CN108530450B - 具有egfr抑制活性的化合物、制备方法及其在疾病治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤化合物、制备方法及其在制备治疗有EGFR耐药型突变体介导疾病的药物中的用途，本发明化合物对EGFR T790M变异的肿瘤具有良好的选择性。

Description

具有EGFR抑制活性的化合物、制备方法及其在疾病治疗中的 应用

技术领域

本发明属于药物领域，具体涉及一种具有EGFR抑制活性的化合物、制备方法及其在疾病治疗中的应用。

背景技术

EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是跨膜蛋白酪氨酸激酶erbB受体家族的一员。第一代小分子EGFR抑制剂，包括吉非替尼和厄洛替尼，在肺癌治疗中显示出较好的疗效。然而经第一代小分子EGFR抑制剂治疗后，几乎所有的NSCLC患者均产生对此类小分子抑制剂的抗药性。其耐药机制包括EGFR继发突变、旁通路激活等。其中半数患者的耐药是由于T790M的继发突变，从而降低了药物与靶点的亲和力而产生抗药性，造成肿瘤的复发或病情进展。

第二代小分子EGFR抑制剂，如使afatinib等，但由于afatinib对野生型EGFR具有更强的抑制作用，造成严重的皮肤和胃肠道毒性而限制了给药剂量，没有显示出治疗效果。

因此，有必要开发第三代小分子EGFR抑制剂，能高选择性抑制EGFR T790M突变体，而对野生型EGFR没有或低度活性。目前报道了多类第三代小分子EGFR抑制剂，如公开于CN201180030338.6，以及公开于CN201180060966.9、CN201280033773.9等专利文献中，其中AZD-9291已经获得FDA批准上市。

发明内容

发明人通过研究，发现了一系列全新结构的具有抑制L858R EGFR突变体、T790MEGFR突变体和外显子19缺失激活突变体活性的化合物。在预防或治疗各类癌症，如非小细胞肺癌药物中的展现出良好的应用前景。

本发明一方面提供一种式I化合物

其中所述的R₁和R₂独立地选自氢、烷基、卤素；

R₃任选自烷基、烷氧基、卤代烷氧基；

R₄和R₅独立地选自氢、烷基、取代烷基、-(CH₂)n-NR₆R₇、R₆R₇N-(CH₂)n-；或R₄、R₅形成环，所述环可以被一个或两个N原子取代；

R₆、R₇为H、甲基、乙基；

n为0～4的整数。

本发明再一方面提供一种式I化合物

其中R₁和R₂独立地选自氢、甲基、氟、氯；

R₃为C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、全卤代C₁-C₄烷氧基或部分卤代C₁-C₄烷氧基；在本发明的一个优选实施方案中，R₃为甲基、甲氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基；

R₄、R₅独立地选自氢、C₁-C₆烷基、-(CH₂)n-NR₆R₇、R₆R₇N-(CH₂)n-；或R₄、R₅形成环，所述环可以被一个N原子取代；本发明的一个优选实施方案中，R₄R₅N-为哌啶基或4-甲基哌嗪基；R₆、R₇独立地选自氢、甲基；

n为0～2的整数。

本发明的一个优选实施方案中，R₃为甲基、甲氧基、三氟甲氧基。

本发明的一个优选实施方案中，R₄R₅N-为4-甲基哌嗪基。

本发明的一个优选实施方案中，n为1。

本发明的优选化合物包括：

本发明再一方面提供一种式I化合物的合成方法，

其中X为卤素、羟基、烷氧基；R₁～R₅如式I的定义；所述方法通过式II与式III在缩合试剂的条件下反应制备，所述的缩合剂为缩合反应常规的缩合剂，如二环己基碳二亚胺。

本发明再一方面提供一种式II的制备方法，

所述式II的制备方法可以参考Hiroki Wada等人发表于TetrahedronLetters.53,2012,Page1720–1724中的方法，其中R₁～R₅如式I的定义；Y为卤素，优选为氟、氯、溴、碘。

本发明再一方面提供一种含有式I化合物的药物制剂，可以为口服给药的固体剂型，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂等，相应的剂型可为速释、缓释、肠溶等。在固体剂型中，本发明式I化合物与一种或多种赋形剂混合，所述赋形剂包括但不限于增溶剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等。增溶剂选择制剂中常用的组分，如淀粉、蔗糖、甘露醇等；粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素等；崩解剂如羧甲基淀粉钠、低取代纤维素、交联聚维酮等；表面活性剂如多元醇、聚山梨酯、烷基磺酸钠等；润滑剂如滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙等。

本发明再一方面提供一种含有式I化合物在制备治疗癌症疾病中的用途，所述癌症为EGFR诱导的癌症，非限制性的癌症如非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腺癌等，所述癌症优选具有L858R突变或T790M突变或L858R突变和T790M突变。

具体实施方式

本发明化合物的结构通过核磁共振(NMR)以及质谱(MS)确证。NMR化学位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)，氘代甲醇(CD₃OD)和氘代氯仿(CDCl₃)，内标为四甲基硅烷(TMS)。

在无特殊说明的情况下，本发明的所有反应均在连续的磁力搅拌下，在干燥氮气或氩气氛下进行，溶剂为干燥溶剂，室温反应为20-25℃条件下。除非特别说明，本发明制备方法所用试剂均为市售购得后直接使用，起始原料参考现有技术的方法合成。

实施例1中间体A4的制备

步骤1

于反应瓶内将化合物A1(2g,8.0mmol)溶于乙腈(100mL)中，室温下滴加三乙胺(0.45g,8.8mmol)，后回流反应5h，加入稀盐酸水溶液，乙酸乙酯萃取3次(300mL)，碳酸氢钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，得到化合物A2(1.6g，产率87.9％)。

步骤2

于反应瓶内将化合物A2(1.6g,7.04mmol)溶于四氢呋喃(100mL)中，冷却至-78℃，滴加正丁基锂的正己烷溶液(14.1mmol,2.0eq)，搅拌反应0.5h后，滴加对甲基苯磺酰叠氮(2.08g,10.56mmol)的四氢呋喃溶液(50mL)，继续搅拌反应0.5h后，升至室温，用氯化铵溶液洗涤，***(400mL)萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥后，进入下一步反应。向上述反应液加入Pd/C(0.2eq)通氢气还原，回流反应3h，过滤，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后减压旋干，制备得到化合物A3(0.8g,产率82.2％)。

步骤3

于反应瓶内将化合物A3(0.8g，5.79mmol)溶于乙醇溶液(100mL)中，加入CsCO₃(1.68g,8.68mmol)，加入丙烯酸乙酯(5.91mmol,1.02eq)，加热回流反应至无起始化合物，冷却至室温，过滤，用二氯甲烷溶液(400mL)萃取，合并有机相用无水硫酸钠干燥，制备得到中间体化合物A4(0.8g，产率71.9％)。MS m/z(ESI):193.1[M+1]

实施例2化合物1的制备

步骤1

将2-甲氧基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)-苯胺(1.0g，4.52mmol)，加入四氢呋喃50mL，加入三乙胺(0.91g,9.04mmol)置于150mL圆底烧瓶内，搅拌下加入4-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)甲酸乙酯(0.934g,4.56mmol)，回流反应6h，反应结束后，蒸除溶剂，加水稀释并用乙酸乙酯萃取(150mL)，有机相分别用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析纯化后得到2-[2-甲氧基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)-苯胺基]-5-氟-嘧啶-4-基甲酸乙酯固体0.81g,产率46％。

步骤2

将步骤1得到的化合物2-[2-甲氧基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)-苯胺基]-5-氟-嘧啶-4-基甲酸乙酯(0.81g,2.08mmol)置于150mL反应瓶内，加入二甲苯50mL，加入三乙胺(0.42g,4.16mmol)，加入化合物A4(0.4g,2.08mmol)，在80-100℃反应10h，降至室温后，加水稀释并用乙酸乙酯萃取(250mL)，有机相分别用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析纯化后得到标题化合物1的固体0.72g，产率64.6％。MSm/z(ESI):535.3[M+1]

1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：10.10(s,1H),9.31(d,J＝9Hz,1H),7.42(s,1H),7.18(s,1H),6.49(dd,J＝16.7,10.1Hz,1H),6.37(m,1H),6.24(m,1H),,6.05(m,1H),6.0(br,1H),5.65(dd,J＝10.0Hz，2.0Hz,1H),4.35(s,2H),4.27(m,2H),3.89(m,2H),3.65(s,3H),3.35(br,4H),2.35(br,4H),2.23(s,3H)

实施例3化合物2的制备

参照实施例2制备化合物1的方法，用2-[2-甲氧基-4-(二甲氨基乙基)(甲基)氨基-苯胺基]-5-氟-嘧啶-4-基甲酸乙酯(1g,mmol)与化合物A4反应制备得到标题化合物2固体0.7g，产率62.6％。MS m/z(ESI):538.3[M+1]

1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：10.07(s,1H),9.31(d,J＝9Hz,1H),7.42(s,1H),7.18(s,1H),6.49(dd,J＝16.7,10.1Hz,1H),6.37(m,1H),6.24(m,1H),6.05(m,1H),6.0(br,1H),5.65(dd,J＝10.0Hz，2.0Hz,1H),4.35(s,2H),4.27(m,2H),3.89(m,2H),3.65(s,3H),3.45(br,2H),2.72((s,3H),2.45(br,2H),2.23(s,6H)

实施例4化合物3的制备

参照实施例2制备化合物1的方法，用2-[2-甲氧基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)-苯胺基]-6-氯-嘧啶-4-基甲酸乙酯(1g,mmol)与化合物A4反应制备得到标题化合物3固体0.5g，产率45.4％。MS m/z(ESI):552.2[M+1]

1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：10.10(s,1H),7.94(s,1H),7.42(s,1H),7.18(s,1H),6.49(dd,J＝16.7,10.1Hz,1H),6.37(m,1H),6.24(m,1H),6.05(m,1H),6.0(br,1H),5.65(dd,J＝10.0Hz，2.0Hz,1H),4.35(s,2H),4.27(m,2H),3.89(m,2H),3.65(s,3H),3.35(br,4H),2.35(br,4H),2.23(s,3H)

实施例5化合物4的制备

参照实施例2制备化合物1的方法，用2-[3-三氟甲氧基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)-苯胺基]-5-氯-嘧啶-4-基甲酸乙酯(1g,mmol)与化合物A4反应制备得到标题化合物4固体0.55g，产率41.7％。MS m/z(ESI):606.2[M+1]

1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：10.10(s,1H),8.54(s,1H),7.42(s,1H),7.18(s,1H),6.49(dd,J＝16.7,10.1Hz,1H),6.37(m,1H),6.24(m,1H),6.05(m,1H),6.0(br,1H),5.65(dd,J＝10.0Hz，2.0Hz,1H),4.35(s,2H),4.27(m,2H),3.89(m,2H),3.35(br,4H),2.35(br,4H),2.23(s,3H)

参照上述制备方法，本发明进一步非限制性的包括以下结构化合物：

实施例10生物学测试

1.EGFR T790M突变型酶学实验

本实验采用荧光共振能量转移(TR-FRET)的方法测试化合物对外显子20T790M突变型EGFR酶的抑制作用，并得出化合物对该酶活性的半数抑制浓度IC₅₀。

1)在96孔板中加入1～5ul EGFR T790M酶溶液，酶终浓度为0.1～1nM。

2)加入1～5ul梯度稀释好的待测化合物溶液，室温孵育10分钟。

3)加入1～5ul底物混合液包含底物多肽终浓度5～50nM和ATP终浓度1～10uM，室温孵育0.5～2小时。

4)加入5ul EDTA终止液终止反应5分钟。

5)加入5ul含标记抗体的检测液，室温孵育1小时。

6)酶标仪测定各板的665nm荧光信号值。

7)通过荧光信号值计算抑制率。

8)根据不同浓度的抑制率通过曲线拟合得出化合物的IC₅₀。

2.EGFR野生型(WT)酶学实验

本实验采用荧光共振能量转移(TR-FRET)的方法测试本发明化合物化合物对野生型EGFR酶的抑制作用，并得出化合物对该酶活性的半数抑制浓度IC₅₀。

1)在96孔板中加入1～5ul EGFR野生型酶溶液，浓度为0.1～1nM。

2)加入1～5ul梯度稀释好的化合物溶液。

3)室温孵育10分钟。

4)加入1～5ul底物混合液包含底物多肽终浓度5～50nM和ATP终浓度0.1～5uM。

5)室温孵育0.5～2小时。

6)加入5ul EDTA终止液终止反应5分钟。

7)加入5ul含标记抗体的检测液，室温孵育1小时。

8)酶标仪测定各板的665nm荧光信号值。

9)通过荧光信号值计算抑制率。

10)根据不同浓度的抑制率通过曲线拟合得出化合物的IC₅₀。

根据以上方法，测定本发明化合物的IC₅₀如下表：

本发明实施例对EGFR突变型激酶具有很强的抑制活性，同时对野生型激酶具有较弱的抑制活性，显示出非常优异的选择性。

Claims (4)

1.一种如下化合物：

2.一种药物组合物，其含有权利要求1所示化合物(1)以及药学上可接受的载体。

3.权利要求1所述化合物在制备治疗有EGFR耐药型突变体介导疾病的药物中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的EGFR耐药型突变体为EGFR T790M突变体。