DE1926458A1 - Antibiotische Substanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Antibiotisohe Substanzen und Verfahren zu ihrer Heretellung

Es wird die Priorität beansprucht aus der japanischen Patentanmeldung ITr. 34 716/68 vom 24· Mai 1968

und aus der

japanischen Patentanmeldung Fr. 44 682/68 vom 28. Juni 1963

Die Erfindung bezieht sich auf neue und wertvolle antibiotische Substanzen, die als SF-767-A-Substanz und 3F-767-L-Substanz bezeichnet sind; die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Herstellung dieser antibiotischen Substanzen.

Je ist gefunden worden, daß neue antibiotische substanzen, die eine kräftige wachstumshemmende 7/irkung gegen ei», breites Spektrum von Mikroorganismen, wie grampositive, gram-negative pathogene Bakterien und säurefeste "Bakterien haben, in einem Kulturboden bzw. einer Zulturbräne von einer speziellen Art erzeugt werden, die zum

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8ü9 88Ί/ TG97

^8AD

1925431

Genus Streptomyces gehört, daß solche antibiotischen Substanzen aus der Kulturbrtihe gewonnen werden können und daß eine dieser antibiotischen Substanzen außerordentlich wirkungsvoll zur Verhinderung bzw. Hemmung de3 Waohatums von Pseudomonas aeruginosa ist. Diese neuen Substanzen sind als SF-767-A-Substanz bzw. SP-767-Ii-Sub stanz bezeichnet' worden.

Sowohl die S]?-767-A-Substanz als auch die

3F-767-I)-Sub stanz sind außerordentlich wirkungsvoll zur Verhinderung bzw. Hemmung des Wachstums von gram-positiven, gram-negativen und Mycobakterien, ebenso wie zur Hemmung des Wachstums von pathogenen Bakterien, welche gegen die bekannten Antibiotika und synthetischen chemotherapeutischen Mittel resistant sind. Die SF-767-A- und KF-767-L-Substanzen sind im wesentlichen ungiftig und haben einen therapeutischen Effekt bei Infektionen von menschlichen- Wesen und Tieren durch grampositive, gram^negative und säurefeste Bakterien.

Die erfindungsgsmä3e antibiotische Substanz zur Verhinderung bzw. Hemmung des Wachstums von gram-positiven, gram-negativen Bakterien und säurefesten Bakterien ist dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der Gruppe ausgewählt ist, welche S?-767-A-Substanz und 3F-767-L-Substanz und Sauresalze davon enthält, daß jede der 3F-767-A- und SF-767-Ii-Substanzen eine Substanz ist, die in Wasser löslich ist, mäßig bis schwach löslich in Methanol und sehr schwach löslich bis unlöslich in Äthanol, Butanol, Aceton, Äthylacetat, Benzol, Äthyläther und η-Hexan, welche basiseh ist und mit Säuren Salze bildet, welche kein Absorptionsmaximum für ultraviolettes Licht von 21o mi·--. 360 mA«-auf weist·, welche eine positive Reaktion mit Molisch-, Anthron- und iiinhydrinreagen^ian und eine negative Reaktion mit Benedikt-, Pehling-, Sa kaguschi-, Eisenchlorid-, Elson-Morgan- und Maltolreagenzien ergibt, welche nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, . Stickstoff und Sauerstoff enthält, welche Aminogruppen, jedoch keine Säuregruppen enthält, welche in Wasser rechts-

8098 8 7/169 7 bado_R,g,_Nal

drehend ist,' welche in Wasser eine schwach alkalische lösung ' ergibt, in der die Substanzmole kille bei pH 1,8 zur Kathode wandern, wenn mittels Papierelektrophorese getestet wird, und welche die Merkmale der Aminoglykosid-Antibiotika im infraroten Absorptionsspektrum aufweist; daß die weiteren Eigenschaften der SF-767-A-Subatanz darin bestehen, daß die freie Base dieser Substanz ein weißfarbenes amorphes Pulver bildet, welches keinen scharfen Schmelzpunkt hat, sich jedoch in der Nähe von 19o°0 unter Aufschäumen zersetzt, welches eine Elementaranalyse von 45,06 # 0» 7*4o f H, 8,9o f> N und 39,08 £ ergibt, ein Molekulargewicht von 62o hat, das mittels der Dampfdruokgleichgawichtsmethode in wässriger Lösung bestimmt ist, welches die empirische Formel C₉,H_Ai,N_AO_1t- hat und eine ύ

optische Drehung νοηφζ/ "^ + 67 in 1#iger wässriger Lösung aufweist, und, wenn es in Form der freien Base in Kaliumbromid pelletiert ist, charakteristische Absorptionsbanden im Infrarotbereich des Spektrums bei den folgenden Wellennummern in cm""¹ hatt 34oo, 29oo, 1595i 146o, 135o, II30 (Absatz) und Ι0Ι0; daß die weiteren Eigenschaften der SP-767-L-Substanz darin bestehen, daß die freie Base der SP-767-L-Substanz ein weißfarbenes amorphes Pulver bildet, welches keinen scharfen Schmelzpunkt hat, sich jedoch in der Nähe von 192⁰C unter Aufschäumen zersetzt, welches folgende Elementaranalyse ergibt: 43i58 g C, 6,80 £ H, 8,62 $ Έ und 4o,?5 56 O, welches ein Molekulargewicht von 682 hat, das mittels der Dampfdruckgleichgewicht sme thod β in wässriger Lösung bestimmt ist, welches die \ empirische Formel Op-jH.-U.O^g hat, welches eine optische Drehung-von\W!/^"L ₊ 60 in I^igar, wässriger Lösung aufweisu, und welches, wen*; es in ΪΌπε äer freien Baee in Kaliumbromid pelletiert ist, charakteristische AbsorptioriBbaiideii ic: Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden -^elleniiuEinern ir. cn aufweist.· 34-??, ?-1o, i~35, 148o, 135ο. i13o (Acaa-sz^ ,,r.ö toic

«1b Säure salze der SP-767-A- und 3F-767-L- ;.-lstanaeii ko'jiivi;; ':.v-ircielsvseise 3Ie SäureaääitionsverOinijn-'-e:·: bs'.v. Saureaaaitr.^i^sal^e öieser Su"os~aiizan erwähnt ä "

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BADORfGINAL

192645

mit nicht toxischen organischen und anorganischen Säuren gebildet sind, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoff, Jodwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Essigsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Benzolsäure, Zimtsäure, Aphkorbinsäure, Glycolsäure und dergleichen.

Es zeigen:

Fig. 1 eine Kurve des Ultraviolett-Absorptionsspektrums der SF-767-A-Substanz in der Form der freien Base, gelöst in Wasser in einer Konzentration von 1 /oj

Fig. 2 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums der SF-767-A-Substanz, tablettiert in Kaliumbromid;

Fig. 3 Papierchromatogramme der SF-767-A-Substanz und ihrer verwandten Antibiotika;

Fig. 4 eine Kurve des Ultraviolett-Absorptionsspektrums der SF-767-L-Substanz in der Form der freien Base, gelöst in Wasser in einer Konzentration von 1 $;

Fig. 5 eine Kurve des Infrarotabsorptionsspektrums der SF-767-L-Substanz, tablettiert in Kaliumbromid;

Fig. 6 Papierchromatogramme der SF-767-L-Subs-fcanz und ihrer verwandten Antibiotika;

Fig. 7 Dünnschichtchromatogramme der N-acetylierten SF-767-A- und SF-767-L-Substanzen und von N-acetyliertem Paromomycin I.

Es wurde festgestellt, daß beide SF-767-A- und SF-767-L-Substanzen nicht die Elemente Schwefel und Halogene enthalten.

Es wurde gefunden, daß die Molekulargewichte der SF-767-A- und SF-767-L-Substanzen bei 62o bzw. 682 liegen, während diese Werte bei 614 bzw. 658 (fUr die tetrasaure Base)

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192541

liegen, wenn sie aus den litrationskurven der SF-767-A- und S]?-767-Ii-Substanzen berechnet werden.

Die Tatsache, daß die SF-767-A-'und SF-767-L-Substanzen basische Substanzen sind, die in ihren Molekülen keine sauren Gruppen enthalten, wurde ebenfalls durch die litrationskurven dieser Stoffe bestätigt. Es wurde gefunden, daß die SF-767-A- und SF-767-Ij-Stoffe bzw. -Substanzen unter neutralen oder alkalischen Bedingungen stabil sind, während sie unter sauren Bedingungen leicht instabil werden. . . ■"

Wenn jeder der SP-767-A- und SE¹-767-I»-Stoffe einer absteigenden Papierchromatografie unterworfen wurde, indem verschiedene Lösungsmittelsysteme benutzt wurden, wie (6:4:1:3) n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (7-tägige Entwicklung); (15:10:3*12) n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (2o-stundige Entwicklung) bzw. wassergesättigtes n-Butanol, welches 2 fo p-Toluolsulfonsäure enthält (2o-stündige Entwicklung), worauf anschließend die Stoffe einer Farbgebung durch die Finhydrinreaktion und abschließend einer Bioautografie mit Bacillus subtilis unterworfen wurden, ergab der SF-767-A-Stoff einen Einzelfleck in einer Entfernung von 6,1 cm, 11,4 cm bzw. 3,9 cm von den Ausgangspunkten, und zwar jeweils bezogen auf die oben erwähnten Lösungsmittelsysteme. Der SP-767-L-Stoff ergab dann einen Einzelfleck in einer Entfernung von 5,7 cm, 9,7 cm bzw. 2,5 cm von dem Ausgangspunkt.

Beim Hochspannungs-Papier-Elektrophorese-Iest (3ooo Volt bei pH 1,8 während 2o min.) wurde gefunden, daß jeder der beiden SF-767-A- und SF-767-L-Stoffe über 1-1,5 cm zur Kathode wandert und jeweils einen Einzelfleck ergibt.

Durch Dünnschichtchromatografie mit Silikagel 6· (ein Erzeugnis von Merk Co», USA) wurde gefunden, daß der Ivf-acetylierte SF-767-A-Stoff oder der N-acetylierte 35-767-L-Stoff einen Einzelfleck ergibt, und daß, wenn der N-acetylierte

ÖÖ90Ö7/1ß97' Λ'-'

SF-767-A-Stoff, der N-acetylierte SF-767-L-3toff .und N-acetyliertes Paromomycin I gleichzeitig auf der gleichen Platte entwickelt wurden, jeder dieser Stoffe einen Einzelfleck mit jeweils unterschiedlichen Rf-Werten ergab. Die Verhältnisse der Wander strecken von I\ -acetyliertem SF-767-A-Stoff zu N-acetyliertem Paromomycin I waren 0,89 bzw. 1,o6, wenn (2:1:1) t-Butanol-Essigsäure-Wasser und (6:4:3) n-Butanol-PyridinWasser als Entwicklungslösungsmittel benutzt wurden. Die Verhältnisse der Viand er strecken von N-acetyliertem 8P-7ö7-Ij-Stoff zu N-acetyliertem Paromoinycin I waren 0,78 bzw. 1,oo, wenn (2:1:1) t-Butanol-Eesigsäure-Wasser und (6:4:3) n-Butanol-Pyridin-Wasser als Entwicklungslösungsmittel verwendet wurden.

Die antibakteriellen Spektren der 3P-767-A- und SP-767-L-Stoffe sind in der folgenden Tafel I gezeigt, Die minimalen Hemmkonzentratiorren dieser neuen Antibiotika wurden ermittelt, indem die Nährmittel- bzw. Briihenverdünnungsmethode mit verschiedenen Kulturmedien, wie in Tafel 1 dargestellt) verwendet wurde.

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	*	Minimale Hemm konzentration (ar/mi)	Tafel 1	Minimale Hemm konzentration (JT /ml)	Verwendetes Kulturmedium
	Versuchs-Mikroorganismus	0.19	Verwendetes Kulturmedium	0.19	Bouillon
	Bacillus 3ubtilis !TOC 6633	3.125	Bouillon	-	—
	Bacillus cereus IAM 1o72	1.56	Bouillon	3-125	Bouillon
co	Staphylococcus aureu3 ' 2o9-P	1.56	Bouillon		-
Of GOi CO	Staphylococcus aureus 2o9-P resistent gegen Penicillin	3.125	Bouillon	-	-
σ> co	Staphylococcus aureus 2o9-P resistant gegen Streptomycin und A-249-Substanz	0.78	Bouillon	-	-
	Staphylococcus aureus 2o9-P resistant gegen Novobiocin	0.19	Bouillon	0.39	Bouillon
	Staphylococcus aureus Smith	0.19	Bouillon	0.19	Bouillon
	Staphylococcus aureus Terajima	0.78	Bouillon	1.56	Bouillon
	Staphylococcus aureus 52-34	1.56	Bouillon	1.56	Bouillon .
	Staphylococcus aureus 52-34 resistent gegen	Bouillon■

mycin und Carbomycin

cn -τοπ CO

Tafel 1 (Fortsetzung)

	■*	Staphylococcus aureus 193	1 ·!	Pb	Bouillon	3.125	Bouillon	I	CD
	Staphylococcua aureus resistent gegen Streptomy cin, Erythromycin, Tetra cyclin und Penicillin	OV	78	Bouillon	6.25	Bouillon	CD	CD
	Staphylococcus aureus resistent gegen Streptomy cin, Tetracyclin und Penicillin	1	.56	Bouillon	-	-		ca
β£> O	Sarcina lutea	höher ala	1oo	Bouillon	höher als 1oo	Bouillon
«Ο «* CD -4 'S»,	Lactobacillus arabinosus	1	.56	Glukose, Pepton, Hefeex trakt	25	Glukose, Pepton, Hefe extrakt
cn-	Streptococcus faecalis	. 5o		Il	höher als 1oo	Il
«ο «••Ι	Escherichia coli IAM 1253	12	.5	Bouillon	25	Bouillon
	11 » IAM 123S	12	.5	Bouillon	12.5	Bouillon
	it ti K—12	3	.125	Bouillon	12.5	Bouillon
	Escherichia coli resistent gegen Chloram phenicol	1	.56	Bouillon	3.125	Bouillon
	Escherichia coli resistent gegen Kanamycin	5o		Bouillon	-	-
	Shigella dysenteriae	6	.25	Bouillon	6.25	Bouillon
	Shigella sonnei	12	.5	Bouillon	12.5	Bouillon

Tafel 1 (Fortsetzung)

ο co ca to

Shigella flexneri

re sistent gegen Tetracyclin

und Streptomycin Salmonella typhi Salmonella paratyphi A Salmonella paratyphi B Klebsieila penumoniae Proteus vulgaris Pseudomonasjäeruginosa (8063)

Pseudomonas aeruginosa (8152) Xanthomonas oryzae Mycobaeterium smegmatis 6o7

Mycobacterium smegmatis 6o7 ' re sistent gegen Streptomycin

Mycobacterium smegmatis 6o7 resistent gegen Kanamycin Mycobacterium■phlei Candida albicans

Cryptococcus enoformans Saccharomyces cerevisiae Torula utilis

12.5	Bouillon	25	3-125	Bouillon
3-125	Bouillon	6.25	0.78	Bouillon
3-125	Bouillon	6.25	0.78	B.ouillon
3-125	Bouillon	6.25	Bouillon
3.125	Bouillon	3-125	Bouillon
12.5	Bouillon	25	Bouillon
6.25	Bouillon	mehr als 1oo	Bouillon
3-125	Bouillon	-	-
1.56	Bouillon	Bouillon
0.78	Glyzerin Bouillon	Glyzerin Bouillon
0.78	It	Il

0.39

mehr	als	Sabouraua	mehr	-	als	Sabouraud	to'
1oo				1oo		<J> Ϊ J^
mehr	als	It	mehr	als	Il	XD
loo				1oo
mehr 1oo	als	Il	mehr	als 1oo	Μ
mehr	als	Il	mehr	als	It
1oo			1oo

Tafel 1 (Portsetzung)

Aspergillus niger Penicillium chry30genum Tricb.oph.yton asteroides

mehr als	Sabouraud	mehr als
1oo		1oo
mehr als	Il	mehr als
1oo		1oo
mehr als	Il	mehr als
1oo		1oo

Sabouraud

CD ISJ

* ■ -11-.

Wie es sich aus Tafel 1 ergibt, sind die SF-767-A-Stoffe und SF-767-L-Stoffe Breitspektrum-Antibiotika, die eine wirkungsvolle antibakterielle Aktivität gegen gram-positive * Bakterien, gram-negative Bakterien und säurefeste Bakterien haben. Beide Stoffe bzw. Substanzen 3ind von ausgezeichneter antibakterieller Wirksamkeit, sie haben jedoch keine antimykotische Wirksamkeit.

E3 iet insbesondere besonders bedeutungsvoll,

daß der SF-767-A-Stoff eine nehr hohe antibakterielle Wirksamkeit gefren Pneudomonas und säurebeständige Bakterien hat. Die antibakterielle Wirksamkeit des SF-767-A-Stoffes gegen Pseudomonas ist in der folgenden Tafel 2 aufgeführt, und zwar im _ Vergleich mit der Wirksamkeit von einigen bekannten wasser- ™ löslichen basischen Antibiotika der rechtsdrehenden Art.

Tafel 2 '

Mir

untersuchte antibiotische Substanz

Minimale Hemmkonzen-	bra ti on 'JXJmI)
Pseudomonas aerugi- nosa (eine von einem Patienten entnommene Art)	Ppeudomonas aeru- i-inosa Art 3ο63
3-125	6.25
25	25
12.5	25
3-125	D.25
25	5o
1.56	3.125

SF-767-A-Stoff Kanamyc in A Kanamycin B Ne omyo in

Paromomycin Tenemycin (komplex)

Gentamicin ο·39 ο·7β

Die antibakterielle Wirksamkeit des SF-767-A-Stoffes gegen Pseudomonas aeruginosa ist vier- bis achtmal

höher als diejenige von Kanamycin A, Kanamycin B und Paromo- \

mycin, und es ist vorteilhaft, daß die antibakterielle Wirksam- f

keit äes SF-767-A-Stoffes nicht durch Serum inaktiviert werden :

kann. Infolgedessen bildet die SF-767-A-Substanz eine ausge- ;

zseichnete Medizin zur Behandlung von Pseudomonas-Infektionen. !

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Gemäß Versuchen bezüglich der akuten Toxizität durch intravenöse Injektion bei Mäusen ist die Toxizität sowohl der SF-767-A-Substanz als auch der SF-767-L-Substanz

sehr niedrig. So ist LDc- des SF-767-.A-Sub stanz sulfates

(pH 7·ο) 17ο - 23o mg/kg und LD,- des SF-767-L-Sub stanz sulfates (pH 7·ο) 28o mg/kg. Nach der Injektion wurde kein anormaler Verlauf beobachtet.

Die therapeutische Wirkung der SF-767-L-Substanz wurde an Mäusen getestet, die mit Staphylococcus aureus Smith infiziert waren. Diese Substanz wurde intramuskulär in sechs verschiedenen Dosen im Bereich von I00 mg/kg - 1 mg/kg injiziert. Es wurde festgestellt, daß die SF-767-L-Substanz einen Wert von 1o mg/kg (6,3 - 16 mg/kg) für EDc₀ zeigte, und zwar errechnet gemäß der Lichfiels-Wilcoxon-Methode, und das Kanamycin A, welches als Kontrollmittel verwendet wurde, einen EDc -Wert von etwa 5 mg/kg aufwies.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der SF-767-A-Substanz und der SF-767-L-Substanz, welches darin besteht, eine Art Streptomyces microsporeus in einem Kulturmedium zu zlichten, welches assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, und zwar unter aeroben Bedingungen, um die SF-767-A-Substanz und die SF-767-L-Substanz in der Kultur zu erzeugen und wachsen zu lassen, und anschließend diese antibiotischen Substanzen aus der Kultur zu gewinnen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Tendenz beobachtet werden, daß die SF-767-A-Substanz während der anfänglichen und späteren Phasen des Verfahrens erzeugt wird, während die SF-767-L-Substanz im wesentlichen während der späteren Phase des Verfahrens erzeugt wird.

Der Mikroorganismus, der sowohl die SF-767-A-als auch die SF-767-L-Substanzen erzeugt, wurde von den Erfindern aus einer Bodenprobe isoliert, die in Oiehama, Easaoka-City, Okayama Prefecture, Japan, gesammelt wurde, und dieser

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-Ί3 -

Mikroorganismus wurde als Streptomyces microsporeus bezeichnet, der in der American Type Culture Collection, Washington D.C, unter ATCO Nr. 21384 hinterlegt wurde. Der Streptomyoes miorosporeus hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften:

(I) Morphologische Betrachtung.·

1) Luftmycelium: Luftmycelium ist schwer am allgemeinen für die Klassifizierung verwendeten Kulturmedium zu bilden, es wird jedoch geringfügig zur Erzeugung einer offenen Spirale unter beschränkten Bedingungen gebildet, etwa auf Bodenextrakt-Agar und Kartoffelextrakt-Agar usw.

2) Spore: kugelförmig bis kurz zylindrisch in der Gestalt und o,3 - o,5 Mikron χ ο, 5 - ο, 7 Mikron in der Größe. Die Spore kennzeichnet sich durch ihre geringere Größe als 'die Sporen der üblichen Streptomyces. Die Oberflächenstruktur ist glatt.

3) Kultivierung in Flüssigkeit: Zwei Phasen des

Wachstums, nämlich "kurze Stäbchen-" 7/achstumsart und "Mycelium-" Wachstumsart treten in einer einzigen Generation dieser Mikroorganismen entsprechend der Kultivierungszeit auf.

II) Die Eigenschaften bei verschiedenen Kulturmedien sind in der folgenden Tafel 3 wiedergegeben.

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Tafel 3

Kulturmedium

Saccharose-Czapek-Agar

Wachstum

sehr schwaches V/ach s tum, farblos bis cremefarben

Luftmycelium

nein lösliches Pigment ne in

Glyzerin-Czapek-A gar

Kolonie-Wachstum, dunkelgrün gefärbt

spärlich, bläulich-grau getönt nein

Krainskys Glukose· ' Asparagin-Agar

hellbraun bis braun ge- keins oder teilweise, nein färbtes Wachstum mit gräulich-blau getönt
grünlichem Farbton

—' Ushinskys G-lukose-

A sparagin-Agar

hellbraun getönt, unre- keins oder teilweise, nein gelmäßiges Wachstum mit gräulich-weiß getönt
grünlichem Farbton

Kalziummalat-Agar

Koloniewachstum, die Agarlösung ist gräulich-grün getönt im oberen Teil und braun getönt im unteren Teil

nein nein

Glyzerin-Kalzium- marineblau bis dunkel- spärlich,

malat-Agar blau getöntes Wachstum gräulich-blau getönt nein

Synthetischer Stärke-Agar.

hellbraun,getöntes Wachstum ,'

sehr sOärlich nein

Iafel 3, (Fortsetzung)

NKhragar gut, hellbraun getönt spärlich, weiß gefärbt, nein

und unregelmäßiges jedoch teilweise blau
Wachstum gefärbt

Glukose-Bouillon- dick erhöhtes, sehr spärlich, graulich- nein Agar 3tark unregelmäßiges blau gefärbt

und rissiges Wachstum,

hellbraun und teilweise !o... ' dunkelgrün gefärbt

CD "" '

oo Tyrosin-Agar braun gefärbtes, tief spärlich, weiß gefärbt dunkelrosa

co- in den Agar eindringen- gefärbt

Λ³ des Wachstum

co Kartoffelaufguß-Agar cremefarben gefärbtes spärlich, weiß ge- rosa gefärbt

-α Wachstum färbt, mit Sporenbil

dung

Bodenextrakt.Jlgar cremefarben gefärbtes spärlich, weiß gefärbt, nein

Wachstum mit dunkelblau mit Sporenbildung
gefärbter Begrenzung

Ha.^ermehl-Agar gelblich-braun bis spärlich, weiß gefärbt nein

hellbraun gefärbtes Wachstum .

Gelatine-Agar hellbraun gefärbtes nein nein

(ausgebrütet b'dje 2o%) Wachstum

CO

cn OO

Tafel 3 (Fortsetzung)

Kartoffel

erhöhtes, unregelmäßiges Wachstum, olivegrün gefärbt mit braunem Farbton

spärlich, weiß und teilweise blau gefärbt

nein

Karotte

hellbraun gefärbtes Wachstum

spärlich, weiß gefärbt

nein

Magermilch Hingwachstum, hellbraun

J? (ausgebrütet bei 37 C) gefärbt, pH ö.o nein

glänzend braun gefärbt

co Loefflora koaguliertea gräulich-blau gefärbtes -λ Serum ' Wachstum

^ (ausgebratet bei 37⁰C)

spärlich, bläulich- nein grau gefärbt

Cellulose

kein Wachstum

Bemerkung: Die Brüttemperatur betrug, wenn^: nicht anders angegeben, 28⁽

19264!

(Ill) Physiologische Eigenschaften:-
Bildung von Hydrogensulfid: : negativ Bildung von Tyrosinase: negativ

Bildung von Nitrit: positiv

Peptonigierung von Magermilch: positiv (stark) Gerinnen von Magermilch: negativ Umsetzung von Magermilch: Wechsel auf

einen pH-Wert von 8

Stärkehydrolyse: positiv (stark)

Verflüssigung von Gelatine: positiv (schwach)

Zersetzung von Loefflers koagu- negativ liertem Serum:

(IV) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen:

1) Nutzbar: Glukose, Galactose, Fruktose, Maltose,

Lactose, Haffinose, Dextrin, Stärke, Glyzerin, Sorbitol, Mannitol, Inositol, Natriumacetat, Natriumsuccinat, Natriumzitrat, Mannose und Paraffin.

2) Zweifelhaft: Arabinose und Xylose.

3) Nicht nutzbar: Rhamnose, Saccharose, Inulin,

Dulcit, Salicin und Zellulose.

Die oben behandelten mikrobiologischen Eigenschaften der die SF-767-A- und SF-767-L-Substanz erzeugenden Rasse, im folgenden kurz als SF-767-Rasse bzw. -Art bezeichnet, können wie folgt zusammengefaßt werden:

1) Das Luftmycelium ist spärlich und die Spore, die unter "bestimmten Bedingungen gebildet werden kann, ist kleiner in ihrer Größe. Es treten zwei Wachs tumsphase-n während des Briiteris auf, welches in flüssigem Kulturmedium durchgeführt wird, wobei die "kurze Stäbchen-" Wachstumsform im früheren Stadium der Inkubation auftritt, während die "Mycelium-" Wachstumsform im mittleren und späteren Stadium der Inkubation erscheint.

2) Das Wachstum im synthetischen Kulturmedium ist

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192645?

gewöhnlich braun bis grünlioh-blau gefärbt und es fehlt ein lösbares Pigment.

3) Das Vtechstum im organischen Kulturmedium ist gewöhnlich braun gefärbt und häufig mit einem bläulich-grünen Farbeinschlag. Lösliches Pigment fehlt gewöhnlich, aber in einem einzelnen Fall wird ein glänzend rosa gefärbtes lös-■ liehes Pigment bei Kartoffelextraktnährboden erzeugt.

Die SF-767-Rasse kennzeichnet sich dadurch aus, daß das Luftmyoelium bei Agarmedium spärlich ist, daß die "kurze Stäbchen"-V/achstumsform erfolgt, wenn in flüssigem Kulturmedium ausgebrütet wird und daß Paraffin als Kohlenstoffquelle verwendbar ist. Diese Eigenschaften der SF-767-Rasse sind teilweise denjenigen des Genus Nocardia verwandt. Angesichts der weiteren Eigenschaften der SF-767-Rasse, nämlich, daß das Luftmycelium gut in-Karteoffelextraktagar und Bodenextraktagar wächst, um viele spiralförmige Sporenketten zu erzeugen, und daß die normale "Mycelium-" Wachstumsform im mittleren und -späteren Stadium der Inkubation stattfindet, selbst wenn in flüssigem Kulturmedium ausgebrütet wird, ist es riehtig anzunehmen, daß die 3F~767-Rasse zum Genus Streptomyces gehört. Als derartige Rassen von Streptomyces, welche die Eigenschaften des Genus ITocardia und des Genus Streptomyces zusammengefaßt aufweisen, können erwähnt werden Streptomyces j limosus, Streptomyces autotrophicus, Streptomyces gardneri, t Streptomyces venezuelae, streptomyces kanamyceticus (die Eigenschaften der oben erwähnten Arten bzw. Rassen basieren, sofern nicht anders angegeben, auf Waksmans "The Actinomycetes" Vol. 2, 1961), Streptomyces varius (Scientific Reports of Meiji Seika, ITr. 8, S. 3o - 39, 1966) und Streptomyces : chrestomyceticus (Giorn. Microbiol. Vol. 7, S. 242 - 25o, 1959) usw. Viele dieser Arten bzw. Hassen zeigen das Teilungsphähomen des Myceliums, ähnlich wie Genus Nocardia, wobei jedoch sämtliche dieser Arten nicht die Spirale beim Luftmycelium erzeugen, so daß sie in morphologischer Hinsicht deutlich von der SF-767-Art unterschiedlich sind.

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Bei Nocardia und nocardiaähnlichen Streptomyces erfolgt das Teilungaphänomen prinzipiell, nachdem das vegeta- ■ tive Mycelium gebildet worden ist. Die SF-767-Art unterscheidet aich wesentlich davon, indem bei der SF-767-Art das Stäbchenbzw» Bazillenwaohstum (welches als ein Zustand.der Keimungsverläufe angesehen wird) zu einem früheren Stadium der Inkubation erfolgt, während die Myceliumform in den mittleren und späteren Stadien der Inkubation erscheint. Aus Obigem ist es klar, daß die SF-767-Art eine eigentümliche und neue Art ist, welche nicht unter den bekannten Arten gefunden werden kann, die zu dem "Grenzbereioh" zwischen "dem Genus Nocardia und dem Genus Streptomyces gehören. Da die SF-767-Art die oben erwähnte Position in der Klassifizierung hat, ist die Differenzierung zwischen der SF-767-Art und den üblichen bekannten Strepto- myces-Arten leicht. Abgesehen von der speziellen Begrenzung des "Grenzbereiohes" wird die SF-767-Art nunmehr mit den bekannten Streptomyces-Arten hauptsächlich unter Berücksichtigung ,der Farbgebung des Luftmyceliums und des Wachstums verglichen. Das Wachstum der SF-767-Art hat in vielen Kulturmedien die grtine Farbe oder Farbtönung und in dieser Hinsicht ist die SF-767-Art verwandt mit den grün gefärbten bzw. Viridis-Arten des Genus Streptomyces. Von diesen Arten stehen Streptomyces alboviridis und Streptomyces intermedius in enger Beziehung zu der SF-767-Art, wobei diese beiden Arten sich jedoch von den SF-767-Arten dadurch unterscheiden, daß Streptomyces alboviridis keine Spiralform bildet und ein gutes/Wachstum in Zellülosemedium zeigt, während Streptomyeesintermediua ein luftmycelium mit grüner Parbe bildet, Kartoffelbrei dunkel färbt, und in GlukasB-Asparagin-Agarmedium gelb gefärbtea lösliches Pigment erzeugt.

Angesichts dessen, daß die SF-767-Art Luftmycelium von gräulich-blauer Farbe bildet und lösliches Pigment von rosa Farbe in dem Kartoffelaufgußagarmedium erzeugt, kann die SF-767-»Eassemit violett-roten Arten (violaceoruber aeries) des Genus Streptomyces in Beziehung gesetzt werden. Von diesen

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13264«

- 2ο -

Arten können erwähnt werden Streptomyces violaceo-ruber, Streptomyces aeroleus und Streptomyces oyaneus uw. Diese Rassen der violett-roten (violaceo-ruber) Arten erzeugen selbst in synthetischem Kulturmedium lösliches Pigment, und das lösliche Pigment verändert sich in der Farbe von rot bis zu blau, in Abhängigkeit von den pH-Werten. Die SF-767-Basse erzeugt in synthetischem Kulturmedium kein lösliches Pigment und das rosafarbene lösliche Pigment, das in Kartoffelextrakt-Agarmedium erzeugt wird, verändert sich nicht in der Farbengebung in Abhängigkeit vom pH-Wert. Demzufolge unterscheidet sich die SF-767-Iiasse auch von den-violett-roten (violaceo-ruber) Arten.

Angesichts dessen, daß die SF-767-Art negativ auf Melanin reagiert und eine geringe Bildung von Luftmycelium im

• allgemeinen zeigt, können Streptomycea alboflavus und Streptomycea armillatua als die am nahesten verwandt liegenden Arten erwähnt werden. Von diesen Arten bildet Streptomyces alboflavus pulvriges Luftmycelium weißer Farbe in Saccharose-Zcapek-Agarmedium und das Wachstum in Glukose-Asparagin-Agarmedium ist gelb gefärbt und weist nicht eine blaue bis grüne Färbung oder Farbtönung auf, wie es bei der SF-767-Rasse der Fall ist. Streptomyces armillatus zeigt ein Wachstum von gelber bis orangefarbener Farbe und unterscheidet sioh demzufolge

, von der SF-767-Hasse.

Wie oben erwähnt, kann unter den bekannten Streptomyces-Arten, die bisher behandelt wurden, keine Art gefunden werden, die die gleichen Eigenschaften hat wie die SF-767-Basse

Andrerseits sind die neuen antib lot Ischen 8F-767-.A- und SF-767-L-Substanzen, die aue der SF-767-Haese erzeugt werden können, typisch fttr wasserlösliche und basische Antibiotika, die ein breites antibakterielles Spektrum haben, und ihre optische Drehung ist (+). Von den bekannten Antibiotika gehören Neomycin, Kanamycin, Paromomycin, Gentamicin und Tenemycin zu der gleichen Gruppe von Antibiotika. Es ist daher not'-"

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■ - 21 -

wendig, daß die mikrobiologischen Eigenschaften der SF-767-Art mit den Eigenschaften von Mikroorganismen verglichen werden, welche zur Erzeugung dieser bekannten Antibiotika dienen.

Zuerst können als zur Erzeugung von Gentamicin dienender Mikroorganismus zwei Arten erwähnt werden, nämlich Micromonospora echinospora und Micro-monospora purpurea (s. US-Patent Nr. 3 o91 552, herausgegeben im Jahre 1963), welche leicht von der Sl?7767-Art unterschieden werden können, da sie zu dem anderen Genua der Streptomyces gehören..

Weiterhin bilden der Kanamycin erzeugende Organis- _Λ mus Streptomyoes kanamyoetious, der Neomycin erzeugende Orga- ™ nismus Streptomyces fradiae, der Paromomyoin (oder Hydroxymycin) erzeugende Organismus Streptomyoes paucisporogenes -(Ann. pharm., franc. Vol. 16, S. 585, 1958) und der Paromomycin (oder Aminosydin) erzeugende Organismus Streptomyces chrestomyceticus (Giorn. Microbiol. Vol. 7, S. 242 - 25o, 1959) keine Spiralen, während der Neomycin erzeugende Organismus Streptomyoes albogriseolus Haarsporen erzeugt. In dieser Hinsioht unterscheiden sich diese Arten in morphologischer Hinsicht von der SF-767-Art. Von diesen Arten steht Streptomyces chrestomyceticus in naher Beziehung zu der SF-767-Art, da die zuerst genannte Art die Myceliumspaltung zeigt und wobei die Spore kleiner in der Größe ist. Die SF-767-Art zeigt jedoch nicht die Myceliumtei- i lung bei Agarmedium und unterscheidet sich demzufolge wesentlich von Streptomyoes chrestomyoetieug bezüglich der erwähnten Myceliumspaltung. Streptomyces chrestomyceticus zeigt zusätzlich ein farbloses bis hellgelb gefärbtes Wachstum, wobei jedoch kein lösliches rosafarbenes Pigment bei Kartoffelextfakt-Agarmedium erzeugt wird, was einen deutlichen Unterscheid zur SF-767-Art darstellt.

Der Paramomyoin erzeugende Organismus Streptomyoes rimosus forma paromomyoinus (Jap. Patentschrift Nr. 33-6649), der Paromomyoin erzeugende (oder Zygomyain erzeugende) Organismus Streptomyoes pluveraceus (Agr. Biol. Ghem, VpI. 25,

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S. 171 - 175, 1961), der Paromomycin (oder Catenulin) erzeugende Organismus Streptomyces catenulae und der Tenemyoin erzeugende Organismus Streptomyces tenebrarius (7th Interscience on Antimicrobial Agents and Ohemotherpy held in Chicago City on 25th to 27th Oct.,.1967), erzeugen alle Spiralformen, so daß sie morphologisch zur SF-767-Art gehören.

Von diesen Arten bildet jedoch Streptomyces rimosus forma paromomycinus in Kalziummalat-Agarmedium Luftmyoelium von weißer Farbe und er weist bei keinem Kulturmedium die grün bis grünlich-blaue Färbung auf, die beim Wachstum und dem Iiuftmycelium der SF-767-Art beobachtet wird. Auf diese Weise ist ein deutlicher Unterschied zur SF-767-Art vorhanden.

Streptomyces pluveraceus bildet lösliches Pigment von brauner bis schwarzer Färbung in Glukosebouillon-Agarmedium und in Kartoffelbrei, während ein farbloses Wachstum , in Iioefflers koaguliert em Serum beobachtet wurde. Dadurch^ ist j ein deutlicher Unterschied zur SF-767-Art vorhanden. Streptomyces catenulae zeigt eine Knoten- bzw. Klumpenbildung, es erzeugt Luftmycelium von grauer Farbe in Saccharose-Czapek-Agarmedium und in Kalziummalat-Agarmedium, wobei es jedoch ITitrat nicht reduziert, so daß in dieser Hinsicht ein deutlicher Unterschied zur SF-767-Art vorhanden ist.

Streptomyces ,tenebrarius zeigt gelbes bis orangefarbenes 'Wachstum und eine gute Sporenbildung in synthetischen Kulturmedien und er bringt Magermilch zum Gerinnen, er verwendet «iulTt jedoch nicht Raffinose, so daß er sich in diesen und in anderen Hinsichten von der SF-767-Art unterscheidet.

Als Ergebnis der oben aufgeführten mikrobiologischen Vergleiche bzw. Gegenüberstellungen läßt sich feststellen, daß die SF-767-Art neu ist ala eine von den Arten, welche ^f wasserlösliche, basische antibiotisohe Substanzen erzeugt, und J wobei die SF-767-Art unter dem Gesichtspunkt der naturwissen-

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sohaftliohen Syatemkunde eine neue Spezie3 ist. Aus diesem Grunde ist diese SF-767-Art als Streptomyces mikrosporeus nov. sp. bezeichnet.

Die Eigenschaften der SF-767-Art sind veränderlich, so, wie es Üblicherweise bei anderen Streptomyoes beobachtet werden kann. So kann die SF-767-Art Varianten und Mutanten durch Behandlung mit verschiedenen bekannten Mutantenbildnern, wie z.B. Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, hochfrequente elektromagnetische Wellen, radioaktive Strahlen und Chemikalien usw. erzeugen. Alle natürlichen und künstlichen Varianten der SF-767-Art können demzufolge beim erfindungsgemäflen Verfahren benutzt werden, solange sie die Fähigkeit haben, die SF-767-Substanz, und zwar die SF-767-A-Substanz und die SF-767-L-Subatanz zu erzeugen.

Ggmaß dem erfindungagemäfien Verfahren kann die SF-767-Art in einem Kulturmedium gezüchtet werden, da· die Nährmittel enthält, die von üblichen Mikroorganismen benötigt werden. Als Nährmittelquellen können sämtliche bekannten Nährmittel verwendet werden, die bei der Züchtung von Streptomyoea benutzt worden sind. So sind zB. Glukose, Stärke, Glyzerin, Dextrin, Saccharose und dergleichen als Kohlenstoffquellen verwendbar. Sojabohnenmehl, Weizenkeimling, Fleischextrakt, Pep ton, getrocknete Hefe, Kaiswasser, Brennereilösung, Ammoniumaulfet, Natriumnitrat und dergleichen sind als Stickstoff quellen verwendbar. Falls erforderlich, können organische Salze wie Kalziumkarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate und dergleichen dem Kulturmedium zugesetzt werden. Weiterhin können solche organische und anorganische Stoffe dem Kulturmedium zugesetzt werden, welche das Wachstum der ■SF-767-Art unterstützen und die Erzeugung äer SF-767-A-oubstanz und SF-767-L-Substanz fördern. Ale Methode zur Zucht der SF-767-Art sind flüssige und teilweise flüssige Zuohtverfahren unter submersen, aeroben Bedingungen am vorteilhaftesten, ähnlich wie bei den Üblichen Verfahren zur Herstellung der be-

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•1925451

kannten Antibiotika. Die Kultivierung bzw. Zucht sollte unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden und die geeignete Fermentationstemperatur liegt im Bereich zwischen 25 - 35° G. ■· Zur Herstellung der SF-767-A-Substanz ist es häufig vorteilhaft, eine Fermentationstemperatur von 28⁰O oder in der Nähe davon zu verwenden. Zur Herstellung der SF-767-L-Substanz ist es vorteilhaft, eine Fermentationstemperatur von 3o°C oder in der Nähe davon zu verwenden. Unter diesen Fermentationebedingungen erreichen die Konzentrationen der SF-767-A-Substanz und der SF-767-Ir-Sub stanz in der Fermentationsbriihe ein Maximum am Ende von 2-5 Fermentationstagen, und zwar sowohl beim Schiittelkultivierverfahren als auch beim Tankkultiververfahren.

Zur Untersuchung der SF-767-A- und der SF-767-L-Substanz kann der Mycin-Testagar (pH 7·8) als Medium verwendet werden, und der Bacillus subtilis ATOC Nr. 6633 kann als {DestmikrοOrganismus verwendet werden. Beim Untersuchen der SF-767-A- und der SF-767-Ij-Sub stanz mit dem Bacillus subtilis ATCC Nr. 6633 als TestmikrοOrganismus und bei Benutzung des Mycin-Testagars wurde festgestellt, daß das Verhältnis zwischen dem Logarithmus der Konzentrationen der SF-767-A-Substanz oder der SF-767-L-Substanz und den Durchmessern der Hemmzone gegen den TestmikroOrganismus linear ist bei den Größen von 1 - 25tf/ml Bei diesen Größen betragen die Durchmesserwerte der Hemmzonen j-13 - 23 mm bei der SF-767-A-Substanz bzw. 12 - 22 mm bei der ·\ SF~767-*Ij-Substanz (gemäß der Petri schale-Methode) *

Die SF-767-A- und SF-767-Ii-Substanzen sind lösliche basische Substanzen, wie es sich aus ihren ©fcen änge™ führten physiko-chemisehen Eigenschaften ergibt, und sie können aus der Kulturbrlihe mittels irgendeiner der bekannten Methoden gewonnen werden., die allgemein zur Gewinnung von bekannten wasserlöslichen basischen Antibiotika wie Kanamycin, usw. zur Verfügung stehen.

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Zur Gewinnung von SF-767-A- und SF-767-Ii-Substanzen aus der Permentationsbruhe kann Aktivkohle als Absorptionsmittel verwendet werden» SF-767-A- und SF-767-L-Substanzen können durch Aktivkohle leichter auf der alkalischen Seite absorbiert werden. Wenn sie von der Kohle desorbiert bzw. rückgewinnen werden, ist es wirkungsvoller, daß die Desorption auf der sauren Seite durchgeführt wird, unter Verwendung von Wasser, verdünntem Alkohol oder verdünntem Aceton.

Die SF-767-A- und SF-7ö7-L-Substanzen können unter Verwendung eines Ionenaustauschharzes als Absorptionsmittel gereinigt werden. Als verfügbare Ionenaustaüschharze können z.B. vorzugsweise Eationenaustaüschharze wie Amberlit IRC 5o i (ein Produkt von Rhön & Haas Co., USA) mit NH,⁺-Form, Fa^x-Form oder H -Form. Die Blution kann gewöhnlich durchgeführt werden, indem eine wässrige Lösung von Säure, :Alkali oder Salz benutzt wird.

Die SP-767-A- und SF-767-L-Substanzen können weiterhin wirkungsvoll gewonnen werden, indem ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel einer wässrigen Lösung, welche die SF-767-A-Substanz oder deren Säureadditionssalz und/oder die SF-767-L-Substanz oder deren Säureadditionssalz enthält, zugesetzt wird, um eine aktive Substanz in der Form des Säureadditionssalzes oder der freien Base auszuscheiden.

Ein auf diese Weise erhaltenes Eöhpulver der

SF-767-A-Substanz und/oder der SF-767-L-Substanz kann, weiterhin durch Ionenaustauschchromatografie gereinigt werden mit ITH/¹"»Form-Amberlit CG- 5o (ein Produkt von Rhom & Haas Co., USA) oder OH^orm Dowex 1 χ 2 (ein Produkt von Dow Chemical Co., USA).

Wenn die SF-767-Art, d.h. wenn Streptomyces microsporeus, in einem Kulturmedium gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet bzw. kultiviert wird, werden die SF-767-A-

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Substanz und die SF-T 67-L- Sub stanz gleichzeitig erzeugt und in der Kulturbrühe angesammelt. Wie bereits beschrieben» gleichen sich die physiko-chemischen Eigenschaften der SF-7 67-1- Sub stanz und der SF-767-Ii-Substanz sehr, so daS diese beiden Stoffe zusammen aus der Kulturbrtlhe gewonnen werden können, und zwar durch Absorption mit Aktivkohle oder geeigne- - ten Kationenaustauschharzen oder durch Ausfällen bzw. Niederschlagen mit mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln.

Sobald eine Lösung oder ein Kohpulver, welche bzw. welches sowohl die SF-767-A-Substanz als auch die SP-767-I-Substanz enthält, erhalten worden ist, kann die SF-767-A-Substanz von der SF-T 67-L-Substanz isoliert werden, indem das bekannte Verfahren der Ionenaustauschchromatografie mit einem Kationenaustauschharz, wie z.B. HH.⁺-Form Amberlit GG- 5o (ein Produkt von Shorn &, Haas Co.-, USA) oder OH -Form j3o^T«vex 1x2 (ein Produkt von Dow Chemical Co.., USA) angewendet ??ird.

■ YIIe es sich aus der obigen Beschreibung ergibt, sind die SF-767-A- und S5¹-767-L-Substanzen wasserlösliche, basische Antibiotika und rechts-drehend. Unter den bekannten Antibiotika, die sich mit den SF-767-A- und 5F-767-L·-Substanzen vergleichen lassen, werden demzufolge erwähnt neomycin., Paromomycin, Kanamycin, Gentamicin, Tenemycin und Actinospactacin usw. Zum Vergleich bzw. zur Gegenüberstellung· dieser bekannten Antibiotika mit den SP-767-A- und SP-767-Ii-Substanzen sind ihre optischen Drehungen in der folgenden Tabelle 4 und ihre Papierchromatografien in der folgenden Tafel 5 aufgeführt.

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Tafel 4

	Sübstanznamen	freie Base
	SE~767-A- Substanz	+67°
	8M67-L- Substanz	+69°
to O	Neomycin A	+123°
to m a>
*>%, —*.	Ieomysin B	+ 58°
σ»	Neomycin C	+ 82°
»j	Paramomycin I	+ 64°
	Paramomycin II	+ 78°
	Kanamycin A·	+121°
	Kanamycin 3	+135Ö
	Kanamycin C	+126°
	Gentamicin A	+146°

Gentamicin C
Gentamicin C

Spezielle optische Drehung

f«*Y²⁵,

^^'D (in wässriger LSaung)

ET-azetyliert +6o°

+6o°

+158° + I6o° Literatur

TJmezawa et al; Index of Antibiotics from

Actinomycetes

(University of Tokyo Press and
University Park Press state College,
Pennsylvania, 1967) Seite 453

" ⁿ Seite

Seite
Seite
Seite

454 455 492 492

Kondoi Journal of Antibiotics series B, Seite 262, 1961

W
Il

Umezawa et alj Index of Antibiotics from

Aötinomycetes

(Universitiy of lokyo Pre ss and
University Park Press State College, Pennsylvania, 1967) Seite 308

^{11 M} Seite 308

" ^w Seite 3o8-

OD ^* CJI

Tafel 4 (Fortsetzung)

«ο
ο
co

OO
00

Tenemycin 2

Tenemycin 4 Tenemycin 5 Tenemycin 6 Actinospectaoin

_*. Kasugamycin JjJ Capreomycin Il -* Destomycin A Hygromycin B

+7.6'

+12o^l

+2,5' +7°.

+13o^l

+109- +1o7^c ₊95⁽

Seventh Interscience Conference on Antimicrobial agent and chemotherapy, abgehalten vom 25. - 27· Okt. 1967 in Chicago, USA

Umezawa et alj Index of Antibiotics from Actinomycetes (University of Tokyo Press and University Park Press State College, Pennsylvania, 1967,

Seite Io5

Tafel 5

ι ff

Substanzname "

3F-767-A-Substanz

SF-767-L-Substans

Neomycin A

co

ο Neomycin B

^ Neomycin C

Paromomy-

^ ein I

-* Paromomy-
^m ein II

-4: Gentamicin C

Lösungsmittel A

Sanderstrecke vom Ausgangspunkt (in cm)

3.1

2.5,

11.1

7.7 7.8 5.6

Ε.

767-L

1 .oo

1 .oo

7o 5o

Ϊenemy c inMischung

5.7

.15.6

4.8-9.0·

3·5ο 2.33

2.33

8.67

2.29n 4.29^j

Lösungsmittel	BX	S
Wanderstrecke vom Ausgangs punkt (in cm)	s:	.00
1o,9	1	.00
9-7	1	• 45
13·?	1	.00
10.6	1	. OO
10.7	. 1	.25
1 11.4	1

Lösungsmittel O"

11.3

17.3 10. y

(zwei Flecke)(zwei Flecke) (Sinzel-

fleck)

Kanamycin A , 4.7 Kanamycin B 9·ο. Kanamycin O 7«3

1-74 2.90 2.43

13.5 12.4 15-8

"fand e r s t r e c ke vom Ausgangs punkt (in cm)	5E3E R767-L	13
6.9	1.	00
5-7	1 .	75
17.3	2.	00
7-4	1.	00
7-5	1.	60
9.1	1.

T.25

1.98

i.2o

(Einzelfleck)

I.39 1 .'29

1.6.5

9.0

8.1
9.9

13i
11.

18.

1 .60

1.45 1.77

2.22 1.98 3O9

ro

- 3ο -

Zu Tafel 5 s

χ Lösungsmittel A: Bestehend aus n-Butanol, das mit

- Wasser, enthaltend 2 $ p-Toluolsulfonsäure, gesättigt ist. Dieses Lösungsmittel wurde in absteigender Papierchromatografie bei^einer 2o-stündigen Entwicklung verwendet.

χ Lösungsmittel B: Bestehend aus (I5:1o:3:12)

n-Propanol-Pyridin-13sigsäure-Tasser; dieses Lösungsmittel wurde in absteigender Papierchromatografie bei 2o-stiüiäiger Entwicklung verwendet.

χ Lösungsmittel G: Bestehend aus (6: 4-s 1 ϊ 3) n-Butanol-

Pyridin-Essigsäure-7/asser; dieses Lösungsmittel wurde in absteigender Papierchromatografie bei 7-tägiger Entwicklung verwendet.

XK ILj.'jtI Dieser Ausdruck stellt das Verhältnis der G-rö3e ä-vr ".Ys.nder- ^•»recke et»*¹ SSä^h? einer antibiotischen Substanz zu der Gr₁OSe der Wanderstrecke der 3P-767-L-Substanz dar. Zur Bestimmung von Ηγ5γ__Ιΐ" wurde eine Eenge SI¹-767-L-Sub3tanz als Bezugssubstanz jeder der antibiotisehen Substanzen zugefügt, und die Mischung wurde dann zur Entwicklung gebracht.

Die SF-767-A-3ubstanz wurde der Papierchromatografie unterworfen, und zwar entweder allein oder in Mischung mit Paromomycin I, Paromomyoin II oder Neomycin, wobei jeweils das Lösungsmittel A, das Lösungsmittel B bzw. das Lösungsmittel C wie oben erwähnt verwendet wurde. Die sich daraus ergebenden.

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BADORfGlNAL

Chromatogramme sind in Pig. 3 wiedergegeben. Die SP-767-ϊι-Substanz wurde in der gleichen Weise wie oben beschrieben der _t. Papierchromatografie unterworfen. Die sich daraus ergebenden Chromatogramme sind in Pig. 6 wiedergegeben.

Bei Gegentiber at ellung der spezifischen Drehungen, wie sie in Tafel 4 enthalten sind, wird es deutlich, daß die SF-767-A- und SF-767-L-Substanzen sich unterscheiden von der Kanamyoingruppe (A,B und C), Neomycin A, Gentamicingruppe (A, C- und 02)1 Tenemyoingruppe (2,4,5 und 6), Aotinospektacin, Kasugamycin, Kapriomycin II, Destomycin A bzw. Hygromycin B-. Bai einer Gegenttberstellung der Beweglichkeiten bzw. des Wanderungsvermögens bei der Papierchromatografie, wie es in ä Tafel 5 und den Fig. 3 und 6 dargestellt ist, wird es deutlich, daß sich die SF-767-A- und SF-767-L-Substanzen von allen ande ren Substanzen unterscheiden, d.h. der Kanamyoingruppe, der Tenemyoingruppe, der Gentamioingruppe, Paronionycin I und II sowie lieomycingruppe* Die εΡ-767-Α- und SF-767-L-Sub stanzen können weiterhin deutlich von Kasugamycin, Destomycin A bzw. Hygromyoin B unterschieden werden, und zwar hinsichtlich der oben erwähnten Toxizität und der Merkmale der antibakteriellen Spektren der SF-767-A- und SF-767-I-Substanzen. Die SF-767-A- und SF-767-L-Substanzen unterscheiden sich weiterhin von Capreomyoin II dadurch, daß das letztere eine maximale Absorption im ultravioletten Absorptionsspektrum hat. ^f

Die SF-767-A-Substanz unterscheidet sich von der SF-767-L-Substanz hinaiohtlioh der unterschiedlichen Verhaltensweisen bei der Ionenaustausohohromatografie und bei der Dünnschichtchromatografie mit Silikagel. So wurden die N-aoetylierte SF-767-A-Subatanz, die N-acetylierte SF~767-I»-Substanz und H-acetyliertes Paromomycin I miteinander verglichen, indem al« einer Dünnschichtchromatografie mit Silikafcel G unterworfen würden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tafel 6 auf geführt, und die sich daraus ergebenden Chromatogramme sind in lig. 7 dargestellt. Die Farbengebung der Chromatogramme erfolgte »ittele 1 obiger Scnwefelsäure unter Anwendung von

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	Lösungsmittel D*	3KB ^paromo	Tafel 6	XX •n paromo
	Wanderstrecke vom Ausgangspunkt (in cm)	1.00 1.o6 Loo	Lösungsmittel EÄ	Loo 0.89 0.78
Subatanzname	10.3 11.0 10.6	Wander strecke vom Ausgangspunkt (in cm)
N-acetylier- tea Paromo- myoin I N-acetylierte SP-767-A- Sub stanz N-acetylierte SF-767-1- Substanz	8.0 7.2 6.1

-*■ Erläuterung zu Tafel 6 und Fig. 7:

co x Lösungsmittel D, Zusammengesetzt aus (6:4:3); n-Butanol-Pyridin-Wasser; dieses Lösungs-

"** mittel wurde bei steigender Chromatographie bei einer Entwicklung von

15 Std. verwendet.

χ Lösungsmittel E, Zusammengesetzt aus (2:1:1) Tert-Butanol-Essigsäure-Wasser; dieses Lösungsmittel wurde bei steigender Chromatographie bei einer Entwicklung von 15 Std. verwendet.

Dieser Ausdruck stellt das Verhalten der Größe der Wand er strecke einer antibioti sehen Substanz in der Größe der Wand er strecke von N-acetylier-. fern Paramomycin I dar.

Ui I

XX

aromo"

■■CD

«cn

1926459

Bei der DUnnachichtohromatografie wurde jede der antibiotischen Substanzen in einer aolchen Weiae auf einer Linie plaziert, daß die Flecken derselben sich teilweiae miteinander überlappten, wie es in Fig. 7 dargestellt ist, und wobei das N-acetylierte Paromomycin als Bezugasubstanz diente.

Bei der Bereitung der N-acetylierten Stoffe der oben erwähnten antibiotisehen Substanzen wurde die Acetylie— rung durchgeführt, indem die antibiotisehe Substanz in Methanol in Suspension gegeben wurde, die Substanz bei Baumtemperatur und unter Zugabe einer ausreichenden Menge Essigsäureanhyärid gelöst wurde, die Reaktionslösung anschließend zwanzig Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde und anschließend Äther zugegeben wurde, um das H-aοetylierte Produkt auszuscheiden.

Wie es aus den obigen Vergleichen bzw. Gegenüberstellungen klar wird, können die SF-767-A-Substanz und die SF-767-L-Substanz als neue antibiotische Substanzen angesehen werden, die mit keinem der bekannten Antibiotika übereinstimmen.

Die Erfindung wird nunmehr anhand der folgenden Beispiele näherbeschrieben, auf die die Erfindung jedoch keineswegs beschränkt ist:

Beispiel 1:

Die SF-767-Art, nämlich Streptomyces microsporeus, wurde in 15 1 eines flüssigen Kulturmediums eingeimpft, das 2,o io Stärke, 2,5 ^ Sog'abohnenmehl, 1,o $ Weizenkeime. und o,25 io Natriumchlorid bei einem pH-Wert von 7 enthielt, wobei unter Belüftung drei Tage lang in einem Fermentiergefaß bei 28⁰C umgerührt wurde. Die Kulturbrühe wurde bei einem pH-Wert von 3 gefiltert und der Filterkuchen -wurde mit Wasser gewaschen. Das Waschwaaser wurde dem Filtrat zugeführt, um 15 1 einer Lösung (Stärke 3oy/ml) zu ergeben. Die Lösung wurde dann unter Zugabe von Hatriuinhydroxyd auf einen pH-Wert von 7

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eingestellt und dann durch, eine Säule geschickt, die 1,5 1 Amberlit IRC 5o (NH/'"-Form) enthielt, so daß die aktiven Substanzen an dem Ionenaustauschharz absorbiert wurden. Das Harz wurde mit 30 1 Wasser gewaschen und dann mit 0,5 IT wässriger Lösung von Ammoniak eluiert. Die zuerst durchlaufende Fraktion (2 1) des Eluats wurde abgeschöpft und 1 1 der fol- ' genden Fraktion des Eluats wurde gesammelt und durch Niederdruckverdampfung auf I00 ml konzentriert. Das sich daraus ergebende Konzentrat wurde durch Zugabe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, und der gebildete niederschlag wurde abgefiltert. Das die aktiven Substanzen enthaltende FiItrat wurde von oben her durch eine Kolonne geschickt, die 7o ml Amberlit CG 5o (NH^-Form) enthielt, und die Kolonne

; wurde anschließend mit 14o ml Wasser und 600 ml von o,o5 I wässriger Lösung von Ammoniak gewaschen. Danach wurden die aktiven Substanzen aus der Kolonne unter Verwendung von ο, Τ ΪΤ wässriger Lösung von Ammoniak eluiert. Etwa 2 1 des auf diese Weise erhaltenen Eluats wurden dann unter verringertem Druck

■ durch Verdampfung getrocknet, um 60 mg eines weißen Rohpulvers" - zu ergeben, das die SF-767-A-Substanz und die SF-767-L-Substanz

1 enthielt.

Beispiel 2;

Die SF-767-Art, nämlich Streptomyces microsporeus, wurde in 40 1 eines flüssigen Kulturmediums, das 3,5 $ verzuckerte -Stärke, 4,0 fa lösliches pflanzliches Protein, o,5 i° ^f Ammoniumsulfat, 0,4 $ Kaliumchlorid, o,o2 i> Dikaliumphosphat und 0,8 $ Kalziumkarbonat bei einem pH-Wert von 7,ο enthielt, eingeimpft, woran anschließend unter Luftzufuhr fünf Tage lang f bei 3o°C in einem Fermentiergefäß umgerührt wurde. Die. fer-_T montierte Brühe wurde bei einem pH-Wert von 7 gefiltert und der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen. Das Waschwass'er wurde dein. Filtrat zugesetzt, um 36 1 einer Lösung (Stärke j00Y/ml) zu ergeben. Diese Lösung wurde durch eine Säule geschickt, die 4,5 1 Amberlit IRC 5o (NH/^Form) enthielt, um die aktiven Substanzen von dem Ionenaustauschharz absorbieren

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zu lassen, das dann mit 4o 1 Wasser gewaschen und eluiert wurde, indem o,5 N wässrige Ammoniaklösung verwendet wurde. Die zuerst durchlaufende Fraktion (61) des Eluata wurde abge- * schöpft und 3 1 der daraus folgend durchlaufenden Fraktion de a Eluata wurden auf 3oo ml duroh Niederdruckverdampfung konzentriert. Das sich daraus ergebende Konzentrat wurde durch Zusatz von Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und der gebildete Niederschlag wurde abgefiltert. Bas die aktiven Substanzen enthaltende Filtrat wurde von oben duroh eine Kolonne geschickt, die 300 ml Amberlit CG 5o (NH/^-Form) enthielt, und die Kolonne wurde dann aufeinanderfolgend mit 45o ml Wasser j und 3 1 o,o5 N wässriger Ammoniaklösung gewaschen. Darauf er- j folgte die Eluierung der aktiven Substanz unter Verwendung von o,15 N wässriger Ammoniaklösung. Etwa 2,5 1 des erhaltenen Eluata wurden durch Niederdruokverdampfung getrocknet, um 5,5 g eines Rohpuders zu ergeben, der die SF-767-A- und SF-767-L- ! Substanzen enthielt* ' -

Beispiel 3» . j

2 g des die SF-767-A- und SF-767-L-Substanzen enthaltenden Rohpulvers, wie es gemäß dem Beispiel 2 erhalten worden war, wurden in too ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde duroh Zusatz von Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die Lösung wurde dann von oben durch eine Kolonne von .too ml Amberlit CG 50 (NH^-Form) geschickt und die Harzeäule bzw. Harzkolonne wurde aufeinanderfolgend mit I00 ml Wasser und mit ioo ml von o,o5 N wäesriger Ammoniaklösung gewaschen. Die aktiven Substanzen wurden αβηφτοη dem Harz eluiert, indem o,o75 N wässriger Ammoniaklösung durch die Kolonne be*· Säule geschickt wurden. Das Bluat wurde in Fraktioaen von jeweils 18 ml aufgefangen. Die Erektionen Nr. I03 - Nr. 17o wurden vereinigt und durch Niederdruckverdampfung als Trockensubstanz konzentriert, so daß 1,0t g eines weißen Pulvers erhalten wurde, das die SP-767-L-Substanz enthielt. Die SF-767-A-Substanz wurde zuerst in der Fraktion Nr. 23o eluiert und außerdem in den folgenden Fraktionen. Die Fraktionen Nr. 23o ~ Nr. 4o9 wurden zusammengefügt und durch Niederdruckver-

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dämpfung zu einer Trockensubstanz konzentriert, so daß 1,o1 g eines weißen Pulvers erhalten wurde, das die SF~767-A-Substanz enthielt.

Das die SF-767-L-Substanz enthaltende weifle Pulver (o,o1 g) wurde in 2o ml Wasser gelöst und die Lösung wurde durch eine Kolonne bzw. Säule von 18 ml Dowex 1x2 (OH"~-Form) geschickt, und die aktive Substanz wurde durch Entwicklung mit Wasser von der Kolonne bzw. Säule eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 13 ml gesammelt und die Fraktionen Nr. 2 - Nr. 3o wurden vereinigt und durch Niederdruckverdampfung zur Trockensubstanz konzentriert. Die freie Base der SF-767-L-Substanz wurde in einer Ausbeute von 77o mg erhalten.

Das die SF-767-A-Substanz enthaltende weiße

Pulver (1,ο1g)wurde in ähnlicher Weise in 2o ml Wasser gelöst und die Lösung von oben her durch eine Kolonne bzw* Säule von 2o ml Dowex 1x2 (OH~ Form) geschickt. Die aktive Substanz wurde durch Entwicklung mit Wasser von "dem Harz eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 13 ml geBammelt und die Fraktionen Nr. 3 - Nr. 29 wurden vereinigt und durch Niederdruckverdampfung zur Trockensubstanz konzentriert· Die freie Bas· der SF-767-A-Substanz wurde in einer Ausbeute von 7oo mg erhalten.

Beispiel At

Ein die SF-767-A-Substanz enthaltendes Rohpulver (85 mg) wurde in 5 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde durch Zusatz von verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die Lösung wurde dann von oben durch" eine Kolonne bzw. Säule von 1o ml für die Chromatografie geeigneter Aktivkohle gesohickt (ein Produkt von Mako Junyafca Co», Japan)« Die Entwicklung erfolgte unter der Verwendung von Wasser« Das Sluat wurde in Fraktionen von jeweils 5 ml gesammelt und die Fraktionen Nr. 3 - Nr. 25 wurden vereinigt und durch Fieder-

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druckverdampfung getrocknet und konzentriert. Das SF-767-A-Substanz-SuIfat wurde in einer Ausbeute von 7o mg erhalten.

Beispiel 5:

Ein die SF~767-Ii"-Substanz enthaltendes Bohpulver (8o mg) wurde in „5< ml Wasser gelöst, und die lösung wurde durch Zusatz von verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Diese Lösung "wurde von oben her durch eine Säule geschickt, die mit 1o ml für die Chromatografie geeigneter Aktivkohle gefüllt war (ein Produkt von Mako Junyaku Co., Japan). Die Entwicklung erfo^e dann mittels Wasser. Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 5 ml gesammelt und die Fraktionen Nr. 4 - Nr. 3ο wurden vereinigt und durch Niederdruckverdampfung getrocknet und konzentriert. Das SF-767-L-Substanz-Sulfat wurde in einer Ausbeute von ίο mg erhalten.

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Claims (4)

Patentansprüche

1. Antibiotische Substanz zur Hemmung bzw. Verhinderung des Wachstums von gram-positiven, gram-negativen Bakterien und säurefesten Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der Gruppe ausgewählt ist, welche SF-767-A-Substanz und SF-767-L-Substanz und Säuresalze davon enthält, da3 jede der SF-767-A- und SF-767-L-Substanzen eine Substanz ist, die in Wasser löslich ist, mäßig bis schwach löslich in Methanol und sehr schwach löslich bis unlöslich in Äthanol, Butanol, Aceton, Äthylacetat, Benzol, Äthyläther und η-Hexan, welehe basisch ist und mit Säuren Salze bildet, welche kein Absorptionsmaximum für ultraviolettes Licht von 21 ο m*- 36ö m«aufweist, welches eine positive Reaktion mit· Molisch-, Anthron- und Ninhydrinreagenzien und eine negative Reaktion mit Benedikt-, Pehling-, Sakaguschi-, Eisenchlorid-, Elson-Morgan- und Maltoireagenzien ergibt, welche nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff enthält, welche in Wasser rechtsdrehend ist, welche Aminogruppen, jedochjkeine Säuregruppen enthält, welche in Wasser eine schwach alkalische Lösung ergibt', in der die Substanzmoleküle bei pH 1,8 zur Kathode wandern, wenn mittels Papierelektrophorese getestet wird, und welche die Merkmale der Aminoglykosid-Antibiotika im infraroten Absorptionsspektrum aufweist j daß die weiteren Eigenschaften der SF-767-A- Sub stanz darin bestehen, daß die freie Base dieser Substanz ein weißfarbenes amorphes Pulverjbildet, welches keinen scharfen Schmelzpunkt hat, sich jedoch in der Fähe von 19o°C unter Aufschäumen zersetzt, welches eine Elementaranalyse von 45,06 $ C, 7,4o $ H, 8,9o <fo N und 39,o8 $ 0 ergibt, ein Molekulargewicht von 62o hat, das mittels der Dampfdruckgleichgewichtsmethode in wässriger Lösung bestimmt ist, welches die empirische Formel

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-a-M) -η + 67 * ' JJ

in 1#iger wässriger Lösung aufweist, und, wenn es in Form der freien Base in Kaliumbromid pelletiert, ist, charakteristische Absorptionsbanden im Infrarotbereioh des Spektrums bei den folgenden Wellennummern in cm"' hatt 34oo, 29oo, 1595» 146o, 135o, 113o (Absatz) und 1o1o; daß die weiteren Eigenschaften . der SF-767-L-Substanz darin bestehen, daß die freie Base der SF-767-L-Substanz ein weißfarbenes amorphes Pulver bildet, welches keinen scharfen Schmelzpunkt hat, sich jedoch in der Nähe von 192°G unter Aufschäumen zersetzt, welches folgende Elementaranalyse ergibt: 43158 $> C, 6,8o # H, 8,62 # N und 4oj75 fo O, welches ein Molekulargewicht von 682 hat, das mittels der Dampfdruckgleichgewichtsmethode in wässriger Lösung bestimmt ist. welches die empirische Formel C₀-.H _ACN_A0*c hat,

f s 25 o^ 4o 4 Io ^f

welches eine optische Drehung von wJ ^. +60 in

wässriger Lösung aufweist, und welches, wenn es in Form der freien Base in Kaliumbromid pelletiert ist, charakteristische Absorptionsbanden im Infrarotbereioh des Spektrums bei folgenden Wellennummern in cm"' aufweist: 342o, 291o, 1585_t 148o, 135o, 1130 (Absatz) und Ι0Ι0.

2. Freie Base, dadurch gekennzeichnet, daß sie die freie Base der im Anspruch 1 definierten SF-767-A-Substanz ist.

3. Säureadditionssalz, dadurch gekennzeichnet, daß esdie Säureadditionsverbindung der im Anspruch 1 definierten SF-767-A-Substanz ist.

4. Freie Base, dadurch gekennzeichnet, daS sie die freie Base der im Anspruch 1 definierten SP-767-L-Substanz ist.

5ο SäureadöltionssalZy dadurch ge-

tee&n zeichnet, daß es die Saureadditionaverbin- &wü.g äes* i$.'Anspruch 1 definierten ST?-767-l!~Stibstanz ist.

§i iο

HO

6; Verfahren zur Herstellung der SF-767-A-Substanz und der SF-767-Ii-Substanz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Art bzw. Rasse des Streptomyoes microsporeus in einem Kulturmedium kultiviert wird, welches assimilierbare Stickstoff- und Kohlenetoffquellen unter aeroben Bedingungen enthält» um die SF-767-A-Substanz und die SF-767-Ii-Sub stanz in der Kultur zu erzeugen und zu akkumulieren, und daß diese antibiotisohen Substanzen anschließend aus der Kultur gewonnen werden.

7· Verfahren naoh Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die SF-767-A- und SF-767-Ii-Substanzen aus der Fermentationsbrühe gewonnen und isoliert werden, indem die aktiven Substanzen an einem Kationenaus tauschharz der Ammoniumart adsorbiert werden, dieses Harz mit wässriger Ammoniaklösung eluuiert wird, die Fraktionen des die SP-767-A- und SF-767-Ir-Sub stanzen enthaltenden Eluats gesammelt werden, diese aktiven Fraktionen durch eine Kolonne bzw· Säule eines weiteren Kationenaustausehharzes des Ammoniumtyps hindurchgeschickt werden, um die aktiven Substanzen an diesem Harz zu adsorbieren, daß anschließend das Harz mit wässriger Ammoniaklösung elujtiert wird, die aktiven Fraktionen des die SF-767-A- und SF-767-L-Sub stanzen enthaltenden Eluate gesammelt werden, diese aktiven Fraktionen durch Niederdruokverdampfung getrocknet und konzentriert werden, um ein die SF-767~A- und SF-767-l-Substanzen enthaltendes Eohpulver zu erhalten» daß dieses fiohpulver in Wasser gelCet wird und dl· sich daraus ergebende wässrige Lösung durch eine Säule bzw* Kolonne eines Kationenharzes des Ammoniumtype geschickt wird, um die aktiven Substanzen an diesem Harz zu adsorbieren, daß die die SF-767-A-Sub stanz enthaltenden Fraktionen und die die SF-767-Ii-Substanz enthaltenden Fraktionen getrennt aus der Harzsäule bzw. -kolonne elu^iert werden, und zwar durch Entwicklung mit wässriger Ammoniaklösung» und daß anschließend die die SF-767-A-Substmz enthaltenden Fraktionen und die "SP*WM&-" Substanz enthaltenden Fraktionen durch Niederdruckverdampfung getrocknet und elu'ljert werden. .

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