CN111793035B - 一种n4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向ddr1抑制剂及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种N4‑(3‑甲氧基苯基)‑嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂及其制备方法与应用。本发明的N4‑(3‑甲氧基苯基)‑嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂表现出可缓解非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞PC‑9G，并对另外3株DDR1高表达的细胞具有一定的抗肿瘤活性。根据抗肿瘤活性测试结果，化合物D 06在PC‑9G细胞中表现出了优于先导药Yfq07的生物活性；并对DDR1高表达的A549,A431和HCT116都表现出了较好的活性(IC50＝1.20～2.53μM)，且接近或优于先导药Yfq07；DDR1激酶测试结果显示，在10μM浓度下抑制率达76.2％，选择性较先导药Yfq07高出3倍多；同时，经Western blot实验证实化合物D 06能够抑制PC‑9G细胞中DDR1的磷酸化。

Description

一种N4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂及其制 备和应用
技术领域
本发明涉及医药化学技术领域，尤其涉及一种N4-(3-甲氧基苯基)-N6- 取代嘧啶-4,6-二胺类靶向DDR1可缓解PC-9G细胞化合物及其制备方法与抗肿瘤活性的应用。
背景技术
盘状结构域受体(DDR)是1990年代初发现的跨膜受体酪氨酸激酶 (RTK)超家族的成员，由于它们在细胞外结构域中存在着盘状蛋白基序，从而与其他RTK区别开来。目前，典型的RTK使用类似肽的生长因子作为配体，但DDR能被细胞外基质(ECM)最丰富的成分——胶原蛋白激活。研究人员已经鉴定了两种类型的DDR，包括DDR1和DDR2。其中， DDR1可以与迄今报道的几乎所有类型的胶原蛋白结合；同时DDR1在肺、肾、结肠和大脑的上皮细胞中有广泛表达；在基本细胞过程的调节中发挥重要作用，包括增殖，存活，分化，粘附和基质重塑，并与许多人类疾病密切相关，包括各种癌症、纤维化疾病和动脉粥样硬化等。
化合物Yfq07是本单位早期自主研发，设计合成的靶向EGFR的小分子抑制剂。在对其随后的生物活性进一步研究过程中，通过蛋白组学实验 (如图1)发现在吉非替尼耐药的PC-9G细胞中，EGFR的表达水平显著降低，而DDR1的表达水平异常升高，在加入了化合物Yfq07的耐药细胞中DDR1的表达被明显抑制。因此，我们推测在吉非替尼耐药的PC-9G 细胞中EGFR通路被阻断的同时，可能发生了DDR1旁路信号通路的激活。而化合物Yfq07能够明显降低DDR1的表达，进而对PC-9G细胞产生一定的抑制作用。大量的文献查询后，发现DDR1作为吉非替尼耐药的旁路信号激活在非小细胞肺癌中，罕有报道。因此，为进一步验证此新发现，我们选择以Yfq07为先导进行结构修饰，以求获得靶向DDR1选择性更高、活性更好的抗肿瘤药物。
Figure BDA0002551249960000021
发明内容
本发明提供了一种N4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂以及制备和应用，该N4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂同现有技术相比，具有更好的抗肿瘤活性。
一种N4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂，结构式如下：
Figure BDA0002551249960000022
其中，R为取代或者未取代的苯环或杂芳环；
所述的苯环或杂芳环上的取代基为卤素、甲基、甲氧基、三氟甲基、硝基中的一种或者多种。
作为优选，所述的N4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂为化合物D 01～06、Z 07中的一种，化合物D 01～06、Z 07的R如表1 所示：
Figure BDA0002551249960000023
作为最优选，所述的N4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂，为化合物N4-(3-甲氧基苯基)-N6-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)嘧啶-4,6-二胺(D 06)，化学结构如下：
Figure BDA0002551249960000031
本发明还提供了一种所述的N4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向 DDR1抑制剂的方法，包括以下步骤：
(1)4,6-二氯嘧啶和3-甲氧基苯胺在DIPEA作用下反应，得中间体6-氯-N-(3-甲氧基苯基)嘧啶-4-胺；
(2)中间体6-氯-N-(3-甲氧基苯基)嘧啶-4-胺与4-((4-甲基哌嗪-1-基) 甲基)-3-(三氟甲基)苯胺在碱、配体和钯催化剂的作用下发生反应，得到所述的N4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂。
该制备方法具体包括以下步骤：
(1)称取原料4,6-二氯嘧啶(1.8g,12.1mmol)及3-甲氧基苯胺(1g, 8.1mmol)，加入到100mL单口圆底烧瓶，溶解于20mL无水乙醇中。超声待其充分溶解后，滴加DIPEA(1.6mL,9.7mmol),于80℃下加热回流8 ～12h，以TLC法监测反应进程。反应结束后，加入适量柱层析硅胶，旋干制砂，经柱层析色谱法分离提纯，干燥称量，得中间体6-氯-N-(3-甲氧基苯基)嘧啶-4-胺1.5g，产率为79.8％，熔点为153.3～155.6℃；
(2)取一100mL干燥的三颈圆底烧瓶，依次加入中间体6-氯-N-(3- 甲氧基苯基)嘧啶-4-胺(280mg,1.2mmol)、4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯胺(273mg,1mmol)、碳酸铯(490mg,1.5mmol)、Xantphos(25mg, 0.04mmol)、Pd2(dba)3(20mg,0.02mmol)。在氮气保护下，加入20mL无水二氧六环，于95℃下加热回流12～24h，以TLC法监测反应进程。反应结束后，加入适量柱层析硅胶，减压浓缩反应液，旋干制砂，经柱层析色谱法分离提纯，干燥称量。经ESI-HRMS,1H-NMR,13C-NMR,UPLC鉴定结果；得到目标化合物，熔点217.6～219.0℃，产率28.37％；
本发明还提供了一种所述的N4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向 DDR1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抗肿瘤药物用于***。
作为优选，所述的抗肿瘤药物用于治疗肺癌；作为最优选，所述的肺癌为非小细胞肺癌。
本发明的N4-(3-甲氧基苯基)-取代嘧啶二胺类表现出一定的抗肿瘤活性。根据抗肿瘤活性测试结果，化合物D 06表现出了优于先导药Yfq07 的生物活性；并对DDR1高表达的A549,A431和HCT116都表现出了优秀的活性(IC50＝1.20～2.53μM)；而对DDR1激酶活性测试，也表现出了较高的选择性；经western blot实验证实D 06能够抑制PC-9G细胞中DDR1的磷酸化。
附图说明
图1为差异蛋白磷酸化位点定量信息。
图2为化合物D 06对PC-9G细胞中DDR1磷酸化的抑制结果。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例1化合物的合成
1.1化合物的具体合成路线如下所示:
Figure BDA0002551249960000041
化合物D 01～06、Z 07的合成路线：a:CH3CH2OH,DIPEA,80℃,8～12 h；b:1,4-Dioxane,Cs2CO3,Pd2(dba)3,Xantphos,95℃,N2,12-24h
1.2合成步骤
化合物D 01～06、Z 07的合成
a.称取原料4,6-二氯嘧啶(1.8g,12.1mmol)及3-甲氧基苯胺(1g, 8.1mmol)，加入到100mL单口圆底烧瓶，溶解于20mL无水乙醇中。超声待其充分溶解后，滴加DIPEA(1.6mL,9.7mmol),于80℃下加热回流 8～12h，以TLC法监测反应进程。反应结束后，加入适量柱层析硅胶，旋干制砂，经柱层析色谱法分离提纯，干燥称量，得中间体6-氯-N-(3-甲氧基苯基)嘧啶-4-胺1.5g，产率为79.8％，熔点为153.3～155.6℃；
b.取一100mL干燥的三颈圆底烧瓶，依次加入中间体6-氯-N-(3- 甲氧基苯基)嘧啶-4-胺(280mg,1.2mmol)、杂环取代苯胺(1mmol)、碳酸铯 (490mg,1.5mmol)、Xantphos(25mg,0.04mmol)、Pd2(dba)3(20mg,0.02mmol)。在氮气保护下，加入20mL无水二氧六环，于95℃下加热回流12～24h，以TLC法监测反应进程。反应结束后，加入适量柱层析硅胶，减压浓缩反应液，旋干制砂，经柱层析色谱法分离提纯，干燥称量，计算产率，测熔点，经ESI-HRMS,1H-NMR,13C-NMR,UPLC鉴定结果；
1.3实验结果
合成的所有目标化合物结构如上表1所示；合成的包括活性化合物在内的部分目标化合物的ESI-HRMS,1H-NMR,13C-NMR,UPLC等理化数据如下：
N4-(3-methoxyphenyl)-N6-(quinolin-3-yl)pyrimidine-4,6-diamine(D 01)
Figure BDA0002551249960000051
Chemical Formula:C20H17N5O；Yield/％:57.61％；MP:203.5～205.8℃；UPLC:Purity: 100.0％；HRMS(ESI)for C20H17N5O[M+H]+,calcd:343.1442.Found:343.1438.；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.71(s,1H,Ar-H),9.29(s,1H,Ar-H),8.94(s, 1H,-NH-),8.74(s,1H,Ar-H),8.41(s,1H,Ph-H),7.93(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.88(d,1H, J＝7.5Hz,Ar-H),7.56(m,2H,Ar-H),7.23(m,2H,-NH-+Ar-H),7.14(d,1H,J＝7.6Hz, Ph-H),6.59(d,1H,J＝7.6Hz,Ph-H),6.32(s,1H,Ar-H),3.75(s,3H,-OCH3)；13C-NMR (125MHz,DMSO-d6):160.5,160.3,159.7,157.7,145.4,143.2,141.4,134.5,129.5,128.4, 128.1,127.2,126.9,120.8,112.3,107.3,105.9,87.5,59.7,55.0；
N4-(3-methoxyphenyl)-N6-(quinazolin-4-yl)pyrimidine-4,6-diamine(D 03)
Figure BDA0002551249960000061
Chemical Formula:C19H16N6O；Yield/％:65.98％；MP:206.4～209.7℃；UPLC:Purity: 100.0％；HRMS(ESI)for C19H16N6O[M+H]+,calcd:344.1446.Found:344.1441.；1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.37(s,1H,Ar-H),9.67(s,1H,-NH-),8.35(s, 1H,Ar-H),8.75(d,1H,J＝8.2 Hz,Ar-H),8.51(s,1H,Ph-H),8.10(s,1H,-NH-),7.91(m, 2H,Ar-H),7.66(t,1H,J＝7.5 Hz,Ar-H),7.44(s,1H,Ar-H),7.25(m,2H,Ph-H),6.60(d, 1H,J＝7.0Hz,Ph-H),3.77(s,3H,-OCH3)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):161.7,161.1, 156.3,152.8,150.6,149.8,143.4,132.0,130.5,128.8,127.8,126.4,116.2,110.8,110.1, 108.5,99.4,82.6,55.8；
N4-(3-methoxyphenyl)-N6-(4-((4-methylpiperazin-1-yl)methyl)-3-(trifluoromethyl)phen yl)pyrimidine-4,6-diamine(D 06)
Figure BDA0002551249960000062
Chemical Formula:C24H27F3N6O；Yield/％:28.37％；MP:217.6～219.0℃；UPLC:Purity: 90.8％；HRMS(ESI)for C24H27F3N6O[M+H]+,calcd:472.2254.Found:472.2249.；1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.54(s,1H,Ar-H),9.26(s,1H,Ph-H),8.33(s, 1H,Ph-H),8.05(s,1H,-NH-),7.86(d,1H,J＝8.0 Hz,Ph-H),7.60(d,1H,J＝8.5 Hz,Ph-H), 7.20(m,2H,-NH-+Ar-H),7.12(d,1H,J＝8.0 Hz,Ph-H),6.57(d,1H,J＝7.0 Hz,Ph-H), 6.22(s,1H,Ar-H),3.74(s,3H,Ph-H),3.53(s,2H,-CH2-),2.43(br s,8H),2.24(s,3H, -CH3)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):160.5,160.2,159.7,157.6,141.4,139.9,131.3, 129.4,122.3,112.3,107.2,105.8,87.3,57.3,54.9,54.4,52.1,45.1；
N4-(2,5-dimethoxypyrimidin-4-yl)-N6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine-4,6-diamine (Z 07)
Figure BDA0002551249960000071
Chemical Formula:C17H18N6O3；Yield/％:67.45％；MP:197.4～199.0℃；UPLC:Purity: 100.0％；HRMS(ESI)for C17H18N6O3[M+H]+,calcd:354.1447.Found:354.1439.；1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.66(s,1H,-NH-),8.38(s,1H,Ar-H),8.29(s, 1H,Ar-H),8.03(s,1H,Ph-H),7.74(s,1H,-NH-),7.33(s,1H,Ar-H),7.22(m,2H,Ph-H), 6.60(m,1H,J＝3.0 Hz,Ph-H),3.90(s,3H,-OCH3),3.82(s,3H,-OCH3),3.75(s,3H, -OCH3)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):161.4,159.6,158.1,157.5,156.2,151.2,141.1, 137.4,136.6,129.4,112.6,107.8,106.2,92.1,57.1,54.9,54.3；
本发明所合成目标化合物的性状及其溶解性如下：
目标化合物的产率都比较理想，大部分能达到60～90％，个别化合物如D 06产率只有20～30％；颜色主要为白色或淡黄色。化合物极性普遍较大，所有化合物均不溶于石油醚、正己烷等极性小的溶剂，部分可微溶于乙酸乙酯；除D 04难溶于DMSO、DCM、MeOH外，其余目标化合物均可溶于DMSO、DCM等。
本发明合成的目标化合物，质谱结果：所有化合物可见[M+H]+分子离子峰，其中大部分化合物除[M+H]+的分子离子峰外，还可见丰度更高的 1/2[M+H]+离子峰；1H-NMR谱图结果，所有化合物氢数及相应化学位移，耦合常数等皆可与相应化合物理论值相符；13C-NMR谱图结果，所有化合物碳峰位移及数目皆与理论数据相符；
实施例2化合物抗肿瘤细胞活性
2.1MTT法测试化合物抗肿瘤活性
本实验通过MTT法对非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞PC-9G、非小细胞肺癌细胞A549、人表皮癌细胞A431和结肠癌细胞HCT-116，进行细胞存活率的检测。将处于对数生长期的各肿瘤细胞(PC-9G、A549、A431 和HCT-116)分别培养于96孔板中，铺板浓度在每孔约5×103个细胞，在充满5.0％CO2的37℃恒温条件下培养24h；显微镜下观察，待细胞贴壁后给予以DMSO溶解的终浓度为：不同浓度的先导化合物Yfq07及活性较好的目标化合物D 06溶液1μL。待给药培养48h后，向每孔中加入20μL以PBS溶解为5mg/mL的MTT溶液并继续培养4h，观察发现形成肉眼可见的甲瓒沉淀；小心弃去每孔中的溶液，并向每孔中加入150 μLDMSO，用于溶解甲瓒晶体，并在振荡器上均匀振荡10min；最后用酶标仪检测每孔在490nm处紫外吸收波长的吸光值，并通过换算，计算出相应的细胞存活率，抑制率及IC50值。本实验需进行至少三次重复实验。
2.2实验结果
通过MTT法对筛选出的活性化合物D 06和先导药Yfq07在DDR1 高表达的非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞PC-9G、非小细胞肺癌细胞 A549、人表皮癌细胞A431和结肠癌细胞HCT-116进行了IC50值的测定，相应的实验结果见表2；
表2：活性化合物D 06的IC50(μM)
Figure BDA0002551249960000091
结果表明：化合物D 06在A549、A431、HCT116细胞中均表现出较好的抑制效果，IC50值在1.20～2.53μM之间；此外，在PC-9G细胞中IC50值为0.74±0.03μM，优于先导Yfq07。
实施例3化合物对DDR1激酶抑制活性
3.1 DDR1激酶实验
本实验通过使用LanthaScreen Eu激酶活性测定技术，在10μL的小体积384孔板中进行激酶反应来评估目标化合物对DDR1激酶的抑制作用。反应缓冲液中的激酶由50mMHEPES pH 7.5、0.01％BRIJ-35、10mM MgCl2和1mM EGTA组成，测定中荧光素-聚GAT底物(Invitrogen，美国)的浓度为100nM。在一系列稀释液的存在下，添加100nM ATP引发激酶反应。使反应在室温下进行1小时，然后加入10μL EDTA(20mM) 和TR-FRET稀释缓冲液中的Eu标记抗体(4nM)。测定孔中抗体的终浓度为2nM，EDTA终浓度为10mM。将该板在室温下再孵育一小时，然后在PerkinElmer EnVision多标记阅读器(Perkin-Elmer，Inc.)上获得665 nm/340nm的TR-FRET发射比。使用GraphPad Prism4软件进行曲线拟合和数据分析。
3.2实验结果
Figure BDA0002551249960000092
Figure BDA0002551249960000101
注：Yfq07为先导化合物。所有化合物测试浓度均为10μM，每个化合物至少进行三次实验。
结果表明：(1)先导化合物Yfq07的DDR1激酶抑制率为22.1％；(2) 在目标化合物中，D 01、D 04、D 06对DDR1激酶抑制率优于先导化合物Yfq07；(3)化合物D 06是目标化合物中DDR1激酶抑制活性最好的，对DDR1激酶抑制率达到76.2％。
实施例4化合物D 06对PC-9G细胞中DDR1的抑制
4.1免疫印迹法测DDR1的磷酸化抑制作用
本实验采用Western blot法对活性最好的目标化合物在蛋白水平上进行检测。将非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞PC-9G铺满于6孔板中，在 37℃恒温的充满5.0％CO2条件下饥饿培养24h；次日，给以0μM，2.5 μM，5μM，10μM待测活性化合物，10μM先导化合物Yfq07继续培养 24h；收集细胞，以PBS洗涤三次，并加入现配的裂解液(总蛋白提取试剂:磷酸酶抑制剂:PMSF＝100:1:1)，放置于冰上裂解10min，刮下并收集蛋白；将收集的蛋白通过高速低温离心机在-4℃，12000r/min的条件下离心20min，收集上清液到干净的EP管中。通过标准蛋白曲线计算所需蛋白浓度，上样，进行SDS-PAGE电泳，之后将蛋白转移置PDVF 膜上，并用脱脂牛奶封闭，以TBST溶液清洗，放入相应的一抗中，于4℃冰箱孵育过夜；次日，回收且标记一抗，同时孵育相应的二抗；最后添加曝光液，使用曝光仪进行检测。
4.2实验结果
为了探究活性化合物D 06对DDR1蛋白的作用，选择了非小细胞肺癌吉非替尼耐药PC-9G细胞，通过Western blot实验检测活性化合物D 06在不同浓度对DDR1蛋白及DDR1磷酸化的抑制作用，如图2所示，图2为化合物D 06在不同浓度下DDR1磷酸化的抑制作用，其中Yfq07 为先导化合物。
结果表明：活性化合物D 06在2.5μM时即表现出明显的DDR1磷酸化抑制作用，且作用效果强于先导化合物Yfq07。此外，D 06在10μM时，对DDR1蛋白总量有明显的抑制作用，且抑制效果优于相同浓度下的阳性对照。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种N 4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂，其特征在于，为化合物D 04或化合物D 06；
化合物D 04或D06的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
R的定义如下表：
化合物 R D 04 4-（吡啶-3-基）嘧啶-2-基 D 06 4-（（4-甲基哌嗪-1-基）甲基）-3-（三氟甲基）苯基
。
2.根据权利要求1所述的N 4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂，其特征在于，为化合物N 4-(3-甲氧基苯基)-N 6-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)嘧啶-4,6-二胺 (D 06)，化学结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
3.一种制备如权利要求2所述的N 4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）4,6-二氯嘧啶和3-甲氧基苯胺在DIPEA作用下反应，得中间体6-氯-N-(3-甲氧基苯基)嘧啶-4-胺；
（2）中间体6-氯-N-(3-甲氧基苯基)嘧啶-4-胺与4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯胺在碱、配体和钯催化剂的作用下发生反应，得到所述的N 4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂。
4.一种如权利要求1~2任一项所述的N 4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于***。
5.根据权利要求4所述的N 4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于治疗肺癌。
6.根据权利要求5所述的N 4-(3-甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肺癌为非小细胞肺癌。
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