CN1348011A - 一种体外免疫人b淋巴细胞生产人单克隆抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用加载抗原的人树突状细胞体外免疫人外周血单核细胞,然后用EB病毒转化其中的生产特异性抗体的B淋巴细胞进而生产针对上述抗原的人源化单克隆抗体的方法。使用本发明所提供的方法可获得生产针对上述抗原的人源化单克隆抗体的人B淋巴细胞克隆,培养这些人B淋巴细胞就可生产针对各种抗原的、具有临床治疗和临床诊断价值的人源化单克隆抗体。本方法既适用于在实验室水平制备人单克隆抗体,也适用于人单克隆抗体的工业化生产。
Description
本发明属于生产人单克隆抗体的生物技术领域。
本发明提供了用加载抗原的人树突状细胞免疫人外周血单核细胞，然后用EB病毒转化其中的产生特异性抗体的B淋巴细胞进而生产单克隆抗体的方法，本方法既适用于在实验室水平制备人单克隆抗体，也适用于人单克隆抗体的工业化生产。
单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)是由克隆的B淋巴细胞产生的只识别某一特定抗原决定簇的高度均质和高度专一性的纯化抗体。Milstein和Kohler在1975年报道了生产单克隆抗体的杂交瘤技术，并因此在1984年获得诺贝尔奖。生产单克隆抗体的杂交瘤技术的要点是：用特异性抗原免疫小鼠；把小鼠脾脏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；分离单克隆的产生抗体的杂交瘤细胞；将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔或体外培养生产单克隆抗体。用这种技术生产的单克隆抗体是小鼠单克隆抗体，也称鼠源化单克隆抗体。此类单克隆抗体已被广泛应用于实验室研究、临床疾病诊断和生物分子提纯等方面，创造了巨大的经济效益。
虽然，用杂交瘤技术生产的鼠源化单克隆抗体具有多方面的应用，但它在治疗人类疾病的应用上却受到很大限制。这是因为，鼠源性单克隆抗体对于人体来说是异种蛋白，在应用后会刺激人体产生针对鼠源性单克隆抗体的抗体。这种人抗鼠抗体一方面会加速鼠源性单克隆抗体的清除使之失效，另一方面又会因反复应用可在人体引起超敏反应性疾病。因此，寻找人源化单克隆抗体的生产方法对于生产在人类疾病治疗中有应用价值的人源化单克隆抗体具有重要意义。
目前，主要有两类生产人源化单克隆抗体的技术：一类以杂交瘤技术为基础，另一类以EB病毒转化人B淋巴细胞为基础。第一类技术有两种，一是采用重组DNA技术生产人的单克隆抗体。其具体做法是，用特异性抗原免疫小鼠；取小鼠脾脏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞分离得到编码特异性鼠源抗体的cDNA；采用DNA重组技术，用编码人抗体恒定区的cDNA片段置换鼠源抗体的cDNA片段，获得鼠源抗体可变区的cDNA和人源抗体恒定区的cDNA相融合的cDNA；在大肠杆菌、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达人源化单克隆抗体。二是采用人免疫球蛋白基因小鼠产生人单克隆抗体。其具体做法是，采用基因敲除(knock out)和基因敲进(knock in)技术生产含有人免疫球蛋白基因的小鼠，此小鼠的免疫球蛋白基因位点为人免疫球蛋白基因位点。用特异性抗原免疫此含有人免疫球蛋白基因的小鼠，将此小鼠脾脏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合得到产生特异性人源化单克隆抗体的杂交瘤细胞。培养此杂交瘤细胞生产人源化单克隆抗体。
1987年，Goossens等报道，将反复接触同种异体红细胞抗原的人外周血淋巴细胞用EB病毒转化，可获得多个产生人单克隆抗体的永生化B细胞克隆。这些克隆的B淋巴细胞分别产生Ph(D)、Ph(G)、Ph(C)、Ph(E)、Kell、A和Al血型抗原的人单克隆抗体，其浓度平均可达4-50微克/毫升。这些B淋巴细胞克隆细胞在四年内可在体外培养条件下稳定地产生单克隆抗体(Goossens D等，J. Immunol Methods，1987 Aug 3；101(2)：193-200)。1993年，Delneste等从全身性血管炎患者体内分离B淋巴细胞，用EB病毒将其转化；用人内皮细胞系细胞黏附筛选产生人内皮细胞特异性单克隆抗体的转化B细胞克隆，得到产生人内皮细胞表面分子特异性的人单克隆抗体的两个B细胞克隆(Delneste Y等，Cell Immunol.，1993 Aug，150(1)：15-26)。1994年，Buchacher等用EB病毒转化HIV-1阳性志愿者的外周血淋巴细胞，分别得到产生HIV-1包膜蛋白和核心蛋白特异性单克隆抗体的B淋巴细胞株，这些细胞株产生的单克隆抗体具有诊断、研究和治疗HIV-1的价值(Buchacher A等，AIDS Res.Hum Retroviruses，1994 Apr.，10(4)：259-69)。
尽管采用以EB病毒转化B淋巴细胞技术可生产多种人源化单克隆抗体，但该技术存在一个最大的也是显而易见的局限性，即不能根据具体需要，用特定抗原免疫人，然后分离接受免疫者的淋巴细胞并将其用EB病毒转化。本发明提供的技术突破了上述以EB病毒转化B淋巴细胞技术的局限性。
本发明的目的是提供一种方法，该方法包括：用加载抗原的人树突状细胞免疫人外周血单核细胞，然后用EB病毒转化其中的产生特异性抗体的B淋巴细胞，从而生产针对上述抗原的单克隆抗体。采用本发明的技术可使免疫在体外培养条件下完成，避免了B淋巴细胞的体内免疫，从而使通过EB病毒转化方法制备各种抗原的人源化单克隆抗体成为可能。
本发明的技术方案如下：
1、分离培养人的树突状细胞
1)取人外周血；
2)用等体积RPMI-1640培养基稀释人外周血；
3)加稀释的人外周血于淋巴细胞分离液上，室温离心，吸取单核细胞层的细胞。收集自体血浆备用；
4)以等体积的RPMI-1640培养基离心洗涤细胞；
5)将分离的外周血单核细胞接种于培养板上，37℃，CO2孵箱培养，弃
培养上清；
6)加入含自体血浆和庆大霉素的RPMI-1640培养基，37℃，CO2孵箱培养；加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)，继续在37℃，CO2孵箱中培养；
通过上述步骤可分离得到树突状细胞。
7)鉴定树突状细胞。
2、用特异性抗原加载树突状细胞
1)在上述培养条件下，加特异性抗原刺激分离得到的树突状细胞；
2)继续培养树突状细胞。
3、分离人外周血单核细胞
1)取人外周血；
2)用等体积RPMI-1640培养基稀释人外周血；
3)加稀释的人外周血于淋巴细胞分离液上，室温离心，吸取单核细胞层的细胞；
4)以等体积的RPMI-1640培养基离心洗涤细胞。
4、免疫人B淋巴细胞
将分离的外周血单核细胞和加载抗原的成熟树突状细胞接种于含RPMI-1640培养基的培养板中，37℃，CO2孵箱培养。
5、用EB病毒转化免疫的人B淋巴细胞；
1)在上述接受免疫的人B淋巴细胞培养液中滴加EB病毒上清，加环孢霉素，扩增EB病毒，液氮保存；
2)37℃，CO2孵箱培养上述滴加EB病毒上清的接受免疫的人B淋巴细
胞培养液，移去培养液，补充含胎牛血清和庆大霉素的RPMI-1640培养基，继续培养；
3)在倒置显微镜下观察，将表现生长的细胞移入含10％胎牛血清RPMI-1640的细胞培养瓶中，在37℃，CO2孵箱中继续培养；
4)观察细胞，可见其成簇或以单细胞悬液的形式生长，根据具体生长情况传代。
6、转化细胞的克隆化培养
1)在含胎牛血清和庆大霉素/毫升的RPMI-1640培养基中系列稀释转化的B淋巴细胞，接种培养板，37℃，CO2孵箱培养。从第二天开始每天观察细胞，并对只有一个细胞克隆生长的孔做标记；
2)取含单克隆细胞转化B淋巴细胞的孔的培养上清，用ELISA方法检测其中存在的抗体。
7、采用ELISA方法筛选产生特异性单克隆抗体的转化细胞克隆
1)将可溶性抗原溶于包被液，加到培养板中，室温过夜，4℃放置；
2)吸弃包被液，用PBS/Tween洗涤；每孔加封闭液，室温放置；
3)吸弃封闭液，用PBS/Tween洗涤；
4)每孔加待检上清(取自含单克隆细胞的培养孔)，设两个复孔，室温放
置；
5)用PBS/Tween洗涤；
6)加辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗体，室温孵育；
7)用PBS/Tween洗涤，再用双蒸水洗涤；
8)加邻-苯二胺(OPD)磷酸盐/柠檬酸盐底物显色液(pH 5.0)，室温静置，待明显的颜色出现。加NaOH终止反应；
9)采用酶标仪测定OD值。
8、扩增、保存产生单克隆抗体的B淋巴细胞
1)在含胎牛血清和庆大霉素的RPMI-1640培养基中，37℃，CO2孵箱扩增培养转化的产生单克隆抗体的B淋巴细胞；
2)在液氮中保存产生单克隆抗体的B淋巴细胞。
9、培养生产人单克隆抗体的B淋巴细胞
在含胎牛血清和庆大霉素的RPMI-1640培养基中，37℃，CO2孵箱扩增培养产生单克隆抗体的B淋巴细胞，收集培养上清。
10、分离纯化单克隆抗体
培养上清中含有大量特异地针对上述抗原的人单克隆抗体，采用常规的生物化学技术分离纯化得到相应的人单克隆抗体。
本发明的有益效果：
本发明解决了不能通过使用抗原免疫人体而制备人单克隆抗体的难题，提供了可生产针对各种抗原的人源化单克隆抗体的方法。例如，利用本发明提供的方法可生产多种可用于治疗多种严重疾病如自身免疫性疾病和恶性肿瘤等的人源化单克隆抗体，从而为这些疾病的治疗奠定基础。此外，利用本发明提供的方法还可制备可用于人体细胞(如肿瘤细胞)定位的人源化单克隆抗体标记的放射性示踪物，从而为医学与生物学研究和临床诊断与治疗所应用。
下面叙述本发明的实施例：一、抗人肿瘤坏死因子(TNF)的人源化单克隆抗体的生产。
生产方法如下：
1、分离培养人的树突状细胞
1)用注射器抽取10毫升人外周血；
2)用等体积RPMI-1640培养基(Biowhittaker，Walkersville，Maryland，USA)(含肝素10IU/毫升，不含胎牛血清)稀释抽取的人外周血；
3)稀释的人外周血于Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液上，二者的体积比是2∶1。室温离心，1000g，15分钟。吸取单核细胞层的细胞，收集自体血浆备用；
4)以等体积的RPMI-1640培养基(含5％的胎牛血清)离心洗涤细胞(200g，15分钟)两次；
5)将分离的外周血单个核细胞接种于6孔培养板(Falcon，Lincoln Park，NJ，USA)，每孔含8×106个细胞，3毫升含1％自体血浆，20微克庆大霉素的RPMI-1640培养基。37□C，CO2孵箱培养2小时。吸弃培养上清；
6)加入3毫升含1％自体血浆，20微克庆大霉素的RPMI-1640培养基。37□C，CO2孵箱培养2小时。加入100IU/毫升粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和800U/毫升白细胞介素4(IL-4)，继续在37℃，CO2孵箱中培养6天；
用上述方法可分离到1.5-4×105个树突状细胞。
7)鉴定树突状细胞细胞，其表型为：CD83+，p55/fascin+，CD115/MCSF-R-，CD86+。
2、用肿瘤坏死因子加载树突状细胞
1)在上述培养条件下，加经突变的肿瘤坏死因子(0.1毫克)刺激分离的树突状细胞(1.5-4×105)；
2)继续培养树突状细胞48小时。
3、分离人外周血单个核细胞
1)用注射器抽取10毫升人外周血；
2)用等体积RPMI-1640培养基(含肝素10IU/毫升，不含胎牛血清)稀释抽取的人外周血；
3)加稀释的人外周血于Fidcoll-Hypaque淋巴细胞分离液上，二者的体积比是2∶1。室温离心，1000g，15分钟。吸取单核细胞层的细胞；
4)以等体积的RPMI-1640培养基(含5％的胎牛血清)离心洗涤细胞(200g，15分钟)两次。
4、免疫人B淋巴细胞
将分离的外周血单个核细胞(7.5×106)和加载突变的肿瘤坏死因子的成熟树突状细胞(1×105)接种于6孔培养板(Falcon，Lincoln Park，NJ，USA)，于3毫升含10％胎牛血清，20微克庆大霉素/毫升的RPMI-1640培养基中，37℃，CO2孵箱培养2天。
5、用EB病毒转化免疫的人B淋巴细胞
1)滴加0.5毫升EB病毒上清，加5微升环孢霉素使其终浓度为0.2微克/毫升。采用B95-8 marmoset细胞扩增EB病毒，液氮保存(Hudson L，PracticalImmunology，Blackwell Scientific Publications，1989，Third Edition，第460-461页)；
2)37℃，CO2孵箱培养7天，移除1毫升旧培养液，补充10毫升含10％胎牛血清，20微克/毫升庆大霉素/毫升的RPMI-1640(Biowhittaker，Walkersville，Maryland，USA)培养基，37□C，CO2孵箱培养3-4周；
2)在倒置显微镜下观察，将表现生长的细胞移入含10毫升RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清)的25cm2细胞培养瓶中，继续于37□C，CO2孵箱培养；
3)观察细胞可见其成簇或以单细胞悬液的形式生长，1周后或根据具体情况进行传代。
6、转化细胞的克隆化培养
1)采用在含15％胎牛血清、20微克庆大霉素/毫升的RPMI-1640(Biowhittaker，Walkersville，Maryland，USA)培养基中系列稀释的转化B淋巴细胞，调其浓度为8-10个细胞/毫升。取100微升接种96孔培养板。37℃，CO2孵箱培养7-10天。从第二天开始每天观察细胞，并对只有一个细胞克隆生长的孔做标记；
2)取含单克隆细胞转化B淋巴细胞的孔的培养上清，用ELISA方法检测其中存在的抗体。
7、采用ELISA方法筛选产生特异性单克隆抗体的转化细胞克隆
1)、将人肿瘤坏死因子(1-6微克/毫升)溶于Bicarbonate包被液(1.59克Na2CO3，2.93克NaHCO3，0.2克NaN3，用双蒸水补齐至1升，pH 9.6)，加100微升于96孔培养板的孔中，室温(20-25℃)过夜，4℃继续放置4-12小时；
2)吸弃包被液，用PBS/Tween(含0.05％Tween 20的PBS)洗三次。每孔加100微升PBS/BSA/Tween封闭液(含0.05％Tween 20，1％BSA的PBS)，室温(20-25℃)放置80分钟；
3)用PBS/Tween(含0.05％Tween 20的PBS)洗涤三次；
4)每孔加75微升待检上清(取自含单克隆细胞的培养孔)，设两个复孔，室温(20-25℃)放置2小时；
5)吸弃孔中液体，用PBS/Tween(含0.05％Tween 20的PBS)洗三次；
6)加75微升辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗体，室温孵育2小时；
7)用PBS/Tween(含0.05％Tween 20的PBS)洗涤三次，双蒸水洗涤一次；
8)加100微升邻-苯二胺(OPD)(溶于磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0)底物显色液，室温静置15-60分钟，待明显的颜色出现；加40微升3M NaOH终止反应；
9)采用酶标仪在492纳米波长测定OD值。
8、扩增、保存产生人肿瘤坏死因子特异性单克隆抗体的B淋巴细胞
1)采用含10％胎牛血清、20微克庆大霉素/毫升的RPMI-1640(Biowhittaker，Walkersville，Maryland，USA)培养基，37□C，CO2孵箱扩增培养转化的产生人肿瘤坏死因子特异性单克隆抗体的B淋巴细胞；
2)在液氮中保存产生人肿瘤坏死因子特异性单克隆抗体的B淋巴细胞。
9、培养生产人单克隆抗体的B淋巴细胞
采用含10％胎牛血清和20微克庆大霉素/毫升的RPMI-1640(Biowhittaker，Walkersville，Maryland，USA)培养基，37℃，CO2孵箱扩增培养产生特异性抗人肿瘤坏死因子的人单克隆抗体的B淋巴细胞，收集培养上清。
10、分离纯化单克隆抗体
培养上清中含有大量特异性抗人肿瘤坏死因子的人单克隆抗体，采用常规的生物化学技术分离纯化人肿瘤坏死因子的人单克隆抗体。
此种单克隆抗体可表现出很好的治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、Crohn′s病(Crohn′s disease)和感染性休克等疾病的效果。文献中已有关于抗人肿瘤坏死因子的单克隆抗体的疗效的报道(Raza A，Microsc.Res.Tech.，2000 Aug 1，50(3)：229-35；Brandt J.等，Arthritis Rheum.，2000 Jun.，43(6)：1346-52；Vincent JL.，J.Clin.Pract.2000 Apr.，54(3)：190-3；Kavanaugh A等，J. Rheumatol.，2000 Apr；27(4)：841-50；Maini RN.和Taylor PC.，Annu.Rev.Med.，2000，51：207-29)，但却没有解决单克隆抗体的人源化问题。本发明所提供的方法解决了此问题。二、抗HER2抗原人源化单克隆抗体的生产。
生产方法如下：
重复实施例一的步骤1到步骤10，不同的只是在步骤2中用经突变的HER2特异性抗原(0.1毫克)刺激分离得到的树突状细胞。最后得到的是特异性抗HER2抗原的人单克隆抗体。
HER2抗原是由HER2原癌基因编码的185kDa的跨膜受体糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性转化细胞活性。HER2抗原在10-40％的人乳腺肿瘤细胞有过度表达，因此成为乳腺癌免疫治疗的靶点。动物实验表明，采用人源HER2特异性的单克隆抗体制成的免疫毒素对乳腺癌的治疗有明显的治疗作用。文献中已有关于HER2特异性单克隆抗体对于乳腺癌疗效的报道(Rosenblum MG.等，Int.J.Cancer，2000 Oct 15，88(2)：267-273；Dillman RO.，Cancer Biother.Radiopharm.，1999 Feb.，14(1)：5-10；Dakappagari N.K.等，Cancer Res.，2000 Jul.15，60(14)：3782；Klapper L.N.等，Cancer Res.，2000 Jul.1，60(13)：3384-8)，但却没有解决单克隆抗体的人源化问题。本发明所提供的方法解决了此问题。
Claims (8)
1.一种体外生产人源化单克隆抗体的方法，其特征在于用加载抗原的人树突状细胞免疫人外周血单核细胞，然后用病毒转化其中的生产特异性抗体的B淋巴细胞，以生产针对上述抗原的特异性人源化单克隆抗体；进一步，其特征在于该方法包括以下步骤：
1)分离、培养与鉴定人树突状细胞；
2)应用抗原加载由上述步骤1)得到的人树突状细胞；
3)分离人外周血单核细胞；
4)应用由上述步骤2)得到的加载抗原的人树突状细胞免疫由上述步骤3)得到的人B淋巴细胞；
5)应用病毒转化由上述步骤4)得到的被免疫的人B淋巴细胞；
6)克隆化培养由上述步骤5)得到的转化细胞；
7)应用ELISA方法筛选由上述步骤6)得到的生产针对上述抗原的特异性单克隆抗体的转化细胞克隆；
8)扩增、保存由上述步骤7)得到的生产上述特异性单克隆抗体的B淋巴细胞；
9)培养由上述步骤8)得到的生产上述特异性人单克隆抗体的B淋巴细胞；
10)分离纯化由上述步骤9)得到的针对上述抗原的特异性人源化单克隆抗体。
2.权利要求1的方法，其中所说的病毒为EB病毒；
3.权利要求1的方法，其中所说的抗原包括任何一种可刺激产生单克隆抗体的抗原；
4.权利要求3的抗原，其中所说的抗原是人肿瘤坏死因子(TNF)；
5.权利要求3的抗原，其中所说的抗原是HER2抗原；
6.权利要求1的方法，其中所说的人源化单克隆抗体包括任何一种用权利要求1提供的方法生产的针对权利要求3的抗原的人源化单克隆抗体；
7.权利要求6的人源化单克隆抗体，其中所说的人源化单克隆抗体是抗人肿瘤坏死因子(TNF)的人源化单克隆抗体；
8.权利要求6的人源化单克隆抗体，其中所说的人源化单克隆抗体是抗HER2抗原的人源化单克隆抗体。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Yu Yongli Document name: Notification of Termination of Patent Right |
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| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20050406 Termination date: 20101008 |