad
Escherichia coli	>100ad
Proteus sp.	>100 ad
Pseudomonas sp.	>100 ad
Salmonella sp.	>100ad
Vibrio metschnikovii	>100 ad
Saccharomyces pastorianus	>100ad

Candida albicans

>100ad

Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid zeigt bei Verabreichung an Mäuse durch subcutane Injektion in vivo antimicrobielle Aktivität gegen infektiöse Organismen. Beispielsweise werden bei Anwendung von zwei Dosen folgende ED50-Werte (wirksame Dosis zum Schutz von 50% der Prüftiere) für beispielhafte Infektionen gefunden: Staphylococcus aureus: 9,2 mg/kg, Streptococcus pyogenes: 0,68 mg/kg und Diplococcus pneumoniae: 0,76 mg/kg.

Die akute Toxizität von A-4696-Hydrochlorid, angegeben als LD50, für Mäuse bei intraperitonealer Verabreichung beträgt 2400 mg/kg.

Der Microorganismus, der ^ui Produktion von Antibioticum A-4696 verwendet wird, wurde als Stamm einer Species von Acetinoplanes aus der Familie Actinoplanaceae identifiziert. Die Actinoplanaceae bilden eine neue Familie von Microorganismen der Ordnung Actinomycetales und wurden erstmals von Dr. John N. N. Couch, lour. Elisha Mitchell Sei. Soc 65, 315-318 (1949); und 66, 87-92 (1950); Trans. New York Acad, ScL, 16, 315-318 (1954); Jour. Elisha Mitchell Sei. Soc, 71, U8- 155 und 269 (1955); Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, 825-829 (1957); und Jour. Elisha Mitchell Sei. Soc, 79, 53-70 (1963) beschrieben.

Der Actinoplanes-Stamm, der für die Produktion von Antibioticum-A-4696 geeignet ist. wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und ist dort für jedermann ohne Freigabebeschränkung unter der Nummer ATCC 23342 erhältlich.

Actinoplanes sp. ATCC 23342 ist durch die in den

folgenden Abschnitten angegebenen physikalischen Eigenschaften und Kultureigenschaften gekennzeichnet. Für die Bezeichnung der Farben wurde das System von Ridgeway, Color Standards and Nomenclature,

(1912) verwendet.

Mikroskopische Morphologie
und allgemeine Kulturmerkmale

von Actinoplanes sp. ATCC 23342

Mikroskopische Morphologie

Mycel ziemlich spärlich auf Pollen von Liquidambar (Sweet gum tree; amer. Amberbaum) in Wasser. Die Hyphen sind verzweigt und septiert und haben einer. Durchmesser von 0,2 bis 1,5 Micron. Die Hyphen füllen das Pollenkorn aus und erstrecken sich bis zu einer Strecke, die etwa dem Durchmesser des Korns gleich ist, in das Wasser. Sporangiophoren ragen über die Wasseroberfläche empor; Sporangienstiele, gewöhnlich einzeln, manchmal verzweigt, so daß sie zwei oder seilen mehr Sporangien an dem gleichen Sporangiophor tragen; Stiele 1,0 bis 1,5 Micron dick, septiert.

Sporangien sind ziemlich klein, Durchmesser 4 bis 11 Micron, angenähert kugelartig, selten kugelförmig, gewöhnlich mit einer unregelmäßigen Wand. Reife Sporen sind in einer oder mehreren undeutlichen Wendeln in dem Sporangium angeordnet. Das Aufplatzen und die Entleerung des Sporangiums erfolgt durch Quellung einer Sporenzwischensubstanz, die dazu führt, daß sich das Sporangium vergrößert und eine fast glatte sphärische Gestalt annimmt. Die Sporen sind beweglich, Durchmesser etwa 1,0 bis 1,5 Micron; kugelförmig bis angenähert kugelförmig.

Kulturmerkmale auf

Czapek-Agar (S. A. Waksman, The Actinomycetes, (1950). Wachstum gut; die punktförmige Impfstelle hat nach 8 Wochen einen Durchmesser von etwa 2 cm. Das Mittelstück ist aufgewölbt; der Fleck ist abgeflacht und hat geringe Unebenheiten. Die Farbe des Myceis ist ein leuchtendes Zinkorange; das Agar ist blaßlederbraun bis deutlich gelb. Sporangien werden selten gebildet.

Pepton-Czapek Agar (5 g Pepton anstelle von 2 g Natriumnitrit). Ähnliches Wachstum wie auf Czapek-Agar, Furchen, Grate und Hocker sind jedoch deutlicher als auf Czapek-Agar. Es werden keine Sporangien gebildet.

Wie erwähnt, kann Actinoplanes sp. ATCC 23342 zur Erzeugung von Antibioticum A-4696 in einem Kultur-

iiicuiülii gcZUCiiLct "werden.

Reihe von verschiedenen Medien verwendet werden. Für eine wirtschaftliche Produktion, maximale Ausbeute und leichte Isolierung des Antibioticums werden jedoch bestimmte Kulturmedium bevorzugt. So ist beispielsweise Stärke eine der bevorzugten Kohlenhydratquellen und Sojabohnenmehl eine der bevorzugten Stickstoffquellen. Zu anderen verwendbaren Kohlenhydratquellen gehören beispielsweise Melasse, Glucose, Dextrin und Glycerin. Zu weiteren Stickstoffquellen gehören beispielsweise Aminosäuremischungen und Peptone.

Zu anorganischen Nährsalzen, die die Kulturmedien enthalten sollen, gehören die üblichen Salze, die beispielsweise Ionen wie Natrium, Kalium, Ammoniak, Calcium, Phosphat, Chlorid, Sulfat, Acetat, Kohlenhydrat und dergleichen zu liefern vermögen. Bei der

Produktion von Antibioticum A-4696 können ferner Quellen für Wuchsfaktoren wie Distillers' Solubles und Hefeextrakte verwendet werden. Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Microorganismen erforderlich ist, soll das Kulturmedium für die Züchtung des verwendeten Microorganismus Actinoplanes sp. auch wesentliche Spurenelemente enthalten. Solche Spurenelemente werden gewöhnlich bei Zugabe der anderen Bestandteile des Mediums als zufällige Verunreinigungen zugeführt.

Der zur Produktion von A-4696 verwendete Mikroorganismus kann in einem verhältnismäßig breiten pH-Bereich gezüchtet werden. Es ist jedoch zweckmäßig, das Kulturmedium vor Beimpfen mit dem Mikroorganismus auf einen Wert zwischen etwa pH 6,5 und pH 7.2 einzustellen. Wie bei anderen Actinomyeeten verändert sich allmählich der pH-Wert des Wuchsmediums während der Wachstumsdauer. Am Ende der Fermentationsdauer liegt der pH-Wert gewöhnlich im Bereich von etwa 7,0 bis 7,8.

Für die Produktion von A-4696 werden submersaerobe Kulturbedingungen bevorzugt. Verhältnismäßig kleine Mengen des Antibioticums können mit Schüttelkolbenkulturen erzeugt werden. Für die Herstellung großer Mengen wird jedoch eine Züchtung unter submers-aeroben Bedingungen in sterilen Tanks bevorzugt. Das Kulturmedium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension oder Mycelfragmentsuspension beimpft werden, wegen der Zeitverzögerung bei Verwendung einer Sporensuspension wird jedoch als Inoculum die vegetative Form der Kultur bevorzugt. Indem die Zeitverzögerung in dem Wachstumscyclus vermieden wird, wird die Fermentationsvorrichtung besser ausgenutzt.

Es ist daher zweckmäßig, ein vegetatives Inoculum des Mikroorganismus durch Beimpfen einer verhältnismäßig kleinen Menge Kulturmedium mit den Sporen oder Mycelfragmenten des Mikroorganismus zu erzeugen und, wenn ein junges aktives vegetatives Inoculum entstanden ist, dieses unter aseptischen Bedingungen in den großen Tank zu überführen. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum gezüchtet wird, kann das gleiche Medium sein, das für die Fermentation von A-4696 in großem Maßstab verwendet wird, es können aber auch andere Medien verwendet werden.

Die A-4696 bildende Actinoplanes-Art, Stamm ATCC 23342, wächst bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 4O⁰C. Die größten Mengen A-4696 werden offenbar bei einer Temperatur von etwa 30⁰C erzeugt.

Bei dem submers-aeroben Kulturverfahren wird durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Das Luftvolumen, das in das Kulturmedium eingeleitet und darin verteilt wird, reicht von etwa 0,1 bis etwa 1,0 Volumenteilen Luft pro Minute und pro Volumenteil Kulturmedium. Wachstum und Antibioticum-Produktion erfolgen am wirksamsten, wenn das Luftvolumen wenigstens 1/2 Volumenteil Luft pro Minute und pro Volumenteil Kulturmedium beträgt.

Die Produktionsgeschwindigkeit von A-4696 und die Konzentration an antibiotischer Aktivität in dem Kulturmedium können während der Wachstumsdauer durch Prüfung von Proben der Fermentationsflüssigkeit auf antibiotische Aktivität gegen Mikroorganismen, die bekanntermaßen auf das Antibioticum ansprechen, verfolgt werden. Ein solcher für die erfindungsgemäßen Zwecke geeigneter Testorganismus ist Bacillus subtilis. Der biologische Test kann nach der üblichen turbidometrischen oder Näpfchenmethode oder mit dem Papierscheiben-Test uuf Agiirplatten durchgeführt werden.

Im allgemeinen findet bei Fermentationen mit ScliiUtelkolbenkulturen oder submers-aeroben Kulturen eine maximale Produktion des Antibioticums in etwa 4 bis 6 Tagen statt.

Antibioticum A-4696 kann durch Adsorptions- und Extraktionsmethoden aus dem Kulturmedium gewonnen und von anderen Substanzen getrennt werden. Adsorptionsmethoden werden bevorzugt, da bei sol-

K) chen Methoden die Verwendung großer Volumenmengen von Lösungsmitteln vermieden wird, die bei Extraktionsverfahren erforderlich sind.

Nach der Fermentation ist die antibiotische Aktivität sowohl in der Fermentationsflüssigkeit als auch im Mycel enthalten. Das Kulturmedium wird zur Trennung der Fermentationsflüssigkeit von dem festen Mycel filtriert. Der Mycelkuchen wird mit Wasser gewaschen und dann in Wasser aufgeschlämmt, das mit 5,0 η NaOH auf pH 10,5 eingestellt ist. 30 Minuten lang intensiv

-'<> gerührt und filtriert. Die beiden Filtrate und das Waschwasser werden vereinigt und die antibiotische Aktivität wird daraus an einem geeigneten Adsorptionsmittel adsorbiert, zum Beispiel Aktivkohle, aktiviertes saures Aluminiumoxid, Polyamidharz, Cellulose Kiesel-

2^r> gel und dergleichen. Zur Durchführung der Aosorption kann die antibiotische Aktivität enthaltende Lösung über eine Füllung aus dem Adsorbens geleitet werden oder das Adsorbens kann der Lösung zugesetzt, 20 bis 30 Minuten gründlich vermischt und von dem erschöpften Lösungsmittel abfiltriert werden. Das an dem Adsorbens haftende Antibioticum kann durch übliche Eluiermethoden als unreines A-4696 gewonnen werden.

Das rohe Antibioticum-A-4696 kann durch Herstellung des Picratsalzes und dessen Umwandlung in das Hydrochloridsalz gereinigt werden. Geeignete Adsorbentien sind beispielsweise Polyamidharz, saures Aluminiumoxid, neutrales Aluminiumoxid, basisches Aluminiumoxid, Kieselgel, Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-4 und Dowex 50(H⁺).

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

A. Schüttelkolbenfermentation
von Antibioticum A-4696

Ein Nähragar-Schrägmedium mit folgender Zusammensetzung wird mit Mycelfragmenten von Actinoplanes sp. ATCC 23342 beimpft:

Bestandteil

Menge

Vorgekochtes Hafermehl
Hefe

K₂HPO₄

Getrocknete Distiller's Solubles

Czapek's Mineralstammlösung*)
Agar

Wasser, deionisiert

*) Czapek's Mineralstammlösung:

KCl

MgSO₄-7 H₂O
FeSO₄ ■ 7 H₂O
(in 2 ml konz. HCl gelöst)
Wasser, deionisiert

60g	g
2,5	g
1,0	g
5,0	ml
5,0
25 g
11
100 g
100 g
2g

11

ίο

Das Schrägmedium wird mit ATCC 23342 beimpft und 6 Tage bei 30⁰C inkubiert. Die Kultur sporuliert auf diesem Medium normalerweise nicht und es ist erforderlich, die Mycelmatte mit einer abgeflachten geschärften Impfnadel aufzuschließen, um die Zahl von potentiellen Wuchb^cntren zu erhöhen. Die aufgeschlossene reine Kultur wird mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und zur Gewinnung einer Mycelsuspension vorsichtig mit einem sterilen Stab abgeschabt.

Die so erhaltene Suspension wird zum Beimpfen von 100 ml eines sterilen vegetativen Mediums mit folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteil

Menge

Glucose

Dextrin

Sojabohnenmehl

Hefeextrakt

Calciumcarbonat

Leitungswasser

5,0 g
20,0 g
15,0 g

2,5 g

1,0 g

1 I

Das beimpfte vegetative Medium wird auf einer mit 250 UpM betriebenen Rotationsschüttelvorrichtung 48 Stunden bei 30°C inkubiert.

100 ml eines sterilen »Zwischenmediums« mit der gleichen Zusammensetzung wie vorher werden mit 10 ml des inkubierten vegetativen Mediums beimpft. Das beimpfte »Zwischenmedium« wird 24 Stunden bei 30°C unter konstantem Schütteln auf einer mit 250 UpM betriebenen Rotationsschüttelvorrichtung inkubiert.

Anteile eines Produktionsmediums mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung von 100 ml, die in 500 ml Erlenmeyer-Kolben enthalten sind, werden 30 Minuten bei 120°C sterilisiert und mit 4/10 ml des inkubierten »Zwischenmediums« beimpft.

Bestandteil

Dextrose

Dextrin

Pepton

Sojabohnenmehl

MgSO₄ ■ 7H₂O

Zuckerrübenmelasse

Maisquellwasser

Betain

K₂HPO₄

"Wasser, deionisiert

ad

1,0
3,0
1,5
0,5
0,2
1,5
0,5
0,1
0,05
25 ml

Am Ende des Fermentationscyclus beträgt der pH-Wert etwa 7,2.

B. 40 1 Tankfermentation von Antibioticum A-4696

Die Herstellung des Inoculums wird wie oben unter Abschnitt A beschrieben bis zur Inkubierung des »Zwischen«-Mediums durchgeführt. 25 1 eines Produktionsmediums der oben beschriebenen Art mit einem

ίο Zusatz von 0,02% Dow Corning-Entschäumer werden im Autoklaven 30 Minuten bei 120°C sterilisiert und dann in einen 40 1 Fermentationstank gefüllt. Das sterile Produktionsmedium wird mit 100 ml inkubiertem »Zwischen«-Medium beimpft. Das beimpfte Produktionsmedium in dem 401 Tank wird 4 Tage bei 30°C fermentiert. Die Fermentationsmischung wird mit steriler Luft in einer Menge von etwa 1/2 Volumenteil Luft pro Volumenteil Kulturmedium und pro Minute belüftet. Während der Fermentation wird das Produktionsmedium mit einem Mischer unter Verwendung eines Propeller-Rührers geeigneter Größe gerührt, der mit entsprechender Umdrehungszahl betrieben wird, so daß eine angemessene Vermischung der Luft mit dem Medium gewährleistet ist. Der pH-Wert des Kulturmediums steigt mit fortschreitender Fermentation von einem Anfangswert von etwa 6,9 bis auf etwa 7,2 an.

C. Isolierung von Antibioticum A-4696

Die gesamte Fermentationsflüssigkeit, die aus einer A-4696-Fermentation, wie sie vorher beschrieben wurde, erhalten wird, wird mit Hilfe einer handelsüblichen Filterhilfe filtriert. Das Filtrat wird beiseite gestellt. Der Mycelkuchen wird mit 32 1 Wasser gewaschen und das Waschwasser wird aufbewahrt. Dann wird der Mycelkuchen in weiteren 32 1 Wasser suspendiert und der pH-Wert der Mischung wird mit 5 η Natriumhydroxidlösung auf 10,5 eingestellt. Die Mycelkuchen-Wasser-Suspension wird 45 Minuten lang gerührt und die Mischung wird filtriert. Dieses Filtrat und das Waschwasser werden mit dem ersten Filtrat der Fermentationsmischung vereinigt und der pH-Wert der vereinigten Filtrate wird mit H2SO4 auf 4,0 eingestellt. Die angesäuerten vereinigten Filtrate werden durch eine Kohlesäure mit 1 kg Aktivkohle (Pittsburgh, 12x40) geleitet. Die Aktivkohlesäule wird gewaschen, bis der Abfluß farblos ist. Die A-4596-Aktivität ist an der Kohlesäule adsorbiert. Die A-4696-Aktivität wird aus der Kohlesäule mit einer lprozentigen H₂SO₄-Lösung in Aceton/H₂O (1 :1) eluiert. 21 der angesäuerten Aceton/Wasser-Lösung reichen zum Eluieren der A-4696-Aktivität aus der Kohlesäule aus. Das Eluat, das die A-4696-Äkiiviiäi ciuhäii, wird ffiii gesäüigier Bariumhydroxidlösung behandelt, um einen Niederschlag aus Bariumsulfat zu erzeugen und dadurch die Sulfationen aus der Lösung zu entfernen.

Die Mischung wird filtriert und der Bariumsulfatniederschlag wird verworfen. Das Filtrat, das die A-4696-Aktivität enthält, wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand '"steht aus etwa 80 g A-4696-Aktivität.

Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert des Mediums mit 5 η Natriumhydroxidlösung auf 7,5 eingestellt. Nach dem Sterilisieren beträgt der pH-Wert etwa 6,9.

Die Produktionskultur wird etwa 96 Stunden bei einer Temperatur von 3O⁰C auf einer mit 250 UpM betriebenen Rotationsschüttelvorrichtung geschüttelt.

D. Umwandlung von A-4696
in rohes A-4696-Hydrochlorid

j_e A-4696-Aktivität von etwa 80 g wird in einem Volumen von 5 1 Wasser aufgenommen und dann mit 500 g Aktivkohle (Darco G-60) behandelt. Diese

Mischung wird 1 Stunde lang gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Der Kohlefilterkuchen, der die A-46%-Aktivität enthält, wird mit 1 1 Wasser gewaschen und das Waschwasser wird verworfen. Dann wird der Kohlefilterkuchen mit 1 I 0,05 η Salzsäure gewaschen. Die saure Waschlösung wird verworfen. Der gewaschene Kohlekuchen wird durch 30 Minuten langes Rühren mit 500 ml Salzsäure-Aceton-Lösung (0,05 η HCI : Aceton [7 :3]) eluiert. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat wird aufbewahrt. Das Eluieren der Aktivkohle wird viermal in der gleichen Weise wiederholt.

Jedesmal wird das Filtrat aufbewahrt. Die fünf Eluate, die die A-4696-Aktivität enthalten, werden vereinigt. Die vereinigten Eluate werden dann im Vakuum auf ein Volumen von etwa 100 ml eingeengt. Das wäßrige Konzentrat, das die A-469b-Aktivität enthält, wird mit 200 ml Methanol versetzt. Zu dieser wäßrigen Methanollösung werden 2 1 Aceton gegeben. In der wäßrigen Methanol-Aceton-Lösung bildet sich ein Niederschlag aus rohem A-4696-Hydrochlorid. Nach Abfiltrieren und Trocknen des Niederschlags werden 60,9 g rohes A-4696-Hydrochlorid erhalten.

E. Herstellung von
kristallinem A-4696-Hydrochlorid

25 g des A-4696-Hydrochlorids, das wie unter D beschrieben erhalten wurde, werden in 20 ml Wasser gelöst. Die A-4696-Hydrochloridlösung wird über eine mit Wasser gewaschene Füllung aus Polyamidharz geleitet, die in einer Glassäule mit etwa 7 χ 60 cm enthalten ist. Der Abfluß wird aufbewahrt. Die Polyamidharzsäule wird mit Wasser mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 8 bis 10 ml pro Minute gewaschen. Die antimikrobielie Aktivität des Säulenabflußes wird nach üblichen Methoden gemessen. Abflüsse, die antimikrobielie Aktivität enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in einer Mischung aus 25 ml Wasser und 50 ml Methanol gelöst. Diese wäßrige Methanollösung von A-4696-Hydrochlorid wird mit 5 η HCI auf pH 2,0 angesäuert. Die wäßrige Methanollösung wird mit etwa 1,5 I Aceton versetzt, um das Hydrochloridsalz von A-4696 auszufällen. Der A-4696-Hydrochloridniederschlag wird durch Filtrieren der Mischung gewonnen.

Der Filterkuchen, der das A-4696-Hydrochlorid enthält, wird in der Mindestmenge Wasser gelöst. Dann wird eine Äthanolmenge zugesetzt, die dem doppelten Wasservolumen entspricht und die Mischung wird auf etwa 60°C erwärmt. Hierauf wird die Mischung abgekühlt, wobei das Hydrochloridsalz von A-4696 auskrislallisiert. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Es werden etwa 9 g kristallines A-4696-Hydrochiorid gewonnen.

Beispiel 2

Reinigung von A-4696 durch Herstellung des

Picratsalzes und dessen Umwandlung

in das Hydrochloridsalz

500 mg rohe:; A-4696, das wie in Beispiel 1 bis Abschnitt D beschrieben erhalten wurde, werden in 25 ml Wasser gelöst und die Lösung wird unter Rühren mit 25 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Picrinsäure versetz¹.. Die Mischung wird über Nacht bei 5°C stehen gelassen. Der entstandene Niederschlag wird abzentrifugier: und getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wird in 25 ml Methanol gelöst, der pH-Wert wird mit HCl auf 1,5 eingestellt und es werden 500 ml Diäthyläther zugesetzt, um das A-4696-Hydrochloridsalz abzuscheiden. Das Hydrochloridsalz wird abzentrifugiert, '.nit Diäthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet, wodurch etwa 305 mg A-4696-Hydrochlorid als weißes kristallines Salz erhalten werden.

10

15

20

25

30

Tabelle III

Vergleichende Wirksamkeit des Antibioticums-A-4696-Hydrochlorids gegenüber als Wachstumsfaktoren bekannten Antibiotica bei Küken nach 56tägiger Versuchsdauer

Wirkstoff	Wirkstoff menge	Geschlecht	Anzahl an Küken batterien	Mittl. Gew.- Zunahme	Futtermenge	Verhältnis von Futtermenge zu Gew.-Zunahme
	(g/Tonne)			(g)	(g)
Mnnensin Na	90	W	3	1639	3761	2 294
		M	3	1959	4318	2,204
			jew. Mittelwerte	1799	4039	2,249
Antibioticum-A^t696- Hydrochlorid	5	W M	3 3	1651 2023	3787 4408	2,293 2,178
			jew. Mittelwerte	1837	4097	2,235
Payzone	10	W	3	1653	3699	2,238
		M	3	2015	4380	2,174
			jew. Mittelwerte	1834	4040	2,206
Tylosin	5	W	3	!632	3815	2,337
		M	3	1938	4175	2,154
			iew. Mittelwerte	1785	3995

	13	22 09 018	3 3 jew. Mittelwerte	Mit«. Gew- Zunahme	14	Verhi Futte Gew.
Fortsetzung			3 3 jew. Mittelwerte	(g)
Wirkstoff	WirkstoiT- menge	Geschlecht Anzahl an Küken batterien	Hierzu 1 Blatt Zeichnungen	1625 1988 1807	Futtermenge	2,284 2,169 2,226
	(g/Tonnc)			1615 1924 1770	(g)	2,331 2,25' 2,29(
Poxarsone	45,4	W M			3713 4313 4013
Bacitracin MD	10	W M	3777 4338 4057

Claims

Patentansprüche:

1. Glycopeptid-Antibioticum-A^egB-Hydrochlorid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine weiße kristalline Substanz ist, die in Wasser löslich und in Methanol, Aceton, Äther, Chloroform, Pyridin, Benzol und aliphatischen Kohlenwasserstoffen unlöslich ist, einen Schmelzpunkt von über 220⁰C aufweist, eine elektrometrische Titrationskurve in Wasser oder in einer Mischung aus Dimethylformamid und Wasser (2:1) ergibt, die sich im Bereich von pH 6,0 bis pH 13,0 einer geraden Linie mit einer Steigung von etwa 0,14 nähert etwa eine Elementarzusammensetzung aus 51,33% Kohlenstoff, 5,79% Wasserstoff, 5,46% Stickstoff, 30,96% Sauerstoff und 6,72% Chlor hat, ein aufgrund des osmotischen Dampfdrucks bestimmtes Molekulargewicht von

1158 aufweist, einen spezifischen Dreh wert [alpha] Ό⁵ von -423 (C=I, H₂O) hat, im Ultraviolettabsorptionsspektrum in sauren und neutralen Lösungen ein einziges Absorptionsmaximum bei 276 nm mit einem Extinktionskoeffizienten E !^ von 45 und in basischer Lösung ein einziges Absorptionsmaximum bei 300 nm mit einem Extinktionskoeffizienten E W von 65 hat und als Mineralölsuspension das Infrarotabsorpiionsspektrum mit folgenden unterscheidbaren Banden aufweist: 3,0, 5,8, 5,9, 6,03, 6,15, 6,28,6,63,6,85, 7,27, 7,75, 8,1,8,25,8,9,9,4,9,9 und 10,1 Micron.

2. Tierfuttermittel mit einem geeigneten Träger und einem Antibioticum als Wirkstoff, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff das Glycopeptid-Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid gemäß Anspruch 1 enthält.