DE1939045C - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 289-F - Google Patents

Description

verwendet und die Züchtung in Gegenwart von Ermüdung.

Anthrachinonmono- oder Anthrachinondisulfon- Die Bakterienstämme Nr. 613-15 (ATCC 21395)

säure oder deren Metallsalzen ausführt und das und Nr. 1-125 (ATCC 21396) wurden aus Str. phaeo-

Antibiotikum in üblicher Weise abtrennt. vertivillatus isoliert. Der Bakterienstamm Nr. 2-89

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- 15 (ATCC 21397) wurde als Streptomycesstamm aus kennzeichnet, daß man die Anthrachinonmono- einer bei Takatsuki City, Osaka, Japan, entnommenen bzw. -disulfonsäure oder deren Metallsalze in Bodenprobe isoliert. Der Bakterienstamm Nr. 2->·'-» einer Konzentration von 0,1 bis 2,0°/₀ (Gew./Vol.) (ATCC 21 397) weist eine auffällige Ähnlichkeit /u anwendet. Str. phaeoverticiilatus auf. Diese Bakterienstämi

ao vermögen das Antibiotikum 289-F in der KuIt₁ ·

flüssigkeit zu bilden, wenn sie in dem Medium, welc! ·.

eine Art von Anthrachinonsulfonat enthält, gezüch;· ι werden. Diese Bakierienstämme unterscheiden s !■

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung jedoch von Str. phaeoverticiilatus hinsichtlich . or des Antibiotikums 289-F durch Züchtung eines zur »5 morphologischen Eigenschaften, d.h., diese Stämr Familie Streptomyc»·, phaeoverticiilatus gehörenden bilden keine sekundären Wirbel, während Str. phai. Bakicriensiamms in einem kohlehydrat- und stick- verticillatus sekundäre Wirbel mit Spiralen bildet,
stoffhaltigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen. Die von Str. phaeoverticiilatus unterschiedlich·-.-!

Das erfindungsgemäß herstellbare Antibiotikum Züchtungsbedingungen der Stämme Nr. 613-'·. 289-F wirkt hemmend auf das Wachstum von gram- 3° Nr. 1-125 und Nr. 2-89 sind in der folgenden TjIh.'v. positiven und gramnegativen Bakterien; ferner eignet zusammengestellt; andere Eigenschaften sind dage.p·;; es sich zur Verhinderung des Ehrlich-Bauchwasser- nicht voneinander unterscheidbar.
sucht-Carcinoms bei Mäusen. Auf Grund dieser Ergebnisse wird vorgeschlagtr,

Das neue Antibiotikum 289-F wurde zuerst aus die Streptomyceten, die zu der obigen Bakterieneiner Kulturbrühe eines Bakterienstammes abgetrennt, 35 stammkatagorie gehören, als Str. phacoverticillaius welcher zur Gruppe der Streptomyces phaeoverticil- var. takatsukiensis zu bezeichnen,
latus, insbesondere Str. phaeov. var. takatsukiensis Falls man diese Stämme in einem gewöhnlichen

(ATCC 21395, 21396 und 21397) gehört. Medium züchtet, beobachtet man kaum die Bildung

Weitere Untersuchungen hinsichtlich der Bildung von 289-F in der Kulturbrühe.

von 289-F ergaben, daß sich in der Kulturbrühe zu- 4° Falls man jedoch diese Mikroorganismen in einem nächst ein anderes Antibiotikum, nämlich 289-FO, Medium züchtet, welches zusätzlich zu dem üblichen und dann erst 289-F bildet. 289-FO wird also durch Nährmedium noch Anthrachinonmono- oder Didiese Stämme, je nach der Regelung der Gärungszeit, sulfonsäure oder Metallsalze hiervon enthält, so bildet fermentativ gebildet. sich eine große Menge 289-F in der Kulturbrühe.

Sowohl 289-FO als auch 289-F werden als reine 45 Die Besonderheit des erfindungsgemäßen Verfahkristalline Substanzen erhalten. Verschiedene physi- rens besteht daher darin, daß man als Bakterienstamm kaiische und chemische Eigenschaften dieser Sub- ATCC 21395, 21396 oder 21397 verwendet und die stanzen sind im folgenden angegeben; die chemische Züchtung in Gegenwart von Anthrachinonmono-Struktur ist dagegen noch nicht bekannt. Es ergab oder Anthrachinondisulfonsäure oder deren Metallsich aber, daß sowohl 289-FO als auch 289-F durch 5° salzen ausführt und das Antibiotikum in üblicher Behandeln mit Essigsäureanhydrid dasselbe acetylierte Weise abtrennt.

Derivat ergeben. Aus dieser Tatsache und aus der Zweckmäßigerweise wendet man die Anthrachinon-

Untersuchung der Bildungsweise ist jedoch anzu- mono- bzw. -disulfunsäure in einer Konzentration nehmen, daß die chemischen Strukturen der beiden von 0,1 bis 2,0% (Gew./Vol.) an.
Substanzen einander ziemlich ähnlich sind und daß 55 Im folgenden werden die Gärungsbedingungen zum 289-FO in der ersten Stufe der Gärung als Stoffwechsel- Herstellen von 289-F beschrieben,
produkt des Mikroorganismus gebildet und dann durch Die Bildung von 289-FO in der Kulturbrühe erreicht

weitere Gärung in 289-F umgewandelt wird. nach 65 Stunden Gärzeit ihr Maximum. Danach

Die zur Bildung des erfindungsgemäßen Anti- verringert sich die Menge an 289-FO allmählich, da biotikums 289-F fähigen Mikroorganismen wurden ^6o dieses durch weitere kontinuierliche Gärung in 289-F von Streptomyces phaeoverticiilatus abgetrennt; ferner umgewandelt wird. Die Gärzeit für die Abtrennung wurden sie aus einer bei Takatsuki City, Osaka-Fu, von 289-F muß daher mindestens mehr als 65 Stunden Japan, entnommenen Bodenprobe abgetrennt. Unter- betragen. Zum Herstellen von 289-F züchtet man z. B. suchungen der charakteristischen Eigenschaften der Streptomyces phaeoverticiilatus var. takatsukiensis Mikroorganismen ergaben, daß sie als neue Varianten ⁶5 (z. B. ATCC 21395) in einem geeigneten wäßrigen ve η Streptomyces phaeoverticiilatus zu betrachten Medium, welches zusätzlich zu dem gewöhnlichen sind; sie wurden daher als Streptomyces phaeoverticil- Nährmedium noch Anthrachinonmono- bzw. -disullatus var. takatsukiensis bezeichnet und bei der Ameri- fonsäure oder deren Metallsalze enthält.

Tabelle I
Vergleich zwischen Str. phaeoverticillatus und Str. phaeoverticillatus var. lakatsukiensis

Medium

Str. phaeoverticillaius var. takatsukiensis Nr. 613-15 | Nr. 1-125

(ATCC 21395) (ATCC 21396)

Nr. 2-89
(ATCC 21397)

Str. phaeoverticillatus

Stärke-Agar

Glucose-Czapek-Agar

Sucrose-Czapek-Agar

Glucose-Asparagin-Agar

G: Mäßig

LM: Weiß bis schwach gelbbraun

SM: Weiß bis schwach gelbbraun

LP: Sehr schwach gelbbraun

G: Gut LM: Hellbraun

SM: Braun bis rotbraun LP: Braun bis rotbraun

G: Gut gerunzelt

LM: Schwach, weiß SM: Hellgelhbraun bis gelbbraun LP: Gelbbraun

G: Schwach

LM: Mäßig, weiß bis schwach

braungrau SM: Weiß bis elfenbein

LP: Keines

Morphologische
Eigenschaften

Hauptsächlich monoverticillus Spiräen

Hauptsächlich Spiräen G: Wachstum; LM: Luft-Myzel; SM: Suhstrat-Myzel; LP: Lösliches Pigment.

G: Mäßig

LM: Schwach, weiß bis hellbraungrau

SM: Farblos bis schwach gelbbraun

LP: Fast farblos

G: Gut

LM: Mäßig, weiß bis hellgelbgrau

SM: Hellgelbbraun bis stumpfes Gelb

LP: Stumpfes Gelb

G: Mäßig

LM: Schwach bis kärglich SM: Hellgelbbraun

LP: Hellgelbbraun

G: Mäßig LM: Kärglich

SM: Farblos bis sehr schwach

Ge'bbraun LP: Keines G: Mäßig
LM: Schwach, weiß

SM: farblos bis weiß
LP: keines

G: Gut
LM: Bräunlich weiß

SM: Braun
LP: Braun

G: Gut

LM: Schwach, weiß

SM: Weiß bis bräunlich weiß

LP: Schwach rotbraun

G: Schwach
LM: Kärglich bis keines

SM: Farblos bis weiß
LP: Keines
Hauptsächlich Spiräen

G: Cremeartig cremegelb LM: Weiß bis bräunlichweiß

SIw: Schwach gelbbraun bis

olivnußbraun LP: Schwach, hellocker

G: Cremeartig orangechamois LM: Weiß bis bräunlichweiß

SM: Chamois, körnig L?: Orangechamois

G: Beige bis zimtfarbig

LM: Weiß bis bräunlieh weiß SM: Rosabeige bis chamois

LP: Rosabeige bis chamois

G: Creme, orange, chamois LM: Weiß bis bräunlichweiß

SM: Chamois, körnig LP: Orangechamois Biverticülus Spiräen

CO W CD

5 6

Im Rahmen der Erfindung können die üblichen Durchmesser des Silicagels 0,05 bis 0,2 mm) wird

Medien zum Züchten von Streptomyces in stationärer ausgeführt unter Verwendung eines Gemisches aus

oder wäßriger Kultur angewendet werden. Praktisch Benzol und niedermolekularem Alkylalkohole als

wird jedoch das wäßrige Züchtungsverfahren für die Eluierungsmittel.

Gewinnung von 289-F bevorzugt. 5 Falls man Methanol als niedermolekularen Alkyl-

289-F läßt sich beispielsweise mit gutem Wirkungs- alkohol verwendet, kann man ein Lösungsmittelgrad unter aeroben Bedingungen und Rühren im gemisch aus Benzol-Methanol (Volumverhältnis 9:1 Verlauf von 3 bis 5 Tagen bei einer Temperatur von bis 7: 3) anwenden; vorzugsweise wird ein Benzol-25 bis 35°C, vorzugsweise 25 bis 30⁰C, durch Gärung Methanol-Gemisch im Volumverhältnis 8 : 2 angeherstellen, ίο wendet. Beispielsweise wird die Silicagelkolonne

Die allgemeinen Verfahren zum Züchten von anderen (Mallincrodt-Kieselsäure, 0,147 mm) mit dem Benzol-

Streptomycesstämmen lassen sich auch zum Züchten Methanol-Gemisch (Volumverhältnis 8 : 2) vorbereitet,

der erfindungsgemäßen Bakterienstämme anwenden. und dann wird das vorher in dem gleichen Lösungs-

Das Nährmedium enthält vorzugsweise die folgen- mittel aufgelöste Rohprodukt am Kolonnenkopf einden Bestandteile: Kohlenstoff, z. B. in Form von i₅ geführt und mit demselben Lösungsmittel eluiert. Stärke, Glucose, Maltose oder Gemischen hiervon; Während des Eluierens treten verschiedene Absorp-Stickstoff, z. B. in Form von Fleischextrakt, Peplon, tionsbanden von schwachgelb bis purpurrot auf. Die Soyabohnenmehl, Maiswasser, Erdnußmehl, Lein- jeweiligen Fraktionen werden in einer automatischen samenmehl, Ammoniumsalzen, Nitraten, Hefe und Fraktionsauffangvorrichtung aufgefangen und auf deren Gemischen; anorganische Salze, z. B. in Form ao ihre Farbreaktion mit 2°/₀igem Nickelacetat (in von Kaliumsalzen, Natriumsalzen, Phosphaten oder Methanol) untersucht. Die Fraktion mit dem 289-F Sulfaten, welche im Nährmedium in Ionen dissoziieren. ergibt hierbei eine bläulich bis purpurne und die Es können gegebenenfalls auch verschiedene Metall- Fraktion mit dem 289-FO eine graublaue Farbionen, wie z. B. Magnesium, Mangan, Zink, Kobalt reaktion.

oder Eisen, in geringer Menge oder in Spuren zu dem »5 Die einzelnen Fraktionen werden dann bei niedriger

Züchtungsmedium zugegeben werden. Temperatur unter verringertem Druck bis zur Trockne

Für die technische Herstellung hängt die bevorzugte eingedampft. Man erhält hierbei ein rohes kristallines

Zusammensetzung des jeweiligen Nährmediums von oder amorphes Pulver (289-F). Bei der Tonerde-

dem jeweils eingesetzten Streptomycesstamm ab, wie Säulenchromatographie wendet man vorzugsweise ein

dies auch bei der Herstellung von anderen Antibiotika 30 mit Wasser gesättigtes Gemisch aus niedermolekularem

unter Verwendung von anderen Streptomycesstämmen Alkylalkohol und niedermolekularem Alkylacetat als

der Fall ist. Eluierungsmittel an. Beispiele für brauchbare nieder-

Beispielsweise eignen sich die folgenden Gärungs- molekulare Alkohole sind Methanol oder Äthanol,

bedingungen zur Herstellung von 289-F. Als Essigester eignen sich z. B. Methylacetat, Äthyl-

35 acetat, Propylacetat oder Butylacetat.

Nährmedium _Dj_e beiden Lösungsmittel werden in den folgenden

Fleischextrakt 0,5 °/₀ Mengenverhältnissen angewendet.

Natriumchlorid 0,5°/₀ Benzol: ROH = 7:1 bis 4:1, vorzugsweise 7 : 1.

Calciumcarbonat 0,6^υ/₀

Soyabohnenöl 0,1 °/o 40 Die Arbeitsweise bei der Tonerde-Säulenchromato-

Pepton ' 0,5% graphie ist dieselbe wie bei Silicagel-Chromatographie.

getrocknete Hefe 0,3 °/„ Falls man 289-F bei der Säulenchromatographie in

Glucose 4,0°/₀ amorpher Form erhält, wird es aus Acetonitril um-

Natriumanthrachinon-2,7-disulfonat 0,5 °/₀ kristallisiert, wobei man orangegelbe Kristalle erhält.

45 Diese Kristalle werden dann erneut aus Methanol

Nach dem Einimpfen von Streptomyces phaeo- umkristallisiert, wobei man orangegefärbie nadelverticillatus var. takatsukiensis wird die Züchtung in förmige Kristalle aus reinem 289-F erhält. Die Eigenwäßrigem Medium bei einer Temperatur von 28°C schäften von 289-F werden im folgenden näher be unter aeroben Bedingungen 90 Stunden ausgeführt. schrieben. Da 289-F instabil ist, wurde versucht Das Abtrennen von 289-F aus der Nährbrühe 50 ein stabiles Derivat dieser Verbindung herzustellen wird wie folgt ausgeführt. In diesem Zusammenhang wurde gefunden, daß dii

Die Kulturbrühe wird abfiltriert, und das Filtrat acetylierte Verbindung sehr stabil ist und leicht zu wird durch eine mit einem Kationenaustauschharz Untersuchung der biologischen Aktivität verwende gefüllte Kolonne durchgeleitet. Das Eluat wird mit werden kann. Durch die Acetylierung werden di einem organischen Lösungsmittel extrahiert, und der 55 chemotherapeutischen Eigenschaften dieses Anti Lösungsmittelextrakt wird eingedampft, wobei man biotikums weiter verbessert und ihre Toxizität herab 289-F als Rohprodukt erhält. Gemäß einem anderen gesetzt.

brauchbaren Verfahren wird die Brühe nach dem Das neue Antibiotikum 289-F weist die folgende)

.Abfiltrieren direkt mit einem organischen Lösungs- physikalischen und chemischen Eigenschaften um mittel bei einem schwach alkalischen pH-Wert extra- 60 biologischen Wirkungen auf:
hiert, ohne daß eine Behandlung mit einem Kationen- .

austauschharz erfolgt; der Lösungsmittelextrakt wird w ^Knstalie

dann wie bei dem oben beschriebenen Verfahren ein- 289-F orangegelbe Nadeln (zuerst aus Acetonitr gedampft. und dann aus Methanol umkristallisiert).

Das 289-F enthaltende RoI produkt wird dann 65

weiter auf Silicagel oder Tonerde säulenchromato- w i>cnmelzpunkte

graphisch gereinigt. 289-F 211,5 bis 213,0⁰C (Zersetzung unmittelbi

Die Silicagel-Säulenchromatographie (bevorzugter nach dem Schmelzen).

(3) Elementaranalyse 289-F C 67,04 H 7,12 N 4,15

(4) UV-Spektrum

Das UV-Spektrum der Verbindung 289-F in Methanol ist in F i g. 2 dargestellt. Die Absorptionsmaxima und Absorptionskoeffizienten sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

ιημ (El*) 289· F 244 (E 807), 270 (Schulter), 434 (E 210)

(5) 1R-Spektrum

im (KBr) der Verbindung 289-F

(8) Papierchromatographie von 289-F

Rf

0,14
0,71

Lösungsmittel

Acetonitril Butylacetat Dibutyläther (3:1)

Sonstige Bedingungen

Filterpapier, entwickelt nach dem aufsteigenden Verfahren bei 2O⁰C

Die Rf-Werte wurden auf Grund eines gelben Tupfens oder durch Anfärben mit Nickelacetat erhalten.

289-F 3450, 1620, 1610, 1585

(6) Farbreaktionen von 289-F

(9)	Dünnschichtenchromatographie von 289-F	Sonstige Bedingungen
Rf	Lösungsmittel	auf Silicage! auf Silicagel
0,81 0,06	Äthanol/14°/Oiges Ammoniakwasser (4:1) Äthanol/Pyridin (4:1)

_a„f einem

durch

(10) Optische Drehung

mu"KupIe,ni.,a. bei ^

lischer Lösung.

(7) Löslichkeit von 289-F Löslich in: Methanol, Äthanol Aceton

Äthylacetat, Benzol, Chloroform, Acetonitril, wäßrige saure Lösung.

Schwach löslich in: Wäßriger alkalischer sowie neutraler Losung.

Sehr schwach löslich in: Wasser.

289-F

+456,7°

Bedingungen

l,5°/_oin Chloroform von 20⁰C

(11) Akute Toxizitäten

289-F
Iyomicin B₁

LD intravenös

12,5 bis 4,4 bis 5,5

mg/kg intra peritoneal

12,5 bis 12,5 bis 15,5

Versuchs tier

Maus Maus

(12) Antibiotische Aktivität

Staphylococcus aureus 209-P · ·

MHTococcus flavus

Sar.ma lutea: ATCC 9341 ....

Bacillus subtilis PCI-219

Eschcrichia coli B

Pseudomonas aeruginosa

Proteus vulgaris ·

Streptococcus pyogenes T-I Streptococcus pyogenes S-8 .. ■ Diplococcus pneumoniae DP-I Lactobacillus fermenti 36 .. ■■_ Mycobacterium tuberculosis W Candida albicans YU-1200 .. · Trichophyton interdigitale . · ·

Aspergillus niger

Xantosnonas oryzae

Shigella dysenteriae

Salmonella typhosa 901W ··· Minimale inhibitorisch wirkende Konzentration μg/ml 289-FO») 1 289-F**) | Acetyl 289-F**)

100 100 100 3,12
0,39
0,39
3,12

0,78

1,56
0,39
3,12

100 100 100 100

100

0,39 0,04 0,09 0,78 3,12 12,5

1,56 0,02 0,09 0,01 3,12 0,78 50,0

0,39 6,25 6,25

100 100

100 100

100

0,6 0,78 0,78 1,56 25,0

1,56 0,39 0,39 0,39 0,78 25,0

12,5 25.0

1,56

·) Bestimmt nach de» »* ·♦> Bestimmt nach dem Bll 205684/3«

ίο

(13) Antitumor-Aktivitäten für Ehrlich-Bauchwassersuchtcarcinom

Tumor	Minimale Konzentration für vollständige Inhibierung μg/Maus 289-F
Ehrlich-Bauchwassersucht- Carcinom 3 Tage nach Verabreichung 7 Tage nach Verabreichung	50 12

Aus der obigen Tabelle ergibt sich eine interessante anhaltende inhibierende Wirkung auf das Carcinom, wobei selbst bei Verabreicherung einer geringeren Dosis eine Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen zu einem späteren Zeitpunkt eintritt. Die obigen

Ergebnisse wurden nach dem folgenden Verfahren erhalten:

48 Stunden nach dem intraperitonialen Verabreichen des auf verschiedenen Konzentrationen verdünnten Antibiotikums wurden intraperitoneal 10 Millionen Bauchwassersucht verursachende Krebszellen eingeimpft. Dann wurde jeweils eine Bauchwassersuchtprobe nach der Verabreichung entnommen und die Probe verschmiert und mit Farbstoff angefärbt,

ίο Die angefärbten Proben wurden mit einer Kontrollprobe verglichen, und es wurde die zur vollständiger Inhibierung erforderliche Konzentration bestimmt, in welcher sich die Anzahl der Zellenzahl auf 0 und 5% der Vergleichszellen verminderte.

Zum Beweis der Neuheit des erfindungsgemäßer Antibiotikums 289-F sind in der folgenden Tabelk die Eigenschaften von ähnlichen bekannten Anti biotika aufgeführt. (Die angeführten Daten geber die Hauptunterschiede gegenüber den erfindungs

ao gemäßen Substanzen wieder.)

	R	Schmelzpunkt	LD 50	UV-Absorp-	Elcmentar-	Mole	IR-Ab-	I
				tionsmaxima	analyse	kular	sorption	I
		0C _	mg/kg	λ (E)	gefunden	gewicht	cm"1
Erfindungsgemäß
hergestellte Verbindung
289-F	211,5 bis 213,0	12,5 bis 20	244 (807)	N 4,51		1620
		(i. V.)		H 7,12	676,78	1610
		12,5 bis 20	270	C 67,04
		(i. p.)	(Schulter)
Bekannte Antibiotika
(Vergleich)
Iyomycin B,	>270	4,4 bis 5,5	234 bis 244 (500)	N 3,89	1100	1740
(The Journal of		Maus, i. v.	270 (330)
Antibiotics Α.,		12,5 bis 20
9 [3], S. 117 bis 123		Maus, i. p.	430 (96)
[1964])
Iomycin B4	>270	100	243 bis 244 (360)	N 8,94
(J. A. Α., 9 [3],		(Maus, i. p.)	265 (250)	H 5,81
S. 117 bis 123 [1964])			430(59)	C 55,30
Pluramycin A	177	12,5 bis 25	345 (672)	N 3,66		1744
(J. A. A., 9 [2],	(wird dunkel)	(Maus, i. p.)	265 bis 270	H 6,30
S. 75 bis 81 [1956])	(Kristalle		(Schulter)	C 66^83
	aus ÄtOH)
	200 bis 215
	(wird dunkel)
	(Kristalle
	aus ÄtOAc)
Rubiflavin	nicht	15	395	N 3,45	412
(Antimicrobial	kristallin	(Maus, i. p.)	(Schulter)	H 7,50	Tl*
Agents and				C 68,50
Chemotherapy 1964,
S. 68 bis 74)
Hedamycin	243 bis 245	0,3	245 (800)	N 3,76	743	1660
(Anti. Ag. & Chem.,	(Zersetzung)	^Maus,« p.)	260 bis 265	H 6,89		1630
1966, S. 606 bis 619)			(Schulter)	C 65,65
			430
Anthracidin
(Anti. Ag. & Chem.,
1963, S. 63 bis 67)
A	114 bis 116		233 (784)	N 3,91	452
			358 (465)	H 8,11
.	111 bis 112,5		233 (74η	C 66,49 N 3,69	397
		350 (390)	H 7,90
			C 63,64

11 12

Es wird angenommen, daß das Molekulargewicht Beispiel 2

des erfindungsgemäß hergestellten Antibiotikums „ . . . , . . . . _{lt u} · · λ i, w tri..m '

289-F etwa 600 bis 800 beträgt. Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch Natrium-

289-F ist also eine neue und brauchbare Verbindung. anthrachinon-ß-sulfonat an Stelle von Natriumanthra-Die Erfindune wird nun an Hand der folgenden 5 chinon-2,7-disulfonat verwendet wurde. Beispiele weiter erläutert. Die sterilisierte Nährlösung (151) wurde in eine

gläserne Gärungsvornchtung mit einem Fassungs-

_R ' s D i e 1 1 vermögen von 301 eingebracht und mit 1,5 1 Strepto-

myces phaeoverticillatus var. takatsukiensis Nr. 2-89

Es wurden 1501 einer Nährlösung der folgenden ₁₀ (atCC 21397) geimpft und bei 28 bis 30° C gezüchtet. Zusammensetzung hergestellt. Die Nährlösung wurde auf gleiche Weise wie im Bei-

Glucose 4% spiel 4 verarbeitet, wobei 4,5 g rohes Antibiotikum

Pepton 0'⁵% ²⁸⁹"^{F erllalten} wurden.

trockene Hefe 0,3% B e i s ρ i e 1 3

Fleischextrakt 0,5^u/₀ »5 ^v

Natriumchlorid". 0.⁵% ²'° R ß^emäß Beispiel 1 hergestelltes rohes Anti-

Calciumcarbonat °>⁶% biotikum 289-F wurden säulenchromatographisch

Natriumanthrachinon-2,7-disulfonat 0,5% mit aktivierter Tonerde gereinigt Die Kolonne wurde

durch mit Wasser gesättigtes Äthylacetat-Methanol

Diese Nährlösung wurde 30 Minuten bei 120⁰C *» (7:1) eluiert und das Eluat auf gleiche Weise wie im in einer 300-1-Gärungsvorrichtung sterilisiert. An- Beispiel 4 behandelt. Dabei wurden 350 mg rohes schließend wurde auf 28°C abgekühlt und mit 151 kristallines Antibiotikum 289-F erhalten. Die Eigen-Streptomyces phaeoverticiUatus var. takatsukiensis schäften des Produkts waren dieselben wie im Beispiel 1. Nr. 613-15 (ATCC 21305) geimpft. Die Nährlösung

wurde 90 Stunden bei 27 bis 28⁰C unter Rühren »5 B e i s ρ i e 1 4

und Luftzufuhr aseptisch gezüchtet. Die Gärbrühe _ . . . . , . . _L , _L . . _, t·

wurde mit Filtrierhilfe vermischt und filtriert. Nach Beispiel 1 wurde_ wiederholt, wobei jedoch der

dem Einstellen des pH-Wertes auf 8,2 bis 8,4 mit Bakterienstamm AlCCiLJVo an Stelle des uakwäßrigem Natriumhydroxid wurde das Filtrat mit terienstamms ATCC 21395 verwendet wurde. Durch ¹I seines Volumens an Chloroform dreimal extrahiert. 3<> Behandeln von 1501 Kulturlösunp, gemäß Beispiel 1 E)Ie Chloroformschicht wurde mit Wasser gewaschen, wurden 7,2 g rohes kristallines 289-F erhalten, mit Natriumsulfat getrocknet und bei vermindertem

Druck zur Trockne eingedampft. Nach Zugeben von Beispiels

Petroläther zu dem obigen Rückstand wurden etwa _ . . . . ,.,,., -.,,,O₁

40 g Antibiotikum 289-F enthaltendes Flohprodukt 35 Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch der Bakausgefällt. Dieses Rohprodukt (5 g) wurde in 30 ml terienstamm ATCC 21397 an Stelle des Bakterien-Benzol-Methanol (4:1) aufgelöst und auf eine Silica- Stamms ATCC 21 395 verwendet wurde. Durch Begel-Kolonne (2 8 χ 40 cm) gebracht, welche vorher handeln von 1501 Kulturlösung jiniäß Beispiel 1 mit Benzol-Methanol (4: 1) beschickt worden war. wurden 6,4 g rohes kristallines 289-F erhalten. Beim Fluieren mit demselben Lösungsmittel wurden 40

aus der Kolonne gelb bis purpurrot gefärbte Frak- Anwendbarkeit der erfindungsgemäß hergestellten

tionen eluiert. Die das Antibiotikum 289-F enthal- Verbindung 289-F zur Tumorbekämpfung

tcnden Fraktionen wurden durch papierchromato- Bekämpfung des Sarkoms 180

graphische Prüfung und durch Farbreaktion mit

2°/ieem methanolischem Nickelacetat ermittelt und 45 Subkutane feste Tumore des Sarkoms 180 bei gesammelt Der nach dem Abdampfen des Lösungs- dd-Mäusen wurden etwa 7 Tage nach der Transmittels bei vermindertem Druck unter 40°C ver- plantation entfernt. Ein Scheinehen dieses Tumors bleibende Rückstand wurde in einer geringen Menge wurde im Bereich der rechten Achselhöhle jeder Maus Äthylacetat aufgelöst. Nach Zugeben von Petroläther mittels eines Trokars eingepflanzt. Die Behandlung wurden rohe Kristalle aus dieser Lösung ausgefällt. 50 mit 289-F erfolgte jeweils 24 Stunden nach dem Ein Die Kristalle wurden anschließend mit Petroläther pflanzen des Tumors. Hierbei wurden an sieben auf gewaschen und getrocknet. Dabei wurden 917 mg cinanderfolgenden Tagen jeweils 1 mg 289-F pro k* rohes kristallines Antibiotikum 289-F erhalten. Nach Körpergewicht intravenös verabreicht, dem Umkristallisieren der rohen Kristalle aus Aceto- 40 Tage nach dem Einpflanzen des Tumors konn«

nitril wurden gelblichorange sandartige Kristalle er- 55 bei vier von zehn behandelten Mäusen keinerle halten Durch weiteres Umkristallisieren aus Me- Tumor mehr festgestellt werden, während bei dei thanol wurden orange oder gelblichorange Nadeln übrigen Mäusen zunächst eine Hemmung des Tumor mit einem Schmelzpunkt vun 211,5 bis 213,O⁰C Wachstums und dann eine starke Rückbildung de (Zersetzung nach dem Schmelzen) erhalten. Die Tumors beobachtet wurde.

übrigen Eigenschaften waren dieselben wie bereits 60 Unbehandelte Vergleichsmäuse verendeten dagegei beschrieben. ^{20 bis 30 Ta}ß^{e nach dem} Einpflanzen des Tumors.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

can Type CuKure Collection, RockvUle. Md., unter Patentansprüche: den Nummern ATCC 21395, 21396 und 21397 hinterlegt

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Einzelheiten dieser Mikroorganismen sind im fol-289-F durch Züchtung eines zur Familie Strepto- 5 genden beschrieben.

myces phaeoverticiilatus gehörenden Bakterien- Unter den 289-F bildenden Stämmen eignen sich

Stamms in einem kohlehydrat- und stickstoff- aus Str. phaeoverticiilatus NRRL 3021 sowie aus der

haltigen Nährmedium unier aeroben Bedingungen, obengenannten Bodenprobe abgetrennte Streptomyces-

dadurchgekennzeichnet, daß man als arten, welche als eine Variante von Str. phaeoverticil-Bakterienstaram ATCC 21395, 21396 oder 21397 io latus aufzufassen sind, besonders für den Zweck der