DE2065297C3 - Makrolid-Antibioticum SF-837-A tief 2 und dessen Diacetylderivat sowie Makrolid-Antibiotica SF-837-A tief 3 und SF-837-A tief 4 und deren Monoacetylderivate sowie pharmakologisch nicht giftige Säureadditionssalze der genannten Antibiotica und Verfahren zur Herstellung der Antibiotica SF-837-A tief 2, SF-837-A tief 3 und SF-837-A tief 4 - Google Patents

Makrolid-Antibioticum SF-837-A tief 2 und dessen Diacetylderivat sowie Makrolid-Antibiotica SF-837-A tief 3 und SF-837-A tief 4 und deren Monoacetylderivate sowie pharmakologisch nicht giftige Säureadditionssalze der genannten Antibiotica und Verfahren zur Herstellung der Antibiotica SF-837-A tief 2, SF-837-A tief 3 und SF-837-A tief 4

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DE2065297C3
DE2065297C3 DE19702065297 DE2065297A DE2065297C3 DE 2065297 C3 DE2065297 C3 DE 2065297C3 DE 19702065297 DE19702065297 DE 19702065297 DE 2065297 A DE2065297 A DE 2065297A DE 2065297 C3 DE2065297 C3 DE 2065297C3
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Takashi Kawasaki; Shomura Takashi; Ezaki Norio; Yokohama; Akita Eiichi Tokio; Inoue Shigeharu Yokohama; Fukatsu Shunzo Tokio; Amano Shoichi Kawasaki; Watanabe Hiroshj; Niida Taro; Yokohama; Kanagawa Tsuruoka (Japan)
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OR4
in der R1 den Rest — COCH2CH3, R3 ein Wasserstoffatom oder den Rest —COCH3 und R4 den Rest -COCH2CH3- oder -COCH2CH2CH, bedeutet und deren pharmakologisch nicht giftige Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung der Makrolid-Antibiotica SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß CH,
man den Stamm von Streplomyces mycarofaciens nov. sp., der unter der ATCC-Nr. 21 454 hinterlegt worden ist, in einem Nährmedium, das assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, in üblicher Weise unter aeroben Bedingungen kultiviert bzw. züchtet und die gebildeten Antibiotica nach üblichen Methoden aus der Kulturbrühe isoliert und anschließend voneinander trennt.
Die Erfindung betrifft das Makrolid-Antibioticum SF-837-A, und dessen Diacetylderivat der allgemeinen »rmel I
OR1
< Y
CH3 /
.O
• )\
CH, O
CHO
(X-H.,
CH3 ClI3
"n
OR,
O 'O
OH
OR4
in der R1 den Rest COCH2CH3. R-, und R, entweder je ein Wasserstoffatom oder den Rest — COCH3 und R4 „en Rest -COCH2CH2CH3 bedeutet sowie die Makrolid-Antibiotica SF-837-A., und SF-837-A4 und deren Monoacetylderivate der allgemeinen Formel 11
CHO
S CH, /
/-OCH3
f j[
CH3 O
in der R1 den Rest — COCH2CH3, R3 ein Wasserstoffatom oder den Rest —COCH3 und R4 den Rest -COCH2CH3 oder -COCH2CH2CH3 bedeutet, und deren pharmakologisch nicht giftige Säureadditionssalze sowie ein Verfahren zur Herstelluns der Antibiotica SF-837-A,, SF-837-A3 und SF-837-Ä4..
Es wurde gefunden, daß diese neuen antibiotischen Substanzen eine starke wachstumshemmende bzw. wachstumsverhinderndc Wirkung gegen grampositivc patogene Bakterien und gegen eitererzeugende Bakterien haben, die ansonsten gegen Antibiotica resistent sind. Ihre Wirkung wurde gegenüber einer Reihe von Mikroorganismen geprüft, wobei für einige das bekannte Kitasamycin zum Vergleich herangezogen wurde. Das Kitasamycin ist bekannt aus »Journal of
(111
H-'C /-0R4
O—
CH3
Antibiotics«. Bd. 6. S. 87 (1953). In diesen Versuchen wurde die minimale Hemmkonzentration in üblicher Weise mit der Brühen-Verdünnungsmethode unter is Verwendung von verschiedenen Kulturmedien bestimmt. Als Kulturmedien wurden benutzt:
1. Herzinfusion-Medium,
2. Glycerin-Bouillon-Medium.
3. Sabouraud-Medium.
Die Bebrütung erfolgte jeweils 24 Stunden bei 37 C. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen I und la zusammengestellt, wobei in der Tabelle Ia für einige Mikroorganismen die mit den 3ί Vergleichssubstanzen erhaltenen Werte angegeben sind.
Tabelle
Test-Mikroorganismen
Minimale Hemmkon/entnuion (meg ml)
Sl-'-Xr-Λ, OiaecUl- SF-837-Λ, Monoacelyl- SK-XiU-A4
SF-837-Λ,
Diaecn I-SF-837-Λ,
Monoiicctyl- verwendete SF-837-Aj' Kulturmedien
Staphylococcus aureus 209 P 0.39 0,78 0.39 0.78 0.39 0,78
Staphylococcus aureus 209 P, 0.39 0.39 0.39 0,39 0,39 0,39
resistent gegen Penicillin
Staphylococcus aureus 209 P. 0.39 0.78 0.39 0.39 0.78 0.78
resistent gegen Streptomycin
und A.249-Substanz
Staphylococcus aureus 209 P. 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 > 25
resistent gegen Novobiocin
Staphylococcus aureus 209 P.
resistent gegen Actinomycin
Staphylococcus aureus 209 P. 0.78 1.56 0.78 1.56 0.78 1.56
resistent gegen Kanamycin
Staphylococcus aureus Smith
Staphylococcus aureus
Tcrajima
Staphylococcus aureus. 0.78 1.56 1.56 3.125 1.56 3.125
resistent gegen Streptomycin.
Penicillin und Tetracyclin
Staphylococcus aureus 193
Hai-illus subtilis ATCC 6633 0.2 0.4 0.39 0.78 0.39 1,56
0.1 O.2 0.2 0.2 0.2 0.4
0.39 0.78 0.78 1.56 0.78 1.56
Fortsetzung
Test-Mikroorganismen
Minimale Hemmkonzentration (mcg mil
SF-837-A, Diacetyl- SF-837-A, Monoacetyl- 51--837-A4 Monoacetyl- verwendete
SF-837-A, SF-837-A.,
SF-837-A»
Kulturmedien
Sarcinulutea 0,05 0.1
Escherichia coli > 25 > 25
Pseudomonas aeruginosa > 25 :> 25
Proteus vulgaris >25 > 25
Klebsieila pneumoniae
Shigella dysenteriae
Mycobacterium 12.5 >25
smegmatis 607
Mycobacterium phlei
Candida albicans >25 >25
Penicillium chrysogenum >25 >25
Aspergillus niger
Saccharomyces cerevisiae
0.1 >25
>25 >25
>25
0,2
>25
>25
>25
>25
0.
>25
>25
>25
>25
0,1
>25 >25 >25
>25
■ — >25 >25 >25 ■>
>25 >25 >25 >25 3
>25 3
3
Tabelle Ia
Test-Mikroorganismen
Minimale Hemmkonzentration (meg'ml)
SF-837-A., Mono- SF-837-A4 Mono- Kitasa- Spira-
acctyl- acetyl- mycin rmcin
SF-X37-A., SF-837-A» (bekannt! !bekannt)
SF-837-A, Diacctyl-' SF-837"-A,
Staphylococcus aureus 209 P
Staphylococcus aureus Smith
Staphylococcus aureus Terajima
Bacillus subtilis ATCC 6633
Sarcina lutea
0.39
0.1
0.39
0.2
0.05
0.78
0.2
0.78
0.4
0.1
0.39
0.2
0.78
0.39
0.1 0,78
0.2
1.56
0.78
0.2
0,39
0,2
0.78
0,39
0,1
0,78
0,4
1,56
1,56
0,1
0,78 0,78 0,78 0,78 0,2
1.56 1.56 3.12 3.12 0.2
Aus den Werten der Tabellen I und 1 a geht die vorteilhafte Wirkung des Antibioticums SF-837-Ai und dessen Diacetylderivat sowie der Antibiotica SF-837-Aj und SF-837-A4 und deren Monoacetylderivate hervor. Es konnte nicht festgestellt werden, daß die bakterienverhindernde Aktivität des Antibioticums SF-837-A2 und dessen Diacetylderivat sowie der Antibiotica SF-837-A3 und SF-837-A4 und deren Monoacetylderivate durch Serum inaktiviert werden kann.
Die Toxizität des Antibioticums SF-837-A2 und dessen Diacetylderivat sowie der Antibiotica SF-837-A3 und SF-837-A4 und deren Monoacetylderivate bei oraler und parenteraler Verabreichung ist gering.
Bei oraler Gabe der genannten Substanzen an Mäuse beträgt der LD50-Wert 3100 mc ka bzw. 2900 msic
bzw. 2850 mg/kg.
Ferner wurde die antibakterielle Wirksamkeit in
vivo geprüft.
Hierbei wurden die zu prüfenden Verbindungen an
infizierte Mäuse verabreicht:
ICR-Mäuse wurden mit Streptococcus haemolyticus
Ti-125 Gr-A Type !-Rasse infiziert, die lOOmal größei
war als der LD50-Wert. Bei oraler Verabreichung dei so freien Basen SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A,
wurden ED50-Werte von 135 mg/kg bzw. 170mg/k£
bzw. 155 mg/kg festgestellt.
Weiterhin wurden mit den gleichen Substanzer
Mäuse behandelt, die mit Staphylococcus aureui Smith infiziert worden waren. Folgende Werte wurder erhalten:
Infektbakterien
Anwendung ED5n bei Mäusen (mg/kg)
SF-837-A, SF-837-Aj
SF-837-A»
Kitasamvcin
Staphylococcus aureus Smith
desel.
oral
subkutan
Aus den vorstehenden tabellarischen Zusammenstellungen zeigt sich deutlich die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Substanzen, da die anderen be-
110 46 155
145
230 86
kannten Antibiotica vom Makrolid-Typ wie Niddamy ein. Magnamycin und Spiramycin noch schlechter Ergebnisse liefern als Kitasamycin.
Die ED50-WcHc bei den vorstehend beschriebenen Versuchen wurden nach dem Litchficld-Wilcoxon-Verfahren berechnet.
Ferner wurde die therapeutische Wirkung des Diacetylderivales von SF-837-A2, des Monoacctylderivates von SF-837-A, und des Morioacetyldcrivates von SF-837-A4 in der folgenden Weise untersucht: eine wäßrige Suspension von Staphylococcus aureus Smith wurde ICR-Müuscn intraperitoneal in einer Dosierung injiziert, die lOOmal größer war als der LD50-Wert. 30 Minuten nach dieser Injektion wurden die infizierten Mäuse dann oral mit wäßrigen Suspensionen behandelt, die das betreffende Antibioticum und eine geringe Menge Gummiarabikum enthielten, und zwar in einer Menge von 0,2 mg, 1,0 mg, 2.0 mg, 4,0 mg. 6,0 mg, 8,0 mg und 12 mg Antibiotikum in je 0,5 ml Wasser.
In jeder Gruppe wurden auf diese Weise 10 Mäuse behandelt und nach der Behandlung 7 Tage gefüttert. Aus den Ergebnissen einer Reihe von Versuchen wurde festgestellt, daß die Acetylderivate (in der genannten Reihenfolge) ED50-Werte von 180 mg/kg bzw. 200 mg/kg bzw. 2Ö0 mg/kg ergeben. Die ED50-Werte wurden auch hier nach dem Litchficld-Wilcoxon-Verfahren berechnet.
Die Makrolid-Antibiotica SF-837-A2. SF-837-A3 und SF-837-A4 werden erfindungsgemäß dadurch hergestellt, daß man den Stamm von Streptomyces mycarofaciens nov.sp.. der unter der ATCC-Nr. 21 454 hinterlegt worden ist, in üblicher Weise in einem
Tabelle II
Nährmedium, das assimilierbare Stickstoff- und Kohlcnstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert bzw. züchtet und dann die gebildeten Antibiotica aus der Kultur abtrennt und anschließend voneinander trennt.
Der erstmals aus einer Bodenprobe isolierte und bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus Streptomyces mycarofaciens nov.sp., der uneingeschränkt bei der American Type Culture
to Collection, Washington D.C., unter ATCT Nr. 21 454 hinterlegt worden ist, hat folgende biologische Eigenschaften :
I Morphologische Beobachtung
1. Belüftetes Mycelium
Belüftetes Mycelium, erzeugt auf Glycerin-Czapeks· Agar, Glycerin-Calcium-Maleat-Agar und synthe tischem Stärke-Agar reichlich offene Spiralen.
2. Sporen
Die Sporen sind von kugelförmiger, ovaler odei
elliptischer Form, die Oberflächenstruktur ist dornij bzw. stachelig (verhältnismäßig dünnere und längen Stachel), und die Größe der Spore beträgt 0,5 bi:
0,7 Mikron zu 0,8 bis 1,0 Mikron.
II. Die Eigenschaften auf verschiedenen Kultur bzw. Nährmedien ergeben sich aus der folgender Tabellen.
Kulturmedium
Wachstum
Belüftetes Mycelium
Lösliches Pigment
Secrose-Czapek-Agar geringes Wachstum spärlich, kraus (kraus) keins
farblos, bis cremefarben weißlichgelb
Glycerin-Czapek-Agar dunkelbraun weiß bis cremefarben. keins oder sehr
teilweise mit Bildung schwachrosa
von gräulich gefärbten
und krausen Luftmycel
Krainsky-Glucose- hellbraun bis weiß, mit rose Anstrich keins oder
Asparagin-Agar rötlichbraun schwachbräunlichgelb
Ushinsky-Glucose- braun rn.it rötlichem rose bis lavendelfarben hellbraun
Asparagin-Agar Anstrich
Calcium-Maleat-Agar geringes Wachstum
prpmpfiirHcn		 keins keins
Glycerin-Calcium- hellbraun rose, allmählich keins
Maleat-Agar übergehend zu gräulich
(kraus)
Synthetischer dunkelbraun mit rose mit stark rötlichem keins
Stärke-Agar purpurnem Anstrich Anstrich, allmählich
übergehend in gräulich
(kraus)
Fleischbrühe-Agar gelblichbraun sehr spärlich, weiß keins
Glucose-Fleischbrühe- dick, gut und braun weiß bis gelblich keins
Agar bis dunkelbraun cremefarben
Glucose-Pepton-Agar braun spärlich, weiß keins
Tyrosin-Agar rötlichbraun weiß keins
Kartoffelschnipsel dick, gut und braun reichlich, gräulichbraun schwärzlichbraun
bis schwärzlichbraun
Kartoffclschnipsel braun weiß bis cremefarben braun an der Peripher
des Wachstums
Die BebrütuneMcmperaiiir betrug im allgemeinen, wenn nicht anders anpeueben. 2S C.
609 622/15
Fortsetzung
ίο
Kulturmedium
Magermilch
Ei
Wachstum
wachstum, hellbraun blaßbraun
Glucose-Czapek-Lösung Oberflächen- und
Boden wachst um blaßbraun blaßbraun
Loefflers koaguliertes
Serum
Gelatine (20 C)
Bennetts
cremefarben bis blaßbraun braun bis schwärzlichbraun kein Wachstum
Cellulose-Medium
Die Bebrütungstemperatur betrug im allgemeinen, wenn nicht anders angegeben, 28 C.
Belüftetes Mycelium Lösliches Pigment
spärlich, weiß kcins
keins
spärlich, weiß		 kcins
keins
keins keins
keins keins
rose mit rötlichem
Einschlaa		 hellbraun
III. Physiologische Eigenschaften
Bildung von Schwefelwasserstoff . .. negativ
Bildung von Tyrosinase negativ
Bildung von Nitrit positiv
Gerinnen von Magermilch positiv
Peptonisierung von Magermilch ... negativ
Hydrolyse von Stärke positiv
Verflüssigung von Gelatine positiv
(schwach) Zersetzung von Loefflers koagulier-
tem Serum negativ
Chromogene Wirkung negativ
IV. Verwendung von Kohienstoffqueilen 1. Geeignet
Glucose, Galactose, Fructose, Maltose, Lactose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Inosit. Mannose, Salicin. Natriumacetat, Natriumeitrat, Natriumsuccinat.
2. Zweifelhaft Arabinose und L-Rhamnose.
3. Nicht zu verwenden
Xylose, Saccharose, Raffinose, Dulcit, Sorbit. Mannit und Cellulose.
V. Wachstumstemperatur: 15 bis 380C.
Die obenerwähnten mikrobiologischen Eigenschaften der die Substanzen SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4 erzeugenden Rasse (im folgenden als l$F-837-Rasse bezeichnet) können wie folgt zusammen-
tefaßt werden: Der Sporenträger ist spiralförmig, die pore ist stachelig. Aus synthetischen Kultur- bzw. faährmedien kann ein cremefarben- bis braun- bis tötlichbraungefärbtes Wachstum beobachtet werden, Ivobei ein rosegefärbtes Luftmycelium und ein krauses graugefärbtes Luftmycelium gebildet werden. Es kann keine wesentliche Bildung an löslichem Pigment beobachtet werden, während die Bildung von löslichem Pigment mit hellbrauner Farbe bei einer betchränkten Gruppe synthetischer Kulturmedien beobachtet werden kann. Bei organischen Kulturmedien %'ird andererseits im allgemeinen ein braungefärbtes Wachstum beobachtet unter Bildung von weiß- oder
cremfarbengefärbtem Luftmycelium, jedoch ohne BiI-dung eines löslichen Pigmentes. Bei Kartoffelschnitzeln wird jedoch reichlich Luftmycelium von gräulichbrauner Farbe gebildet und die Bildung von schwärzlich gefärbtem, löslichem Pigment beobachtet.
Im Vergleich zur Beschreibung von Waksman (Waksmans »The Actinomycetesi Bd. 2. 1961) ist zu erkennen, daß die obengenannten Kultureigenschaften der SF-837-Rasse teilweise in der Nähe "der Eigenschaften der Fradiae-Artcn. der Ruber-Arten und Flavus-Arten des Genus-Strcptomyces liciien.
Da die SF-837-Rasse negativ bei der Melanin-Bildung ist und die Bilduna von Luftmycelium von rosa Farbe oder Anstrich "zcim, wird die SF-837-Rasse zuerst mit den Rassen der Fradiae-Arten verglichen, nämlich Streptomyces fradiae. Streptomyces lundus, Streptomyces roseus und Streptomyces fuscus. Die SF-837-Rasse unterscheidet sich von den Rassen der Fradiae-Arten dadurch, daß bei der SF-837-Rasse das Luftmycelius mit rosa Farbe oder Anstrich zeitweilig in der Anfangsstufe der Bebrütuni: auftritt und in vielen Fällen während des mittleren und späteren Stadiums der Bebrütung sich in ein uraueefarbtes und krauses Luftmycelium verändert, "während die rosa Farbe oder der rosa Anstrich, die bzw. der bei den Rassen der Fradiae-Arten beobachtet wird, sehr stabil so ist. Das Luftmycelium von Streptomyces fradiae ist gradlinig und unterscheidet sich von der Spirale der SF-837-Rasse. Streptomyces fradiae unterscheidet sich auch deutlich von der SF-837-Rasse dadurch, daß Mreptomyces fradiae eine reichliche Bildune von Luitmycelium auf Saccharose-Czapek-Aear und ein farbloses Wachstum auf Stärke-Agar zeigt.
Die SF-837-Rasse unterscheidet sich "von Streptomyces fuscus und Streptomyces luridus dadurch, daß Mreptomyces fuscus nicht die Spiralbildung hat, oo wahrend Streptomyces luridus die Spiralbildung nur bei einer begrenzten Gruppe von Kulturmedien aufweist, wahrend die SF-837-Rassc auf vielen Kulturmedien cmc ergiebige Spiralbildunc zeict. Streptomyces roseus ist mit der SF-837-Rasse insoweit verg'eichhar. als die Spiralbildunii beobachtet werden Kann, wobei diese beiden sich jedoch deutlich dadurch voneinander unterscheiden, daß Streptomyces roseus ein larbloses Wachs.um auf synthetischem Stärke-
Agar zeigt, während es jedoch nicht die Bildung von Luftmycclium auf Kartoffelschnitzei aufweist.
Da die SF-837-Rasse negativ bei der Melanin-Bildung ist und ein Wachstum von roter Farbe oder rotem Anstrich zeigt, wird die SF-837-Rasse zweitens verglichen mit Strcptomyces albosporeus. Streptomyces erythraeus, Strcptomyces niveoruber und Streptomyces purpurascens usw., die zu den Ruber-Arten gehören.
Streptomyecs niveoruber unterscheidet sich deutlich von der SF-837-Rasse dadurch, daß die Oberflächenstruktur der Spore der zuerst erwähnten Art gleichmäßig ist, während diejenige der zuletzt erwähnten Art stachelig ist. Streplomyces albosporeus unterscheidet sich von der SF-837-Rasse weiterhin dadurch, daß Streptomyces albosporeus Luftmycelium bildet, das hauptsächlich gradlinig ist, wobei ein ausgeprägt rotgefärbtes Wachstum auf Sucrose-Czapek-Agar und auf Glycerin-Calcium-Maleat-Agar vorhanden ist, während kein Luftmycelium auf Stärke-Agar gebildet wird. Streptomyces erythraeus stimmt mit der SF-837-Rasse insoweit nicht überein, als Streptomyces erythraeus auf Sucrose-Czapek-Agar und auf Kartoffelschnitzcl-Agar ein rotgefärbtes Wachstum zeigt, während ein cremefarbenes Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar und synthetischem Stärke-Agar vorhanden ist. auf denen die SF-837-Rasse ein Wachstum mit rötlichem Anstrich zeigt. Streptomyces purpurascens stimmt mit der SF-837-Rasse hinsichtlich der stacheligen bzw. faserigen Struktur der Sporenoberfläche überein, wobei sich jedoch Streptomyces purpurascens von der SF-837-Rasse dadurch unterscheidet, daß die zuerst genannte Art deutlich lösliches Pigment von roter Farbe oder rotem Anstrich auf synthetischem Kulturmedium bildet, während die SF-837-Rasse kein solches lösliches Pigment aufweist.
Die SF-837-Rasse wird weiterhin mit Streptomyces microflavus und Streptomyces rosefiavus verglichen, die zu den Flavus-Arten gehören und von denen angenommen wird, daß sie in enger Beziehung zu der SF-837-Rasse stehen. Wie die Kultureigenschaften es zeigen, liegen Streptomyces microflavus und Streptomyces roseoflavus hinsichtlich gewisser Punkte nicht bei der SF-837-Rasse, wobei jedoch die beiden zuerst genannten Rassen Sporen bilden, deren Oberflächenstruktur gleichmäßig bzw. glatt ist (H. D. T r e s η e r und andere, »Journal of Bacteriology«. Bd. 91. S. 1998 bis 2005, 1966), was einen deutlichen Unterschied zur stacheligen bzw. faserigen Sporenstruklur der SF-837-Rasse bedeutet.
Es ergibt sich somit, daß keine Rasse unter den bekannten Arten des Genus Streptomyces gefunden werden kann, die mit der SF-837-Rasse übereinstimmt.
Andererseits sind die neuen antibiotischen Substanzen SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4, die mittels der SF-837-Rasse erzeugt werden, typisch für basische makrolide Antibiotica. Von den neuen erfindungsgemäßen antibiotischen Substanzen zeigt das SF-837-Ä2 ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 232 πΐμ im ultravioletten Spektrum, woraus geschlossen werden kann, daß diese Substanz ein Antibioticum der gleichen Art ist wie Leucomycin, Josamycin. Spiramycin, Miamycin und Tertiomycin. Die Substanzen SF-837-A3 und SF-837-A* zeigen außerdem ein hohes Absorptionsmaximum in der Nähe der Wellenlänge von 280 ma im ultravioletten Spektrum, woraus geschlossen werden kann, daß diese beiden Substanzen Antibiotica der gleichen Art sind wie Niddamycin, Carbomycin B, Tylosin, Relomycin und Macrocin.
Es bestehen deutliche Unterschiede zwischen den morphologischen Eigenschaften der SF-837-Rasse und den bekannte Antibiotica erzeugenden bekannten Mikroorganismen wie aus der folgenden Tabelle 111 hervorgeht.
Tabelle III
Gebildete
Anlibioiica
SF-837-A2-SF-837-A.r
SF-837-A4-Substanz
Leucomycin
.Iosamycin
Spiramycin
Miamycin
Tertiomycin
Tertiomycin
Carbomycin B
Tylosin
Macrocin
Relomycin
Mikroorganismus
Lufi-
mycclium
Oberflächen struktur der Spore
SF-837-Rasse Spirale stachelig
Streptomyces
kitasatoensis
Streptomyces
narboensis var.
josamyceticus
Streptomyces
ambofaciens
Streptomyces
ambofaciens
Streptomyces
eurocidicus
Streptomyces
albireticuli
Streptomyces
halstedii
Streptomyces
fradiac
Streptomyces
fradiae
Streptomyces
hygroscopicus
Quirl
geradlinig
Spirale
Spirale
Quirl
Quirl
Spirale
geradlinig geradlinig Spirale
glatt glatt
glatt glatt glatt glatt glatt glatt glatt glatt
Die SF-837-Rasse unterscheidet sich auch dcutlicr von dem Niddamycin erzeugenden Mikroorganismu; Streptomyces djakartensis (der in der deutscher Patentschrift 10 77 381 beschrieben ist), von dem di< Sporenoberflächenstruktur nicht beschrieben ist, wo bei der Unterschied darin liegt, daß Streptomyce; djakartensis bei der Melaninbildung positiv ist. wöbe jedoch weder eine Peptonisierung oder Koagulierun; von Magermilch auftritt.
Die obengenannten mikrobiologischen Vergleich! und Betrachtungen haben ergeben, daß die SF-837 Rasse nicht nur ein neuer Mikroorganismus ist. de die betreffenden basischen makroliden Antibiotic; erzeugt, sondern auch, daß die SF-837-Rasse sich voi allen bekannten Rassen selbst vom Gesichtspunkt de naturwissenschaftlichen Systemkunde aller Actino myccten unterscheidet. Daher wurde diese SF-837 Rasse als Streptomyces mycarofaciens nov. sp. be zeichnet.
Die SF-837-Rasse hat Eigenschaften, die zu Verände runüen neicen. wie es üblicherweise bei andere!
Streptomyces beobachtet »verden kann. So kann die SF-837-Rasse beispielsweise Varianten und Mutanten bilden, wenn sie mit verschiedenen bekannten Mutantenbildnern behandelt wird, z. B. ultravioletten Strahlen, Röntgenstrahlen, hochfrequenten magnetischen Wellen, radioaktiven Strahlen, Chemikalien.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der Weise durchgeführt, daß die SF-837-Rasse nach bekannten Methoden in einem Kultur- bzw. Nährmedium gezüchtet bzw. kultiviert wird, das Nährstoffe enthält, die von üblichen Mikroorganismen benutzt werden. AJs Nährstoffquellen lassen sich sämtliche bekannten Nährstoffe verwenden, die üblicherweise zur Züchtung bzw. Kultivierung von Streptomyces-Arten bekannt sind. Als Kohlenstoffquelle können beispielsweise benutzt werden: Glucose, Stärke, Glycerin, Dextrin, Sucrose bzw. Saccharose, verzuckerte Starke, Melasse. Als Stickstoffquelle können beispielsweise verwendet werden: Sojabohnenmehl, Weizenkeimlinge, Fleischextrakt. Pepton, Maiswasser, lösliches pflanzliches Protein, Trockenhefe, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat. Falls notwendig, können dem Kultur- bzw. Nährmedium anorganische Salze wie Calciumcarbonat. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate zugegeben werden. Zusätzlich können solche organischen und anorganischen Stoffe zugesetzt werden, die das Wachstum der SF-837-Rasse fördern und die Bildung mindestens einer der Substanzen SF-837-A2,SF-837-A3 oder SF-837-A4 beschleunigen.
Als Verfahren zur Züchtung oder Kultivierung der SF-837-Rasse ist die Flüssigkultur und insbesondere die Flüssigkultur unter submersen aeroben Bedingungen am vorteilhaftesten, und zwar in ähnlicher Weise wie bei den üblichen Verfahren zur Herstellung der bekannten Antibiotica. Die Zucht bzw. Kultur wird unter aeroben Bedingungen bei einer Fermentationstemperatur von etwa 20 bis 30'C durchgeführt. Für die handelsmäßige oder labormäßige Erzeugunc der Substanzen SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4 ist es jedoch häufig vorzuziehen, das Züchtungsverfahren bei einer Temperatur in der Nähe von 28° C durchzuführen. Unter diesen Bedingungen erreicht die Konzentration der Substanzen SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4 in der Kulturbrühc ein Maximum am Ende einer Fermentationszeit von 2 bis 4^ 5 Tagen, und zwar entweder in Schüttelkulturcn oder Tankkulturen.
Als hauptsächliches Stoffwechselprodukt von Streptomyces myearofaciens nov. sp. ATCC Nr. 21.454 wird dabei die Substanz SF-837 gebildet, während die Substanzen SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4 in kleineren Anteilen gebildet werden, und zwar in der Größenordnung, die etwa 5 bis 20 Gewichtsprozent der Menge an Substanz SF-837 entspricht.
Die Isolierung der Substanzen SF-837-A2. SF-837-A3 und SF-837-A4 aus der Kultur kann auf verschiedenen Weizen erfolsien.
Die Substanzen SF-837. SF-837-A2. SF-837-A., und SF-837-A4 sind sowohl in der festen Phase, die Mycelkuchcn enthält, als auch in der flüssigen Phase der Kultur vorhanden. Die Kultur kann in bekannter Weise filtriert werden, um den Filterkuchen (d. h. die feste Phase, die Mycelkuchen enthält) und das Filtrat (d. h. die flüssige Phase der Fermentationsbrühc) getrennt zu erhalten. Die in dem Filtrat vorhandenen 6s Aktivstoffe können mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel unter neutralen oder schwach alkalischen Bediniiunnen extrahiert werden, z. B. mit Äthylacetat, Butylacetat, Chloroform, Benzol, Äthyläther, Methylisobutylketon oder Butanol. Die in dem Filterkuchen vorhandenen Aktivstoffe können mit angesäuertem Wasser extrahiert werden oder mit einem, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol und Aceton. Wahlweise kann die Kultur direkt mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel ohne vorhergehende Filtration des Mycelkuchens extrahiert werden, so daß die Aktivstoffe unmittelbar aus der Kultur in das verwendete organische Lösungsmittel übergehen.
Die Aktivstoffe, die in Lösung in das organische Lösungsmittel übergeführt worden sind, können dann mit angesäuertem Wasser wieder extrahiert werden. Der anfallende saure Extrakt kann anschließend neutral oder durch Zugabe von basischen Stoffen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat schwach alkalisch gemacht werden, woran sich eine Rüttel- bzw. Schüttelbehandlung mit einem entsprechenden organischen Lösungsmittel anschließt, so daß die Aktivstoffe wieder in die organische Lösungsmittelphase übergehen. Indem diese Operation der Rück- bzw. Umkehrextraktion wiederholt wird, können bis zu einem gewissen Umfang Verunreinigungen von den Aktivstoffen getrennt werden. Der organische Lösungsmittelextrakt kann unter verringertem Druck bis zur Trockne eingeengt werden, wobei ein Rohpulver gewonnen wird, das die Substanzen SF-837, SF-837-A2, SF-837-Aj und SF-837-A4 enthält. Die Lösung de~r Aktivstoffe in dem angesäuerten Wasser kann wahlweise entweder gefriergetrocknet werden, um die Säureanlagerungssalze der Aktivstoffe zu erhalten, oder die wäßrige Lösung kann neutral oder schwach alkalisch gemacht werden, so daß die Aktivstoffe in Form der freien Basen ausfallen.
Da die Substanzen SF-837, SF-837-A2, SF-837-A, und SF-837-A4 von basischer Natur sind, kann die Kultur oder deren Filtrat oder eine Lösung der Aktivstoffe auch mit Ionenaustauschern behandelt werden, z. B. einem Ionenaustauschharz wie Amberlite IRC-50 oder einer Ionenaustauschcellulose, wobei die Aktivstoffe von dem Ionenaustauscher adsorbiert werden, der anschließend mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert wird.
Das anfallende Rohpulver, das die miteinander vermischten aktiven Substanzen enthält, kann weiter durch Extraktion mit einem entsprechenden organischen Lösungsmittel gereinigt werden, z. B. mit Benzol, das die vorhandenen Substanzen SF-837, SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4 löst oder durch Waschen mit einem anderen Lösungsmittel, z. B. Petroläther, Ligroin oder η-Hexan, das die Substanzen SF-837, SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4 kaum oder nicht, die Verunreinigungen jedoch gut löst, und /oder durch Zugabe von Petroläther, Ligroin oder η-Hexan zu einer Lösung der Aktivstoffe in einem organischen Lösungsmittel wie Benzol.
Auf diese Weise erhält man ein gereinigtes Gemisch der Substanzen SF-837. SF-837-A2, SF-837-A, und SF-837-A4, wobei die Gesamtmenge der drei letztgenannten aktiven Substanzen in der Größenordnung von 5 bis 20 Gewichtsprozent, bezogen auf den Anteil Substanz SF-837. liegt.
Das ucrcininte Gemisch der Substanzen SF-837. SF-837-A,, SF-837-A., und SF-837-A4 kann direkt mil Hilfe üblicher Methoden in ein Gemisch der ent-
t.
/rs
sprechenden Säureanlagerungssalze umgewandelt werden. Ferner kann man das gereinigte Gemisch der freien Basen mittels eines üblichen Acetylierungsverfahrens, z. B. durch Lösen in Pyridin, Behandlung der Lösung mit Essigsiiureanhydrid bei Raumtemperatur oder bei einer geringfügig höheren Temperatur über einen ausreichend langen Zeitraum, auch in ein Gemisch der Acetylderivate überfuhren; man erhält dabei das Diacetylderivat von SF-837 und der Substanz SF-837-A-, und die Monoacetylderivate der Substanzen SF-837-A·, und SF-837-A4.
Für die Reinigung und Trennung der Substanzen SF-837, SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4 eignet sich jedes bisher Tür die Reinigung und Trennung von makroliden Antibiotica angewendete bekannte Ver- ,5 fahren.
Um die Substanzen SF-837, SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4 voneinander zu trennen, sind chromatographische Verfahren geeignet, wobei ein geeignetes Adsorbens, z. B. aktiviertes Aluminiumoxid oder SiIikagel und ein geeignetes Entwicklungslösungsmittel, oder verschiedene Arten von Gegenstromverteilungsmethoden entweder allein oder in Kombination angewendet werden. So kann es zur Isolierung der Komponenten zweckmäßig sein, das gereinigte Gemisch der freien Basen zuerst einem Gegenstromverteilungsverfahren zu unterwerfen, in welchem eine Fraktion, die reich an Substanz SF-837 ist, und eine weitere Fraktion, die reich an einem Gemisch der Substanzen SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4 ist, gewonnen wird und diese beiden Fraktionen dann getrennt über Silikagel oder Aluminiumoxid zu chromatographieren, um eine vollständige Isolierung der einzelnen Substanzen voneinander zu erreichen.
Bei der Trennung der Substanzen SF-837, SF-837-A2, 3s SF-837-A3 und SF-837-A4 mittels Chromatographie über Aluminiumoxid oder Silikagel verwendet man vorzugsweise eine Mischung von Äthylacetat-Benzol (1:1) oder Benzol-Aceton (4:1) als Entwicklungslösungsmittel. Die chromatographischen Trennmc- thoden können gegebenenfalls mehrmals wiederholt werden. Im allgemeinen können die Aktivstoffe nacheinander aus einer Alunüniumoxidkolonne in der Reihenfolge Substanz SF-837-A4, Substanz SF-837-A3, Substanz SF-837-A2 und schließlich SF-837 eluiert werden, wenn als Entwicklungsmedium Äthylacelat-Benzol (1:1) verwendet wird. Die anfallenden Eluatfraktioncn werden fortlaufend mittels Aluminiumoxid-Dünnschichtchromatographie geprüft. Die Fraktionen mit Einzelflcckcharakteristik im Dünnschichlchromatogramm — was auf einen Gehalt an nur einem Aktivstoff hinweist werden miteinander vereinigt und unter verringertem Druck zur Trockne eingeengt. Auf diese Weise können die reinen freien Basen der Substanzen SF-837, SF-837-A2, SF-837-A3 und SF-837-A4 voneinander getrennt und in Form von weißen Pulvern gewonnen werden.
Das Mal.rolid-Antibiotieum SF-837-A2 und sein Diacetyldeinat sowie die Makrolid-Antibiotica SF-837-A,, und SF-837-A4 und deren Monoacetylderivate und deren nicht giftige Säureanlagerunjrssalzc können in verschiedenen Formen für therapeutische Zwecke verwendet werden. Brauchbare Säureanlagcrungssalze sind beispielsweise solche mit Salzsäure, Schwefelsäure. Bromwasserstoffsäure. Phosphorsiiure. Salpetersäure, Essigsäure. Zilroncnsäure. Maleinsäure. Apfelsäure. Weinsäure. Zimtsäure. Ascorbinsäure und Glycolsäure.
Beispiel 1
Streptomyces mycarofaciens nov.sp. der ATCC Nr. 21 454 (SF-837-Rasse) wurde in 300 1 eines flüssigen Kulturmediums eingeimpft, das 2,0% Glucose, 1,5% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,4% Maiswasser, 0,2% NaCl, 0,3% CaCO3 und 0,2% Schweinefett bei einem pH-Wert von 7,0 enthielt; anschließend wurde unter Belüftung 70 Stunden bei 28° C unter Rühren kultiviert.
Die fermentierte Brühe bzw. Nährlösung wurde direkt filtriert und der den Mycelkuchen enthaltende Filterkuchen mit verdünnter Salzsäure gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Kulturfiltrat ergab eine Gesamtflüssigkeitsmenge von 280 1 (Stärke 320 mcg/ml). Das Filtrat wurde mit 701 Äthylacetat extrahiert, und 71 1 der anfallenden Äthylacetatphase wurden unter verringertem Druck auf etwa 20 1 eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 10 1 Wasser verdünnt, durch Zugabe von 5n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und dann kräftig geschüttelt. Die wäßrige Phase wurde von der organischen Phase getrennt und diese wäßrige Phase durch Zugabe von 3 n-Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 9 eingestellt und dann mit 4 1 Äthylacetat extrahiert. Der anfallende Äthylacetatextrakt wurde dann mit 2 1 wäßriger Salzsäure geschüttelt, die wäßrige Phase abgetrennt und diese mit 1 1 Äthylacetat bei einem pH-Wert von 8 extrahiert. Dieser Äthylacetatextrakt wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck eingeengt, wobei 92 g eines gelben Rohpulvers erhalten wurden.
90 g dieses Rohpulvers wurden in 1 1 Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde durch eine mit Kohlepulver gefüllte Kolonne bzw. Säule hindurchgeschickt; das Kohlepulver nahm in der Kolonne ein Volumen von 1,5 1 ein und war mit Äthylacetat imprägniert. Die Entwicklung wurde unter Verwendung von Äthylacetat als Lösungsmittel durchgeführt; das Eluat wurde in 15 Fraktionen von je 500 ml aufgefangen; die aktiven Fraktionen waren die Fraktionen 2 bis 12. Die aktiven Fraktionen des Eluats (festgestellt durch Dünnschicht-Chromatographie an Aluminiumoxid) wurden vereinigt und ergaben eine Gesamtmenge von 5,5 1, die unter verringertem Druck bis zur Trockne eingedampft wurde, wobei man 55 g eines weißen Pulvers (Stärke 700mcg/mg) erhielt. Dieses Pulver wurde einem Gegenstromverteilungsverfahren mit Benzol und 0,3-m Phosphatpuffer (pH 4,40) unterworfen. Bezüglich der Durchführung des Gegenstromverteilungsverfahrens wird auf die im Anschluß an die Beispiele gebrachten Ausführungen verwiese.!. Von den beiden genannten Lösungsmitteln, d. h. dem Benzol und dem 0,3-m Phosphatpuffer (pH 4,40 wurden je 2,5 1 benutzt; die untere bewegliche Schichi wurde bei dem Gegenstromverteilungsverfahren lOma entfernt. Die Substanz SF-837 war in den ersten bii dritten Rohren und hauptsächlich in dem zweiter Rohr verteilt vorhanden, während größere Anteil· (etwa 80%) der Substanzen SF-837-A2, SF-837-A, um SF-837-A4 in dem ersten Rohr zurückgehalten wur den.
Der Anteil (2,4 1) im ersten Rohr wurde unter ver ringertem Druck eingeengt, wobei man 7,7 g eine weißen Pulvers (Stärke 720 mcg/mg) erhielt. Diese Pulver wurde in 15 ml Benzol gelöst, evtl. vorhanden unlösliche Stoffe abfiltriert und die filtrierte Lösun
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dann durch eine mit Silikagel gefüllte Kolonne bzw. Säule geschickt; das Silikagel nahm in der Kolonne ein Volumen von 800 ml ein und war mit Benzol imprägniert. Die chromatographische Entwicklung der am Silikagel adsorbierten Aktivstoffe wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol-Aceton (4:1) durchgefiihrt. Das Eluat wurde in 105 Fraktionen von jeweils 50 ml aufgefangen bzw. gesammelt. 01 -ml-Anteile jeder dieser Fraktionen wurden untersucht, indem sie einer Aluminiumoxid-Dünnschicht-Chromatographie unterworfen wurden. Die Fraktionen Nr. 28 bis 30, die bei dieser Aluminiumoxid-Dünnschicht-Chroinatographie (mit 2:1 Äthylacetat-Benzol als Entwicklungslösungsmittel) einen Einzeifieck ergaben und die in Anbetracht des Rf-Wertes des Einzelfi'eckens als Fraktionen mit einem Gehalt an nur einer bestimmten Substanz anzusehen waren, wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, wobei man 140 mg eines weißen Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 120 bis 122DC erhielt; dieses Pulver wurde durch Analyse als die reine freie Base der Substanz SF-837-A4 identifiziert. Bezüglich der Durchführung der Dünnschicht-Chromatographie wird auf die im Anschluß an die Beispiele gebrachten Ausführungen verwiesen. Die Substanz SF-837-A4 besitzt weiterhin folgende Eigenschaften:
I η 50%igem wäßrigen Äthanol beträgt derpKa- Wert 7,0; die optische Drehung bei einer Konzentration von 1 % in Äthanol beträgt (a)? - 40°.
Die Verbindung besitzt charakteristische Absorptionsbanden im infraroten Bereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen in cm"1: 3500, 2970, 2930, 1738, 1680, 1640, 1600, 1460, 1378, 1360, 1300, 1276, 1252,1190,1170, 1120, 1082, 1052, 1017,980,910,863, 840 und 780; das Infrarotabsorptionsspektrum der Substanz SF-837-A4 in Form der freien Kaliumbromid granulierten Base ist in F i g. 6 dargestellt.
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum der Substanz SF-837-A4 (in Äthanol) ist in Fi g. 5 dargestellt; die Verbindung besitzt ein charakteristisches Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 28Omμ (Ej*„ = 285) im ultravioletten Bereich des Spektrums.
Gewichtsanalyse in Prozent für C42H67O15N:
Berechnet ... C 61,09, H 8,12, N 1,70, O Rest; gefunden .... C 60,82, H 8,52, N 1,73, O 28,93. MG = 825, bestimmt durch Massenanalyse.
Die Fraktionen 38 bis 57, die bei der Aluminiumoxid-Dünnschicht-Chromatographie drei Flecken ergaben, wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt, wobei man 1,1 g eines weißen Pulvers erhielt, das gemäß Analyse die Substanzen SF-837-A2 und SF-837-A3 zusammen mit einer kleineren Menge der Substanz SF-837 enthielt.
In 4 ml Benzol wurde 1 g des wie vorstehend beschrieben erhaltenen weißen Pulvers gelöst, das die Substanzen SF-837-A:! und SF-837-A, zusammen mit einer kleineren Menge SF-837 enthielt. Die Lösung wurde einem chromatographischen Trennverfahren unterworfen, indem sie durch eine Kolonne bzw. Säule von 100 ml Aluminiumoxid hindurchgeschickt wurde, die mit Benzol imprägniert war, und indem sie mil einem Lösungsmittelgcmisch aus Äthylacetat-Benzol (1:1) entwickelt wurde. Das Eluat wurde in 125 Fraktionen von jeweils 20 rnl entnommen: jede Fraktion wurde untersucht, indem sie der Aluminiumoxid - Diinnschichl-Chromatographic unterworfen wurde. Das Entwicklungslösungsmiltel wurde wäh-
45 rend des Verlaufs der Entwicklung gewechselt, und zwar wurde zunächst Äthylacelat-Benzol (1:1) und dann Äthylacetat-Benzol (2:1) verwendet. Die hierbei erhaltenen Fraktionen 30 bis 48 wurden vereint und unter Vakuum eingeengt, wobei 230 mg eines weißen Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 122 bis 125 C erhalten wurden; durch Analyse wurde dieses Pulver als reine freie Base der Substanz SF-837-A3 bestätigt.
Die weiteren Eigenschaften der Substanz SF-837-A, sind folgende: In 50%igem wäßrigem Äthanol beträgt der pKa-Wert 7,0; die optische Drehung bei einer Konzentration von 1% in Äthanol beträgt (n)-: -AT.
Die Verbindung besitzt charakteristische Absorptionsbanden im infraroten Bereich des Spektrums bei folgenden Wellenläraen in cm"1: 3500, 2970. 2930. 1738 1680, 1640, 1600, 1460, 1378, 1360, 1300, 1275, 1252, 1190, 1168, 1121, 1083, 1052, 1015,980,863.840, 805 und 780; das Infrarotabsorptionsspektrum der Substanz SF-837-A3 in Form der freien in Kaliumbromid granulierten Base ist in F i g. 4 dargestellt; das Uhraviolettabsorptionsspektrum der Substanz SF-837-Aj (in Äthanol) ist in Fi g. 3 dargestellt; die Verbindung besitzt ein charakteristisches Absorptionsmaximum " bei einer Wellenlänge von 280 nv* (Ej"°m = 295) im ultravioletten Bereich des Spektrums.
Gewichtsanalyse in Prozent für C41H65O15N:
Berechnet ... C 60,67, H 8,01, N 1,73, O Rest;
gefunden .... C 60,53, H 8,23, N 1,87, O 29,32.
MG = 81 !,bestimmt durch Massenanalysc.
Nachdem die Fraktion 80 von der Kolonne bzw. Säule eluiert war, wurde die Zusammensetzung des Entwicklungslösungsmittels geändert, so daß das Verhältnis Äthylacetat-Benzol 2:1 betrug; die Fraktionen 90 bis 125 wurden aufgefangen und vereinigt und unter Vakuum eingeengt, wobei man 280 mg eines «veißen Pulvers erhielt, das gemäß Analyse etwa 70 Gewichtsprozent der Substanz SF-837-A2 enthielt. 250 mg dieses Pulvers wurden in 3 ml Benzol gelöst und die Lösung über eine Kolonne mit Aluminiumoxid Chromatographien; die Kolonne bzw. Säule war mit so viel Aluminiumoxid gefüllt, daß dies ein Volumen von 50 ml einnahm; das Aluminiumoxid war mit Benzol imprägniert. Zum Entwickeln der Kolonne wurden zunächst 300 ml Äthylacetat-Benzol (1:3) und dann ein Gemisch aus Äthylacetat-Benzol (2:1) verwendet. Das Eluat wurde in 60 Fraktionen von jeweils 5 ml entnommen und jede Fraktion mittels Aluminiumoxid-Dünnschicht-Chromatographie untersucht. Die Fraktionen 36 bis 47, die bei dieser Aluminiumoxid-Dünnschicht-Chromatographie einen Einzelfleck ergaben, wurden vereint und im Vakuum eingeengt, wobei man in einer Ausbeute von 80 mg ein weißes Pulver vom F. 125 bis 128°C erhielt; dieses Pulver wurde als die freie Base der Substanz SF-837-A2 identifiziert.
Die weiteren Eigenschaften der Substanz SF-837-A2 sind folgende: In 50%igem wäßrigen Äihanol liegt der pKa-Wert bei 6,8; die optische Drehung bei einer Konzentration von )% in Äthanol beträgt (u)" —68'.
Die Verbindung besitzt charakteristische Absorptionsbanden im infraroten Bereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen in cm"1: 3500, 2970, 2935, 1737, 1460, 1410, 1377, 1360, 1300, 1275, 1195, 1170, I 123. !082, 1052, 1017, 990. 920, 910, 860, 840. 805. 780, 740 und 700; das Infrarotabsorptionsspektium der Substanz SF-837-A2 in Form der freien in Kaliumbromid granulierten Base ist in Fig. 2 dar-
iiestellt: das Ultraviolettabsorptionsspektrum der Substanz SF-837-A, (in Äthanol) ist in F i g. 1 dargestellt: die Verbindung besitzt ein charakteristisches Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 232 mu. (E!""„ = 320) im ultravioletten Bereich des Spektrums. Gewichtsanalyse in Prozent für C42H69O15N:
Berechnet ... C 60,94, H 8,38, N 1,69, O Rest;
gefunden .... C 60,58, H 8,85, N 1,72, O 28.85.
MG = o27, bestimmt durch Massenanalyse.
Die Substanzen SF-837-A-,, SF-837-A3 und SF-837-A4 sind in Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform, Äthylacetat, Butylacetat, angesäuertem Wasser, Benzol, Äthyläther und Tetrachlorkohlenstoff löslich und in Pelroläther, η-Hexan und neutralem Wasser schwer löslich.
Wenn der Erythromycin-Test mit 50%iger Schwefelsäure durchgerührt wird, gibt die Substanz SF-837-A2 eine bräunlich- und rötlichpurpurne Farbe, während die Substanz SF-837-A3 und die Substanz SF-837-A4 eine schwach gelbliche braune Farbe aufweisen.
Ferner ergeben die Substanzen SF-837-A,, SF-837-Aj und SF-837-A4 bei der Silikagel- oder Aluminiumoxid-Dünnschicht-Chromatographie untor Verwendung verschiedener Lösungsmittelsystemc Einzelflecken mit jeweils verschiedenen Rf-Wertcn, wodurch die Reinheit und Homogenität der Substanzen bestätigt wird.
Die Rf-Werte der drei Substanzen mit verschicdenen Lösungsmittelsystemen sind in der folgenden Tabelle IV aufgerührt:
Tabelle IV
Lösungsmittelsystemc Rf-Wert
Substanz Substanz Substanz
SF-837-A2 SF-837-A, SF-837-A,
35
40
Silikagcl-Dünnschicht-Chromatographie
Benzol-Aceton 2:1 0,51 0,50 0,55
n-Bulanol-Fssigsäure- 0,68 0,68 0 69
Wasser 3:1:1 '
Methanol 0,83 0,83 0,84
Aluminiumoxid-Dünnschicht-Chromatographie
Äthylacctat-Benzol 0,40 0,45 0 5^ 2:1
Allylacetat 0,84 0,87 0,91
Beispiel 2
55
Streptomyccs mycarofacicns nov.sp. der ATCC-Nr. 21454 (SF-837-Rassc) wurde in 30 1 eines flüssigen Kulturmediums eingeimpft, das 3,0% Glucose, 5% lösliches pflanzliches Protein, 0,2% KCl und 0,3% CaCO, bei einem pH-Wert von 7.0 enthielt und unicr ho Belüftung 25 Stunden in einem Stand- bzw. Flaschenfennenter bei 30'C unter Rühren kultiviert. Die fermentierte Brühe bzw. Nährlösung wurde direkt liltriert und der den Mycclkuchcn enthaltende Filterkuchen mit verdünnter Salzsäure gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Kullurfiltrat wurde in einer Gesamtmenge von 28 I (Stärke 300 mcg.'ml) erhallen. Das Filtral (pH 8.4) wurde mit 7 1 Butylacetat extrahiert und der erhaltene Butylacetalextrakt anschließend wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt, um die Reextraktion der Aktivstoffe durchzuführen. Man erhielt so ein gelbes Rohpulver in einer Ausbeute von 15,2 g. 15 g dieses Rohpulvers wurden in 200 ml Butylacetat gelöst, und die Lösung wurde über eine mit Aktivkohle beschickte Kolonne bzw. Säule Chromatographien; die Kolonne war mit so viel Aktivkohle gefüllt, daß diese ein Volumen von 400 ml einnahm; die Aktivkohle war mit Butylacetat imprägniert worden. Zum Entwickeln der Kolonne wurde ebenfalls Butylacetat verwendet.
Das Eluat wurde in 14 Fraktionen von je 200 ml aufgefangen; die aktiven Fraktionen waren die Fraktionen Nr. 2 bis 10. Die vorstehend genannten, durch Dünnschicht-Chromatographie festgestellten aktiven Fraktionen wurden abgetrennt und vereinigt und ergaben eine Gesamtmenge von 1,8 1, die im Vakuum auf etwa 220 ml eingeengt wurde. Das Konzentrat wurde mit 50 ml destilliertem Wasser verdünnt, unter Zugabe von 6 η-Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und kräftig geschüttelt. Die wäßrige Phase wurde von der organischen Phase abgetrennt und die wäßrige Lösung durch Zusatz von 1 n-Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt, wobei ein Niederschlag ausfiel. Dieser Niederschlag wurde abfiltriert und in einem Trockenapparat getrocknet; man erhielt 6,3 g eines weißen Pulvers (Stärke 720 mcg/mg).
Dieses Pulver wurde in 12 ml Benzol gelöst, und die unlöslichen Stoffe wurden abfiltriert. Die filtrierte Lösung ließ man dann durch die Kolonne laufen, die mit Silikagel beschickt war, das mit Benzol imprägniert war; die eingefüllte Silikagelmenge nahm in der Kolonne ein Volumen von 600 ml ein. Die Kolonne mit den adsorbierten Aktivstoffen wurde hierauf mit einem Lösungsmittclgemisch aus Benzol-Aceton (6:1) entwickelt. Das Eluat wurde in 120 Fraktionen von jeweils 20 ml entnommen. Die Substanzen SF-837-A,, SF-837-Aj und SF-837-A4 wurden dabei durch diese Eluation von der Substanz SF-837 getrennt. Alle aufgefangenen Fraktionen wurden mittels der SiIikagel-Dünnschicht-Chromatographic untersucht (unter Verwendung von Benzol-Aceton (2:1) als Entwicklungslösungsmittel). Die Fraktionen 64 bis 82 wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt, wobei man 800 mg eines weißen Pulvers erhielt, das nach der Analyse aus den Substanzen SF-837-A,, SF-837-A3 und SF-837-A4 sowie einer kleineren Menge der Substanz SF-837 bestand. Dieses weiße Pulver wurde wie im Beispiel 1 beschrieben zunächst über eine Silikagel-Kolonne und dann über eine Aluminiumoxid-Kolonnechromatographiert, wodurch man 15 mg der reinen freien Base der Substanz SF-837-A2, 85 mg der reinen freien Base der Substanz SF-837-A, und 35 mg der reinen freien Base der Substanz SF-837-A4 jeweils in Form eines weißen Pulvers erhielt.
Beispiel 3
200 mg des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Antibioticums SF-837-A, (freie Base) wurden in 15 ml Äthyläther aufgenommen. Die entstandene Lösung wurde mit einer gesättigten Lösung von Zitronensäure in Äthylälher vermischt, worauf sich ein Niederschlag von SF-837-A,-Citral absetzte. Dieses Ciliat wurde abfiltriert und getrocknet. Ausbeule: 210 mg. F.: 157 bis 159 C (unter Zersetzung).
Bei Wiederholung der beschriebenen Arbeitsweise unter Verwendung von 200 mg SF-837-A, bzw. 200 mg SF-837-A4 (freie Basen) erhielt man das SF-837-A,-Citrat mit F.: 174 bis 177°C (unter Zersetzung) und das SF-837-A4-Citral mit F.: 170 bis 172CC (unter Zersetzung) in Ausbeulen von 220 mg bzw. 190 mg.
Beispiel 4
300 mg der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Substanz SF-837-A, wurden in 20 ml destilliertem Wasser suspendiert, und die erhaltene Suspension wurde mit einer wäßrigen Lösung von Weinsäure versetzt. Das Gemisch wurde gut umgerührt, auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und filtriert, um unlösliche Anteile zu entfernen. Das Filtrat wurde dann gefriergetrocknet, wobei man 340 mg des Tartrats der Substanz SF-837-A3 in Form eines weißen Pulvers vom F. 115° C erhielt.
Beispiel 5
Jeweils 300 mg der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Substanz SF-837-A2, SF"-837-A3 und SF-837-A4 wurden in 1,5 ml Pyridin gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 1,0 ml Essigsäureanhydrid versetzt. Das Gemisch wurde umgerührt und 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter Rühren in Eiswasser gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wobei jeweils 330 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden, das durch Umkristallisation aus Tetrachlorkohlenstoff gereinigt wurde.
Man erhielt (a) das Diacetylderivat des Makrolid-Antibioticums SF-837-A2 vom F.: 130 bis 134 C: Ausbeute: 310 mg; weiße Kristallnadeln.
Gewichtsanalyse in Prozent für C46H73O17N:
Berechnet ... C 60,57, H 8,06, N 1.53. O Rest:
gefunden .... C 60,68, H 8,23, N 1.49. O 29.60.
(bj das Monoacetylderivat des Makrolid-Antibioticums SF-837-A3 vom F.: 182 bis 185°C: Ausbeute: 295 mg; sandähnliche Kristalle.
Gewichtsanalyse in Prozent für C43H67Oi6N:
Berechnet ... C 60,47, H 7,90, N 1,64, O Rest:
gefunden .... C 60,56, H 7,92, N 1,68, O 29,84.
(c) das Monoacetylderivat des Makrolid-Antibioticums SF-837-A4 vom F.: 166 bis 168°C: Ausbeute: 300 mg; sandähnlichc Kristalle.
Gewichtsanalyse in PrOZCnIfUrC44H69O16N:
Berechnet ... C 60,88, H 8,01, N 1,61, O Rest;
gefunden .... C 60,85, H 8,06, N 1,65, O 29,44.
Dünnschicht-Chromatographie
Die Dünnschicht-Chromatographic wurde in üblicher Weise nach der absteigenden Methode an einer dünnen Schicht (0,25 mm dick) aus Aluminiumoxid durchgeführt, die durch Erhitzen auf 1100C aktiviert worden war. Der Einzelfleck der aktiven Substan? wurde durch Behandlung mit Schwefelsäure sichtbar gemacht.
Gegenstromverteilungsverfahren
Das Gegenstromverteilungsverfahren wurde mit Hilfe speziell entwickelter zylindrischer Gefäße mit einem Durchmesser von 18 cm und einer Höhe von 30 cm durchgeführt. Eine Lösung des Pulvers in Benzol und eine Menge des Phosphatpuffers wurden in das erste Gefäß eingeführt, worauf die beiden Schichten in dem Gefäß mit Hilfe eines rotierenden Rührers vermischt wurden. Anschließend wurde die die wäßrige Lösung enthaltende Schicht durch c;n Loch im Boden des Gefäßes abgezogen und in das nächste Gefäß geleitet, welches dieselbe Form unc dieselben Abmessungen aufwies wie das erste GcfäT und ebenfalls das organische Lösungsmittel enthielt dort wie beschrieben behandelt, weitergeleitet zurr nächsten Gefäß usw.
Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Makrolid-Antibioticum SF-837-A, und dessen Diacetylderivat der allgemeinen Formel I
OR,
in der R1 den Rest -COCH1CH3, R2 und R3 entweder je ein Wasserstoffatom oder den Rest — COCH, und R4 den Rest -COCH2CH2CH3 bedeutet und die Makrolid-Antibiotica SF-S37-A-, und SF-837-A4 sowie deren Monoacetylderivate der allgemeinen Formel II
O
DE19702065297 1969-09-25 1970-02-03 Makrolid-Antibioticum SF-837-A tief 2 und dessen Diacetylderivat sowie Makrolid-Antibiotica SF-837-A tief 3 und SF-837-A tief 4 und deren Monoacetylderivate sowie pharmakologisch nicht giftige Säureadditionssalze der genannten Antibiotica und Verfahren zur Herstellung der Antibiotica SF-837-A tief 2, SF-837-A tief 3 und SF-837-A tief 4 Expired DE2065297C3 (de)

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