TW202043268A - 產生異二聚體抗體之方法 - Google Patents

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麥可 卡帕迪
喬瑟夫 沙奇亞馬
傑佛瑞 柯亨
安德魯 迪索
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美商健生生物科技公司
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Abstract

本發明係關於產生異二聚體抗體之方法。

Description

產生異二聚體抗體之方法
本發明係關於產生異二聚體抗體之方法。
單株抗體已證明其作為治療分子的成功，特別是在治療癌症上。預期雙特異性抗體會增加單株抗體療法之效力及療效，這是因為其可用於將藥物或毒性化合物定向至目標細胞，用於將效應機制重定向至疾病相關部位，或者用於增加對腫瘤細胞的特異性，例如藉由與一或多種在腫瘤細胞上表現的目標分子結合。此外，藉由將兩種單株抗體的特異性組合於一種抗體中，雙特異性抗體可能涉及較大量的作用機制。
不同格式之雙特異性抗體及其產生方法已有說明，然而在藉由最佳化製造程序以大規模產生雙特異性抗體上存在著挑戰。
本發明提供一種產生異二聚體抗體之方法，其包含：
提供第一同型二聚體抗體，該第一同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第一Fc區，該第一Fc區包含第一CH3區；及第二同型二聚體抗體，該第二同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第二Fc區，該第二Fc區包含第二CH3區，其中該第一 CH3區與該等第二CH3區之胺基酸序列不同，且係使得在該第一CH3區與該第二CH3區之間的異二聚體交互作用較在該第一CH3區之間的同型二聚體交互作用或該第二CH3區之間的同型二聚體交互作用強；
將該第一同型二聚體抗體與該第二同型二聚體抗體組合成混合物；及
在還原劑及周圍溶解氧(DO2)存在下孵育該混合物，以產生該異二聚體抗體，其中該方法在產生該異二聚體抗體期間缺少下列中之一或多個步驟：測量該混合物中之DO2百分比(%)、控制該混合物中之該DO2%、或將氧添加至該混合物中。
本發明亦提供一種產生異二聚體抗體之方法，其包含：
提供第一同型二聚體抗體，該第一同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第一Fc區，該第一Fc區包含第一CH3區；及第二同型二聚體抗體，該第二同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第二Fc區，該第二Fc區包含第二CH3區，其中該第一CH3區與該等第二CH3區之胺基酸序列不同，且係使得在該第一CH3區與該第二CH3區之間的異二聚體交互作用較在該第一CH3區之間的同型二聚體交互作用或該第二CH3區之間的同型二聚體交互作用強；
將該第一同型二聚體抗體與該第二同型二聚體抗體組合成混合物；
在還原劑存在下孵育該混合物；及
移除該還原劑以產生該異二聚體抗體，其中
該還原劑存在下孵育該混合物之步驟期間、移除該還原劑以產生該異二聚體抗體之步驟期間、或在該還原劑存在下孵育該混合物及移除該還原劑以產生該異二聚體抗體之步驟期間，溶解氧(DO2)百分比(%)經控制為約30%或更低。
〔圖1〕顯示Fab臂交換的彙總。
〔圖2〕顯示在使用Fab臂交換來製造雙特異性抗體期間，還原及超濾(ultrafiltration)/透析過濾(diafiltration)(UF/DF)期間的程序步驟。
〔圖3〕顯示硫醇-雙硫交換(thiol-disulfide exchange)反應的分子細節
〔圖4〕顯示在2-MEA存在下進行Fab臂交換期間可發生的反應彙總。
〔圖5顯示UF/DF設置及DO2與pH感測器位置的草圖，其中RmV=相對毫伏特。
〔圖6〕顯示在UF/DF期間於低DO2條件下製造雙特異性抗體A之期間，在滲餘物(retentate)管路、滲透物管路、及入口管路中測量到的UF/DF期間之DO2百分比(%)。a.s.：空氣飽和(air saturated)。
〔圖7〕顯示在UF/DF期間於低DO2條件下製造雙特異性抗體B之期間，在滲餘物管路、滲透物管路、及入口管路中測量到的UF/DF期間之DO2百分比(%)。a.s.：空氣飽和。
〔圖8〕顯示在低DO2條件(低DO還原)或在周圍DO2(目標還原)下，於還原期間隨時間的DO2百分比(%)。a.s.：空氣飽和。
定義
所有在本說明中引用、包括但不限於專利及專利申請文件之發表文獻在此全部併入作為參照。
應理解的是，本文中所使用的用語僅用於描述特定實施例，且不意欲為限制性。除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學用語，均與具有本發明有關技藝之通常知識者所一般了解之意義相同。
雖然任何類似或等效於本文中所述者之方法及材料可用於測試本發明之實務中，本文中仍描述例示性材料及方法。在描述及請求本發明時，將使用下列用語。
如於本說明書及隨附的申請專利範圍中所使用，除非內文另有明確規定，否則單數形式的「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱。因此，例如對於「一細胞(a cell)」之指稱包括兩或更多個細胞之組合與類似者。
連接詞「包含(comprising)」、「基本上由...組成(consisting essentially of)」、及「由...組成(consisting of)」意欲意味著彼等在專利語言中一般公認的意義；亦即，(i)「包含(comprising)」與「包括(including)」、「含有(containing)」、或「其特徵在於(characterized by)」同義，係包括式或開放式，且不排除額外、未列舉之元件或方法步驟；(ii)「由...組成」排除請求項中未指明的任何元件、步驟、或成分；且(iii)「基本上由...組成」將請求項的範疇限制在所指明的材料或步驟「及不實質影響(所請發明的)(多個)基本及新穎特徵者」。以片語「包含」(或其均等詞)描述的實施例亦提供以「由...組成」及「基本上由...組成」所獨立描述之實施例。
「抗體(antibody)」係指具有藉由雙硫鍵互連之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)的免疫球蛋白分子。各重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區，重鏈恆定區分成CH1區、鉸鏈區、CH2區、及CH3區。各輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。VH及VL可進一步細分成散佈於架構區(FR)的多個高 變區，其被稱為互補決定區(CDR)。各VH及VL係由三個CDR及四個FR區段構成，按照下列順序從胺基至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。抗體包括單株抗體(包括鼠類、人類、人源化、及嵌合抗體)、雙特異性抗體、或多特異性抗體。
「互補決定區(complementarity determining region,CDR)」係結合抗原之抗體區。VH中有三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，且VL中有三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。CDR可使用各種描繪來定義，諸如Kabat(Wu et al.(1970)J Exp Med 132：211-50)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia(Chothia et al.(1987)J Mol Biol 196：901-17)、IMGT(Lefranc et al.(2003)Dev Comp Immunol 27：55-77)、及AbM(Martin and Thornton(1996)J Bmol Biol 263：800-15)。描述各種描繪與可變區編號之間之對應(參見，例如Lefranc et al.(2003)Dev Comp Immunol 27：55-77；Honegger and Pluckthun,J Mol Biol(2001)309：657-70；國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics,IMGT)資料庫；網路資源，http：//www_imgt_org)。可用程式(諸如UCL Business PLC之abYsis)可用於描繪CDR。本文中所使用之用語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」及「LCDR3」包括由上述Kabat、Chothia、IMGT、或AbM中的任何方法定義的CDR，除非在說明書中另有明確說明。
免疫球蛋白可被分為下列五大類：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，取決於重鏈恆定區胺基酸序列。IgA及IgG被進一步細分為同型IgA1、 IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可被分為兩種明確不同類型(即kappa(κ)及lambda(λ))中之一者，其視其恆定域的胺基酸序列而定。
「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」係指免疫球蛋白分子之保留親本全長抗體之抗原結合性質的部分。例示性抗原結合片段係重鏈互補決定區(HCDR)1、2、及/或3、輕鏈互補決定區(LCDR)1、2、及/或3、VH、VL、VH及VL、Fab、F(ab')2、Fd、及Fv片段、以及由一個VH域或一個VL域所組成的域抗體(dAb)。VH及VL域可經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計，其中VH/VL域會進行分子內配對，或者在VH及VL域係由分開之鏈所表現之情況下則會進行分子間配對，以形成單價抗原結合部位，諸如單鏈Fv(scFv)或雙價抗體(diabody)；其係例如描述於下列中：國際專利公開號WO1998/44001、國際專利公開號WO1988/01649；國際專利公開號WO1994/13804；國際專利公開號WO1992/01047。
「單株抗體(monoclonal antibody)」係指自實質上均一的抗體分子群體獲得之抗體，亦即，除了可能熟知之改變之外包含該群體之個別抗體係同一的，該等改變諸如從抗體重鏈移除C端離胺酸或轉譯後修飾，諸如胺基酸異構化或脫醯胺化、甲硫胺酸氧化或天冬醯胺酸或麩醯胺酸脫醯胺化。單株抗體一般結合一種抗原表位。雙特異性單株抗體會結合兩種不同的抗原表位。單株抗體在抗體群內可能有異源醣化。單株抗體可係單特異性或多特異性的(諸如雙特異性的)、單價、二價、或多價的。
「Fab臂(Fab-arm)」係指抗體的一個重鏈-輕鏈對。
「同二聚化(homodimerization)」係指具有相同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。
「同型二聚體(homodimer)」係指具有兩個有相同CH3區胺基酸序列之重鏈的抗體。
「異二聚化(heterodimerization)」係指具有不同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。
「異二聚體(heterodimer)」係指具有兩個在CH3區之胺基酸序列中有一或多個胺基酸不同之重鏈的抗體。
「Fc區(Fc region)」或「Fc域(Fc domain)」係指包含鉸鏈區之至少一部分、CH2區、及CH3區的抗體區。Fc區可藉由下列產生：用木瓜酶(papain)消化抗體，或用胃蛋白酶分解(pepsing)，其中該Fc區係藉此獲得的片段(包括免疫球蛋白之一或兩個CH2-CH3區及鉸鏈區之一部分)。抗體重鏈之恆定域定義抗體同型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE。Fc區介導抗體與細胞表面Fc受體及補體系統之蛋白質的效應功能。
「CH1區(CH1 region)」或「CH1域(CH1 domain)」係指免疫球蛋白之CH1區。人類IgG1抗體之CH1區對應於胺基酸殘基118至215。然而，CH1區亦可係任何如本文中所述之其他抗體同型。
「CH2區(CH2 region)」或「CH2域(CH2 domain)」係指免疫球蛋白之CH2區。人類IgG1抗體之CH2區對應於胺基酸殘基231至340。然而，CH2區亦可係任何如本文中所述之其他抗體同型。
「CH3區(CH3 region)」或「CH3域(CH3 domain)」係指免疫球蛋白之CH3區。人類IgG1抗體之CH3區對應胺基酸殘基341至446。然而，CH3區亦可為任何本文所述之其他抗體同型。
「鉸鏈(hinge)」或「鉸鏈區(hinge region)」係指免疫球蛋白之鉸鏈區。人類IgG1抗體之鉸鏈區大致上對應於根據EU編號系統之胺基酸216至230。亦可將「鉸鏈」視為包括稱為上鉸鏈區及下鉸鏈區之額外殘基，諸如自胺基酸殘基216至239。
「混合物(mixture)」係指二或更多種抗體之水溶液。
「還原劑(reducing agent)」係指能夠將抗體絞鏈區中之鏈間雙硫鍵還原的試劑。
「符合GMP之條件(GMP-compliant condition)」係指在FDA強制執行之優良製造規範(CGMP)規定下進行製造。CGMP提供確保製造程序及設施之適當設計、監測、及控制的系統。遵守CGMP規定係藉由要求藥物製造商適當控制製造作業來確保藥品之同一性、劑型規格、品質、及純度。此包括建立強大的品質管理系統、獲得適當品質的原料、建立健全的作業程序、偵測及調查產品品質偏差、及維持可靠的測試實驗室。如果此正規的控制系統在製藥公司適當地付諸實踐，則其會幫助防止汙染、混淆(mix-up)、偏差、失敗、及失誤的情況。此確保藥品符合其品質標準。
「原料藥(drug substance)」或「DS」係指任何意欲用於製造藥物(藥用)產品之物質或物質混合物，且當用於產生藥物時，其變成該藥物產品之活性成分。此類物質意欲在疾病之診斷、治癒、減輕、治療、或預防中提供藥理活性或其他直接效應，或影響身體之結構或功能。
「藥品(drug product)」或「DP」係指含有活性醫藥成分(例如原料藥)的成品劑型(例如錠劑、膠囊、或溶液)，其通常但不一定與非活性成分結合。
「參考產品(reference product)」係指與生物相似藥產品比較的經核准之生物產品。除了其他方面外，參考產品係基於全面的安全性及有效性數據而獲得核准，且係在美國、歐洲、或日本中之至少一者獲得核准。
(經核准之參考產品/生物藥物)之「生物相似藥(biosimilar)」係指高度類似於參考產品的生物產品，儘管在不具臨床活性的組份上有微小差異，但在生物相似藥與參考產品之間，就安全性、純度、及效力而言不具有臨床上有意義的差異，此係基於衍生自下列之數據：(a)分析研究，其證明儘管在不具臨床活性的組份上有微小差異，但該生物產品高度類似於該參考產品；(b)動物研究(包括毒性評估)；及/或(c)(多個)臨床研究(包括免疫原性及藥物動力學或藥效動力學的評估)，其在一或多個適當的使用條件下足以證明安全性、純度、及效力，該等使用條件係該參考產品已獲得許可並意欲使用的條件、及針對該生物相似藥所尋求許可的條件。生物相似藥可係在藥局可取代參考產品的可互換產品，而無需開處方的醫療照護專業人員之介入。為了符合「可互換性(interchangeability)」的額外標準，預期生物相似藥會在任何給定患者中產生與參考產品相同的臨床結果，且若向個體投予生物相似藥多於一次，則在生物相似藥與參考產品之間交替或切換使用之安全性或療效減少方面的風險不大於使用該參考產品而無此類交替或切換的風險。在參考產品之機制為已知的情況下，生物相似藥針對所提出之使用條件利用相同的作用機制。針對生物相似藥提出之標籤中所規定、推薦、或建議的(多個)使用條件必須先前已 獲准用於參考產品。生物相似藥之投予途徑、劑型、及/或劑型規格(strength)必須與參考產品者相同，且生物相似藥必須在符合經設計以確保生物相似藥持續為安全、純淨、及有效之標準的設施中製造、加工、包裝、或存放。當相較於參考產品時，生物相似藥可在胺基酸序列中包括微小修飾，諸如不預期會改變生物相似藥性能之N或C端截短。參考產品可在美國、歐洲、或日本中之至少一者獲得核准。
「經單離(isolated)」係指已自製出該分子的系統(諸如重組細胞)的其他組分實質上分離及/或純化出之均質性分子族群(諸如合成多核苷酸或蛋白質，諸如抗體)、以及已經受至少一次純化或單離步驟的蛋白質。「經單離之抗體(isolated antibody)」係指實質上不含其他細胞材料及/或化學物的抗體，且涵蓋經單離成更高純度的抗體，諸如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純度。
「人源化抗體(humanized antibody)」係指至少一個CDR係衍生自非人類物種且至少一個架構係衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體可在架構中包括取代，所以該等架構可能不是所表現人類免疫球蛋白或人類免疫球蛋白生殖系基因序列的確切複製物。
「人類抗體(human antibody)」係指經最佳化以在投予至人類對象時具有最小免疫反應之抗體。人類抗體之可變區係衍生自人類免疫球蛋白序列。若人類抗體含有恆定區或恆定區的一部分，則該恆定區亦衍生自人類免疫球蛋白序列。如果該人類抗體的可變區係得自使用人類生殖系免疫球蛋白或重排(rearranged)免疫球蛋白基因的系統，則人類抗體包含「衍生自(derived from)」人源序列的重及輕鏈可變區。此等例示性系統係經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫(gene library)、及基因轉殖非人類動物(諸如帶有人類免疫球蛋白基因位點的小鼠或大鼠)。當相較於人類中表現之免疫球蛋白時，「人類抗體」一般含有胺基酸差異，這是由於用於獲得人類抗體及人類免疫球蛋白基因位點之系統之間的差異、引入體細胞突變或向架構或CDR或兩者中刻意引入取代。一般而言，「人類抗體」在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情況下，「人類抗體」可能含有自人類架構序列分析導出的共有架構序列，例如Knappik et al.,(2000)J Mol Biol 296：57-86中所述，或併入經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫的合成HCDR3，例如Shi et al.,(2010)J Mol Biol 397：385-96及WO2009/085462中所述。至少一種CDR係衍生自非人類物種的抗體不包括在「人類抗體」的定義中。
「重組(recombinant)」係指當來自不同來源之區段經連接以產生重組DNA、抗體或蛋白質時，藉由重組手段製備、表現、產生或單離之DNA、抗體及其他蛋白質。「重組抗體(recombinant antibody)」包括所有藉由重組手段來製備、表現、建立、或單離之抗體，諸如自經過人類免疫球蛋白基因之基因轉殖或染色體轉殖的動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤(於以下進一步描述)單離之抗體，自經轉形(transform)以表現抗體的宿主細胞單離之抗體，自重組的組合抗體庫單離之抗體，及藉由任何其他涉及將人類免疫球蛋 白基因序列剪接至其他DNA序列的手段來製備、表現、建立、或單離之抗體，或在體外使用Fab臂交換所產生的抗體(諸如雙特異性抗體)。
「雙特異性(bispecific)」係指特異性結合二種不同抗原或相同抗原內兩個不同表位的抗體。雙特異性抗體可對其他相關抗原具有交叉反應性，或者可結合二或更多個截然不同的抗原之間共有的表位。
「多特異性(multispecific)」係指特異性結合至少二種不同抗原或相同抗原內至少兩個不同表位的抗體。多特異性抗體可結合例如二、三、四或五種不同抗原或在相同抗原內不同的表位。
「約(about)」意指在特定值的可接受誤差範圍內，如所屬技術領域中具有通常知識者所判定，其將部分地取決於該值是如何測量或判定的，即測量系統的限制。除非在實例或說明書中的其他地方在一特定檢定、結果或實施例的上下文中另有明確說明，「約(about)」意指根據本領域的實務在一個標準偏差內，或者至多5%的範圍，以較大者為準。
「變體(variant)」係指因一或多個修飾(例如取代、***、或缺失)而不同於參考多肽或參考多核苷酸的多肽或多核苷酸。
「突變(mutation)」係指當相較於參考序列時，多肽或多核苷酸序列中之經工程改造或天然發生的改變。改變可為取代、***或缺失一或多個胺基酸或多核苷酸。
整份說明書中抗體恆定區中之胺基酸殘基編號係根據如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中所述的EU索引(EU index)，除 非另有明確說明。抗體恆定鏈編號可見於例如ImMunoGeneTics網站中之IMGT Web資源中之IMGT Scientific charts。
本文中所述之CH3區中的突變係表現為在第一重鏈之第一CH3域中的(多個)經修飾位置/在第二重鏈之第二CH3域中的(多個)經修飾位置。例如，F405L/K409R係指在第一CH3區中之F405L突變及在第二CH3區中之K09R突變。L351Y_F405A_Y407V/T394W係指在第一CH3區中之L351Y、F40FA及Y407V突變及在第二CH3區中之T394W突變。D399FHKRQ/K409AGRH係指其中D399可經F、H、K、R或Q置換，且K409可經A、G、R或H置換之突變。
習用一字母及三字母胺基酸代碼係於本文中使用且如表1所示。
Figure 108145933-A0202-12-0013-1
本發明之方法
本發明提供使用Fab臂交換產生異二聚體抗體之方法。本發明至少部分基於的認定為，與文獻(參見例如US2014/0303356)中已揭示者相反，當雙硫鍵在Fab臂交換期間還原以形成穩定異二聚體抗體之後，雙硫鍵之重新形成不需要氧，因此提供在大規模產生異二聚體抗體(例如，雙特異性抗體)期間用於處理程序控制的替代性方法。
本發明提供一種產生異二聚體抗體之方法，其包含：
提供第一同型二聚體抗體，該第一同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第一Fc區，該第一Fc區包含第一CH3區；及第二同型二聚體抗體，該第二同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第二Fc區，該第二Fc區包含第二CH3區，其中該第一CH3區與該等第二CH3區之胺基酸序列不同，且係使得在該第一CH3區與該第二CH3區之間的異二聚體交互作用較在該第一CH3區之間的同型二聚體交互作用或該第二CH3區之間的同型二聚體交互作用強；
將該第一同型二聚體抗體與該第二同型二聚體抗體組合成混合物；及
在還原劑及周圍溶解氧(DO2)存在下孵育該混合物，以產生該異二聚體抗體，其中該方法在產生該異二聚體抗體期間缺少下列中之一或多個步驟：測量該混合物中之DO2百分比(%)、控制該混合物中之該DO2%、或將氧添加至該混合物中。
在一些實施例中，在產生異二聚體抗體期間，混合物中之DO2%係在約10%與約90%之間。
在一些實施例中，在添加變性劑之前，混合物中之DO2%在混合物中佔約30%或更高。
本發明亦提供一種產生異二聚體抗體之方法，其包含：
提供第一同型二聚體抗體，該第一同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第一Fc區，該第一Fc區包含第一CH3區；及第二同型二聚體抗體，該第二同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第二Fc區，該第二Fc區包含第二CH3區，其中該第一CH3區與該等第二CH3區之胺基酸序列不同，且係使得在該第一CH3區與該第二CH3區之間的異二聚體交互作用較在該第一CH3區之間的同型二聚體交互作用或該第二CH3區之間的同型二聚體交互作用強；
將該第一同型二聚體抗體與該第二同型二聚體抗體組合成混合物；
在還原劑存在下孵育該混合物；及
移除該還原劑以產生該異二聚體抗體，其中
在步驟c)、步驟d)、或步驟c)及步驟d)兩者中，溶解氧(DO2)百分比(%)經控制為約30%或更低。
在一些實施例中，混合物中之DO2%係約25%或更低、20%或更低、約15%或更低、約10%或更低、約9%或更低、約8%或更低、約7%或更低、約6%或更低、約5%或更低、約4%或更低、約3%或更低、約2%或更低、或約1%或更低。
在一些實施例中，藉由用惰性氣體(諸如氮氣)覆蓋混合物而自混合物中替代氧，以控制DO2%。可藉由已知方法來監測溶解氧濃度，諸如利用溶解氧探針。
「較強(stronger)」就第一CH3區與第二CH3區的異二聚體交互作用而言，其相較於最強大的第一CH3區之間的同型二聚體交互作用或第二CH3區之間的同型二聚體交互作用，可強超過兩倍，例如強超過三倍、強超過四倍、或強超過五倍。CH3域的交互作用強度可使用質譜術來測量。在例示性 檢定中，使用標準分子生物技術製造建構體，該等建構體包含第一CH3區及第二CH3區，或替代地兩者皆包括CH2區。製備含有第一CH3域、第二CH3域、或第一CH3域及第二CH3域之樣本，並使用10kDa MWCO離心過濾器管柱將其緩衝劑交換為100mM乙酸銨(pH 7)。將連續稀釋樣本(20μM至25nM；單體當量)之等分試樣(~1μL)載入鍍金的硼矽酸鹽毛細管以用於LCT質譜儀(Waters)的分析。將單體信號(Ms)定義為單體峰面積佔光譜中所有峰面積的分率(Ms/(Ms+Ds)，其中Ds=二聚體信號)。將平衡時的單體濃度([M]eq)定義為Ms．[M]0，其中[M]0係就單體而言的整體蛋白質濃度。將平衡時的二聚體濃度([D]eq)定義為([M]0-[M]eq)/2。接著，同型二聚體CH3交互作用及異二聚體CH3交互作用的KD係擷取自[D]eq對[M]eq2的圖之梯度。
在一些實施例中，第一同型二聚體抗體與第二同型二聚體抗體係以約1：1的莫耳比組合成混合物。
在一些實施例中，第一同型二聚體抗體與第二同型二聚體抗體係以約1.05：1的莫耳比組合成混合物。
在一些實施例中，第一同型二聚體抗體與第二同型二聚體抗體係以約1：1.03至約1：2之間的莫耳比組合成混合物。在一些實施例中，第一同型二聚體抗體與第二同型二聚體抗體係以約1：1.05至1：1.5之間的莫耳比組合成混合物。在一些實施例中，第一同型二聚體抗體與第二同型二聚體抗體係以約1：1.1至1：1.5之間的莫耳比組合成混合物。在一些實施例中，第一同型二聚體抗體與第二同型二聚體抗體係以約1：1.1至1：1.4之間的莫耳比組合成混合物。在一些實施例中，第一同型二聚體抗體與第二同型二聚體抗體係以約1：1.15至1：1.35 之間的莫耳比組合成混合物。在一些實施例中，第一同型二聚體抗體與第二同型二聚體抗體係以約1：1.2至1：1.3之間的莫耳比組合成混合物。
在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係在約1g/L與70g/L之間。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係在約8g/L與約50g/L之間。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係在約8g/L與約13g/L之間。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約9.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約9.5g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約10g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約10.5g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約11.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約11.5g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約12.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約12.5g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約13.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約13.5g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約14.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約14.5g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約15.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約20.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約25.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約30.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約35.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約40.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約45.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約50.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約55.0g/L。在 一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約60.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約65.0g/L。在一些實施例中，混合物中之免疫球蛋白總濃度係約70.0g/L。
在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約10分鐘或更久。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約10分鐘至約30小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約10分鐘至約24小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約15分鐘。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約20分鐘。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約30分鐘。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約40分鐘。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約50分鐘。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約1小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約2小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約3小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約4小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約4小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約5小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約6小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約7小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約8小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約9小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約10小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約11小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約12小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約13小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約14小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約15小時。在一些實 施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約16小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約17小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約18小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約19小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約20小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約21小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約22小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約23小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約24小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約25小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約26小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約27小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約28小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約29小時。在一些實施例中，混合物係在還原劑存在下孵育約30小時。
在一些實施例中，還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)。在一些實施例中，還原劑係2-MEA之化學衍生物。在一些實施例中，還原劑係L-半胱胺酸。在一些實施例中，還原劑係D-半胱胺酸。在一些實施例中，還原劑係麩胱甘肽。在一些實施例中，還原劑係參(2-羧乙基)膦。
在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係在約0.1mM至約1M之間。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係在約1.0mM至約500mM之間。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係在約5.0mM至約100mM之間。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約10mM。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約15mM。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約20mM。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約25mM。在一些實 施例中，混合物中之還原劑濃度係約30mM。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約35mM。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約40mM。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約50mM。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約60mM。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約70mM。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約80mM。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約90mM。在一些實施例中，混合物中之還原劑濃度係約100mM。
在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係在約10mM與約100mM之間。在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係在約20mM與約90mM之間。在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係在約20mM與約80mM之間。在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係在約20mM與約70mM之間。在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係在約20mM與約60mM之間。在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係在約20mM與約50mM之間。在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係在約20mM與約40mM之間。在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係約20mM。在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係約25mM。在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係約30mM。在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係約35mM。在一些實施例中，混合物中之2-MEA濃度係約40mM。
在一些實施例中，混合物中之總免疫球蛋白與總還原劑之質量比係在約1.0與約5.0之間。在一些實施例中，混合物中之總免疫球蛋白與總還原劑之質量比係在約1.4與約3.8之間。在一些實施例中，混合物中之總免疫球蛋白與總還原劑之質量比係在約1.4與約3.5之間。在一些實施例中，質量比係 在約1.8與約3.8之間。在一些實施例中，質量比係在約2.3與約3.0之間。在一些實施例中，質量比係在約1.6與約2.1之間。在一些實施例中，質量比係約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0。3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0。4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、或5.0。「質量比(mass ratio)」係指每公升總免疫球蛋白克數比每公升總還原劑克數。「總免疫球蛋白(total immunoglobulin)」係指在還原步驟開始時，混合物中兩種親本抗體的量。
在一些實施例中，混合物包含緩衝劑。在一些實施例中，緩衝劑包含乙酸鈉緩衝劑。在一些實施例中，緩衝劑進一步包含NaCl。在一些實施例中，緩衝劑包含約100mM乙酸鈉及約30mM NaCl。在一些實施例中，緩衝劑之pH係約7.3。可使用其他緩衝劑，諸如1 x達爾伯克磷酸鹽緩衝液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline,DPBS)、磷酸鈉緩衝劑、磷酸鉀緩衝劑、Tris緩衝劑、組胺酸緩衝劑、或檸檬酸鹽緩衝劑。
在一些實施例中，該方法進一步包含自混合物移除還原劑之步驟。
在一些實施例中，還原劑係藉由過濾移除。
在一些實施例中，過濾係透析過濾。
在一些實施例中，第一同型二聚體抗體及第二同型二聚體抗體係IgG1、IgG2、或IgG4同型。
在一些實施例中，第一同型二聚體抗體及第二同型二聚體抗體係IgG1同型。在一些實施例中，第一同型二聚體抗體及第二同型二聚體抗體係 IgG2同型。在一些實施例中，第一同型二聚體抗體及第二同型二聚體抗體係IgG4同型。
在一些實施例中，當相較於SEQ ID NO：1之野生型IgG1時，第一CH3域及第二CH3域包含下列突變：F405L/K409R、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、Y407LWQ/K409AGRH、T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、T366W/T366S_L368A_Y407V、L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W、K409D/D399K、K409E/D399R、K409D_K360D/D399K_E356K、K409D_K360D/D399E_E356K、K409D_K370D/D399K_E357K、K409D_K370D/D399E_E357K、K409D_K392D/D399K_E356K_E357K、或K409D_K392D/D399E_E356K_E357K。亦可將該等突變引入SEQ ID NO：2之野生型IgG2或SEQ ID NO：3之野生型IgG4，在此情況下(如所熟知)，由於野生型IgG1、IgG2、及IgG4之間的序列差異，在特定突變部位處的野生型殘基可能不會對應於IgG1中者。例如，IgG4突變野生型/F405L_R409K對應於IgG1突變F405L/K409R，且IgG4突變R409D/D399K對應於IgG1突變K409D/D399K。該等 突變係相較於參考野生型IgG1(SEQ ID NO：1)、IgG2(SEQ ID NO：2)、及IgG4(SEQ ID NO：3)。
在一些實施例中，當相較於SEQ ID NO：1之野生型IgG1、SEQ ID NO：2之野生型IgG2、SEQ ID NO：3之野生型IgG4時，第一Fc區及/或第二Fc區包含一或多個突變，其調節第一Fc區及/或第二Fc區與Fcγ受體(FcγR)、FcRn、或蛋白質A之結合。
野生型IgG1(SEQ ID NO：1)
Figure 108145933-A0202-12-0023-2
野生型IgG2(SEQ ID NO：2)
Figure 108145933-A0202-12-0023-3
野生型IgG4(SEQ ID NO：3)
Figure 108145933-A0202-12-0024-4
在一些實施例中，FcγR係FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、或FcγRIII。
在一些實施例中，調節第一Fc區及/或第二Fc區與Fcγ之結合的一或多個取代係L234A_L235A、F234A_L235A、S228P_F234A_L235A、S228P_L234A_L235A、V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S、V234A_G237A、H268Q_V309L_A330S_P331S、S267E_L328F、L234F_L235E_D265A、L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S、或S228P_F234A_L235A_G237A_P238S。
在一些實施例中，調節第一Fc區及/或第二Fc區與FcRn之結合的一或多個取代係M428L_N434S、M252Y_S254T_T256E、T250Q_M428L、N434A及T307A_E380A_N434A、H435A、P257I_N434H、D376V_N434H、M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F、T308P_N434A、或H435R。
在一些實施例中，調節第一Fc區及/或第二Fc區與蛋白質A之結合的一或多個取代係Q311R、Q311K、T307P_L309Q、T307P_V309Q、T307P_L309Q_Q311R、T307P_V309Q_Q311R、H435R、或H435R_Y436F。
在一些實施例中，產生異二聚體抗體之步驟係在符合GMP之條件下進行。
在一些實施例中，產生異二聚體抗體之步驟係在製造原料藥之期間進行，該原料藥包含該異二聚體抗體。
在一些實施例中，異二聚體抗體係雙特異性抗體。
在一些實施例中，雙特異性抗體結合CD3、BCMA、或CD123。
在一些實施例中，產生異二聚體抗體之步驟係在製造原廠藥品(innovator drug product)之期間進行。
在一些實施例中，產生異二聚體抗體之步驟係在製造學名藥品(generic drug product)之期間進行。
促進異二聚化的Fab臂交換及Fc區突變
異二聚體抗體可利用Fab臂交換來產生，其中一種親本同型二聚體抗體的一個重鏈及其附接輕鏈(半臂)係與另一種親本同型二聚體抗體的一個重鏈及其附接輕鏈交換，以形成由兩個重鏈及兩個附接輕鏈構成的異二聚體抗體(van der Neut Kolfschoten et al.,(2007)Science 317：1554-1557)。
兩種同型二聚體親本抗體經工程改造以在其CH3區中具有不對稱突變，該等不對稱突變利於在抗體之鉸鏈區中雙硫鍵的還原及重新形成後，進行Fab臂交換及異二聚體抗體形成。Fab臂交換反應的圖示係表示於圖1中。在將還原劑引入兩種親本同型二聚體抗體之混合物後，半臂解離，且不對稱 CH3突變利於異二聚體抗體之重新形成。雙硫鍵在半臂之間的後續重新形成穩定化所形成的異二聚體抗體(Gramer et al.(2013)MAbs 5：962-973)。
在本發明之方法中，可使用任何促進CH3異二聚體形成的CH3區突變，諸如本文中所述者。已知數種方法用於CH3區中之修飾以促進異二聚化。一般而言，在所有此類方法中，將第一CH3區及第二CH3區以互補方式工程改造，使得各CH3區(或包含其之重鏈)無法再與自身同二聚化，而是強制與經互補性工程改造的其他CH3區異二聚化(使得第一及第二CH3區異二聚化，而沒有同型二聚體在兩個第一CH3區或兩個第二CH3區之間形成)。
利於Fab臂交換的CH3突變包括Duobody®突變(Genmab)、鈕扣結構(Knob-in-Hole)突變(Genentech)、靜電吸引突變(Chugai,Amgen,NovoNordisk,Oncomed)、鏈交換工程改造之域體(SEEDbody)(EMD Serono)、及其他不對稱突變(例如Zymeworks)。
Duobody®突變(Genmab)係揭示於例如US9,150,663及US2014/0303356中，且包括突變F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、及Y407LWQ/K409AGRH。
鈕扣結構突變係揭示於例如WO1996/027011中且包括在CH3區之界面上的突變，其中具有小側鏈之胺基酸(孔)被導入第一CH3區且具有大側鏈之胺基酸(鈕)被導入第二CH3區，導致在第一CH3區與第二CH3區之間的優先交互作用。形成鈕及孔之例示性CH3區突變係T366Y/F405A、 T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S及T366W/T366S_L368A_Y407V。
重鏈異二聚體形成可藉由使用藉由取代在第一CH3區上的帶正電殘基及在第二CH3區上的帶負電殘基之靜電交互作用來促進，如US2010/0015133、US2009/0182127、US2010/028637或US2011/0123532中所述。
可用來促進重鏈異二聚化之其他不對稱突變係L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如US2012/0149876或US2013/0195849中所述。
SEEDbody突變涉及用IgA殘基取代選定IgG殘基以促進重鏈異二聚化，如US20070287170中所述。
可使用的其他例示性突變係R409D_K370E/D399K_E357K、S354C_T366W/Y349C_T366S_L368A_Y407V、Y349C_T366W/S354C_T366S_L368A_Y407V、T366K/L351D、L351K/Y349E、L351K/Y349D、L351K/L368E、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、K392D/D399K、K392D/E356K、K253E_D282K_K322D/D239K_E240K_K292D、K392D_K409D/D356K_D399K，如WO2007/147901、WO 2011/143545、WO2013157954、WO2013096291及US2018/0118849中所述。
此等用於Fab臂交換之不同方法可與各種雙特異性抗體形式組合，諸如涉及VH/VL工程改造(諸如VH/VL域交換)、CH1/CL域交換、利用常見輕鏈(如WO98050431中所述)、或利用栓繫(tethered)輕鏈(包括外翻(inside-out)栓繫的輕鏈，如US9062120中所述)者。
異二聚體抗體的進一步工程改造
Fc工程改造
除了促進異二聚化的CH3區突變外，在本發明之方法中使用的抗體可在Fc區中包含調節抗體效應功能或半衰期之突變。此外，在本發明之方法中使用的抗體可包含調節該等抗體與蛋白質A之結合的Fc突變，因此促進該等抗體的純化。
可經突變以調節抗體半衰期之Fc位置(例如，與FcRn之結合包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434、及435。可單獨或組合進行之例示性突變為突變T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A、及H435R。可進行以增加抗體之半衰期的例示性單個或組合突變係突變M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A、及T307A/E380A/N434A。可進行以減少抗體之半衰期的例示性單個或組合突變係突變H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及H435R。
可將突變引入Fc區，該等突變減少抗體與活化性Fcγ受體(FcγR)的結合並降低Fc效應功能(諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP))。
可經突變以減少抗體與活化性FcγR之結合且因而降低效應功能之Fc位置包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331、及365。可單獨或組合進行之例示性突變為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中之突變K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S、及P331S。導致具有降低之ADCC之抗體的例示性組合突變為下列突變：IgG1上之L234A/L235A、IgG2上之V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上之F234A/L235A、IgG4上之S228P/F234A/L235A、所有Ig同型上之N297A、IgG2上之V234A/G237A、IgG1上之K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上之H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上之S267E/L328F、IgG1上之L234F/L235E/D265A、IgG1上之L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上之S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、及IgG4上之S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。亦可使用混成的IgG2/4 Fc域，諸如具有來自IgG2的殘基117至260及來自IgG4的殘基261至447的Fc。
導致具有降低之CDC之抗體的例示性突變為K322A突變。
可在IgG4抗體中進行熟知的S228P突變以增強IgG4穩定性。
可將突變引入Fc區，該等突變增強抗體與Fcγ受體(FcγR)的結合並增強Fc效應功能(諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)及/或吞噬作用(ADCP))。
可經突變以增加抗體與活化性FcγR之結合並增強抗體效應功能之Fc位置包括位置236、239、243、256,290,292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396、或430(根據EU索引之殘基編號)。可單獨或組合進行的例示性突變係G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E333A、K334A、A339T、及P396L。導致具有增加的ADCC或ADCP之抗體的例示性組合係IgG1上的239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、及G236A/S239D/I332E。
可經突變以增強抗體CDC之Fc位置包括位置267、268、324、326、333、345、及430。可單獨或組合進行的例示性突變係S267E、F1268F、S324T、K326A、K326W、E333A、E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430S、E430F、及E430T。導致具有增加的CDC之抗體的例示性組合突變係IgG1上的K326A/E333A、K326W/E333A、H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T、及S267E/H268F/S324T。
「抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity)」、「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)」、或「ADCC」是一種誘導細胞死亡的機制，其取決於抗體包覆的目標細胞與具有裂解活性的效應細胞(諸如自然殺手細胞(NK)、單 核球、巨噬細胞及嗜中性球)之間經由表現在效應細胞上的Fcγ受體(FcγR)的相互作用。例如，NK細胞表現FcγRIIIa，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIIIa。抗體之ADCC活性可使用體外檢定使用表現抗體所結合之蛋白質的細胞作為目標細胞及NK細胞作為效應細胞來評定。細胞裂解可透過從裂解細胞中釋放的標記(例如放射性基質、螢光染料或天然的細胞內蛋白)來檢測。在一例示性檢定中，目標細胞係以1個目標細胞對4個效應細胞之比率使用。將目標細胞用BATDA預標記，並與效應細胞及測試抗體組合。將樣本孵育2小時，且藉由測量釋放至上清液中之BATDA來測量細胞裂解。將數據相對於使用0.67% Triton X-100(Sigma Aldrich)的最大細胞毒性及在沒有任何抗體的情況下由目標細胞自發釋放的BATDA所判定之最小對照值正規化。
「抗體依賴性細胞吞噬作用」(「ADCP」)係指一種透過吞噬細胞(諸如巨噬細胞或樹突細胞)內化(internalization)以消滅抗體包覆的目標細胞的機制。ADCP可藉由使用衍生自單核球的巨噬細胞作為效應細胞並使用表現抗體所結合之蛋白質的細胞作為目標細胞來評估，該等目標細胞亦經工程改造以表現GFP或另一標記分子。在一例示性檢定中，效應細胞：目標細胞比可為例如4：1。可將效應細胞與目標細胞在存在或不存在本發明之抗體的情況下一起孵育4小時。孵育後，使用細胞剝離液(accutase)將細胞分離。巨噬細胞可用偶接螢光標記的抗CD11b及抗CD14抗體來鑑定，且吞噬作用百分比可根據在該等CD11+CD14+巨噬細胞中的GFP螢光百分比使用標準方法判定。
「補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity)」或「CDC」係指一種誘導細胞死亡的機制，其中與目標結合之抗體的Fc效應域結合並活化補體成分C1q，其轉而活化補體級聯反應而導致目標細胞死亡。補體 之活化亦可造成補體成分沉積在該目標細胞表面上，其藉由結合白血球上的補體受體(例如，CR3)而促進CDC。細胞的CDC可藉由例如下列步驟來測量：將道迪(Daudi)細胞以1×105個細胞/孔(50μl/孔)接種於RPMI-B(補充有1% BSA的RPMI)中、將50μL的測試抗體添加至孔中使最終濃度在0至100μg/mL之間、使反應在室溫下孵育15min、將11μL的匯集人類血清添加至孔中、及使反應在37℃下孵育45min。裂解細胞百分比(%)可使用標準方法以FACS檢定中經碘化丙啶染色的細胞%來偵測。
抗體與FcγR或FcRn之結合可在經工程改造以表現各受體之細胞上使用流動式細胞測量術來評定。在例示性結合檢定中，將每孔2x105個細胞接種於96孔盤中，並以BSA染色緩衝劑(BD Biosciences,San Jose,USA)在4℃下阻斷30min。在4℃下，將細胞與測試抗體於冰上孵育1.5小時。用BSA染色緩衝劑洗滌兩次之後，將細胞用經R-PE標示的抗人類IgG二級抗體(Jackson Immunoresearch Laboratories)在4℃下孵育45min。將細胞以染色緩衝劑洗滌兩次，然後再懸浮於150μL含有經1：200稀釋之DRAQ7 Live/Dead染料的染色緩衝劑(Cell Signaling Technology,Danvers,USA)中。經染色細胞之PE及DRAQ7信號係藉由Miltenyi MACSQuant流式細胞儀(Miltenyi Biotec,Auburn,USA)分別使用B2及B4通道來偵測。以DRAQ7排除對活細胞進行閘控(gated)，且判定收集之至少10,000個活事件之幾何平均螢光信號。將FlowJo軟體(Tree Star)用於分析。將數據繪製為抗體濃度之對數對平均螢光信號。執行非線性迴歸分析。
「增強(enhance/enhanced)」係指當相較於沒有突變之親本抗體時，本發明抗體的增強之效應功能(例如，ADCC、CDC、及/或ADCP)或增強之與Fcγ受體(FcγR)或FcRn之結合，本發明抗體在Fc區中具有至少一個突變。 「增強」可為約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多之增強、或統計上顯著的增強。
「降低(reduce/reduced)」係指當相較於沒有突變之親本抗體時，本發明抗體的降低之效應功能(例如，ADCC、CDC、及/或ADCP)或降低之與Fcγ受體(FcγR)或FcRn之結合，本發明抗體在Fc區中具有至少一個突變。「降低」可為約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多之降低、或統計上顯著的降低。
「調節(modulate)」係指當相較於沒有突變之親本抗體時，本發明抗體的增強或降低之效應功能(例如，ADCC、CDC、及/或ADCP)、或增強或降低之與Fcγ受體(FcγR)或FcRn之結合，本發明抗體在Fc區中具有至少一個突變。
可將突變引入本發明之方法中使用的抗體，該等突變調節該抗體與蛋白質A之結合。全長雙特異性治療性抗體的產生及純化需要雙特異性抗體有效率地自過量親本及/或中間分子分離。因此，以不對稱方式(例如僅在一個重鏈中)具有調節蛋白質A結合的Fc突變之雙特異性抗體，可自親本抗體基於其自蛋白質A親和性管柱的差異洗提概況來純化。可引入本發明之方法中使用的抗體以調節蛋白質A結合的例示性突變係Q311R、Q311K、T307P_L309Q、T307P_V309Q、T307P_L309Q_Q311R、T307P_V309Q_Q311R、H435R、或H435R_Y436F。
醣基工程改造(glycoengineering)
本發明之方法中使用的抗體誘導ADCC的能力可藉由工程改造其寡醣組分來增強。人類IgG1在Asn297處經N-醣基化且大部分聚醣呈熟知的雙觸角(biantennary)G0、G0F、G1、G1F、G2、或G2F形式。由未經工程改造之CHO細胞所產生之抗體一般具有約至少85%之聚醣岩藻醣(glycan fucose)含量。自附接至Fc區之雙觸角複合型寡醣移除核心岩藻糖經由改善FcγRIIIa結合且不改變抗原結合或CDC活性來增強抗體之ADCC。此類mAb可使用經報導會造成成功表現相對高量去岩藻糖基化(defucosylated)抗體(帶有雙觸角複合型Fc寡醣)的不同方法來達成，諸如控制培養物滲透壓、應用變體CHO系Lec13作為宿主細胞系、應用變體CHO系EB66作為宿主細胞系、應用大鼠融合瘤細胞系YB2/0作為宿主細胞系、引入特異性針對α 1,6-岩藻糖基轉移酶(FUT8)基因的短小干擾RNA、或共表現β-1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III與高基氏α-甘露糖苷酶II或基夫鹼(kifunensine，一種強效α-甘露糖苷酶I抑制劑)。
本發明之方法中使用的異二聚體抗體可具有雙觸角聚醣結構，其岩藻糖含量約在0%至約15%之間，例如15%、14%、13%、12%、11%10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或0%。
本發明之方法中使用的異二聚體抗體可具有雙觸角聚醣結構，其岩藻糖含量為約50%、40%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或0%。
「岩藻糖含量(fucose content)」意指Asn297處糖鏈內岩藻糖單醣的量。岩藻糖的相對量係含岩藻糖結構相對於所有醣類結構的百分比。此等可藉由多種方法來表徵及定量，例如：1)使用經N-醣苷酶F(N-glycosidase F)處 理之樣本(例如錯合、雜合及寡與高甘露糖(oligo-and high-mannose)結構)的MALDI-TOF；2)酶促釋放Asn297聚醣，隨後衍生化並藉由HPLC(UPLC)以螢光檢測及/或HPLC-MS(UPLC-MS)來檢測/定量；3)天然或還原mAb的完整蛋白質分析，將Asn297聚醣以Endo S或其他會在第一與第二GlcNAc單醣之間切割而留下連接至第一GlcNAc之岩藻糖的酵素處理或不經處理；4)以酶消化法(enzymatic digestion)(例如胰蛋白酶或內肽酶Lys-C)將mAb消化成構成分(constituent)肽，隨後以HPLC-MS(UPLC-MS)分離、檢測及定量；或5)用PNGase F在Asn 297進行特異性酶促去醣基化(specific enzymatic deglycosylation)以將mAb寡醣從mAb蛋白分離。該等釋放出的寡醣可用螢光團標記，藉由各種互補的技術分離和鑑定，該等技術允許：藉由基質輔助雷射脫附游離(MALDI)質譜術比較實驗質量與理論質量以精細定性聚醣結構、藉由離子交換HPLC(GlycoSep C)測定唾液酸化(sialylation)程度、藉由正相HPLC(GlycoSep N)根據親水性標準(hydrophilicity criteria)分離及定量寡醣形式、及藉由高效毛細管電泳-雷射誘導螢光(HPCE-LIF)分離及定量寡醣。
「低岩藻糖(low fucose)」或「低岩藻糖含量(low fucose content)」係指抗體的岩藻糖含量為約0%至15%。
「正常岩藻糖(normal fucose)」或「正常岩藻糖含量(normal fucose content)」係指抗體的岩藻糖含量約超過50%，一般而言約超過60%、70%、80%、或超過85%。
本發明之方法中使用的異二聚體抗體可藉由下列程序而經轉譯後修飾(post-translationally modified)：諸如醣基化、異構化、去醣基化、或非天然發生之共價修飾(諸如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化(pegylation))及脂質 化。此等修飾可發生在活體內或活體外。舉例而言，本發明之方法中使用的異二聚體抗體可與聚乙二醇共軛(聚乙二醇化(PEGylated))以改善其藥物動力學特性。共軛可藉由所屬領域中具有通常知識者習知之技術來進行。治療性抗體與PEG之共軛已顯示會增強藥效動力學而不干擾功能。
C端離胺酸
本發明之方法中使用的異二聚體抗體之C端離胺酸(CTL)可在製造期間被部分移除。在製造期間，藉由控制胞外Zn2+、EDTA或EDTA-Fe3+的濃度可將CTL去除控制在小於最大水平，如在美國專利公開號US20140273092中所述。抗體中的CTL含量可使用習知方法測量。
本發明之方法中使用的異二聚體抗體可具有約10%至約90%、約20%至約80%、約40%至約70%、約55%至約70%、或約60%的C端離胺酸含量。
本發明之方法中使用的異二聚體抗體可具有約0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%的C端離胺酸含量。
抗體同種異型(antibody allotype)
本發明之方法中使用的異二聚體抗體可屬於任何同種異型。預期同種異型對於Fab臂交換沒有影響。治療性抗體的免疫原性與輸注反應(infusion reaction)的風險增加及治療反應的持續時間減少相關聯(Baert等人，(2003)N、Engl J Med 348：602-08)。治療性抗體在宿主中誘導免疫反應的程度可 部分地由該抗體之同種異型決定(Stickler et al.,(2011)Genes及Immunity 12：213-21)。抗體同種異型與抗體恆定區序列中特定位置處的胺基酸序列變異相關。表2顯示所選之IgG1、IgG2、及IgG4同種異型。
Figure 108145933-A0202-12-0037-5
目標抗原
本發明之方法可用來藉由使用Fab臂交換產生具有任何特異性的異二聚體抗體，此係因為預期在製造期間的雙硫鍵還原及重新形成不會受到抗體之VH/VL區影響(如本文中亦證明的)。異二聚體抗體可在兩個不同表位處結合一種目標抗原，或者可結合二或更多種目標抗原，其取決於各VH/VL對的特異性。當異二聚體抗體結合兩種目標抗原時，該等目標抗原可位於相同細胞上或位於兩個不同細胞上。目標抗原可係腫瘤相關抗原、在發炎、T細胞或B細胞活性調控上扮演角色的抗原、或大致上欲調節其生物活性的任何目標，或者欲減少表現該目標之細胞數目。
本發明之方法中使用的異二聚體抗體可結合的例示性抗原係下列中之一或多者：ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、ADORA2A、聚集蛋白聚醣(aggrecan)、AGR2、AICDA、AIF1、AIG1、AKAP1、AKAP2、白蛋白、AMH、AMHR2、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOC1、APOE、AR、AZGP1(鋅-a-醣蛋白)、B7.1、B7.2、BAD、BAFF、BAG1、BAI1、BCL2、BCL6、BCMA、BDNF、BLNK、BLR1(MDR15)、BlyS、BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(網格蛋白(plectin))、BRCA1、BTLA、C19orf10(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CANT1、CASP1、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCL1(1-309)、CCL11(伊紅趨素(eotaxin))、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、SLC、次級淋巴組織趨化因子-2(exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/伊紅趨素-2)、CCL25(TECK)、CCL26(伊紅趨素-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD123、CD137、CD164、CD16a、CD16b、CD19、CD1C、CD20、 CD200、CD-22、CD24、CD28、CD3、CD3 ε、CD30、CD32a、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD39、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD47、CD52、CD69、CD72、CD73、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD80、CD81、CD83、CD86、CD89、CD96、CDH1(E-鈣黏蛋白)、CDH10、CDH12、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(p16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CER1、CHGA、CHGB、幾丁質酶、CHST10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(密連蛋白-7(claudin-7))、CLN3、CLU(群集素(clusterin))、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、COL18A1、COL1A1、COL4A3、COL6A1、CR2、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CTNNB1(b-連環蛋白(b-catenin))、CTSB(組織蛋白酶B(cathepsin B))、CX3CL1(SCYD1)、CX3CR1(V28)、CXCL1(GRO1)、CXCL10(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYC1、CYSLTR1、DAB2IP、DES、DKFZp451J0118、DNAM-1、DNCL1、DPP4、E2F1、ECGF1、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、ENO1、ENO2、ENO3、EPHB4、EPO、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、ESR1、ESR2、F3(TF)、FADD、FasL、FASN、FCER1A、 FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FIL1(EPSILON)、FIL1(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRT1(纖連蛋白素(fibronectin))、FLT1、FOS、FOSL1(FRA-1)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GDF5、GFI1、GGT1、GITR、GITRL、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCC10(C10)、GRP、GSN(凝溶膠蛋白(gelsolin))、GSTP1、HAVCR2、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、HGF、HIF1A、HIP1、組織胺及組織胺受體、HLA、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOX1、HUMCYT2A、HVEM、ICEBERG、ICOS、ICOSL、IDO、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNγ、IFNW1、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、IL-1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL-12、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1HY1、IL1R1、IL1R2、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RL1、IL1RL2、IL1RN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST (醣蛋白130)、IL7、IL7R、IL8、IL8RA、IL8RB、IL8RB、IL9、IL9R、ILK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、胰島素、胰島素受體、IRAK1、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(a6整合素)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(b 4整合素)、JAG1、JAK1、JAK3、JUN、K6HF、KAI1、KDR、KITLG、KIR、KLF5(GC盒BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(毛髮特異性II型角蛋白(hair-specific type II keratin))、LAG-3、LAMA5、LDL、LEP(瘦素)、LFA、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MDK、間皮素(mesothelin)、c-Met、MIB1、中期因子(midkine)、MIF、MIP-2、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金屬硫蛋白-III(metallothionectin-III))、MTSS1、MUC1(黏液素)、c-MYC、MYD88、NCK2、神經蛋白聚糖(neurocan)、NFKB1、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NKG2D、NKp46、NME1(NM23A)、NOX5、NPPB、NR0B1、NR0B2、NR1D1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NRII2、NRII3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRP1、NRP2、NT5E、NTN4、ODZ1、OPRD1、OX-40、OX-40L、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCNA、PD-1、PD-L1、PDGFA、PDGFB、PECAM1、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷酸蛋白聚糖(phosphacan)、PIAS2、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、 PLXDC1、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PSMA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、RAC2(p21Rac2)、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNF110(ZNF144)、ROBO2、ROR1、SI00A2、SCGB1D2(親脂素(lipophilin B))、SCGB2A1(乳腺球蛋白2(mammaglobin 2))、SCGB2A2(乳腺球蛋白1)、SCYE1(內皮單核球活化性細胞介素)、SDF2、SERPINA1、SERPINA3、SERPINB5(乳腺絲抑蛋白(maspin))、SERPINE1(PAI-1)、SERPINF1、SHBG、SLA2、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Spr1)、ST6GAL1、STAB1、STAT6、STEAP、STEAP2、TB4R2、TBX21、TCP10、TDGF1、TEK、TF(轉鐵蛋白受體)、TGFA、TGFB1、TGFB111、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、THBS1(血小板反應蛋白-1(thrombospondin-1))、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIGIT、TIM-3、TIMP3、組織因子、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSF11A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配體)、TNFSF5(CD40配體)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配體)、TNFSF8(CD30配體)、TNFSF9(4-1BB配體)、TOLLIP、類鐸受體、TOP2A(拓樸異構酶Iia)、TP53、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TREM1、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、VEGF、 VEGFB、VEGFC、多能蛋白聚糖(versican)、VHL C5、VISTA、VLA-4、XCL1(淋巴細胞趨化因子(lymphotactin))、XCL2(SCM-1b)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、YY1、及ZFPM2。
在一些實施例中，本發明之方法中使用的異二聚體抗體結合CD3。
在一些實施例中，本發明之方法中使用的異二聚體抗體結合CD3及腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen,TAA)。
在一些實施例中，本發明之方法中使用的異二聚體抗體結合CD123與CD3、及BCMA與CD3。
在一些實施例中，本發明之方法中使用的異二聚體抗體結合EGFR及c-Met。
在一些實施例中，結合EGFR及c-Met的異二聚體抗體包含SEQ ID NO：4之第一重鏈(HC1)、SEQ ID NO：5之第一輕鏈(LC1)、SEQ ID NO：6之第二重鏈(HC2)、及SEQ ID NO：7之第二輕鏈(LC2)。
本發明亦提供一種藉由本發明之方法產生的雙特異性抗體。
本發明亦提供一種藉由本發明之方法產生的結合EGFR及c-Met之雙特異性抗體。
本發明亦提供一種藉由本發明之方法產生的結合EGFR及c-Met之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含SEQ ID NO：4之第一重鏈(HC1)、SEQ ID NO：5之第一輕鏈(LC1)、SEQ ID NO：6之第二重鏈(HC2)、及SEQ ID NO：7之第二輕鏈(LC2)。
同型二聚體抗體及異二聚體抗體的產生
第一同型二聚體抗體及第二同型二聚體抗體可在培養容器(諸如生物反應器)中一起產生或分開產生。可藉由下列來產生第一同型二聚體抗體及第二同型二聚體抗體：藉由共表現以表現於宿主細胞中，或者藉由使用不同宿主細胞來產生各同型二聚體抗體。在後者情況下，宿主細胞可屬於相同或不同的來源。
「宿主細胞(host cell)」係指已引入一或多種載體的細胞，其表現至少一種抗體重鏈及一種抗體輕鏈。「宿主細胞」不只指特定對象細胞，亦指此細胞之後裔，且亦指自該特定對象細胞產生之穩定細胞系。由於某些修飾可能會因為突變或環境影響而發生於後代中，使得後裔可能與親本細胞不同，但仍包括於如本文中所使用之用語「宿主細胞」的範疇內。
此類宿主細胞可為真核細胞、原核細胞、植物細胞或古菌(archeal)細胞。大腸桿菌(Escherichia coli)、桿菌(諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis),、及其他腸桿菌(enterobacteriaceae)(諸如沙門桿菌(Salmonella)、鋸桿菌(Serratia)))、及各式假單胞菌(Pseudomonas)菌種皆為原核宿主細胞之實例。其他微生物(諸如酵母菌)對於表現亦為有用者。酵母菌(Saccharomyces)(例如釀酒酵母菌(S.cerevisiae))及畢赤酵母菌(Pichia)皆為合適酵母菌宿主細胞之實例。例示性真核細胞可以是哺乳動物、昆蟲、鳥類或其它動物來源。哺乳動物真核細胞包括永生化細胞系(immortalized cell line)如融合瘤或骨髓瘤細胞系，諸如SP2/0(American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(European Collection of Cell Cultures(ECACC),Salisbury, Wiltshire,UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)及Ag653(ATCC CRL-1580)鼠類細胞系。例示性人類骨髓瘤細胞系為U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他有用之細胞系包括衍生自中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)細胞者，諸如CHOK1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、Potelligent® CHOK2SV(Lonza)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
可用於表現一或多種抗體重鏈及輕鏈的例示性載體包括pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL(Pharmacia)、pEE6.4(Lonza)、及pEE12.4(Lonza)、以及在Lonza Xceed系統中使用的載體。
第一同型二聚體抗體及第二同型二聚體抗體可藉由將彼等表現於不同宿主細胞中來產生。在此情況下，在還原劑存在下混合第一同型二聚體抗體及第二同型二聚體抗體以起始Fab臂交換之前，可先將彼等純化。可使用已知方法(諸如蛋白質A層析)來達成純化。替代地，可將含有第一同型二聚體抗體及第二同型二聚體抗體的培養基組合，可添加還原劑至其以起始Fab臂交換。如果藉由共表現來產生第一同型二聚體抗體及第二同型二聚體抗體，則亦可使用蛋白質A層析來純化抗體。
本文描述用於產生異二聚體抗體的Fab臂交換。使程序條件(諸如第一同型二聚體抗體及第二同型二聚體抗體的濃度、還原劑、還原劑濃度、還原時間、溶解氧濃度、反應進行的溫度、及所使用的緩衝劑)最佳化，以產生具有高產率及純度的異二聚體抗體(如本文中所述)。
在Fab臂交換之後，可進一步純化所產生的異二聚體抗體。純化方法包括下列之組合：蛋白質A、蛋白質G層析、其他親和層析之方式(諸如 基於抗原結合或與抗獨特型抗體的結合、硫親和性(thioaffinity)、離子交換、疏水***互作用、氫氧磷灰石層析、及其他混合模式樹脂之親和層析)。額外方法可使用以例如鹽或聚乙二醇進行的沉澱來獲得純化的異二聚體抗體。
適用於本發明方法之程序的設備為已知的。以宿主細胞來表現同型二聚體抗體，一般而言可例如在反應容器(諸如生物反應器)中執行。還原步驟及氧化步驟可在與表現第一同型二聚體抗體及/或第二同型二聚體抗體相同的生物反應器中發生，或者其可在不同反應器容器中發生。反應容器及支援程序管路可係拋棄式或可重複使用的，且係由標準材料(塑膠、玻璃、不鏽鋼等)製成。反應容器可配備有混合、噴灑(sparging)、頂部空間加氣(headspace gassing)、溫度控制，且/或用探針監測以用於測量溫度、重量/體積、pH、溶解氧(DO)、及氧化還原電位。所有此類技術皆常見於製造廠的標準單元操作之內，且係所屬技術領域中具有通常知識者熟知的。
雖然已用一般用語描述了本發明，但本發明之實施例將進一步揭露於下列實例中，且其不應被解讀為限制申請專利範圍之範疇。
實例1.一般方法
cSDS
毛細管十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳在基於分子量下分離蛋白質。分析採用在溫控卡匣中具有熔融矽石毛細管的市售毛細管電泳系統。將測試物品與內部標準品及烷化試劑混合，在規定的時間及溫度下加熱以使蛋白質變性。然後，藉由電壓以電動力方式注射樣本，接著藉由以一段預定持續時間施加較大電場來分析樣本。藉由在220nm的吸光度完成檢測，並藉由 計算在內部標準品後電泳圖中主峰相對於所有其他峰的校正峰面積來判定純度。
IEX-HPLC
以離子交換高效液相層析(IEX-HPLC)判定相較於殘留親本同型二聚體抗體的雙特異性抗體百分比。離子交換層析利用分子上的表面電荷差異來達成分離。使用Thermo Scientific Propac WCX-10(4mm ID x 150mm，填充10um粒子)來執行IEX-HPLC。使用鹽梯度及/或pH梯度來解析物種的分離。隨著梯度濃度增加，中和了各抗體與管柱的整體表面交互作用，並於280nm檢測洗提。藉由比較峰面積計數來測量各IgG之相對量。
HIC-HPLC
疏水***互作用層析基於蛋白質的疏水性質來分離該等蛋白質。蛋白質在高鹽條件下保留在管柱上，並藉由降低鹽濃度來洗提。高鹽緩衝劑條件因蛋白質的溶劑合作用降低而暴露疏水區，並促進與HIC固定相的結合。將樣本注射到Tosoh TSKgel Butyl-NPR(4.6mm x 10cm、2.5um基於無孔樹脂之珠粒)管柱上並用硫酸銨梯度洗提。在280nm下監測吸光度並識別峰值(相較於參考標準注射)。
RP-HPLC(以檢測胱胺)
逆相高效層析基於與固定相介質的疏水性結合交互作用，分離流動相中的溶質分子。藉由RP-HPLC且藉由比較測量值與標準曲線，並利用2- MEA與氧化二聚體形式胱胺之疏水性差異來解析並定量。使用Phenomenex Luna 18(4.6mm×150mm,3um)管柱(其使用己磺酸鹽(hexane sulfonate)/乙腈流動相系統)，以用增加有機溶劑的階段式梯度分離兩種物種。監測在220nm(2-MEA)及255nm(胱胺)之吸光度及相較於其相對標準曲線的峰值面積，以檢測該等物種。
一般單特異性及雙特異性(以200ml規模進行者)抗體產生方案及規模
將各單特異性抗體自個別哺乳動物細胞庫解凍、擴增，並使其等分開表現於生物反應器中。產生生物反應器係補充有滋養培養基且在顯著細胞死亡前採集。藉由離心及/或過濾之手段採集生物反應器，並藉由親和性蛋白質A層析分開捕獲單特異性抗體。然後，將所得的經捕獲單特異性抗體冷凍儲存，直到在FAE階段中組合為止。
實例2.在使用Fab臂交換以製造雙特異性抗體期間的程序改善
使用藉由下列進行的Fab臂交換，來產生雙特異性抗體：在兩種同型二聚體親本抗體之CH3域中引入不對稱突變，隨後進行分子間雙硫鍵的還原及重新形成。不對稱CH3域突變驅動異二聚體雙特異性抗體相對於同型二聚體親本抗體的優先形成。
為了確保製造期間的程序穩固性，實驗經設計以獲取對製造期間各種參數之可能臨限及範圍的了解。抗體雙硫鍵重新形成已顯示為取決於氧及游離金屬的存在，此係因為EDTA及無氧條件抑制半胱胺酸在抗體中對雙硫鍵的再氧化(US2014/0303356)。因此，起始了研究以調查在使用Fab臂交換以製造雙特異性抗體期間，控制溶解氧(DO2)及金屬之量的需求。
圖2顯示在藉由Fab臂交換來製造雙特異性抗體期間，雙硫鍵還原及重新形成期間的製造步驟。
理論上，用還原劑(諸如2-巰基乙胺(2-MEA))還原後，抗體雙硫鍵重新形成可經由各種途徑發生。例如，硫醇-雙硫交換可解釋雙硫鍵的還原及重新形成。為了進行硫醇-雙硫交換，還原劑(諸如2-MEA)需要呈其硫醇根(RS-)形式以進行硫醇-雙硫交換。圖3顯示硫醇-雙硫交換反應的分子細節。為了還原親本抗體中之雙硫鍵，硫醇根(thiolate)陰離子(在圖中圈出)攻擊雙硫鍵之硫原子，其替代其中一個硫原子，並與2-MEA硫醇根形成新的雙硫鍵。
藉由使用如下所示的亨德森-哈塞爾巴爾赫(Henderson-Hasselbalch)方程式，2-MEA硫醇(S-H)與硫醇根陰離子(S-)的比率係高度取決於pH及2-MEA硫醇pKa。
Figure 108145933-A0202-12-0049-6
因此，雙硫鍵還原及整體Fab臂交換在低pH下變得受到抑制，其中2-MEA的質子化硫醇形式相對於其去質子化硫醇根陰離子形式係有利的。在較高的pH下，平衡朝向硫醇根偏移使得能夠進行雙硫鍵還原及硫醇-雙硫交換。
在2-MEA存在下進行Fab臂交換期間可發生的反應彙總係呈現於圖4中。在Fab臂交換期間，藉由緩衝劑交換(在UF/DF期間)移除還原劑(諸如2-MEA)，使得能夠在異二聚體雙特異性抗體中重新形成雙硫鍵，然而有多個反應路徑允許雙硫重新形成程序發生。在氧存在下，氧可與質子化硫醇根反應，而促進雙硫鍵在異二聚體雙特異性抗體中重新形成，如圖4中之反應2 所繪示。氧的存在亦可耗盡溶液中之殘留2-MEA硫醇，而形成胱胺二聚體及水，如圖4中之反應4所示。因此，應在Fab臂交換期間使用足夠高濃度的2-MEA，以改善雙特異性抗體的效率及產率。
然而，在氧不存在下，仍可能進行硫醇根雙硫交換及雙硫鍵重新形成。在氧匱乏的條件下，當2-MEA的濃度在緩衝劑交換程序期間降低時，抗體硫醇基及2-胺基乙基二硫化物Fab中間物可逆向驅動圖4中之反應1而在雙特異性異二聚體抗體中重新形成雙硫鍵，伴隨2-MEA硫醇根產生。隨著在緩衝劑交換程序期間移除更多2-MEA，會將此反應繼續推向逆向。
實例3.在UF/DF期間於低DO 2 條件下的雙特異性抗體A製造
實驗方法
在此實驗中，周圍DO2水平存在於還原期間及2-MEA添加後長達23小時，其後在UF/DF期間將氮覆蓋納入以最小化DO2%。該方法反映了氧存在於還原階段期間而不存在於雙硫鍵重新形成期間的條件。
雙特異性抗體A結合BCMA及CD3，且係IgG4同型，其在兩個重鏈中皆具有S228P、F234A、L235A取代(「PAA取代」)，在一個重鏈中之位置405處具有F且在位置409處具有R，而在第二重鏈中之位置405處具有L且在位置409處具有K，以驅動異二聚體形成。親本抗體係命名為p1A-IgG4PAAF405R409及p2A-IgG4PAAL405K409。
自細胞培養生物反應器採集親本抗體p1A-IgG4PAAF405R409及p2A-IgG4PAAL405K409，並藉由蛋白質A親和性層析純化。
以轉向莫耳比(steered molar ratio)或1：1.06使用p1A-IgG4PAAF405R409及p2A-IgG4PAAL405K409來製備溶液，以故意限制其中一種親本抗體。然後，將混合物調整至pH 7.3，並使用101mM乙酸鈉、105mM Tris鹼(pH 7.3)稀釋至10.5g/L的總IgG濃度。將50mM乙酸鈉、800mM 2-MEA(pH 5.0)儲備溶液添加至親本mAb混合物中。UF/DF前的最終還原緩衝劑組成係約100mM乙酸鈉、約35mM 2-MEA、約30mM NaCl，pH 7.3。將還原之親本mAb溶液在24℃下孵育23小時，隨後轉移至UF/DF滲餘物容器。在超濾(UF)及透析過濾(DF)開始之前，將氮覆蓋經由容器之頂部空間遞送至滲餘物容器，以在雙硫鍵重新形成期間耗盡DO2，並在整個UF及DF程序中維持該氮覆蓋。為了防止透過透析過濾緩衝劑添加DO2，在整個處理過程中將透析過濾緩衝劑(100mM Tris-乙酸酯、30mM NaCl，pH 7.5)用氮噴灑。使用線上(in-line)DO2感測器來驗證在UF步驟及DF步驟開始前，滲餘物DO2已達到低於5%的DO2水平，且透析過濾緩衝劑已達到低於1%的DO2水平。
在整個UF及DF程序中，DO2水平係於UF/DF期間在進料入口管路、滲餘物管路、及滲透物管路中測量，且皆維持在<4%的DO2。將透析過濾緩衝劑維持在<1%的DO2水平。將UF/DF系統維持在54mL/min的掃流率(crossflow rate)，並將目標定為14.5psi的跨膜壓以達到透析過濾體積(diafiltration volume,DV)為11。在室溫(18至22℃)下執行孵育後的所有程序。在UF/DF完成後，將回收的滲餘物用1.0M乙酸淬熄並調整至pH 5.0以最小化進一步的雙硫鍵形成，隨後儲存於2至8℃下。並未在UF/DF完成後執行額外緩衝劑回收沖洗，以防止材料因引入額外透析過濾緩衝劑而進行任何可能的氧化。
UF/DF設置經配備以在進行處理時於3個位置處測量DO2。在進料入口管路、滲餘物管路、及滲透物管路中的DO2%線上監測係顯示於圖5中。降低DO2之後，滲透物中的水平仍低於5%，且入口/滲餘物中的水平仍低於3%。表3顯示UF/DF程序參數及性能的彙總。
Figure 108145933-A0202-12-0052-7
表4顯示在2-MEA添加前及後之期間，離線(offline)DO2%、pH、及導電性測量的彙總。圖6顯示在UF/DF期間在滲餘物管路、滲透物管路、及入口管路中測量到的DO2百分比(%)。經過再循環中滲餘物的氮覆蓋後，DO2%隨時間穩定化，在滲透物中達到3.2%，在滲餘物中達到1.5%，且在進料中達到1.4%。
使用非還原性cSDS分析來測量所形成的異二聚體雙特異性抗體之雙硫鍵完整性(以在非還原性cSDS上異二聚體抗體的純度%測量)。抗體A的純度經測量為97.59%。
此研究證明，在還原期間的周圍DO2%(範圍為89至13%)及低DO2%環境(UF/DF期間為<4%的DO2)下，雙特異性抗體A形成且具有高水平的雙硫鍵形成(藉由在非還原性cSDS上的純度%反映)。先前相信的是，會需要DO2來將硫醇氧化成雙硫鍵以穩定化雙特異性抗體。
Figure 108145933-A0202-12-0053-8
在此研究期間存在的氧水平經計算係不足以在UF/DF期間促成硫醇的氧化。下文的計算證明，使用圖4中之反應2所表示的反應，在溶液中需要高於30%的DO2濃度以使硫醇氧化發生。
針對此研究，做出下列假設以計算將存在抗體量中所有硫醇氧 化的理論DO2百分比飽和溶液：
˙IgG溶液：10g/L
˙S-S(待還原及氧化的雙硫鍵)莫耳數/莫耳mAb
˙½莫耳O2/莫耳S-S，如果需要氧以自硫醇產生雙硫鍵，參照圖4之反應2。
˙空氣飽和水中的氧溶解度=7ppm(g O2/106g溶液)=100%飽和度
˙mAb MW：150kDa
為了計算當4二硫化物/莫耳mAb氧化時可將10mg/mL抗體溶液氧化的溶解DO2%濃度、及將所有硫醇氧化所需的O2：
1.(10mg mAb/mL溶液)*(莫耳mAb/150000g mAb)*(2莫耳S-S/莫耳mAb)*(½莫耳O2/莫耳S-S)*(1000mL/1L)(1g/1000mg)=6.67×10-4莫耳O2/L溶液
2.(6.67 x 10-5莫耳O2/L溶液)*(31.998g O2/1莫耳O2)*(1L/1000g)=2.13×10-6g O2/g溶液
3.(2.13×10-6g O2/g溶液)*(106g溶液)=2.13g O2/106g溶液=2.13ppm
4.空氣飽和水約7g O2/106g溶液=7ppm
5.2.13ppm/7ppm=所需30% O2飽和溶液
在操作溫度下的2% DO2等效於0.192mg/mL或6.00μM，3% DO2等效於0.288mg/L或8.99μM，4% DO2等效於0.384mg/L或11.29μM，5% DO2等效於0.480mg/mL或14.99μM。30% DO2等效於2.88mg/mL or 90μM。
這指示，存在氧非依賴性化學反應路徑，其允許在UF/DF步驟期間於氧不存在下重新形成雙硫鍵。可能的是，當將2-MEA自溶液移除時，圖4之反應1之逆反應趨動雙硫鍵在異二聚體雙特異性抗體中重新形成。
結論：在UF/DF期間將DO2水平維持在<4%並未顯著影響雙硫鍵形成。UF/DF完成時，雙特異性抗體的純度係>97%。
實例4.在UF/DF期間於低DO 2 下的雙特異性抗體B製造
在此實驗中，周圍DO2水平存在於還原期間及2-MEA添加後長達23小時，其後在UF/DF期間將氮覆蓋納入以最小化DO2%。該方法反映了氧存在於還原階段期間而不存在於雙硫鍵重新形成期間的條件。
雙特異性抗體B結合CD123及CD3，且係IgG4同型，其在兩個重鏈中皆具有S228P、F234A、L235A取代(「PAA取代」)，在一個重鏈中之位置405處具有F且在位置409處具有R，而在第二重鏈中之位置405處具有L且在位置409處具有K，以驅動異二聚體形成。親本抗體係命名為p1B-IgG4PAAF405R409及p2B-IgG4PAAL405K409。
自細胞培養生物反應器採集親本抗體p1B-IgG4PAAF405R409及p2B-IgG4PAAL405K409，並藉由蛋白質A親和性層析純化。
製備p1B-IgG4PAAF405R409及p2B-IgG4PAAL405K409的溶液，且將其調整至pH 7.3，並使用101mM乙酸鈉、105mM Tris鹼(pH 7.3)稀釋至10.5g/L的總IgG濃度。將50mM乙酸鈉、800mM 2-MEA(pH 5.0)儲備溶液添加至親本混合物中。UF/DF前的最終還原緩衝劑組成係約100mM乙酸鈉、約35mM 2-MEA、約30mM NaCl，pH 7.3。將還原之親本溶液在24℃下孵育23小時，隨後轉移至UF/DF滲餘物容器。在超濾(UF)及透析過濾(DF)開始之前，將氮覆蓋經由容器之頂部空間遞送至滲餘物容器，以在雙硫鍵重新形成期間耗盡DO2，並在整個UF及DF程序中維持該氮覆蓋。為了防止由透析過濾緩衝劑添加DO2，在整個處理過程中將透析過濾緩衝劑(100mM Tris-乙酸酯、30mM NaCl，pH 7.5)用氮噴灑。使用線上DO2感測器來驗證在UF步驟及DF步驟開始前，滲餘物已達到低於5%的DO2水平，且透析過濾緩衝劑已達到低於1%的水平。
在整個UF及DF程序中，DO2水平係於UF/DF期間在進料入口管路、滲餘物管路、及滲透物管路中測量，且皆維持在<4%的DO2。將透析過濾緩衝劑維持在<1%的DO2水平。將UF/DF系統維持在42mL/min的掃流率，並將目標定為15.0psi的跨膜壓以達到透析過濾體積(DV)為11。在室溫(18至22℃)下執行孵育後的所有程序。在UF/DF完成後，取3mL樣本，將其在pH 7.5下維持未調整，且立即儲存於-70℃下以防止進一步氧化。將回收滲餘物之剩餘主體用1.0M乙酸淬熄並調整至pH 5.0，以最小化進一步的雙硫鍵形成。隨後，將主體材料儲存於-70℃下。並未在UF/DF完成後執行額外緩衝劑回收沖洗，以防止材料因引入額外透析過濾緩衝劑而進行任何可能的氧化，然而產率低於一般觀察到的。
UF/DF設置經配備以在進行處理時於3個位置處測量DO2。在進料入口管路、滲餘物管路、及滲透物管路中的DO2%線上監測係顯示於圖5中。降低DO2之後，滲透物中的水平仍低於5%，且入口/滲餘物中的水平仍低於3%。
表5顯示UF/DF程序參數的彙總。圖7顯示在UF/DF期間在滲餘物管路、滲透物管路、及入口管路中測量到的DO2%。表6顯示離線DO2%、pH、及導電性測量的彙總。
Figure 108145933-A0202-12-0056-9
Figure 108145933-A0202-12-0057-10
Figure 108145933-A0202-12-0057-11
針對在pH 7.5下的冷凍樣本及在pH 5.0下的主體材料，使用非還原性cSDS分析來測量所形成的雙特異性抗體中之雙硫鍵完整性。pH 7.5雙特異性抗體製劑之純度經測量為97.16%，且在pH 5.0下的抗體製劑之純度經測量為97.27%。
此研究證明，在還原期間的周圍DO2%(範圍為83至24%)及UF/DF期間的低DO2%環境(<4% DO2)下，雙特異性抗體B形成且具有高水平的雙硫鍵形成。
此研究及實例2中所述之研究兩者皆證明，在Fab臂交換期間用於重新形成雙硫鍵的UF/DF步驟期間，不需要氧。
結論：在使用Fab臂交換來製造雙特異性抗體B的UF/DF步驟期間，將DO2水平維持在<4%並未顯著影響雙硫鍵形成。UF/DF完成時，非還原性cSDS展示>97%的純度%。
實例5.在UF/DF期間EDTA存在下於低DO 2 下的雙特異性抗體A製造
在製造雙特異性抗體期間，有機會將游離金屬離子引入於製造程序。在經由原料及金屬組分瀝濾(leaching)而製備緩衝劑期間，此等游離金屬離子可變成涉及Fab臂交換中的氧化還原反應。為了調查痕量金屬在Fab臂交換中的可能效應，研究了Fab臂交換期間的EDTA添加。EDTA添加螯合(sequester)了溶液中可能的游離金屬離子，該等游離金屬離子可催化用於雙硫鍵重新形成之氧化反應。
以1.05：1.00之莫耳比，使用p1A-IgG4PAAF405R409及p2A-IgG4PAAL405K409製備溶液。然後，將混合物調整至pH 7.3，並使用101mM乙酸鈉、105mM Tris鹼(pH 7.3)稀釋至10.5g/L的總IgG濃度。將50mM乙酸鈉、800mM 2-MEA(pH 5.0)儲備溶液添加至親本mAb混合物中。UF/DF前的最終還原緩衝劑組成係約100mM乙酸鈉、約35mM 2-MEA、約30mM NaCl，pH 7.3。將還原之親本溶液在24℃下孵育23.5小時。孵育完成時，將500mM EDTA(pH 8.0)儲備溶液添加至還原之親本混合物中，以達到2mM EDTA的目標，以螯合(chelate)會在UF/DF開始前存在於溶液中的游離金屬離子。亦將EDTA添加至透析過濾緩衝劑，以達到100mM Tris-乙酸酯、30mM NaCl、2mM EDTA、pH 7.5的目標。如此進行以確保，在UF/DF緩衝劑交換期間無法引入額外游離金屬離子。在還原步驟期間未添加EDTA，以允許在該步驟期間可能自發性發生之任何可能的二硫化物氧化及胱胺形成。
隨後，將含有EDTA的還原之親本溶液轉移至UF/DF滲餘物容器，並在UF開始前，將氮覆蓋經由容器之頂部空間遞送至滲餘物容器，以自滲 餘物耗盡DO2，並在整個UF及DF程序中維持該氮覆蓋。為了防止透過透析過濾緩衝劑添加DO2，在整個處理過程中將透析過濾緩衝劑用氮噴灑。線上DO2感測器驗證了在UF步驟及DF步驟開始前，滲餘物DO2水平達到低於2%的DO2水平，且透析過濾緩衝劑達到低於1% DO2的DO2水平。
在整個UF及DF程序中，DO2水平係於UF/DF期間在進料入口管路、滲餘物管路、及滲透物管路中測量，且皆維持<4%的DO2。將透析過濾緩衝劑維持在<1%的DO2水平。將UF/DF系統維持在58mL/min的掃流率，並將目標定為14.5psi的跨膜壓以達到透析過濾體積(DV)為11。在室溫(18至22℃)下執行孵育後的所有程序。在UF/DF完成後，取9mL樣本，將其在pH 7.5下維持未調整，且立即儲存於-70℃下以防止進一步氧化。將回收滲餘物之剩餘主體用1.0M乙酸淬熄並調整至pH 5.0，以最小化進一步的雙硫鍵形成。隨後，將在pH 5.0下的主體雙特異性抗體樣本儲存於-70℃下。並未在UF/DF完成後執行緩衝劑回收沖洗，以防止材料因引入額外透析過濾緩衝劑而進行可能的氧化。
表7彙總UF/DF程序參數及性能。
Figure 108145933-A0202-12-0059-12
針對在pH 7.5下的冷凍樣本及在pH 5.0下的主體材料，使用非還原性cSDS分析來測量所形成的雙特異性抗體中之雙硫鍵完整性。pH 7.5雙特異性抗體製劑之純度係97.44%，且在pH 5.0下的雙特異性抗體製劑之純度經測量為97.39%。
此研究證明，在UF/DF期間低DO2%環境及最少可用游離金屬離子下，雙特異性抗體A形成且具有高水平的雙硫鍵形成。研究證明，在Fab臂交換的UF/DF期間，可能不需要用於催化氧化反應的游離金屬離子。
結論：實驗結果證明，在Fab臂交換的UF/DF之前，將EDTA添加至還原之親本混合物並未影響雙硫鍵形成。UF/DF完成時，非還原性cSDS得到>97%的純度%。
實例6.在還原及UF/DF期間周圍及低DO 2 條件下之Fab臂交換的比較
此研究經設計以評估一些DO2介導氧化可在2-MEA還原期間發生的假設。
針對此研究，Fab臂交換係使用親本抗體p1B-IgG4PAAF405R409及p2B-IgG4PAAL405K409進行。製備於溶液中的p1B-IgG4PAAF405R409與p2B-IgG4PAAL405K409之混合物，且將其調整至pH 7.3，並使用101mM乙酸鈉、105mM Tris鹼(pH 7.3)稀釋至10.5g/L的總IgG濃度。將含有親本抗體的混合物分至兩個不同容器中。在一個容器中，將氮覆蓋經由頂部空間遞送至容器，以自親本混合物耗盡DO2，直到達到<5%的DO2%。另一親本混合物容器維持在周圍空氣條件下，作為還原的對照組。將50mM乙酸 鈉、800mM 2-MEA(pH 5.0)儲備溶液添加至親本混合物之各者中。UF/DF前的最終還原緩衝劑組成係約100mM乙酸鈉、約35mM 2-MEA、約30mM NaCl，pH 7.3。將兩個還原之親本溶液在24℃下孵育24小時，並測量兩個容器的DO2%，其結果如圖8所示。將低DO2%的還原容器在整個孵育過程中維持在氮覆蓋下，並維持在<2% DO2下24小時。在維持於周圍空氣下的容器中，DO2%在摻入2-MEA後有起始下降至大約40% DO2，其後DO2%逐漸線性增加而回到>90% DO2。UF/DF程序參數及性能的彙總係如表8所示。
Figure 108145933-A0202-12-0061-13
在還原期間，透過容器上的取樣埠，自兩個容器獲得樣本。在各樣本抽吸前沖洗埠，並立即藉由添加10% v/v的胱胺RP-HPLC流動相、20mM己磺酸鹽的pH 2.0緩衝劑來淬熄樣本，且驗證了各樣本在分析前已經還原至pH<5。所有時間點皆以非還原性cSDS檢定雙硫鍵完整性，並以RP-HPLC檢定殘留2-MEA/胱胺濃度。
需要額外樣本製備以用於殘留2-MEA/胱胺分析，其涉及藉由5kDa分子量滯留過濾器來移除抗體。非還原性cSDS純度%及殘留2-MEA/胱胺結果係記述於表9中。
在24小時還原孵育完成時，將低DO2%的容器轉移至UF/DF系統。繼續將氮覆蓋經由容器之頂部空間遞送至滲餘物容器，以繼續自滲餘物耗盡DO2，並在整個UF及DF程序中維持該氮覆蓋。亦在整個處理過程中將透析過濾緩衝劑用氮噴灑，以防止透過緩衝劑添加DO2。使用線上DO2感測器來驗證在UF步驟及DF步驟開始前，滲餘物已達到低於5%的DO2水平，且透析過濾緩衝劑已達到低於1%的DO2水平。
在整個UF及DF程序中，DO2水平係於UF/DF期間在進料入口管路、滲餘物管路、及滲透物管路中測量，且皆維持在<4%的DO2。將透析過濾緩衝劑維持在<1%的DO2水平。將UF/DF系統維持在55mL/min的掃流率，並將目標定為14.5psi的跨膜壓以達到透析過濾體積(DV)為12，其使用100mM Tris-乙酸酯、30mM NaCl、pH 7.5緩衝劑。在室溫(18至22℃)下執行孵育後的所有程序。在UF/DF完成後，將回收滲餘物用1.0M乙酸淬熄並調整至pH 5.0，以最小化進一步的雙硫鍵形成。隨後，將主體材料儲存於-70℃下。並未在UF/DF完成後執行額外緩衝劑回收沖洗，以防止材料因引入額外透析過濾緩衝劑而進行任何可能的氧化。
針對低DO2%的容器及具有周圍DO2的對照容器兩者，在整個還原及UF/DF期間於各種時間點，以非還原性cSDS測量雙硫完整性，並以RP-HPLC測量殘留2-MEA/胱胺。
數據彙總係顯示於表9中。在此實驗中的整個UF/DF期間，只有在氧匱乏條件下的Fab臂交換反應持續進行。僅透過兩種Fab臂交換條件下的還原來測量殘留2-MEA及胱胺，然而在氧匱乏條件下的UF/DF期間，獲得樣本來以非還原性cSDS測量雙硫鍵的可能重新形成。
Figure 108145933-A0202-12-0063-14
結論：此數據支持在還原及UF/DF期間於氧不存在下由氧非依賴性路徑介導雙硫鍵形成的假設。
當在氧匱乏條件下執行Fab臂交換時，在還原過程期間觀察到最少的胱胺形成及雙硫鍵重新形成。在2-MEA存在下的24小時孵育完成時，僅觀察到1.6mM胱胺及14.74%完整抗體。儘管如此，一旦透過UF/DF處理抗體樣本，則在移除2-MEA時雙硫鍵重新形成水平的增加明顯。在DV結束(在DV12)時，所形成之在pH 5.0下的雙特異性抗體製劑經測量為90.59%的純度%
在周圍DO2下，快速發生雙硫鍵還原，在還原開始後30min，還原了約86%的親本抗體。在還原之剩餘時間期間，甚至在溶液中殘留2-MEA持續存在下，仍觀察到雙硫鍵重新形成。在還原階段完成時，71%的抗體具有完整雙硫鍵。在還原孵育期間的胱胺二聚體形成以及雙特異性抗體的形成水平增加，指示氧正分別依反應4及反應2(繪示於圖4中)消耗。此係由RP-HPLC數據支持，其顯示2-MEA顯著耗盡且轉化為二聚體化合物胱胺(圖4中之反應4)。
此研究證明，在還原階段期間的DO2催化IgG HC-HC及LC-HC鏈間雙硫鍵的形成，但當雙硫鍵甚至在氧匱乏條件下重新形成時，則對於完整雙特異性抗體之形成並非必要。在透析過濾期間，甚至在氧不存在下移除2-MEA，其解釋了由圖4中之反應1之逆反應驅動的雙硫鍵重新形成。
實例7.利用高濃度的親本抗體，在周圍DO 2 中使用Fab臂交換產生雙特異性EGFR/c-Met抗體
此研究經設計以評估以下假設：較高的同型二聚體混合物蛋白質濃度及不同的還原劑與蛋白質質量之比率產生氧化異二聚體抗體。
在研究中使用雙特異性EGFR/cMet抗體。EGFR/cMet抗體包含SEQ ID NO：4之第一重鏈(HC1)、SEQ ID NO：5之第一輕鏈(LC)、SEQ ID NO：6之第二HC(HC2)、及SEQ ID NO：7之第二LC(LC2)。
針對此研究，使用親本EGFR抗體及c-Met抗體(兩者皆係IgG1同型)來進行Fab臂交換。製備於溶液中的親本抗體經過濾中和之蛋白質A洗出液的混合物，且將其調整至pH 7.9，並使用209.5mM乙酸鈉、300mM NaCl(pH 7.9)稀釋至10至35g/L的總IgG濃度。將50mM乙酸鈉、800mM 2-MEA(pH 5.0)儲備溶液添加至親本混合物之各者中，以達到35、50、或100mM的目標還原劑濃度。將兩個還原之親本溶液控制在21.5℃或24℃下孵育3小時，或者不受控制在周圍室溫下孵育。在3小時後，將經孵育的混合物相對於10mM Tris、7.8mM乙酸(pH 7.5)超過濾及透析過濾。操作條件及分析結果的彙總係顯示於表10中。此研究展示出在此等條件下的氧化異二聚體，該等條件為溫度範圍在21.5至24℃、還原劑濃度為35至100mM、及同型二聚體混合物蛋白質濃度為10至35g/L。雙特異性抗體完整性及純度係使用實例1中所述之方法，以NR-cSDS及IHC-HPLC兩者評估。
Figure 108145933-A0202-12-0065-15
Figure 108145933-A0202-12-0066-16
SEQ ID NO：4(HC1)
Figure 108145933-A0202-12-0066-17
SEQ ID NO：5(LC1)
Figure 108145933-A0202-12-0066-18
Figure 108145933-A0202-12-0067-19
SEQ ID NO：6(HC2)
Figure 108145933-A0202-12-0067-20
SEQ ID NO：7(LC2)
Figure 108145933-A0202-12-0067-21
相關申請案之交互參照
本申請案主張2018年12月18日申請之美國臨時專利申請案序號62/781,180之優先權，其全部內容以引用方式併入本文中。
序列表
本申請案含有經由EFS-Web提交的序列表，其全部內容以引用方式併入本文中。ASCII文字檔(建立於2019年12月10日)被命名為JBI6029TWNP_ST25.txt且檔案大小為21千位元組。
<110> 楊森生技公司(Janssen Biotech,Inc.) 阿方索‧馬丁，佩德羅‧荷西(Alfonso Martin,Pedro Jose) 卡帕爾迪，麥可(Capaldi,Michael) 科恩，杰弗裡(Cohen,Jeffrey) 德策爾，安德魯(Detzel,Andrew) 薩基亞馬，約瑟夫(Sakyiama,Joseph)
<120> 產生異二聚體抗體之方法
<130> JBI6029TWNP
<140> 待指派
<141> 2019-12-xx
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Figure 108145933-A0202-12-0069-22
Figure 108145933-A0202-12-0070-23
Figure 108145933-A0202-12-0071-24
<210> 2
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Figure 108145933-A0202-12-0071-25
Figure 108145933-A0202-12-0072-26
Figure 108145933-A0202-12-0073-27
<210> 3
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Figure 108145933-A0202-12-0073-28
Figure 108145933-A0202-12-0074-29
Figure 108145933-A0202-12-0075-30
<210> 4
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR/cMet抗體之HC1
<400> 4
Figure 108145933-A0202-12-0075-31
Figure 108145933-A0202-12-0076-32
Figure 108145933-A0202-12-0077-33
<210> 5
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR/cMet抗體之LC1
<400> 5
Figure 108145933-A0202-12-0078-34
Figure 108145933-A0202-12-0079-35
<210> 6
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR/cMet抗體之HC2
<400> 6
Figure 108145933-A0202-12-0079-36
Figure 108145933-A0202-12-0080-37
Figure 108145933-A0202-12-0081-38
<210> 7
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR/cMet抗體之LC2
<400> 7
Figure 108145933-A0202-12-0082-39
Figure 108145933-A0202-12-0083-40

Claims (72)

  1. 一種產生異二聚體抗體之方法，其包含：
    a)提供第一同型二聚體抗體，該第一同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第一Fc區，該第一Fc區包含第一CH3區；及第二同型二聚體抗體，該第二同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第二Fc區，該第二Fc區包含第二CH3區，其中該第一CH3區與該等第二CH3區之胺基酸序列不同，且係使得在該第一CH3區與該第二CH3區之間的異二聚體交互作用較在該第一CH3區之間的同型二聚體交互作用或該第二CH3區之間的同型二聚體交互作用強；
    b)將該第一同型二聚體抗體與該第二同型二聚體抗體組合成混合物；及
    c)在還原劑及周圍溶解氧(DO2)存在下孵育該混合物，以產生該異二聚體抗體，其中該方法在產生該異二聚體抗體期間缺少下列中之一或多個步驟：測量該混合物中之DO2百分比(%)、控制該混合物中之該DO2%、或將氧添加至該混合物中。
  2. 如請求項1所述之方法，其中在步驟1b)，該混合物中之該DO2%係約30%或更高。
  3. 如請求項1或2所述之方法，其中在產生該異二聚體抗體期間，該DO2%係在約10%與約90%之間。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之方法，其中該第一同型二聚體抗體與該第二同型二聚體抗體係以約1：1至約1：2之間的莫耳比在步驟1b)中組合成該混合物。
  5. 如請求項1至3中任一項所述之方法，其中該第一同型二聚體抗體與該第二同型二聚體抗體係以約1.05：1的莫耳比在步驟1b)中組合成該混合物。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該混合物中之免疫球蛋白總濃度係在約8g/L與約13g/L之間，諸如約10.5g/L。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之方法，其中該混合物係在該還原劑存在下孵育約10分鐘或更久。
  8. 如請求項7所述之方法，其中該混合物係在該還原劑存在下孵育約10分鐘至約24小時。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之方法，其中該還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、2-MEA之化學衍生物、L-半胱胺酸、或D-半胱胺酸。
  10. 如請求項9所述之方法，其中該混合物中之2-MEA濃度係在約20mM與40mM之間，諸如約35mM。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之方法，其中該混合物包含緩衝劑。
  12. 如請求項11所述之方法，其中該緩衝劑包含乙酸鈉緩衝劑。
  13. 如請求項12所述之方法，其中該緩衝劑進一步包含NaCl。
  14. 如請求項13所述之方法，其中該緩衝劑包含約100mM乙酸鈉及約30mM NaCl。
  15. 如請求項14所述之方法，其中該緩衝劑之pH係約7.3。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之方法，其包含自該混合物移除該還原劑之步驟。
  17. 如請求項16所述之方法，其中該還原劑係藉由過濾移除。
  18. 如請求項17所述之方法，其中過濾係透析過濾(diafiltration)。
  19. 如請求項1至18中任一項所述之方法，其中該第一同型二聚體抗體及該第二同型二聚體抗體係IgG1、IgG2、或IgG4同型。
  20. 如請求項19所述之方法，其中當相較於SEQ ID NO：1之野生型IgG1、SEQ ID NO：2之野生型IgG2、或SEQ ID NO：3之野生型IgG4時，該第一CH3域及該第二CH3域包含下列突變：F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、Y407LWQ/K409AGRH、T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、T366W/T366S_L368A_Y407V、L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W、K409D/D399K、K409E/D399R、K409D_K360D/D399K_E356K、K409D_K360D/D399E_E356K、K409D_K370D/D399K_E357K、K409D_K370D/D399E_E357K、K409D_K392D/D399K_E356K_E357K、或K409D_K392D/D399E_E356K_E357K。
  21. 如請求項20所述之方法，其中當相較於SEQ ID NO：1之野生型IgG1、SEQ ID NO：2之野生型IgG2、或SEQ ID NO：3之野生型IgG4時，該第一 Fc區及/或該第二Fc區包含一或多個突變，其調節該第一Fc區及/或該第二Fc區與Fcγ受體(FcγR)、FcRn、或蛋白質A之結合。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該FcγR係FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、或FcγRIII。
  23. 如請求項21所述之方法，其中調節該第一Fc區及/或該第二Fc區與該Fcγ之結合的該一或多個取代係L234A_L235A、F234A_L235A、S228P_F234A_L235A、S228P_L234A_L235A、V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S、V234A_G237A、H268Q_V309L_A330S_P331S、S267E_L328F、L234F_L235E_D265A、L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S、或S228P_F234A_L235A_G237A_P238S。
  24. 如請求項21所述之方法，其中調節該第一Fc區及/或該第二Fc區與該FcRn之結合的該一或多個取代係M428L_N434S、M252Y_S254T_T256E、T250Q_M428L、N434A及T307A_E380A_N434A、H435A、P257I_N434H、D376V_N434H、M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F、T308P_N434A、或H435R。
  25. 如請求項21所述之方法，其中調節該第一Fc區及/或該第二Fc區與蛋白質A之結合的該一或多個取代係Q311R、Q311K、T307P_L309Q、T307P_V309Q、T307P_L309Q_Q311R、T307P_V309Q_Q311R、H435R、或H435R_Y436F。
  26. 如請求項1至25中任一項所述之方法，其中產生該異二聚體抗體之該等步驟係在符合GMP之條件下進行。
  27. 如請求項26所述之方法，其中產生該異二聚體抗體之該等步驟係在製造原料藥(drug substance)之期間進行，該原料藥包含該異二聚體抗體。
  28. 如請求項1至27中任一項所述之方法，其中該異二聚體抗體係雙特異性抗體。
  29. 如請求項28所述之方法，其中該雙特異性抗體結合CD3、CD123、BCMA、EGFR、或c-Met、或其任何組合。
  30. 如請求項1至29中任一項所述之方法，其中該混合物中該還原劑與總免疫球蛋白之質量比係在約1.0與約5.0之間。
  31. 如請求項30所述之方法，其中該質量比係在約1.4與約3.8之間。
  32. 如請求項30所述之方法，其中該質量比係在約3.3與約4.4之間。
  33. 一種產生異二聚體抗體之方法，其包含：
    a)提供第一同型二聚體抗體，該第一同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第一Fc區，該第一Fc區包含第一CH3區；及第二同型二聚體抗體，該第二同型二聚體抗體包含免疫球蛋白之第二Fc區，該第二Fc區包含第二CH3區，其中該第一CH3區與該等第二CH3區之胺基酸序列不同，且係使得在該第一CH3區與該第二CH3區之間的異二聚體交互作用較在該第一CH3區之間的同型二聚體交互作用或該第二CH3區之間的同型二聚體交互作用強；
    b)將該第一同型二聚體抗體與該第二同型二聚體抗體組合成混合物；
    c)在還原劑存在下孵育該混合物；及
    d)移除該還原劑以產生該異二聚體抗體，其中
    在步驟c)、步驟d)、或步驟c)及步驟d)兩者中，溶解氧(DO2)百分比(%)經控制為約30%或更低。
  34. 如請求項33所述之方法，其中該混合物中之該DO2%係約25%或更低、20%或更低、約15%或更低、約10%或更低、約9%或更低、約8%或更低、約7%或更低、約6%或更低、約5%或更低、約4%或更低、約3%或更低、約2%或更低、或約1%或更低。
  35. 如請求項34所述之方法，其中DO2%係藉由氮覆蓋來控制。
  36. 如請求項34或35所述之方法，其中該第一同型二聚體抗體與該第二同型二聚體抗體係以約1：1至約1：2之間的莫耳比在步驟b)中組合成該混合物。
  37. 如請求項34或35所述之方法，其中該第一同型二聚體抗體與該第二同型二聚體抗體係以約1.05：1的莫耳比在步驟b)中組合成該混合物。
  38. 如請求項33至37中任一項所述之方法，其中該混合物中之免疫球蛋白總濃度係約10.5g/L。
  39. 如請求項33至38中任一項所述之方法，其中該混合物係在該還原劑存在下孵育約10分鐘或更久。
  40. 如請求項33至39中任一項所述之方法，其中該混合物係在該還原劑存在下孵育約10分鐘至約24小時。
  41. 如請求項33至40中任一項所述之方法，其中該還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、2-MEA之化學衍生物、L-半胱胺酸、或D-半胱胺酸。
  42. 如請求項41所述之方法，其中該混合物中之2-MEA濃度係約35mM。
  43. 如請求項33至42中任一項所述之方法，其中該混合物包含緩衝劑。
  44. 如請求項43所述之方法，其中該緩衝劑包含乙酸鈉緩衝劑。
  45. 如請求項44所述之方法，其中該緩衝劑進一步包含NaCl。
  46. 如請求項45所述之方法，其中該緩衝劑包含約100mM乙酸鈉及約30mM NaCl。
  47. 如請求項46所述之方法，其中該緩衝劑之pH係約7.3。
  48. 如請求項33至47中任一項所述之方法，其包含自該混合物移除該還原劑之步驟。
  49. 如請求項48所述之方法，其中該還原劑係藉由過濾移除。
  50. 如請求項49所述之方法，其中過濾係透析過濾。
  51. 如請求項33至50中任一項所述之方法，其中該第一同型二聚體抗體及該第二同型二聚體抗體係IgG1、IgG2、或IgG4同型。
  52. 如請求項51所述之方法，其中當相較於SEQ ID NO：1之野生型IgG1、SEQ ID NO：2之野生型IgG2、或SEQ ID NO：3之野生型IgG4時，該第一CH3域及該第二CH3域包含下列突變：F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、Y407LWQ/K409AGRH、T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、T366W/T366S_L368A_Y407V、 L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W、K409D/D399K、K409E/D399R、K409D_K360D/D399K_E356K、K409D_K360D/D399E_E356K、K409D_K370D/D399K_E357K、K409D_K370D/D399E_E357K、K409D_K392D/D399K_E356K_E357K、或K409D_K392D/D399E_E356K_E357K。
  53. 如請求項52所述之方法，其中當相較於SEQ ID NO：1之野生型IgG1、SEQ ID NO：2之野生型IgG2、或SEQ ID NO：3之野生型IgG4時，該第一Fc區及/或該第二Fc區包含一或多個突變，其調節該第一Fc區及/或該第二Fc區與Fcγ受體(FcγR)、FcRn、或蛋白質A之結合。
  54. 如請求項53所述之方法，其中該FcγR係FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、或FcγRIII。
  55. 如請求項53所述之方法，其中調節該第一Fc區及/或該第二Fc區與該Fcγ之結合的該一或多個取代係L234A_L235A、F234A_L235A、S228P_F234A_L235A、S228P_L234A_L235A、V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S、V234A_G237A、H268Q_V309L_A330S_P331S、S267E_L328F、L234F_L235E_D265A、L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S、或S228P_F234A_L235A_G237A_P238S。
  56. 如請求項53所述之方法，其中調節該第一Fc區及/或該第二Fc區與該FcRn之結合的該一或多個取代係M428L_N434S、M252Y_S254T_T256E、T250Q_M428L、N434A及T307A_E380A_N434A、H435A、P257I_N434H、D376V_N434H、M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F、T308P_N434A、或H435R。
  57. 如請求項53所述之方法，其中調節該第一Fc區及/或該第二Fc區與蛋白質A之結合的該一或多個取代係Q311R、Q311K、T307P_L309Q、T307P_V309Q、T307P_L309Q_Q311R、T307P_V309Q_Q311R、H435R、或H435R_Y436F。
  58. 如請求項33至57中任一項所述之方法，其中產生該異二聚體抗體之該等步驟係在符合GMP之條件下進行。
  59. 如請求項33至57中任一項所述之方法，其中產生該異二聚體抗體之該等步驟係在製造原料藥之期間進行，該原料藥包含該異二聚體抗體。
  60. 如請求項33至59中任一項所述之方法，其中該異二聚體抗體係雙特異性抗體。
  61. 如請求項60所述之方法，其中該雙特異性抗體結合CD3、CD123、BCMA、EGFR、或c-Met、或其任何組合。
  62. 如請求項33至61中任一項所述之方法，其中該混合物中該還原劑與總免疫球蛋白之質量比係在約1.0與約5.0之間。
  63. 如請求項62所述之方法，其中該質量比係在約1.4與約3.8之間。
  64. 如請求項62所述之方法，其中該質量比係在約3.3與約4.4之間。
  65. 一種經單離之雙特異性抗體，其藉由如請求項1所述之方法產生。
  66. 如請求項65所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體結合EGFR及c-Met。
  67. 如請求項65或66所述之雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：4之第一重鏈(HC1)、SEQ ID NO：5之第一輕鏈(LC1)、SEQ ID NO：6之第二重鏈(HC2)、及SEQ ID NO：7之第二輕鏈(LC2)。
  68. 如請求項65所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體結合CD3。
  69. 一種經單離之雙特異性抗體，其藉由如請求項33所述之方法產生。
  70. 如請求項69所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體結合EGFR及c-Met。
  71. 如請求項69或70所述之雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：4之第一重鏈(HC1)、SEQ ID NO：5之第一輕鏈(LC1)、SEQ ID NO：6之第二重鏈(HC2)、及SEQ ID NO：7之第二輕鏈(LC2)。
  72. 如請求項69所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體結合CD3。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2023008190A (es) * 2021-01-11 2023-09-28 Adimab Llc Variantes de dominios ch3 genomodificados para la heterodimerización de ch3 preferencial, anticuerpos multi específicos que los comprenden, y sus métodos de fabricación.
KR20230041210A (ko) * 2021-09-17 2023-03-24 고려대학교 산학협력단 Fc 감마 수용체와의 결합력이 증대된 Fc 변이체
CN116178546A (zh) * 2022-10-13 2023-05-30 深圳市百士通科技开发有限公司 一种多功能重组抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10344050B2 (en) * 2011-10-27 2019-07-09 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
US20170275367A1 (en) * 2012-11-21 2017-09-28 Janssen Biotech, Inc. Bispecific EGFR/C-Met Antibodies
EP3447069B1 (en) * 2012-11-21 2020-09-23 Janssen Biotech, Inc. Bispecific egfr/c-met antibodies
EA201990673A1 (ru) * 2016-09-14 2019-08-30 Бэйцзин Ханми Фарм. Ко., Лтд. Антитела, специфически связывающиеся с il-17a, и их функциональные фрагменты

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