CN104030990B - 苯基氨基嘧啶化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及苯基氨基嘧啶化合物及其用途，所述化合物为蛋白激酶(包括JAK激酶)的抑制剂。特别地，所述化合物对JAK2激酶具有选择性。所述激酶抑制剂可被用于治疗激酶相关性疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病(包括器官移植)；过度增殖性疾病(包括癌症和骨髓增殖性疾病)；病毒性疾病；代谢性疾病；以及血管疾病。

Description

苯基氨基嘧啶化合物及其用途
本申请是2008年3月12日提交的发明名称为“苯基氨基嘧啶化合物及其用途”的中国专利申请200880015782.9的分案申请。
技术领域
本发明涉及苯基氨基嘧啶化合物，其为蛋白激酶(包括JAK激酶)的抑制剂。特别地，所述化合物对JAK2激酶具有选择性。所述激酶抑制剂可被用于治疗激酶相关性疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病(包括器官移植)；过度增殖性疾病(包括癌症和骨髓增殖性疾病)；病毒性疾病；代谢性疾病；以及血管疾病。
背景技术
JAK是使被称为信号转导和转录激活因子或STAT的一组蛋白磷酸化的激酶。当被磷酸化时，STAT成为二聚体，转移至细胞核，并且激活尤其导致细胞增殖的基因的表达。
在若干重要细胞类型的增殖和最终功能的细胞因子依赖性调节中，蛋白酪氨酸激酶的JAK家族所发挥的主要作用表明，能够抑制JAK激酶的药剂可用于依赖这些酶的疾病状态的预防和化学疗法治疗。目前已知的4种JAK家族成员各自的有效且特异性的抑制剂会提供抑制促发免疫性疾病和炎性疾病的细胞因子的作用的方法。
骨髓增殖性疾病(MPD)尤其包括，真性红细胞增多症(PV)、原发性骨髓纤维化、血小板增多症、自发性血小板增多(ET)、特发性骨髓纤维化(IMF)、慢性髓性白血病(CML)、***性肥大细胞增多症(SM)、慢性嗜中性粒细胞白血病(CNL)、骨髓增生异常综合征(MDS)和***性肥大细胞病(SMCD)。JAK2是JAK家族激酶的成员，在99％的真性红细胞增多症(PV)患者和50％的自发性血小板减少(ET)和特发性骨髓纤维化(MF)患者中，已发现JAK2的特异性突变(JAK2V617F)。此突变被认为激活JAK2，有力地证明JAK2抑制剂可用于治疗这些类型的疾病的论点。
哮喘是以局部和全身的过敏性炎症和可逆性气道阻塞为特征的综合性病症。哮喘的症状，特别是气短，是气道阻塞的结果，而且死亡几乎始终是因为窒息。气道高反应性(AHR)和杯状细胞过度分泌粘液是在哮喘患者中气道阻塞的两个主要原因。有趣地是，在哮喘动物实验模型中的近期研究已强调了作为哮喘病理学中的关键角色的IL-13的重要性。利用特异性IL-13阻滞剂，已证明IL-13发挥作用不依赖于IL-4，并且可能能够在不诱导IgE的情况下(即以非特应性的方式)，引起全部过敏性哮喘表型。此模型及其它模型已证明了用于探讨哮喘的病理生理学的重要的二阶机制(second tier mechanism)，其不依赖于由定居B细胞产生IgE或者嗜酸性粒细胞的存在。由IL-13直接诱导AHR代表了重要的过程，该过程可能成为通过新疗法进行干涉的优异靶点。JAK2抑制剂对肺的预期效果会导致抑制由IL-13介导的IgE生成的局部释放，并因此减少肥大细胞和嗜酸性粒细胞的组胺释放。缺少IL-13的该结果和其它结果表明，通过向肺给药JAK2抑制剂，可以缓解哮喘的许多效应。
慢性阻塞性肺病(COPD)是指可以妨碍正常呼吸的一大类肺病的术语。现行的临床准则将COPD定义为以不完全可逆的气流限制为特征的疾病状态。气流限制通常是进行性的，而且与肺对有毒颗粒和气体、特别是吸烟和污染的异常炎症反应相关。若干研究已证明IL-13的生成增加和COPD之间的相关性，证实了在COPD中也可以实现通过使用JAK2抑制剂来有效地缓解哮喘症状的论点。COPD患者具有包括咳嗽、气短和多痰的各种症状。COPD包括若干临床呼吸性综合征，包括慢性支气管炎和肺气肿。
慢性支气管炎是引起粘液产生增加和其它改变的支气管的长时间的炎症。患者的症状是咳嗽和咳痰。慢性支气管炎可导致更频繁且严重的呼吸道感染、支气管狭窄和堵塞、呼吸困难和无力。
肺气肿是影响肺泡和/或细支气管(the smallest bronchi)末端的慢性肺病。肺失去它的弹性，因此肺的这些区域扩张。这些扩张的区域留滞不新鲜的空气并且不能有效地使它与新鲜空气交换。这样导致呼吸困难，并且可以导致血液供氧不足。肺气肿患者的主要症状是气短。
此外，在恶性肿瘤，尤其是肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、***癌和肝癌以及霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和肝细胞癌中，存在STAT活化的证据。在许多恶性血液病，包括慢性髓性白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、慢性嗜酸性白血病(CEL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性疾病(MPD)和急性淋巴细胞白血病(ALL)中，已经描述了涉及JAK2与Tel、Bcr和PCMl的融合的染色体易位。这表明，指示通过JAK抑制剂治疗过度增殖性疾病，例如癌症，包括多发性骨髓瘤；***癌、乳腺癌和肺癌；霍奇金淋巴瘤；CML；AML；CEL；MDS；ALL；B细胞慢性淋巴细胞白血病；转移性黑色素瘤；胶质瘤；和肝细胞瘤。
JAK2的有效抑制剂，除了上述之外，还可用于血管疾病，例如高血压、肥大、心肌缺血、心力衰竭(包括收缩期心力衰竭和舒张期心力衰竭)、偏头痛和相关的脑血管病症、中风、雷诺现象、POEMS综合征、普林兹迈托心绞痛、血管炎例如高安动脉炎和韦格纳肉芽肿病、外周动脉病、心脏病和肺动脉高压。
肺动脉高压(PAH)是影响肺小动脉的肺血管病，其导致肺动脉压和肺血管阻力的提高，但是伴有正常或仅稍微提高的左心室充盈压。PAH由影响肺血管***的一组疾病引起。PAH可以由胶原血管疾病(collagen vascular disorders)引起，或者与胶原血管疾病相关，所述胶原血管疾病例如***性硬化症(硬皮病)、未矫正的先天性心脏病、肝病、门静脉高压、HIV感染、丙型肝炎、某些毒素、脾切除术、遗传性出血性毛细血管扩张症和原发性遗传性畸形。具体地，已将骨形态生成蛋白2型受体(TGF-b受体)的突变确认为家族性原发性肺动脉高压(PPH)的病因。据估计，6％的PPH病例是家族性的，其余的是“散发性的”。估计PPH的发病率约为每一百万人口中一例。PAH的继发性病因具有更高的发病率。PAH的病理标志是肺的丛状损伤，其由小的前毛细血管肺小动脉内的闭塞性内皮细胞增殖和血管平滑肌细胞肥大组成。PAH是与高死亡率相关的进行性疾病。PAH患者可能形成右心室(RV)衰竭。RV衰竭的程度预示着后果。最近已表明，JAK/STAT途径涉及PAH的病理生理学。JAK是使被称为信号转导和转录激活因子或STAT的一组蛋白磷酸化的激酶。当被磷酸化时，STAT成为二聚体，转移至细胞核并且激活导致内皮细胞和平滑肌细胞增殖而且引起心肌细胞肥大的基因的表达。有三种不同的JAK同工型：JAK1、JAK2和JAK3。与JAK高度同源性的另一种蛋白被称为Tyk2。新的数据已表明，在PAH的动物模型中，JAK2的底物——STAT3的磷酸化增加了。在大鼠的野百合碱模型中，促有丝***(promitogenic)转录因子STAT3的磷酸化增加。在此同样的研究中，用野百合碱处理的肺动脉内皮细胞(PAEC)产生STAT3的过度激活。促有丝***的药剂或蛋白是诱导或促进诱导细胞增殖的药剂或蛋白。因此，抑制JAK2的一个功效可能是降低内皮细胞或其它细胞例如平滑肌细胞的增殖。JAK2抑制剂的预期功效可能是降低阻塞肺小动脉腔的内皮细胞或其它细胞的增殖。通过降低细胞的阻塞性增殖，JAK2抑制剂可能有效地治疗PAH。
此外，表明了JAK激酶抑制剂用于治疗病毒性疾病和代谢性疾病的用途。
虽然基本上所有组织都表达JAK家族的其它成员，JAK3的表达似乎限于造血细胞。这与它在经IL-2、IL4、IL-7、IL-9和IL-15的受体，通过JAK3与这些多链受体共有的γ链非共价缔合来进行的信号转导中的重要作用一致。患有X染色体连锁性严重联合免疫缺陷病(XSCID)的雄性，在共有的细胞因子受体γ链(γc)基因中存在缺陷，所述基因编码白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15的受体共有的主要组分。已确定XSCID综合征，其患者具有突变的或者严重降低的JAK3蛋白水平，表明免疫抑制应该是由于阻断经JAK3途径的信号转导所致。小鼠的基因敲除研究已表明，JAK3不仅在B淋巴细胞和T淋巴细胞成熟中发挥关键性作用，而且在构成上JAK3是维持T细胞功能所必须的。综合JAK3参与IL-2和IL-4受体的信号转导事件下游的生化证据，这些人类和小鼠突变研究表明，能够证明通过抑制JAK3来调节免疫活性可用于治疗T细胞和B细胞增殖性病症，例如移植排异和自身免疫性疾病。相反地，不期望的JAK3抑制可能对用药物治疗的个体的免疫状态具有破坏性影响。
虽然抑制靶向一系列疾病状态的各种类型的蛋白激酶无疑是有益的，但是，迄今已证明，发现对感兴趣的蛋白激酶具有选择性并且具有满意的“类药”性质例如高口服生物利用度的化合物是富有挑战性的目标。此外，已普遍接受的是，无论被靶向的酶之间的序列相似性水平如何，在激酶抑制剂的研发中，抑制性或选择性的可预测性相当低。
在开发治疗学上适合的、用于治疗激酶相关性疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病(包括器官移植)；过度增殖性疾病(包括癌症和骨髓增殖性疾病)；病毒性疾病；代谢性疾病；以及血管疾病的JAK2抑制剂中的挑战包括设计具有适当的特异性并具有良好的类药性的化合物。
因此，不断地需要设计和/或发现特异性地抑制JAK家族激酶的化合物，特别是相对于其它的JAK激酶，可以优选地抑制一种JAK激酶、特别是JAK2的化合物。需要这样的化合物用于治疗一系列疾病。
发明概述
在第一个方面，提供了式I的化合物
其中
Q和Z独立地选自N和CR1；
n是1、2或3；
R1独立地选自氢、卤素、R2、OR2、OH、R4、OR4、CN、CF3、(CH2)nN(R2)2、NO2、R2R4、SO2R4、NR2SO2R3、COR4、NR2COR3、CO2H、CO2R2、NR2COR4、R2CN、R2CN、R2OH、R2OR3和OR5R4；或者
两个R1取代基与它们连接的碳共同形成不饱和的5或6元杂环基；
R2是取代的或未取代的C1-4烷基、或者取代的或未取代的C1-4亚烷基，其中至多2个碳原子可以任选地被CO、NRY、CONRY、S、SO2或O替代；
R3是R2、C2-4烯基、或者取代的或未取代的芳基；
R4是NH2、NHR2、N(R1)2、取代的或未取代的吗啉代、取代的或未取代的硫代吗啉代、取代的或未取代的硫代吗啉代-1-氧化物、取代的或未取代的硫代吗啉代-1，1-二氧化物、取代的或未取代的哌嗪基、取代的或未取代的哌啶基、取代的或未取代的吡啶基、取代的或未取代的吡咯烷基、取代的或未取代的吡咯基、取代的或未取代的噁唑基、取代的或未取代的咪唑基、取代的或未取代的四氢呋喃基、以及取代的或未取代的四氢吡喃基；
R5是取代的或未取代的C1-4亚烷基；
R6-R10独立地选自H、RXCN、卤素、取代的或未取代的C1-4烷基、OR1、CO2R1、N(R1)2、NO2、CON(R1)2、SO2N(RY)2、N(SO2R1)2、取代的或未取代的哌嗪基、N(RY)SO2R2和CF3；
Rx不存在，或者是取代的或未取代的C1-6亚烷基，其中至多2个碳原子可以任选地被CO、NSO2R1、NRY、CONRY、S、SO2或O替代；
RY是H，或者是取代的或未取代的C1-4烷基；并且
R11选自H、卤素、取代的或未取代的C1-4烷基、OR2、CO2R2、CN、CON(R1)2和CF3，
或其对映体、其前药、或其药学可接受的盐。
在第二个方面，提供了用于制备上文定义的式I的化合物的方法，其包括使式II的化合物与式III和IV的化合物偶联的步骤
其中
Y和R11以及n如上文定义，并且X是离去基
其中
n、Z、R1和R6-R10如上文定义；并且
M是B或者金属例如Sn、Zn或Mg。
式I的化合物为激酶抑制剂，优选为JAK抑制剂，更优选为JAK2抑制剂。这些化合物可用于治疗激酶相关性疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病(包括器官移植)；过度增殖性疾病(包括癌症和骨髓增殖性疾病)；病毒性疾病；代谢性疾病；和血管疾病。
在第三个方面，提供了包含上文定义的式I的化合物的药剂或其代谢物。
还提供了式I的化合物作为药剂或其代谢物的用途。
进一步提供了用作药剂或其代谢物的上文定义的式I的化合物。
在第四个方面，提供了包含上文定义的式I的化合物的激酶抑制剂。
还提供了上文定义的式I的化合物作为激酶抑制剂的用途。
进一步提供了用作激酶抑制剂的上文定义的式I的化合物。
在第五个方面，提供了用作药剂或其代谢物、优选用作激酶抑制剂、更优选用作JAK激酶抑制剂、最优选用作JAK2选择性抑制剂的上文定义的式1的化合物。
还可以与药学可接受的载体一起，以药物组合物的形式给药所述式I的化合物。
在第六个方面，提供了包含上文定义的式I的化合物和药学可接受的载体的药物组合物。
在一个实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种其它的治疗药剂。
可以将所述式I的化合物包含在植入物例如药物洗脱支架内或者与之连接。例如，当所述化合物用于治疗肺动脉高血压(PAH)时，可以将所述化合物包含在肺动脉支架内或者与之连接，所述化合物可以局部地发挥作用，或者由所述支架释放至肺循环中，在那里所述化合物发挥其在肺血管***中的治疗活性。
在第七个方面，提供了包含上文定义的式I的化合物的植入物。
在第八个方面，提供了用于治疗激酶相关性疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病(包括器官移植)；过度增殖性疾病(包括癌症和骨髓增殖性疾病)；病毒性疾病；代谢性疾病；和血管疾病的方法，其包括将有效量的上文定义的式I的化合物或药物组合物给药于有此需要的个体。
还提供了如上文定义的式I的化合物或药物组合物在制备用于治疗激酶相关性疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病(包括器官移植)；过度增殖性疾病(包括癌症和骨髓增殖性疾病)；病毒性疾病；代谢性疾病；和血管疾病的药物中的用途。
进一步提供了如上文定义的式I的化合物或药物组合物在治疗激酶相关性疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病(包括器官移植)；过度增殖性疾病(包括癌症和骨髓增殖性疾病)；病毒性疾病；代谢性疾病；和血管疾病中的用途。
更进一步地提供了用于治疗激酶相关性疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病(包括器官移植)；过度增殖性疾病(包括癌症和骨髓增殖性疾病)；病毒性疾病；代谢性疾病；和血管疾病的上文定义的式I的化合物或药物组合物。
在第九个方面，提供了抑制细胞激酶的方法，其包括使所述细胞与上文定义的式I的化合物接触。
附图说明简要
图1显示了所选的JAK激酶的氨基酸序列排比。显示的序列是j2h＝JAK2(SEQ.ID.NO.1)、jlh＝JAK1(SEQ.ID.NO.2)、j3h＝JAK3(SEQ.ID.NO.3)、和tyk2＝TYK2(SEQ.ID.NO.4)。所述序列以起始于JAK2序列(取自Genbank序列NP_004963)的氨基酸833为第1位加以编号，并终止于C-末端氨基酸的序列。所示序列对应于C-末端激酶结构域。
图2显示了未治疗的红白血病细胞(HEL92.1.7)与已用0.25、0.5、1、或2μM化合物3、或者DMSO/STAT5py处理的细胞的STAT5磷酸化的流式细胞术分析对比。治疗后，用小鼠单克隆抗-STAT5(Y694)PE抗体将细胞染色，并利用荧光激活细胞分选术(FACS)分析。按照相对于同型对照(透明轮廓的同型对照线(Isocont lane))的中值荧光度的倍数变化，为直方图上不同深浅的颜色。
图3显示了化合物3对IL-3诱导的BaF3细胞的STAT5磷酸化的影响。用仅有媒介物(vehicle)、渐增浓度的化合物3、或阳性对照化合物温育BaF3细胞。用STAT5磷酸化特异性抗体处理蛋白质印迹，并且曝光胶片5分钟(顶部的印迹)和1分钟(中间的印迹)。底部的印迹显示总的STAT蛋白，无论其磷酸化状态如何。这些印迹明确地显示：随着化合物3的浓度增加，IL-3刺激的BaF3细胞的STAT5磷酸化降低。
图4显示了化合物3对HEL细胞的STAT5磷酸化的影响。用仅有媒介物、渐增浓度的化合物3、或阳性对照化合物温育HEL细胞。用STAT5磷酸化特异性抗体处理蛋白质印迹，并且曝光胶片5分钟(顶部的印迹)和1分钟(中间的印迹)。底部的印迹显示总的STAT蛋白，无论其磷酸化状态如何。这些印迹明确地显示：随着化合物3的浓度增加，HEL细胞的STAT5磷酸化降低。
图5显示了用化合物3治疗对小鼠血浆的生长激素刺激的***-1(IGF-1)浓度的影响。
图6显示了口服给药化合物3在裸鼠Ba/F3TelJAK2细胞的皮下肿瘤模型中的功效。
图7显示了点图，其显示STAT5磷酸化(y轴)，对在来自具有JAK2V617F阳性ET的患者骨髓的红系细胞的CD71的表达(x轴)作图，以及化合物3对pYSTAT5的功效。在这种情况下，阴性对照(A)仅显示出少量的pYSTAT5染色，在用红细胞生成素(B)(阳性对照)刺激后，pYSTAT5染色显著增加。如(C)中所示，添加化合物3引起对pYSTAT5抑制的剂量依赖性增强。这表示为在左幅图中的所测的阳性对照的pYSTAT5活性的抑制百分比，并表示为在右幅图中的全部红系细胞群的荧光强度的绝对变化。
发明详述
本发明涉及式I的化合物，其抑制激酶，特别是抑制JAK激酶例如JAK2，并且其可用于治疗激酶相关性疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病(包括器官移植)；过度增殖性疾病(包括癌症和骨髓增殖性疾病)；病毒性疾病；代谢性疾病；和血管疾病。
化合物
本发明涉及式I的化合物
其中
O和Z独立地选自N和CR1；
n是1、2或3；
R1独立地选自氢、卤素、R2、OR2、OH、R4、OR4、CN、CF3、(CH2)nN(R2)2、NO2、R2R4、SO2R4、NR2SO2R3、COR4、NR2COR3、CO2H、CO2R2、NR2COR4、R2CN、R2CN、R2OH、R2OR3和OR5R4；或者
两个R1取代基与它们连接的碳共同形成不饱和的5或6元杂环基；
R2是取代的或未取代的C1-4烷基、或者取代的或未取代的C1-4亚烷基，其中至多2个碳原子可以任选地被CO、NRY、CONRY、S、SO2或O替代；
R3是R2、C2-4烯基、或者取代的或未取代的芳基；
R4是NH2、NHR2、N(R1)2、取代的或未取代的吗啉代、取代的或未取代的硫代吗啉代、取代的或未取代的硫代吗啉代-1-氧化物、取代的或未取代的硫代吗啉代-1，1-二氧化物、取代的或未取代的哌嗪基、取代的或未取代的哌啶基、取代的或未取代的吡啶基、取代的或未取代的吡咯烷基、取代的或未取代的吡咯基、取代的或未取代的噁唑基、取代的或未取代的咪唑基、取代的或未取代的四氢呋喃基、以及取代的或未取代的四氢吡喃基；
R5是取代的或未取代的C1-4亚烷基；
R6-R10独立地选自H、RXCN、卤素、取代的或未取代的C1-4烷基、OR1、CO2R1、N(R1)2、NO2、CON(R1)2、SO2N(RY)2、N(SO2R1)2、取代的或未取代的哌嗪基、N(RY)SO2R2和CF3；
Rx不存在，或者是取代的或未取代的C1-6亚烷基，其中至多2个碳原子可以任选地被CO、NSO2R1、NRY、CONRY、S、SO2或O替代；
RY是H，或者是取代的或未取代的C1-4烷基；并且
R11选自H、卤素、取代的或未取代的C1-4烷基、OR2、CO2R2、CN、CON(R1)2和CF3，
或其对映体、其前药、或其药学可接受的盐。
在一个实施方案中，所述式I的化合物具有式Ia：
其中，
Q和Z独立地选自N和CR1；
R1独立地选自H、卤素、R2、OR2、OH、R4、CN、CF3、NO2、R2R4、SO2R4、NR2SO2R3、COR4、CO2H、CO2R2、NR2COR3、NR2COR4、R2CN、R2OH、R2OR3和OR5R3；或者
两个R1取代基与它们连接的碳原子共同形成不饱和的5或6元含N杂环基；
R2是C1-4烷基、或者C1-4亚烷基；
R3是R2、C2-4烯基或芳基；
R4是NH2、NHR2、N(R2)2、吗啉代、硫代吗啉代、硫代吗啉代-1-氧化物、硫代吗啉代-1，1-二氧化物、4-羰基甲基哌嗪基、4-甲基哌嗪基、3-或4-羟基哌啶基、4-羟基甲基哌啶基、4-吡咯烷基哌啶基、4-或5-甲基噁唑基、4-羟基吡啶基、3-羟基吡咯基、3-羟基吡咯烷基、吡啶基吡唑基或咪唑基；
R5是C2-4亚烷基；
R6-R9独立地选自H、RXCN、卤素、取代的或未取代的C1-4烷基、取代的或未取代的芳基、OR1、CO2R1、N(R1)2、NO2、CON(R1)2和CON(R1)2；
RX是取代的或未取代的C1-4亚烷基，其中至多2个碳原子可以任选地被CO、NSO2R1、NRY、CONRY、SO、SO2或O替代；
RY是H，或者是取代的或未取代的C1-4烷基；并且
R11选自H、卤素、取代的或未取代的C1-4烷基、OR2、CO2R2、CN、CON(R1)2和CF3，
或其对映体、其前药、或其药学可接受的盐。
优选地，Q是N，并且Z是CR1。
优选地，R1是氢、吗啉基、CH2吗啉基、C1-4烷氧基、硫代吗啉基、3-羟基吡咯烷基、碘、氟、OH、4-羟基哌啶基、4-羟基甲基哌啶基、N-甲基哌啶基、3-羟基哌啶基、羰基4-吡咯烷基哌啶基、氧基-4-哌啶基、4-羰基甲基哌嗪基、4-甲基哌嗪基、4-NHSO2CH3-哌啶基、4-氧基哌啶基、咪唑基CON(R1)2、CF3或R2OR3。
优选地，R6是H或甲基。
优选地，R7是H、甲基、甲氧基、卤素如氯、或羟基。
优选地，R8是H、RXCN例如CONHCN、CH2NHCOCN、CN、CONHC(CH3)2CN、NCNSO2CH3、SO2NHCH2CN或N(SO2CH3)CH2CN、OH、CO2CH2CH3、CON(R1)2、N(R1)2或者CO2R1。
优选地，R9是H、RXCN例如CONHCN、CH2NHCOCN或CH2NHCN、甲氧基、卤素、OCF3或者CF3。
优选地，R11是H、卤素、取代的或未取代的C1-4烷基、OR2、CO2R2、CN或CF3，更优选地是H、甲基、甲氧基、C1、Br、F或CO2R2，最优选地是H或甲基。
在优选的实施方案中，所述式I或Ia的化合物具有式Ib：
其中
Z独立地选自N和CH；
R1独立地选自H、卤素、OH、CONHR2、CON(R2)2、CF3、R2OR2、CN、吗啉代、硫代吗啉基、硫代吗啉代-1，1-二氧化物、取代的或未取代的哌啶基、取代的或未取代的哌嗪基、咪唑基、取代的或未取代的吡咯烷基、和被吗啉代、硫代吗啉基、硫代吗啉代-1，1-二氧化物、取代的或未取代的哌啶基、取代的或未取代的哌嗪基、咪唑基、或者取代的或未取代的吡咯烷基取代且其中碳原子任选地被NRY和/或O替代的C1- 4亚烷基；
R2是取代的或未取代的C1-4烷基；
RY是H，或者是取代的或未取代的C1-4烷基；
R8是RXCN；
RX是取代的或未取代的C1-4亚烷基，其中至多2个碳原子可以任选地被CO、NSO2R1、NRY、CONRY、SO、SO2或O替代；
R11是H或C1-4烷基，
或其对映体、其前药、或其药学可接受的盐。
式I的化合物的实例包括但不局限于以下：
术语“C1-6烷基”和“C1-4烷基”是指具有1-6个碳原子的直链或支链烃基。实例包括乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基和己基。
术语“C1-6亚烷基”和“C1-4亚烷基”是“C1-6烷基”和“C1-4烷基”的二价等价物。
术语“C2-4烯基”是指具有至少一个双键(适用时具有E或Z立体化学)并且具有2-4个碳原子的直链或支链烃基。实例包括乙烯基、1-丙烯基、1-和2-丁烯基以及2-甲基-2-丙烯基。
术语“芳基”是指芳烃的单环残基、多环残基、共轭残基或稠合残基。实例包括苯基、联苯基、三联苯、四联苯、萘基、四氢萘基、蒽基、二氢蒽基、苯并蒽基、二苯并蒽基和菲基(phenanthrenyl)。
术语“不饱和的5或6-元含N杂环基”是指含有至少一个氮的不饱和环烃基团。
适合的含N杂环基团包括含有1-4个氮原子的不饱和5至6-元杂单环基团，例如吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、***基或四唑基；
含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和5或6-元杂单环基团，例如噁唑基、异噁唑基或噁二唑基；以及
含有1-2个硫原子和1-3个氮原子的不饱和5或6-元杂单环基团，例如噻唑基或噻二唑基。
术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
术语“取代的”是指被一个或多个选自C1-6烷基、C3-6环烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷基芳基、芳基、杂环基、卤素、卤代C1-6烷基、卤代C3-6环烷基、卤代C2-6烯基、卤代C2-6炔基、卤代芳基、卤代杂环基、羟基、C1-6烷氧基、C2-6烯基氧基、C2-6炔基氧基、芳氧基、杂环基氧基、羧基、卤代C1-6烷氧基、卤代C2-6烯基氧基、卤代C2-6炔基氧基、卤代芳基氧基、硝基、硝基C1-6烷基、硝基C2-6烯基、硝基芳基、硝基杂环基、叠氮基、氨基、C1-6烷基氨基、C2-6烯基氨基、C2-6炔基氨基、芳基氨基、杂环氨基酰基、C1-6烷基酰基、C2-6烯基酰基、C2-6炔基酰基、芳基酰基、杂环基酰基、酰基氨基、酰氧基、醛基、C1-6烷基磺酰基、芳基磺酰基、C1-6烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、C1-6烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、C1-6烷基亚磺酰基(C1-6alkylsulphenyl)、C2-6烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、烷氧羰基、芳氧羰基(carboaryloxy)、巯基、C1-6烷硫基、芳硫基、酰硫基、氰基等的基团取代。优选的取代基选自C1-4烷基、C3-6环烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷基芳基、芳基、杂环基、卤素、卤代芳基、卤代杂环基、羟基、C1-4烷氧基、芳氧基、羧基、氨基、C1-6烷基酰基、芳基酰基、杂环基酰基、酰基氨基、酰氧基、C1-6烷基亚磺酰基、芳基磺酰基和氰基。
本发明的化合物还可以被制备成药学可接受的盐，但是应理解为非药学可接受的盐也包括在本发明的范围内，因为它们可在制备所述药学可接受的盐的过程中用作中间体。药学可接受的盐的实例包括药学可接受的阳离子，例如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵的盐；药学可接受的无机酸的酸，例如盐酸、正磷酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸的加成盐；或者药学可接受有机酸，例如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、丁二酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、三卤代甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸盐、依地酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗坏血酸盐、戊酸和乳清酸的盐。胺基的盐还可以包括季铵盐，其中氨基氮原子带有适当的有机基团，例如烷基、烯基、炔基或芳烷基部分。
可以通过常规的方法，例如，通过在溶剂或所述盐不溶于其中的介质中，或者在溶剂如水(在真空中或者通过冷冻干燥被除去)中，使化合物的游离碱形式与一个或多个当量的适当酸反应，或者通过在适当的离子交换树脂上使现有盐的阴离子与其它阴离子交换，来形成所述盐。
在化合物具有手性中心的情况下，所述化合物可以作为纯化的对映体或非对映体，或者作为以任意比例的立体异构体的混合物被使用。但是，优选所述混合物包含至少70％、80％、90％、95％、97.5％或99％的优选的异构体，其中所述优选的异构体提供期望水平的效力和选择性。
本发明还包括式I的化合物的前药。本发明还包括治疗可以通过抑制蛋白激酶如JAK来治疗的疾病的方法，其包括给药本发明的化合物的药物或前药。例如，具有游离氨基、酰胺基、羟基或羧酸基团的式I的化合物可以被转化为前药。前药包括这样的化合物，其中氨基酸残基、或者两个或多个(例如两个、三个或四个)氨基酸残基的多肽链通过肽键与本发明化合物的游离氨基、羟基和羧酸基团共价连接。所述氨基酸残基包括通常由三个字母符号表示的20种天然存在的氨基酸，还包括4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素(demosine)、异锁链素(isodemosine)、3-甲基组氨酸、正缬氨酸(norvlin)、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸和甲硫氨酸砜。前药还包括这样的化合物，其中碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺和烷基酯通过羰基碳前药侧链与本发明化合物的上述取代基共价连接。前药还包括化合物的磷酸酯衍生物(例如酸、酸的盐、或酯)，其通过磷-氧键与式I化合物的游离羟基连接。前药还可以包括式I的适当的氮和硫原子的N-氧化物和S-氧化物。
方法
通式I的化合物通常从二氯嘧啶制备。
本方法的第一步典型地以2,4-二氯嘧啶和适当官能化的偶联配体(couplingpartner)之间的交叉偶联反应开始。或者，所述二氯嘧啶可以被转化为二碘嘧啶，然后使其与适当官能化的偶合配体偶联。典型的偶联配体是有机硼酸或有机硼酸酯(Suzuki偶联：参见例如Miyaura，N.和Suzuki，Chem Rev.1995，952457)；有机锡烷(Stille偶联：参见例如Stille，J.K.，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.，1986，25，508)；格式试剂(Kumada coupling：Kumada，M.；Tamao，K.；Sumitani，K.Org.Synth.1988，Coil.Vol.6，407.)，或者有机锌类(Negishi偶联：Negishi，E.；J.Organomet.Chem.2002，653，34)。Suzuki偶联是优选的偶联方法，并且典型地在添加或不添加水的溶剂(例如DME、THF、DMF、乙醇、丙醇、甲苯、乙腈或1，4-二氧六环)中，在碱(例如碳酸钠或碳酸钾、氢氧化锂、碳酸铯、氢氧化钠、氟化钾或磷酸钾)的存在下进行。此反应可以在高温下进行，并且使用的钯催化剂可以选自Pd(PPh3)4、Pd(OAc)2、[PdCl2(dppf)]、Pd2(dba)3/P(t-Bu)3。
本方法的第二步包括以上所得产物与适当取代的苯胺的亲核芳香取代反应。典型地，在溶剂(例如乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇、二氧六环、THF、DMF、甲苯或二甲苯)中，通过将苯胺加入由第一步反应得到的单卤代杂环中间体，进行所述亲核芳香取代。典型地，在酸(例如HCl或对甲苯磺酸)存在下，或者在碱例如非亲核性碱(例如三乙胺或二异丙基乙胺)、或无机碱(例如碳酸钾或碳酸钠)存在下，在高温下进行此反应。
或者，可以通过过度金属催化的胺化反应导入所述苯胺取代基。用于这样的转变的典型催化剂包括Pd(OAc)2/P(t-Bu)3、Pd2(dba)3/BINAP和Pd(OAc)2/BINAP。这些反应典型地在溶剂(例如甲苯或二氧六环)中，在碱(例如碳酸铯或叔丁醇钠或叔丁醇钾)存在下，在从室温至回流温度的温度范围下进行(例如Hartwig，J.F.，Angew.Chem.Int.Ed.1998、37、2046)。
从商业上获得，或者使用本领域技术人员熟知的方法制备在合成这些化合物的第一步中使用的苯胺。
使用本领域技术人员已知的方法，可以进一步地衍生由任一反应步骤形成的产物。或者，在取代卤素取代基之前，可以衍生所述单卤代中间体。本领域技术人员会理解：在某些条件下，可以改变上述合成中描述的反应的顺序，并且为了使上述反应以合理的收率和效率进行，在某些情况下可能需要衍生化(即保护)某些官能团。保护官能团的种类为本领域技术人员熟知，并且在例如Greene(Greene，T.，Wuts，P.(1999)Protective Groups inOrganic Synthesis.Wiley-Interscience；第3版)中有描述。
式II的化合物(本发明的方法所用的中间体)中的离去基团可以是任何适当的已知类型，例如在J.March，“Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms andStructure”，第4版，pp352-357，John Wiley&Sons，New York，1992中公开的那些类型，将该文献通过引用纳入本文中。所述离去基团优选为卤素，更优选为氯或碘。
JAK抑制
式I的化合物具有抑制蛋白激酶、特别是JAK激酶的活性，而且最特别地是具有抑制JAK2的活性。JAK2抑制剂是选择性地抑制JAK2的活性的任何化合物。JAK2的作用之一是磷酸化STAT蛋白。因此，JAK2抑制剂的功效的实例是降低一种或多种STAT蛋白的磷酸化。所述抑制剂可以抑制JAK2的磷酸化形式或者JAK2的非磷酸化形式。
本发明还提供了激酶抑制剂例如JAK激酶抑制剂，特别是JAK2抑制剂的用途。
药物组合物
本发明提供了包含至少一种式I的化合物和药学可接受的载体的药物组合物。所述载体必须是“药学可接受的”，意指它与所述组合物中的其它组分相容，并且对个体无害。本发明的组合物可以包含如下所述的其它治疗剂，并且可以例如通过使用常规的固体或液体的媒介物或稀释剂，以及适用于期望的给药方式的药学添加剂类型(例如赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等)，按照例如药学制剂领域熟知的技术(参见例如Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第21版，2005，Lippincott Williams&Wilkins)，来配制所述组合物。
可以通过任何适当的方法给药本发明的化合物，例如口服给药(例如以片剂、胶囊剂、颗粒剂或散剂的形式)；舌下给药；含服给药；肠胃外给药，例如通过皮下注射、静脉内注射、肌内注射、皮内(透皮)注射、或脑池内注射或者输液技术(如作为无菌的可注射的水性或非水性溶液剂或混悬剂)；经鼻给药，例如通过吸入喷雾或吹入法；局部给药，例如采用乳膏或软膏剂；以溶液剂或混悬剂的形式经眼给药；以***栓剂(pessaries)、棉塞剂(tampons)或乳膏剂的形式***给药；或者直肠给药，例如以栓剂的形式；以包含无毒的药学可接受的媒介物或稀释剂的剂量单位制剂给药。例如可以采用适合于速释或缓释的形式给药所述化合物。可以通过使用包含本发明化合物的适当药物组合物实现速释或缓释，或者，特别是在缓释的情况下，通过使用装置例如皮下植入物或渗透泵来实现。
为了给药本发明的化合物，所述药物组合物可以方便地是剂量单位的形式，并且可以通过药学领域熟知的任何方法配制。这些方法通常包括使式I的化合物和构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，通过均一地且紧密地使式I的化合物与液体载体或精细粉碎(divided)的固体载体或者二者结合，然后，如果需要，使产品成型，成为期望的制剂，来配制所述药物组合物。在所述药物组合物中，包含足以对疾病过程或状况产生期望的效力的量的活性目标化合物。如在本文中使用的，术语“组合物”意在包括包含特定量的特定成分的产品，以及直接或间接地由特定量的特定成分的组合产生的任何产品。
包含式I的化合物的药物组合物可以是适合口服使用的形式，例如片剂、含片、锭剂、水性混悬剂或油性混悬剂、可分散的散剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊剂或软胶囊剂、或者糖浆剂或酏剂。可以按照本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法制备准备口服使用的组合物，并且这样的组合物可以包含一种或多种药剂例如甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，例如以提供药学上稳定且可口的制剂。片剂包含式I的化合物和适用于制备片剂的、无毒性的药学可接受的赋形剂的混合物。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或***胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。所述片剂可以是无包衣的，或者可以按照已知技术将它们包衣以延迟在胃肠道内的崩解和吸收，并由此在更长时间内提供持续性作用。例如，可以使用延时材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。还可以将它们包衣以形成用于控释的渗透性治疗片剂。
口服使用的制剂还可以作为硬胶囊剂存在，其中式I的化合物和惰性固体例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合；或者作为软胶囊剂存在，其中式I的化合物与水或油性介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水性混悬剂包含活性材料和适于制备水性混悬剂的赋形剂的混合物。这样的赋形剂是助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪树胶和***树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂；或者是烯基氧化物与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；或者是环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)；或者是环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；或者是环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。所述水性混悬剂还可以包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯、或对羟基苯甲酸正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；以及一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。
可以通过将式I的化合物悬浮于植物油(如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或者矿物油(如液体石蜡)中，来配制油性混悬剂。所述油性混悬剂可以包含增稠剂，如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂例如上文所述的那些甜味剂和调味剂，以提供可口的口服制剂。可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸，使这些组合物防腐。
适合于通过添加水来配制水性混悬剂的可分散的散剂和颗粒剂，提供式I的化合物与分散剂或润湿剂、助悬剂和一种或多种防腐剂的混合物。适当的分散剂或润湿剂和助悬剂通过在上文中已提到的那些举例列出。也可以存在其它赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物也可以是水包油型乳剂的形式。油相可以是植物油例如橄榄油或花生油、或者矿物油例如液体石蜡、或者它们的混合物。适当的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如***树胶或黄芪树胶；天然存在的磷脂，例如大豆磷脂、卵磷脂；以及衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯；以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。所述乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。
可以用甜味剂如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖来配制糖浆剂和酏剂。这样的制剂还可以包含缓和剂、防腐剂、调味剂和着色剂。
所述药物组合物可以是无菌的可注射的水性混悬剂或油性混悬剂。可以按照已知的方法，使用那些适当的上文中已提及的分散剂或润湿剂和助悬剂，来配制此混悬剂。所述无菌的可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌、可注射的溶液剂或混悬剂，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液剂。可以使用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格液和等渗氯化钠溶液。另外，常规地用无菌的不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何无刺激性的不挥发性油，包括合成的单酸甘油酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可以用于配制可注射制剂。
为了向呼吸道给药包括鼻内给药，可以通过本领域为向呼吸道给药所使用的任何方法和制剂，来给药所述活性化合物。
因此，通常可以溶液剂或混悬剂的形式，或者作为干粉剂来给药所述活性化合物。
溶液剂和混悬剂通常是水性的，例如仅由水(例如无菌水或无热原水)、或由水和生理学上可接受的共溶剂(例如乙醇、丙二醇或聚乙烯二醇例如PEG400)制备。
这样的溶液剂或混悬剂可以另外地包含其它赋形剂，例如防腐剂(例如苯扎氯铵)、增溶剂/表面活性剂例如聚山梨醇酯(如Tween80、Span80、苯扎氯铵)、缓冲剂、等渗调节剂(例如氯化钠)、吸收促进剂和增稠剂。混悬剂可以另外包含助悬剂(例如微晶纤维素和羧甲基纤维素钠)。
通过常规的方法，例如用点滴器、吸管或喷雾器，直接将溶液剂或混悬剂施用至鼻腔。可以采用单剂量或多剂量的形式提供所述制剂。在后一种情况下，需要提供量度剂量的方法。对于点滴器或吸管，可以通过个体给药适合的确定体积的溶液剂或混悬剂，来实现剂量量度。对于喷雾器，例如可以通过计量雾化喷雾泵来实现。
也可以通过气雾剂实现向呼吸道给药，其中所述化合物与适当的抛射剂，例如氯氟化碳(CFC)如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷、二氧化碳或者其它适合的气体一起，在加压包装中提供。所述气雾剂也可以方便地包含表面活性剂例如卵磷脂。可以通过提供计量阀来控制活性化合物的剂量。
或者，可以采用干粉剂的形式提供所述活性化合物，例如所述化合物在适当的粉末基质例如乳糖、淀粉、淀粉衍生物例如羟丙甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷(PVP)中的粉末状混合物。粉末载体会方便地在鼻腔中形成凝胶。所述粉末组合物可以单位剂型存在，例如以明胶胶囊或药筒、或者泡罩包装的形式，由其可以通过吸入器给药粉末。
在预期向呼吸道给药的制剂，包括鼻内剂型中，所述活性化合物通常具有小的粒径，例如约5微米级或更小。可以通过本领域已知的方法例如微粉法，来得到这样的粒径。
需要时，可以采用适于提供所述活性化合物的缓释的制剂。
所述活性化合物可以作为自由流动的粉末，经由“Diskhaler”(Glaxo Group Ltd的商标)或剂量剂量的气雾剂吸入器，通过经口吸入来给药。
本发明的化合物也可以采用供直肠给药的栓剂来给药。可以通过将药物与适当的无刺激性赋形剂混合来配制这些组合物，所述赋形剂在常温下是固体而在直肠的温度下是液体，并且因此会在直肠中融化释放出药物。这样的物质如可可脂和聚乙二醇。
适合于***给药的组合物可以作为***栓剂、棉塞剂、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂存在，所述制剂除了活性成分之外包含本领域已知的适合的载体。
为了局部使用，采用包含本发明的化合物的乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、溶液剂或混悬剂等。(为了本申请的目的，局部施用应包括漱口剂和含漱剂。)
为了施用至眼部，所述活性化合物可以是在适当的无菌水性或非水性媒介物中的溶液剂或混悬剂。还可以包含添加剂，例如缓冲剂、防腐剂包括杀菌剂和杀真菌剂(例如乙酸苯汞或硝酸苯汞、苯扎氯铵、或氯己定)和增稠剂例如羟丙甲纤维素。
还可以采用脂质体剂给药本发明的化合物。如本领域已知的，通常脂质体得自磷脂或其它脂质物质。通过分散于水性介质中的单层或多层水合液晶形成脂质体。可以使用任何无毒性的生理学上可接受的且可代谢的能够形成脂质体的脂质。本发明的脂质体形式的组合物，除了本发明的化合物之外，可以包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是天然的和合成的磷脂和磷脂酰胆碱。形成脂质体方法是本领域已知的。
这类化合物的功效可以适用于药物洗脱支架。含有这些化合物的药物洗脱支架的潜在用途包括肺动脉狭窄、肺静脉狭窄和冠状动脉狭窄。药物洗脱支架也可以用于隐静脉移植物或动脉移植物或导管。释放这类化合物的药物洗脱支架也可以适用于治疗主动脉或外周动脉(例如髂动脉、股动脉或腘动脉)狭窄。通过本领域已知的各种方法中的任一种方法，可以将所述化合物结合在所述药物洗脱支架上。这样的方法的实例包括聚合物、磷酸胆碱和陶瓷。也可以将所述化合物浸渍入生物可吸收的支架中。
所述活性化合物还可以兽用组合物的形式存在供使用，所述兽用组合物例如可通过本领域常规的方法制备。这样的兽用组合物的实例包括适用于以下的那些兽用组合物：
(a)口服给药、外部施用，例如兽用顿服药(如水性或非水性溶液剂或混悬剂)；片剂或大丸药；为了与饲料混合的散剂、颗粒剂或丸剂；为了施于舌头的糊剂；
(b)肠胃外给药，例如通过皮下注射、肌肉注射或静脉内注射，如作为无菌的溶液剂或混悬剂；或(适当时)通过***内注射，其中混悬剂或溶液剂经***被导入***中；
(c)局部施用，如作为施用于皮肤的乳膏剂、软膏剂或喷雾剂；或者
(d)直肠给药或***内给药，如作为***栓剂、乳膏剂或泡沫剂。
本发明的药物组合物和方法可以进一步包含如本文中所述的其它治疗活性化合物，其通常用于治疗上述的病理状况。本领域的技术人员可以按照常规的药学原理选择用于联合治疗的适当药剂。治疗剂的联合可以协同作用，以实现治疗或预防上述各种疾病。采用此方法，个体可能能够用更小剂量的各药剂达到治疗效果，因此减少潜在的不利副反应。
其它治疗剂的实例包括以下：内皮素受体拮抗剂(如安贝生坦(ambrisentan)、波生坦、西他生坦(sitaxsentan))、PDE-V抑制剂(如西地那非、他达拉非、伐地那非)、钙通道阻滞剂(如氨氯地平、非洛地平、维拉帕米、地尔硫薄荷醇)、前列环素、曲罗尼尔、伊洛前列素、贝前列素、一氧化氮、氧气、肝素、华法林、利尿剂、地高辛、环孢菌素(如环孢菌素A)、CTLA4-Ig、抗体例如ICAM-3、抗-IL-2受体(抗-Tac)、抗-CD45RB、抗-CD2、抗-CD3(OKT-3)、抗-CD4、抗-CD80、抗-CD86，阻断CD40和gp39相互作用的药剂例如CD40和/或gp39(即CDl54)特异性抗体、由CD40和gp39(CD401g和CD8gp39)构建的融合蛋白、抑制剂例如核转位抑制剂、NF-κB功能抑制剂例如脱氧精胍菌素(DSG)、胆固醇生物合成抑制剂例如HMG CoA还原酶抑制剂(洛伐他汀和辛伐他汀)、非甾体抗炎药(NSAID)例如布洛芬、阿司匹林、醋氨酚、来氟米特、脱氧精胍菌素、环加氧酶抑制剂例如塞来昔布、类固醇例如***龙或***、金化合物、β-激动剂例如沙丁胺醇、LABA’s例如沙美特罗、白三烯拮抗剂例如孟鲁司特、抗增殖剂例如甲氨蝶呤、FK506(他克莫司，Prograf)、吗替麦考酚酯、细胞毒类药物例如硫唑嘌呤、VP-16、依托泊苷、氟达拉滨、多柔比星、阿霉素、安吖啶、喜树碱、阿糖胞苷、吉西他滨、氟脱氧尿苷、美法仑和环磷酰胺、抗代谢药例如甲氨蝶呤、拓扑异构酶抑制剂例如喜树碱、DNA烷化剂例如顺铂、激酶抑制剂例如索拉非尼、微管毒剂例如紫杉醇、TNF-α抑制剂例如替尼达普、抗-TNF抗体或可溶性TNF受体、羟基脲和雷帕霉素(西罗莫司或Rapamune)、或它们的衍生物。
当其它治疗剂与本发明的化合物联合使用时，可以例如，按照Physician DeskReference(PDR)中所述量使用它们，或者按照另由本领域的普通技术人员决定的量使用。
治疗方法
式I的化合物可以用于治疗激酶相关性疾病，包括JAK激酶相关性疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病(包括器官移植)；过度增殖性疾病(包括癌症和骨髓增殖性疾病)；病毒性疾病；代谢性疾病；以及血管疾病。
通常，术语“治疗”意指影响个体、组织或细胞以达到期望的药理学和/或生理学效果，并且包括：(a)预防可能易患疾病但尚未诊断为已患所述疾病的个体罹患所述疾病；(b)抑制疾病，即阻止其进展；或(c)缓解或改善疾病的影响，即使疾病的影响消退。
术语“个体”意指患有需要用式I的化合物治疗的疾病的任何动物。
除了灵长类例如人类之外，利用本发明的化合物、组合物和方法可以治疗各种其它哺乳动物。例如，可以治疗哺乳动物，包括但不局限于牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其它牛族动物、绵羊类动物(ovine)、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或鼠科动物。但是，也可以在其它物种例如鸟类(如鸡)中实施本发明。
术语“给药”应理解为意指向需要治疗的个体提供本发明的化合物。
术语“激酶相关性疾病”是指直接或间接地由激酶活性异常，特别是JAK活性异常造成的或者加重的一种或多种病症，和/或通过抑制一种或多种的这些激酶而减轻的一种或多种病症。
在优选的实施方案中，所述激酶相关性疾病状态涉及一种或多种JAK激酶——JAKl、JAK2、JAK3或TYK2。在特别优选的实施方案中，所述疾病涉及JAK2激酶。这样的疾病包括但不局限于列于下表中的那些疾病。
在各种病况中JAK/STAT途径的活化
术语“免疫性疾病和炎性疾病”是指免疫性疾病、炎性疾病或自身免疫性疾病，包括但不局限于类风湿性关节炎、多关节炎、类风湿性脊柱炎、骨关节炎、痛风、哮喘、支气管炎、变应性鼻炎、慢性阻塞性肺病、囊性纤维化病、炎性肠病、肠易激综合征、粘液性结肠炎、溃疡性结肠炎、溃破性结肠炎(diabrotic colitis)、克罗恩病、自身免疫性甲状腺病、胃炎、食管炎、肝炎、胰腺炎、肾炎、银屑病L、湿疹、寻常痤疮、皮炎、荨麻疹、多发性硬化症、阿尔茨海默病、运动神经元病(Lou Gehrig病)、佩吉特疾病、败血症、结膜炎、鼻卡他(neranlcatarrh)、慢性关节风湿病、全身炎症反应综合征(SIRS)、多发性肌炎、皮肌炎(DM)、结节性多动脉炎(Polaritis nodoa)(PN)、混合型***病(MCTD)、干燥综合征、克鲁宗综合征、软骨发育不全、***性红斑狼疮、硬皮病、血管炎、致死性发育不全、胰岛素抗性、I型糖尿病以及糖尿病和代谢综合征导致的并发症。
术语“过度增殖性疾病”包括癌症和骨髓增殖性疾病状态例如细胞增殖性疾病状态，包括但不局限于：心脏：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺：支气管原癌(鳞状细胞癌、未分化的小细胞癌、未分化的大细胞癌、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨性过误瘤(chondromatous hanlartoma)、中皮瘤(inesothelioma)；胃肠道：食道(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰(导管腺癌、胰岛素瘤、高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、舒血管肠肽瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道：肾(腺癌、维尔姆斯肿瘤[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、***(腺癌、肉瘤)、睾丸(***瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、***癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝：肝细胞性肝癌(肝细胞癌)、胆管上皮癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞性腺瘤、血管瘤；骨：成骨性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞肿瘤、脊索癌、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤(chondromyxofibroma)、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系 统：颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤)、脑(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(***、肿瘤前宫颈发育不良(pre-tumor cervical dysplasia))、卵巢(卵巢癌[浆液囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类的癌]、颗粒-泡膜细胞瘤(granulosa-thecal cell tumors)、Sertoli-Leydig细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤)、***(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤[胚胎性横纹肌肉瘤])、输卵管(癌)；血液学：血液(髓样白血病[急性和慢性]、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤；皮肤：恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、发育异常痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、银屑病；肾 上腺：神经母细胞瘤；和骨髓增殖性疾病例如真性红细胞增多症(PV)、原发性骨髓纤维化、血小板增多症、自发性血小板增多(ET)、原因不明性髓样化生(AMM)(也被称为特发性骨髓纤维化症(IMF))、慢性髓性白血病(CML)、***性肥大细胞增多症(SM)、慢性嗜中性粒细胞白血病(CNL)、骨髓增生异常综合征(MDS)和***性肥大细胞病(SMCD)。
术语“血管疾病”是指包括但不局限于心血管疾病、高血压、肥大、高胆固醇血症、高脂血症、血栓病、卒中、雷诺现象、POEMS综合征、心绞痛、缺血、偏头痛、外周动脉病、心力衰竭、再狭窄、动脉粥样硬化、左心室肥大症、心肌梗塞、心脏缺血性疾病、肾脏缺血性疾病、肝脏缺血性疾病和脑缺血性疾病、和肺动脉高压的疾病。
对于JAK2选择性抑制剂，优选的疾病包括免疫性疾病和炎性疾病例如自身免疫性疾病如特应性皮炎、哮喘、类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病、克鲁宗综合征、软骨发育不全、***性红斑狼疮、硬皮病、混合型***病、血管炎、致死性发育不全和糖尿病；过度增殖性疾病例如癌症如***癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌例如肝细胞性肝癌、肺癌、头颈癌例如神经胶质瘤、皮肤癌例如转移性黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，和骨髓增殖性疾病例如真性红细胞增多症(PV)、骨髓纤维化、血小板增多症、自发性血小板增多(ET)、原因不明性髓样化生(AMM)(也被称为特发性骨髓纤维化(IMF))和慢性髓性白血病(CML)；和血管疾病例如高血压、肥大、卒中、雷诺现象、POEMS综合征、心绞痛、缺血、偏头痛、外周动脉病、心力衰竭、再狭窄、动脉粥样硬化和肺动脉高压。
剂量
术语“治疗有效量”是指式I和II的化合物的量，所述量会引起为研究者、兽医、医生或其它临床医生所探寻的组织、***、动物或人类的生物学或医学反应。
在需要抑制激酶的病症的治疗或预防中，适当的剂量水平通常为约0.01-500mg/kg患者体重/日，其可以单剂量或多剂量给药。优选地，所述剂量水平为约0.1-约250mg/kg/日；更优选为约0.5-约100mg/kg/日。适当的剂量水平可以是约0.01-250mg/kg/日、约0.05-100mg/kg/日、或者约0.1-50mg/kg/日。在此范围内，剂量可以为0.05-0.5、0.5-5或5-50mg/kg/日。对于口服给药，所述组合物优选以片剂的形式提供，所述片剂包含1.0-1000毫克的所述活性组分，特别地包含1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克的所述活性组分。为了治疗效果和/或针对症状调节给予待治疗患者的剂量，所述剂量可以例如选择在这些剂量范围中任一个的范围内的任何剂量。所述化合物优选地按照1-4次/日、优选一或两次/日的给药方案给药。
应理解，对于任何具体的患者，特定的剂量水平和给药频率可以改变，并且取决于各种因素，包括所用的特定化合物的活性、所述化合物的代谢稳定性和作用时间长短、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药的方式和时间、***速率、联合用药、具体病症的严重性和接受治疗的主体。
为了例证本发明的本质以更明确地理解本发明，提供了以下非限制性实施例。
实施例
化合物的合成
可以通过本领域技术人员熟知的方法，按照以下针对选定化合物的合成和实验步骤中所述，来制备本发明的化合物。
定义：
PyBOP 苯并***-1-基氧基三吡咯烷基鳞六氟磷酸盐
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DCM 二氯甲烷
NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮
n-PrOH 正丙醇
ACN 乙腈
EDC.HCl 1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
HOBT N-羟基苯并***
TEA 三乙胺
DIPEA 二异丙基乙胺
p-TsOH 对甲苯磺酸
HATU o-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐
实施例1-合成化合物3
充分地搅拌4-乙氧基羰基苯基硼酸(23.11g，119mmol)、2,4-二氯嘧啶(16.90g，113mmol)、甲苯(230mL)和碳酸钠水溶液(2M、56mL)的混合物，并且向此悬浮液充入氮气15分钟。加入四(三苯基膦)钯[0](2.61g，2.26mmol)。再充入氮气10min.，将此混合物加热至100℃，然后在75℃过夜。冷却此混合物，用乙酸乙酯(200mL)稀释，加入水(100mL)，并分离各层。用乙酸乙酯(100ml)萃取水层，然后合并此二有机萃取液。用盐水洗涤有机液，经硫酸钠过滤，浓缩，接着用甲醇(100mL)研制所得固体，然后过滤。用甲醇(2x30mL)洗涤此固体，然后风干。将此原料溶于乙腈(150mL)和二氯甲烷(200mL)，与MP.TMT Pd-清除树脂(Agronaut货号800471)(7.5g)共同搅拌2天。过滤此溶液，用二氯甲烷(2x100mL)洗涤固体，然后浓缩滤液，得到为灰白色固体的4-(2-氯嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯(17.73g，60％)-用二氯甲烷进一步洗涤，得到另外的1.38g和0.5g产物。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ8.89(1H，d，J＝5.0Hz)；8.32(2H，d，J＝8.7Hz)；8.22(1H，d，J＝5.5Hz)；8.12(2H，d，J＝8.7Hz)；4.35(2H，q，J＝7.1Hz)；1.34(3H，t，J＝7.1Hz)；LC-ESI-MS(方法B)：rt7.3min.；m/z263.0/265.0[M+H]+。
将4-(2-氯嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯(26.15g，99.7mmol)和4-吗啉代苯胺(23.10g，129.6mmol)的混合物悬浮于1，4-二氧六环(250mL)。加入一水合对甲苯磺酸(17.07g，89.73mmol)。加热回流此混合物40h，冷却至环境温度，浓缩，然后在乙酸乙酯和1∶1饱和碳酸氢钠/水(总计1L)之间分配此剩余物。用水(2x100mL)洗涤有机相，然后浓缩。用二氯甲烷(3x200mL)萃取水相。经过滤收集在此后处理过程中的沉淀物，然后静置。合并液体有机物，浓缩，用甲醇(200mL)研制，然后过滤，得到另外的黄色固体。合并固体，将其悬浮于甲醇(500mL)中，使其静置过夜，然后超声处理，过滤。固体经甲醇(2x50mL)洗涤，干燥后，得到4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯(35.39g，88％)。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.49(1H，s)；8.54(1H，d，J＝5.0Hz)；8.27(2H，d，J＝8.7Hz)；8.10(2H，d，J＝8.7Hz)，7.66(2H，d，J＝9.1Hz)；7.38(1H，d，J＝5.0Hz)；6.93(2H，d，J＝8.7Hz)；4.35(2H，q，J＝6.9Hz)，3.73(4H，m)；3.04(4H，m)；1.34(3H，t，J＝6.9Hz)；LC-ESI-MS(方法B)：rt7.5min.；m/z404.1[M+H]+。
用氢氧化锂(4.41g，183.9mmol)的水(90mL)溶液处理4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯(35.39g，87.6mmol)在3∶1甲醇/四氢呋喃(350mL)中的溶液。加热回流此混合物2h，冷却，浓缩，然后用盐酸(2M，92.5mL，185mmol)酸化。过滤深色沉淀，用水洗涤，然后在真空下干燥。用研钵和研杵将固体研磨成粉末，用甲醇(500mL)研制，然后再次过滤，得到为泥状固体的4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸。此材料经***洗涤，过夜风干，然后用研钵和研杵研磨成细粉。根据回收的质量(34.49g)，认为收率是定量的。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.47(1H，s)；8.53(1H，d，J＝5.2Hz)；8.24(2H，d，J＝8.5Hz)；8.08(2H，d，J＝8.8Hz)，7.66(2H，d，J＝9.1Hz)；7.37(1H，d，J＝5.2Hz)；6.93(2H，d，J＝9.1Hz)；3.73(4H，m)；3.04(4H，m)。LC-ESI-MS(方法C)：rt7.3min.；m/z377.1[M+H]+。
向4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸(理论上32.59g，86.6mmol)在DMF(400mL)中的悬浮液加入三乙胺(72.4mL，519.6mmol，6eq.)。此混合物经超声处理以确保溶解。加入氨基乙腈盐酸盐(16.02g，173.2mmol)，然后加入N-羟基苯并***(无水，14.04g，103.8mmol)和1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(19.92g，103.8mmol)。充分地过夜搅拌此悬浮液。在减压下蒸发溶剂，用5％碳酸氢钠(400mL)和水(300mL)稀释剩余物，得到黄色固体，将固体打碎，然后过滤。用100mL/份的水洗涤固体若干次，用热甲醇/二氯甲烷(500mL，1∶1)研制，浓缩至约300mL的体积)，冷却，然后过滤。用冷的甲醇(3x100mL)、***(200mL)和己烷(200mL)洗涤所得固体，然后干燥，得到化合物3(31.69g，88％)。M.p.238-243℃。微量分析：实测值：C，66.52；H，5.41；N，20.21.C23H26N6O10S2；理论值：C，66.65；H，5.35；N20.28％。13C NMR(75.5MHz，d6-DMSO)166.04，162.34，160.26，159.14，146.14，139.87，134.44，132.73，127.80，126.84，120.29，117.49，115.50，107.51，66.06，49.16，27.68。
实施例2-合成化合物47
向2,4-二氯-5-甲基嘧啶(244mg，1.5mmol)和2-甲氧基-4-(4，4,5,5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酸甲酯(210mg，1.0mmol)的甲苯(3mL)溶液，加入正丙醇(1mL)、碳酸氢钠水溶液(2M，1.5μL)和四(三苯基膦)钯[0](116mg，0.1mmol)。在110℃加热反应物40h，然后在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液之间分配。用乙酸乙酯另外萃取水层两次，用水、盐水洗涤合并的有机部分，然后干燥(硫酸钠)，过滤，浓缩。用30-60％乙酸乙酯/石油精作为洗脱剂，经硅胶色谱法得到为乳白色固体的4-(2-氯-5-甲基嘧啶-4-基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(165mg，56％)；LC-ESI-MS(方法B)：rt6.2min.；m/z293.3/295.3[M+H]+。
向4-(2-氯-5-甲基嘧啶-4-基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(165mg，0.56mmol)的1，4-二氧六环(5mL)溶液，加入4-吗啉代苯胺(96mg，0.54mmol)和一水合对甲苯磺酸(97mg，0.51mmol)。加热回流反应物40h，冷却至室温，然后在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液之间分配。用乙酸乙酯另外萃取水层两次，用5％的柠檬酸水溶液、水、盐水洗涤合并的有机部分两次，然后干燥(硫酸钠)，过滤，浓缩，得到粗产物。用甲醇研制，得到为黄色固体的4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(77mg，32％)；1HNMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.36(s，1H)，8.38(s，1H)，7.76(d，J＝8.1Hz，1H)，7.62(d，J＝9.0Hz，2H)，7.38(s，1H)，7.27(d，J＝8.1Hz，1H)，6.88(d，J＝9.0Hz，2H)，3.89(s，3H)，3.82(s，3H)，3.72(m，4H)，3.01(m，4H)，2.12(s，3H)；LC-ESI-MS(方法B)：rt6.7min.；m/z435.3[M+H]+。
向4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(70mg，0.16mmol)的1，4-二氧六环(5mL)溶液，加入氢氧化钠水溶液(5M，5mL)。加热回流反应物过夜，然后冷却至室温。通过过滤收集沉淀的黄色固体，然后用水洗涤，以定量收率得到化合物40的钠盐。通过将4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)-2-甲氧基苯甲酸的钠盐(化合物40)(0.16mmol)悬浮于乙酸乙酯中，并在5％柠檬酸水溶液间分配，使其酸化。进一步用乙酸乙酯萃取，接着蒸发溶剂，然后得到悬浮于二氯甲烷(3mL)中的游离酸。向此溶液加入三乙胺(111μL，0.8mmol)、1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(58mg，0.3mmol)、氨基乙腈盐酸盐(61mg，0.4mmol)和催化量的N,N-二甲基氨基吡啶。加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)以助溶，然后搅拌反应物64h。经TLC分析，反应不完全，因此加入O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(76mg，0.2mmol)，并另外搅拌反应物24h，然后在二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液之间分配。另外用二氯甲烷萃取水层两次，接着用水、盐水洗涤合并的有机液，然后干燥(硫酸钠)，过滤，浓缩，得到粗产物。使用0-3％甲醇/乙酸乙酯作为洗脱剂，经硅胶色谱法得到为绿色/黄色固体的化合物47(13.2mg，18％)。
实施例3-合成化合物90
在0℃，向4-羧基苯基硼酸(5.0g，30mmol)在DMF(5mL)和二氯甲烷(200mL)中的悬浮液，滴加草酰氯(5.9mL，66mmol)。当气体释放减缓时，移去冰浴，然后使反应物在30min内温热至室温。然后在40℃加热反应物3小时，至此时，所有固体已溶解。通过蒸馏除去二氯甲烷，将DMF溶液冷却至0℃。然后滴加氨基乙腈盐酸盐(3.05g，33mmol)的DMF(80mL)溶液和DIPEA(13mL，75mmol)。加入完成后，移去冰浴，然后在室温下搅拌此溶液16h。然后在真空下除去大部分DMF，并在乙酸乙酯和2M盐酸水溶液之间分配反应物。进一步用乙酸乙酯萃取水层两次，然后干燥(Na2SO4)合并的有机部分，过滤，然后减压浓缩，得到为蜡状浅黄色固体的4-(氰基甲基氨基甲酰基)苯基硼酸(5.34g，87％)。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)：9.18(br.t，J＝5.1Hz，1H)，7.8-7.9(m，4H)，4.31(d，J＝5.4Hz，2H)；LC-ESI-MS(方法B)：rt0.9min.；m/z203.3[M-H]-。
向2,4-二氯嘧啶(3.2g，0.22mmol)和4-(氰基甲基氨基甲酰基)苯基硼酸(3.0g，15mmol)的甲苯(146mL)溶液，加入正丙醇(44mL)、碳酸氢钠水溶液(2M，22mL)和四(三苯基膦)钯[0](850mg，0.7mmol)。在90℃加热反应物24h，然后在乙酸乙酯和水之间分配。进一步用乙酸乙酯萃取水层两次，然后用盐水洗涤合并的有机部分，干燥(Na2SO4)，过滤，然后浓缩。使用30-70％乙酸乙酯/石油精作为洗脱剂，经硅胶色谱法得到为浅黄色蜡状固体的4-(2-氯嘧啶-4-基)-N-(氰基甲基)苯甲酰胺(1.35g，33％)。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.40(t，J＝5.4Hz，1H)，8.88(d，J＝5.2Hz，1H)，8.32(d，J＝8.7Hz，2H)，8.23(d，J＝5.1Hz，1H)，8.05(d，J＝8.7Hz，2H)，4.36(d，J＝5.4Hz，2H)；LC-ESI-MS(方法B)：rt5.3min.；m/z273.2/275.2[M+H]+。
在真空下，用加热枪干燥Schlenck烧瓶2分钟，然后在室温下再充入氮气。加入三(二亚苄基丙酮)二钯(9mg，0.01mmol)、(2-联苯基)二叔丁基膦(5.7mg，0.02mmol)、磷酸钾(56mg，0.27mmol)、4-(2-氯嘧啶-4-基)-N-(氰基甲基)苯甲酰胺(52mg，0.19mmol)和4-[(1，1-二氧化硫代吗啉-4-基)甲基]苯胺(40mg，0.17mmol)，然后在连续的氮气流下，在烧瓶中一起混合。密封此烧瓶，在高真空下抽真空，然后充入氮气。重复此操作两次。经橡胶隔片加入1，2-二甲氧基乙烷(1.9mL)。密封此烧瓶，并开始充分搅拌。然后用液氮冷冻此混合物，在高真空下脱气，然后充入氮气(重复此操作两次)。然后将密封的烧瓶加热到100℃过夜。加入少量的三(二亚苄基丙酮)二钯和(2-联苯基)二叔丁基膦，冷冻此混合物，在高真空下脱气并再充入氮气，然后在100℃进一步加热16h。加入乙酸乙酯，然后通过烧结的漏斗过滤此混合物。然后浓缩滤液，并加入乙酸乙酯。然后用柠檬酸(2％)溶液和氯化钠饱和溶液洗涤所得混合物。干燥(硫酸钠)有机层，过滤，然后蒸发得到粗产物，使用石油精/乙酸乙酯(1/4)，通过柱色谱法纯化粗产物得到剩余物，用甲醇使研制此剩余物，得到化合物90(5.5mg，7％)。
实施例4-合成化合物73
向圆底烧瓶加入4-甲磺酰基氨基苯基硼酸(4.30g，20mmol)和2,4-二氯嘧啶(5.97g，40mmol，2eq.)、甲苯(75mL)、正丙醇(25mL)和碳酸钠水溶液(2M，18mL，1.8eq.)。将此反应混合物抽真空并充入氮气，操作三次，然后加入四(三苯基膦)钯(0)催化剂(1.02g，4.4mol％)。再次将此反应混合物抽真空并充入氮气，操作三次，然后在氮气氛下，在100℃加热66小时。冷却此反应混合物，然后在室温下搅拌若干小时，在此过程中，产物自反应混合物中析出。通过真空过滤收集微细的黄色固体(3.45g，61％收率)，用甲醇洗涤，然后在高真空下干燥。1HNMR和LC MS数据确认此化合物为预期的N-(4-(2-氯嘧啶-4-基)苯基)甲磺酰胺。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.26(1H，brs)；8.75(1H，d，J＝5.5Hz)；8.17(2H，d，J＝9.1Hz)；8.05(1H，d，J＝5.5Hz)；7.35(2H，d，J＝8.7Hz)；3.10(3H，s)。LC-ESI-MS(方法B)：rt5.5min.；m/z284.2/286.1[M+H]+。
将N-(4-(2-氯嘧啶-4-基)苯基)甲磺酰胺(750mg2.64mmol)和碳酸钾(730mg，2eq.)置于圆底烧瓶中并悬浮于丙酮(50mL)中。搅拌此混合物若干分钟，随后加入溴乙腈(368μL，2eq.)。在室温下，搅拌此反应混合物48h。真空浓缩此粗反应混合物，将剩余物溶于乙酸乙酯(200mL)，接着用水(2x100mL)、盐水(100mL)洗涤，然后干燥(硫酸钠)。真空浓缩有机相，得到为浅黄褐色固体的N-(4-(2-氯嘧啶-4-基)苯基)-N-(氰基甲基)甲磺酰胺(762mg，收率89％)。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ8.86(1H，d，J＝5.0Hz)；8.28(2H，d，J＝8.7Hz)；8.18(1H，d，J＝5.5Hz)；7.66(2H，d，J＝8.7Hz)；4.97(2H，s)；3.22(3H，s)。LC-ESI-MS(方法B)：rt5.9min.；m/z323.2/325.2[M+H]+。
将N-(4-(2-氯嘧啶-4-基)苯基)-N-(氰基甲基)甲磺酰胺(171mg，0.53mmol)、5-氨基-2-吗啉代苯甲酸(142mg，1.2eq.)和一水合对甲苯磺酸(98mg，0.98eq.)悬浮于1，4-二氧六环(8mL)中，然后在100℃加热过夜。使此反应混合物冷却至室温，真空浓缩。将剩余物溶于乙酸乙酯(80mL)，然后用水(20mL)和盐水(20mL)洗涤。随后干燥有机相并真空浓缩。重复地用甲醇(5mL，然后3mL)研制剩余物，得到为奶油色固体的5-(4-(4-(N-(氰基甲基)甲基磺酰胺基)苯基)嘧啶-2-基氨基)-2-吗啉代苯甲酸(101mg，37％)。1HNMR(300MHz，d6-DMSO)δ17.23(1H，s)CO2H；9.99(1H，s)；8.74(1H，d，J＝2.7Hz)；8.62(1H，d，J＝5.0Hz)；8.33(2H，d，J＝8.7Hz)；8.01(1H，dd，J＝2.8，J＝8.7Hz)；7.69(1H，d，J＝9.1Hz)；7.63(2H，d，J＝8.7Hz)；7.52(1H，d，J＝9.1Hz)；4.97(2H，s)；3.81(4H，m)；3.21(3H，s)；3.06(4H，m)。LC-ESI-MS(方法C)：rt5.4min.；m/z509.3[M+H]+。
将5-(4-(4-(N-(氰基甲基)甲基磺酰胺基)苯基)嘧啶-2-基氨基)-2-吗啉代苯甲酸(50mg，0.098mmol)和O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N,N,N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(41mg，1.1eq.)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)，然后超声处理5分钟。加入三乙胺(41mL，3eq.)和N,N-二甲基乙二胺(21mL，2eq.)，然后在室温下搅拌此混合物过夜。然后用乙酸乙酯(50mL)稀释此反应混合物，随后用碳酸氢盐溶液(20mL)、水(20mL)和盐水(20mL)洗涤。干燥(硫酸钠)有机相，然后真空浓缩，得到为黄色固体的化合物73(48mg，收率86％)。
实施例5-合成化合物65
向保持在-5℃的5-溴-2,4-二氯嘧啶(300mg，1.3mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液，加入冷的57％的氢碘酸水溶液(5mL)。在-5℃搅拌所得溶液2小时。分小批地加入固体碳酸钠直至此溶液为pH7，然后通过加入5％的焦亚硫酸钠水溶液，使此混合物脱色。加入水直至全部固体溶解，然后分出有机相。用二氯甲烷萃取水相两次，然后用无水硫酸钠干燥合并的有机层，过滤，浓缩，得到为白色固体的粗5-溴-2,4-二碘嘧啶(410mg)。未经进一步纯化，将此材料用于下一步。LC-ESI-MS(方法B)：rt6.8min.；m/z410.9/412.9[M+H]+。
向4-(氰基甲基氨基甲酰基)苯基硼酸(参见实施例3)(185mg，0.9mmol)和5-溴-2,4-二碘嘧啶(410mg,1.0mmol)在1，4-二氧六环(10mL)中的混合物，加入2M碳酸钾水溶液(100μL)。在氮气下，搅拌所得混合物5分钟，然后在氮气氛下加入四(三苯基膦)钯(0)(52mg，0.045mmol)。在80℃加热此混合物过夜。用水稀释冷却的反应混合物，随后用乙酸乙酯萃取两次。用水，然后用盐水洗涤合并的有机萃取液，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到为棕色固体的粗产物。用50％乙酸乙酯/石油精洗脱，通过快速色谱法纯化粗产物，得到4-(5-溴-2-碘嘧啶-4-基)-N-(氰基甲基)苯甲酰胺(200mg，经2个步骤后为35％)。LC-ESI-MS(方法B)：rt6.2min.；m/z443.0/445.0[M+H]+。
向含有4-(5-溴-2-碘嘧啶-4-基)-N-(氰基甲基)苯甲酰胺(45mg，0.1mmol)和4-吗啉代苯胺(27mg，0.15mmol)的1，4-二氧六环(3mL)溶液的圆底烧瓶中，加入二异丙基胺(26mg，0.2mmol)。该烧瓶装配有回流冷凝管，加热回流反应混合物过夜。冷却至室温后，用乙酸乙酯稀释此反应混合物，用水，然后用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，浓缩，得到为棕色固体的粗产物。用50％乙酸乙酯/石油精，然后用80％乙酸乙酯/石油精洗脱，通过快速色谱法纯化粗物质，得到为黄色固体的化合物65(12mg，24％)。
实施例6-由化合物3形成盐
将化合物3(10.0g)悬浮于甲醇(1L)中。将浓硫酸(10.52g，90％w/w)滴加入搅拌中的溶液。产生澄清的棕色溶液并且形成固体块。快速地过滤此溶液，然后继续搅拌3h(在数分钟内第二次出现沉淀)。此后，经过滤收集浅黄色沉淀，用甲醇(10mL)洗涤，然后在真空下干燥过夜，得到为浅黄色固体的4-(4-(4-(4-(氰基甲基氨基甲酰基)苯基)嘧啶-1-鎓-2-基氨基)苯基)吗啉-4-鎓硫酸氢盐(10.20g，69％)。m.p.205℃。微量分析：实测值：C，45.18；H，4.36；N，13.84；S，10.24.C23H26N6O10S2理论值：C，45.24；H，4.29；N13.76；S10.50％。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.85(br.s，1H)，9.34(t，J＝5.4Hz，1H)，8.59(d，J＝5.2Hz，1H)，8.27(d，J＝8.5Hz，2H)，8.03(d，J＝8.5Hz，2H)，7.83(d，J＝8.4Hz，2H)，7.50(d，J＝5.2Hz，1H)，7.34(br.s，2H)，4.36(d，J＝5.4Hz，2H)，3.89(br.s，4H)，3.37(b r.s，4H)；13C NMR(75.5MHz，d6-DMSO)166.07，163.36，159.20，158.48，140.19，139.34，136.45，134.89，128.00，127.22，121.13，119.89，117.59，109.05，64.02，54.04，27.82。LC-ESI-MS(方法D)：rt10.0min.；m/z415.1[M+H]+。
将化合物3(0.25g)悬浮于甲醇(25ml)中。将甲磺酸(0.255g)滴加入搅拌中的溶液，得到澄清的棕色溶液。搅拌此溶液3h，其后，使体积减至9ml。收集所得沉淀，然后真空下干燥8h，得到为浅黄色固体的4-(4-(4-(4-(氰基甲基氨基甲酰基)苯基)嘧啶-1-鎓-2-基氨基)苯基)吗啉-4-鎓甲磺酸盐(0.22g)。m.p.208℃。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ9.83(b r.s，1H)，9.35(t，J＝5.3Hz，1H)，8.59(d，J＝5.1Hz，1H)，8.28(d，J＝8.5Hz，2H)，8.04(d，J＝8.5Hz，2H)，7.83(d，J＝9.0Hz，2H)，7.50(d，J＝5.5Hz，1H)，7.31(d，J＝9.0Hz，2H)，4.36(d，J＝5.5Hz，2H)，3.88(m，4H)，3.35(b r.s，4H)，2.36(s，6H)；LC-ESI-MS(方法D)：rt10.2min.；m/z415.3[M+H]+。
将化合物3(0.50g)悬浮于甲醇(45m1)中。将新配制的盐酸-甲醇溶液(2.6ml，浓HCl40mg/ml)滴加入搅拌中的溶液，并产生澄清的棕色溶液。搅拌此溶液2h，然后收集所得的沉淀，用甲醇(5ml)洗涤，然后在真空下干燥8h，得到为浅黄色固体的4-(4-(4-(4-(氰基甲基氨基甲酰基)苯基)嘧啶-1-鎓-2-基氨基)苯基)吗啉-4-鎓盐酸盐(0.30g)。m.p.210℃。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)1H NMR(300MHz，DMSO)δ9.92(br.s，1H)，9.42(t，J＝5.3，1H)，8.62(d，J＝4.8，1H)，8.29(d，J＝8.1，2H)，8.06(d，J＝8.1，2H)，7.89(d，J＝9.0，2H)，7.53(br.s，3H)，4.36(d，J＝5.4，2H)，3.82(br.s，4H)，3.43(br.s，4H)
LC-ESI-MS(方法D)：rt10.3min.；m/z415.3[M+H]+。
实施例7-合成化合物79
50mL的双颈圆底烧瓶装配有磁搅拌器和滴液漏斗。加入NaBH4的四氢呋喃悬浮液(100mg，2.4mmol/10mL)，随后一次性地全部加入5-氨基-2-吗啉代苯甲酸(222mg，1.0mmol)。装配上回流冷凝管，在氮气氛下使反应混合物冷却至0℃。将碘的四氢呋喃溶液(250mg，1.0mmol/15mL)滴加入反应混合物。碘添加完成并且停止释放气体后，加热回流此反应混合物6小时，然后留在室温下搅拌过夜。缓慢加入甲醇直至混合物变澄清。在室温下搅拌所得溶液30分钟，然后减压下除去溶剂。将剩余物溶于20％KOH(30mL)，搅拌4小时，然后用二氯甲烷(3x30mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机萃取液，用无水Na2SO4干燥，然后浓缩，得到为灰白色固体的5-氨基-2-吗啉代苄醇(150mg，收率72％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)7.05(d，J＝8.7Hz，1H)，6.59(dd，J＝8.4，2.7Hz，1H)，6.49(d，J＝2.7Hz，1H)，5.51(br s，1H)，4.71(s，2H)，3.84(t，J＝5.1Hz，4H)，3.60(br s，2H)，2.91(t，J＝5.1Hz，4H)。LC-ESI-MS(方法B)：rt2.31min.；m/z209.2[M+H]+。
向NaH在冷四氢呋喃中的悬浮液(80mg/20mL)，加入5-氨基-2-吗啉代苄醇(400mg，2mmol)。搅拌此混合物15分钟，然后加入烯丙基氯(150mg，2mmo1)和碘化四丁基铵(37mg，5mol％)。在室温下，搅拌所得混合物2小时，然后在60℃搅拌过夜。冷却至室温后，加入水(200μL)，搅拌此混合物10分钟，然后用乙酸乙酯稀释。依次用10％氯化铵水溶液和盐水洗涤有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，得到黄色固体。用50％乙酸乙酯/石油精纯化粗产物，得到为浅橙黄色油的3-((烯丙氧基)甲基)-4-吗啉代苯胺(250mg，收率50％)。1H NMR(300MHz，CDCl3).6.95(d，J＝8.3Hz，1H)，6.82(d，J＝2.7Hz，1H)，6.61(dd，J＝8.2，2.7Hz，1H)，6.10-5.90(m，1H)，5.34-5.28(m，1H)，5.23(dd，J＝10.5，1.9Hz，1H)，4.57(s，2H)，4.07-4.05(m，2H)，3.80(t，J＝4.8Hz，4H)，3.55(br s，2H)，2.83(t，J＝4.6Hz，4H)。LC-ESI-MS(方法B)rt5.91min.；m/z249.3[M+H]+。
使用类似于合成化合物3和化合物47所述的那些方法，在对甲苯磺酸存在下，通过与4-(2-氯嘧啶-4-基)-N-(氰基甲基)苯甲酰胺反应，将3-((烯丙氧基)甲基)-4-吗啉代苯胺转化为化合物79。
化合物分析
在Brucker AV-300AVANCE NMR波谱仪上获得1H NMR和13C NMR数据。
LC-EI-MS和EI-MS
通用参数：
在与Waters2996Photodiode Array Detector和Integrity TMD ElectronImpact Mass Spectrometer连接的Waters2795Alliance HPLC上，在Waters Millenium32软件4.0版的控制和如下所述的设置下操作，获得LC-EI-MS和EI-MS数据。
质谱仪参数：
氦气流量约0.36L/min.；采集模式设置为扫描；采样速率为1波谱/秒；源温度200℃；雾化器温度80℃；扩散区温度75℃；按照需要，质量范围为m/z100-550，m/z100-650或m/z100-700。
HPLC参数
为各方法所述的LC-MS参数如下所述。注射入EI-MS样品，并在不存在柱的条件下以溶剂流速0.25mL/min进行分析。
方法A1(LC-EI-MS)
溶剂梯度：
流速：0.25mL/min.
柱：以下之一
·Alltima HP C182.1x150mm，5微米
·XTerra MS C18，3.0x100mm，3.5微米
·XBridge C18，3.0x100mm，3.5微米
方法A2(LC-EI-MS)
溶剂梯度：
流速：0.25mL/min
柱：以下之一
·Alltima HP C182.1x150mm，5微米
·XTerra MS C18，3.0x100mm，3.5微米
·XBridge C18，3.0x100mm，3.5微米
LC-ESI-MS
通用参数：
在与Waters2996Photodiode Array Detector和Waters ZQ Mass Spectrometer连接的Waters2695Xe HPLC上获得LC-ESI-MS数据，用Masslynx软件4.1版和如下所述的设置，在电喷雾离子化条件下操作。
质谱仪参数：
质量范围： m/z100-650
扫描时间： 0.5
扫描间延迟： 0.1
去溶剂化气体： 500L/h N2
锥孔气体： 100L/h N2
去溶剂化温度： 400℃
源温度： 120℃
锥孔电压： 对于ESI正离子模式为+30V，或
对于ESI负离子模式为-45V
HPLC参数：
是下述的下列条件组之一。
方法B
溶剂梯度：
时间％MilliQ水％ACN曲线
流速：0.25mL/min.
柱：XTerra MS C18，2.1x50mm，3.5微米
方法C
溶剂梯度：
流速：0.25mL/min.
柱：XTerra MS C18，2.1x50mm，3.5微米
方法D
溶剂梯度：
时间％MilliQ水％ACN曲线
流速：0.25mL/min。
柱：XTerra MS C18，3.0x100mm，3.5微米
实施例8-酶筛选
稀释化合物
为了筛选，使用之前，在37℃温热化合物(在100％DMSO中)至少20分钟。最初，在测定用缓冲液中配制20μM的储备液，其中DMSO的终浓度为0.3％。然后在384孔Optiplates(Packard)中稀释储备液，其中化合物的终浓度为5μM。
制备JAK酪氨酸激酶结构域
使用以下步骤制备JAK激酶结构域：
JAK2
使用以下引物，利用聚合酶链反应，从U937mRNA扩增人类JAK2的激酶结构域：
SALI-jk25'-ACG CGT CGA CGG TGC CTT TGA AGA CCG GGA T-3’[SEQ.ID.NO.7]
jk2-NOTI5’-ATA GTT TAG CGG CCG CTC AGA ATG AAG GTC ATT T-3’[SEQ.ID.NO.8]
将JAK2PCR产物克隆至pDest20目标载体(Gibco)。然后将JAK2质粒转化至感受态DH10Bac细胞(Gibco)，随后经Sf9昆虫细胞转染制备重组的杆状病毒。
JAK3
使用以下引物，利用聚合酶链反应，从U937mRNA扩增人类JAK3的激酶结构域：
XHOI-J35’-CCG CTC GAG TAT GCC TGC CAA GAC CCC ACG-3’[SEQ.ID.NO.9]
J3-KPNI5’-CGG GGT ACC CTA TGA AAA GGA CAG GGA GTG-3’[SEQ.ID.NO.10]
将JAK3PCR产物克隆至pDest20目标表达载体(Gibco)。然后将JAK3质粒转化至感受态DH10Bac细胞(Gibco)，随后经Sf9昆虫细胞转染制备重组的杆状病毒。
大量制备激酶结构域
将从各JAK家族成员制备的杆状病毒感染至1升的Sf9(草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda))细胞(Invitrogen)，所述细胞在SF900II无血清培养基(Invitrogen)中培养至细胞密度为约2x106细胞/ml。以细胞培养物比病毒原种20∶1的比例，用病毒感染细胞。收获细胞，并在感染后溶解细胞48小时。在GSH琼脂糖柱(Scientifix)上，通过亲和色谱法纯化GST-标记的JAK激酶结构域。
测定方案
利用Alphascreen Protein Tyrosine KinaseP100检测试剂盒，在384孔Optiplates(Packard)中进行激酶测定。在磷酸酪氨酸测定用缓冲液(10mM HEPES、pH7.5、100mM MgCl2、25mM NaCl、200mM正钒酸钠和0.1％Tween20)存在下，将化合物和亲和纯化的PTK结构域预温育20分钟。然后，在80或625μM ATP的存在下，使化合物与底物温育60或90分钟。使用的底物是具有序列生长素-EGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2[SEQ.ID.NO.13]的底物-1(终浓度111μM)，或是具有序列生长素-EQEDEPEGDYFEWLEPE的底物-2(终浓度133μM)。在柔和的光照下，向各孔加入Alphascreen磷酸酪氨酸受体珠，随后加入链霉亲合素供体珠，二者以终止液计浓度均为1/100，温育2-3小时。在Packard Fusion Alpha仪上读Alphascreen板。
在下表2中给出选定化合物的酶测定结果和结构数据，其中+++是<100nM，++是<500nM，以及+是<1μM。
实施例9-细胞筛选
稀释化合物
为了筛选，在96孔板中稀释化合物至浓度20μM。在进行测定前，在37C温热板30分钟。
建立TEL：JAK2细胞系
利用寡核苷酸5TEL(5′-GGA GGA TCC TGA TCT CTC TCG CTG TGA GAC-3′)[SEQID NO14]和3TEL(5′-AGGC GTC GAC TTC TTC TTC ATG GTT CTG-3′)[SEQ ID NO15]和U937mRNA作为模板，通过PCR扩增包含TEL的核苷酸1-487的编码区。将BamHI限制位点加入5TEL引物，将Sal I限制位点加入3TEL引物。利用Taq DNA聚合酶(Gibco/BRL)和作为模板的U937mRNA，通过PCR制备包含JAK2的激酶结构域(核苷酸2994-3914；JAK2F5′-ACGC GTC GACGGT GCC TTT GAA GAC CGG GAT-3′[SEQ ID NO16]；JAK2R5′-ATA GTT TAG CGG CCG CTCAGA ATG AAG GTC ATT T-3′)[SEQ ID NO17]和JAK3的激酶结构域(核苷酸2520-3469；JAK3F5′-GAA GTC GAC TAT GCC TGC CAA GAC CCC ACG ATC TT-3′)[SEQ ID NO18]的区域。将Sal I限制位点加入JAK2和JAK3的正向引物，将Not I位点加入JAK2反向引物，并且将Xba I位点加入JAK3的反向引物。
通过用BamH I/Sal I限制性内切酶消化TELPCR产物，用Sal I/Not I限制性内切酶消化JAK2PCR产物，产生TEL/Jak2融合体，然后将连接产物连接和亚克隆至哺乳动物的表达载体pTRE2(Clontech)(其是通过用BamH I-Not I限制性内切酶消化而制得的)，而得到TEL/Jak2融合质粒pTELJAK2。
通过连接JAK3Sal I/Not I切断的激酶结构域PCR产物和BamH I/Sal I限制酶切消化的TEL产物，来制备TEL/Jak3融合体，随后将连接产物连接至BamH I/Not I消化的pTRE2，而得到TEL/Jak3融合质粒pTELJAK3。
用pTELJAK2或pTELJAK3转染带有pTET-off质粒的生长因子依赖性骨髓单核细胞系BaF3(Clontech)，然后选择转染的细胞，进行非生长因子依赖性的细胞培养生长。在含有10％FCS、10％WEHI3B条件培养基的DMEM中，培养BaF3野生型细胞。在DMEM10％Tet-SystemApproved FBS(无WEHI3B的条件培养基)中，培养BaF3TELJAK细胞(BafT_J2或BafT_J2)。
细胞测定如下进行：
通过从培养液中收获细胞制备细胞悬浮液。(在此测试中使用的细胞处于具有高生存力的对数生长后期)。如上所述，在适当的生长培养基中，将细胞稀释至1.1x终浓度(50000细胞/mL至200000细胞/mL，取决于细胞系)。
将待测化合物加入(10μL，10X终浓度)至平底的96孔板。然后加入细胞悬浮液(90μL/孔)，在37℃，5％CO2下，温育板48-72hr。加入Alamar Blue10μL/孔，然后将板放回培养箱，再温育4-6小时。然后在544nm读板。
结果
在表2中给出结果，其中+++是<1μM，++是<5μM，以及+是<20μM。
表2(NT＝未测试)
实施例10-荧光激活细胞分选(FACS)
多参数细胞内流式细胞检测分析STAT5磷酸化
在含有10％FCS并添加1mM丙酮酸钠的RPMI1640中，培养人类红白血病细胞系—HEL92.1.7(ATCC，TIB-180)。为了测定磷酸化-STAT5，在RPMI1640+1％FCS中，在37℃培养HEL细胞18小时，然后在37℃将每测定点2X105细胞暴露于DMSO/测试化合物2小时。以1300rpm离心细胞3分钟，然后在37℃在低聚甲醛(2％终浓度)中固定15分钟。离心后，在4℃，在90％甲醇中，透化处理细胞30分钟。在PBS-2％FCS中清洗三次后，利用BD PharMingen藻红蛋白结合的小鼠免疫球蛋白同型对照(目录号551436)和抗STAT5的藻红蛋白结合的小鼠IgG1抗体(Y694)(目录号612567)，如下进行染色。
室温下，在黑暗中，染色1小时，随后在PBS-2％FCS中清洗三次。然后将细胞再悬浮于800uL PBS-FCS中，用于FACS分析。利用具有3色和侧向散射性能的Beckman Cell LabQuanta SC System，进行流式细胞术。利用CXP分析软件(2.2版)进行数据分析。利用荧光强度中值(MFI)测定用特定抑制剂化合物处理细胞时的倍数变化，计算为磷酸化特异性抗体荧光通道(FL2)MFI受刺激/MFI未受刺激的比值。
在图2中所示的结果明确地表明了用化合物3处理对STAT5磷酸化的剂量依赖性效力。
实施例11-蛋白质印迹法
实验例1
方法
常规地将鼠科前B细胞系BaF3保存在含有10％FCS的RPMI1640培养基中。在实验当天，在PBS中清洗细胞两次，然后再悬浮于含有0.1％FCS的RPMI1640培养基中。在除去血清2小时后，用预期浓度的化合物3、对照化合物、或仅媒介物(DMSO)再处理细胞2小时。然后以终浓度5ng/ml加入小鼠IL-3，保持15分钟。随后将细胞置于冰上，并且在冰冷的PBS中清洗两次。在液氮中快速冷冻清洗的细胞团，并在-80℃贮存。
在冰上，在RIPA缓冲液中溶解细胞团，然后通过离心(20000x g，4℃，5min)使溶胞液澄清。通过Bradford法测定溶胞液中的蛋白质浓度，然后通过SDS-PAGE分离等量的蛋白(60μg/泳道)。随后将蛋白转移至PVDF，然后利用特异性识别在酪氨酸694处磷酸化的STAT5的抗体，进行蛋白质印迹。随后剥去膜，并利用识别全部STAT5蛋白的抗体重新探测。
图3中所示的结果明确地表明了用化合物3处理对STAT5磷酸化的剂量依赖性效力。
实验例2
方法
常规地将人类红白血病细胞系HEL92.1.7保存在含有10％FCS的RPMI1640培养基中。在实验前一天，在PBS中清洗细胞两次，再悬浮于含有0.1％FCS的RPMI1640培养基中，然后培养过夜。
第二天，用预期浓度的化合物3、对照化合物，或仅媒介物(DMSO)处理细胞2小时。随后将细胞置于冰上，并且在冰冷的PBS中清洗两次。在液氮中快速冷冻清洗的细胞团，并在-80℃贮存。
在冰上，在RIPA缓冲液中溶解细胞团，然后通过离心(20000x g，4℃，5min)使溶胞液澄清。通过Bradford法测定溶胞液中的蛋白质浓度，然后通过SDS-PAGE分离等量的蛋白(60μg/泳道)。随后将蛋白转移至PVDF，然后利用特异性识别在酪氨酸694处磷酸化的STAT5的抗体进行蛋白质印迹。随后剥去膜，并利用识别全部STAT5蛋白的抗体重新探测。
图4中所示的结果表明了用化合物3处理后STAT5磷酸化降低。
实施例12-化合物3对JAK2依赖性生理学和肿瘤细胞生长的功效
化合物3对小鼠血浆中生长激素刺激的***-1的浓度的影响。
测定在时间0点皮下给药生长激素(+GH，30μg/小鼠)或盐水(对照)之前8h和30min时，通过灌胃给药化合物3(50mg/kg)或仅媒介物(对照，+GH)后，雌性C3/H小鼠(n＝6/组)的循环IGF-1浓度(平均值±s.e.m.)。在给药GH6h后，采集血样，然后利用小鼠IGF-1的ELISA(R&D Systems)测量血浆IGF-1浓度。不同的上标表示通过单因素方差分析和Bonferroni事后检验检测的组间显著性差异(p<0.05)。
图5中所示的结果表明：经化合物3处理后，血浆IGF-1浓度显著降低。
口服给药化合物3对皮下肿瘤模型裸鼠的Ba/F3TelJAK2细胞功效。
用小鼠Ba/F3TelJAK2细胞(2.5x106/小鼠)对Balb/Cnu/nu小鼠进行皮下接种，并且灌胃给药化合物3(20mg/kg，10mg/kg，或5mg/kg)或仅媒介物(5％N-甲基吡咯烷酮，0.1M)每天两次、或者(5mg/kg i.V.3x/周，n＝15只小鼠/组)。肿瘤细胞接种后11天，当肿瘤可触及时(平均肿瘤体积6mm3)，开始给药。每周测量肿瘤尺寸两次。至给药14天，化合物3以20mg/kg每天给药两次的平均百分比T/C值为39％，以10mg/kg每天给药两次的为25％，以5mg/kg/天的为82％。给药14天后，通过t检验(曼-怀二氏秩和检验)对比肿瘤体积，发现，与媒介物对照治疗组和5mg/kg化合物3治疗组比较，用化合物3以20mg/kg每天给药两次和以10mg/kg每天给药两次以及和Taxol治疗的组的肿瘤体积更小(p<0.05)，而它们相互之间没有区别。进行更严格的统计学检验(Kruskal Wallis单因素方差分析)，然后进行与对照组的事后Dunn多重比较，也表明了媒介物对照治疗组和任一化合物3治疗组(10或20mg/kg每天给药两次)或Taxol处理组之间具有显著性差异(p<0.05)。结果显示于图6中。
结果表明：化合物3在体外抑制JAK2酶，还抑制Baf3TelJak2细胞的体外生长(该细胞的生长和存活取决于组成性激活的Jak2)。在体内生长为肿瘤的Baf3TelJAK2细胞，也以剂量依赖性方式被化合物3抑制。另外，结果证明，化合物3抑制生长激素(并因此JAK2依赖性地)促进的体内小鼠肝脏的IGF-1合成和分泌。
实施例13-其它的化合物评价
也可以在JAK2V617F阳性骨髓增殖性疾病(MPD)的鼠科模型中测试化合物。
建立JAK2 V617F 阳性MPD
可以用JAK2-V617F-GFP反转录病毒感染来自5-氟尿嘧啶处理的Balb/c雄性小鼠的骨髓，并将其眶后注射入被致死性辐射的雌性接受者。从第21天起，可以通过每日检查和每周两次的血细胞计数+GFP阳性细胞FACS，来监测小鼠。会预测到：在第28天左右，血细胞比容可能会增加，并且在第40天左右白细胞计数可能增加。
用化合物治疗
早期干预组：在第21天，可以用化合物或载体，经灌胃给药(12只小鼠/组)开始治疗。可以通过每日检查和每周两次地血细胞计数+GFP阳性细胞FACS，来监测小鼠。可以在第60天最后一次给药8-12h后处死动物。可以更早地处死濒死的小鼠或者白细胞计数超过200000/nl或重量减轻>20％的小鼠。
后期干预组：在第29、36、43、50和57天，可以处死3只小鼠的组，并且可以分析骨髓和脾的网状纤维化。一旦证明3/3小鼠的纤维化，就可以通过灌胃给药化合物或载体开始治疗。可以通过每日检查和每周两次地血细胞计数+GFP阳性细胞FACS，来监测小鼠。可以在治疗30天后，最后一次给药8-12h后处死动物。可以更早地处死濒死的小鼠或者白细胞计数超过200000/nl或重量减轻>20％的小鼠。动物可以接受尸检。
分析组织和存活
可以测定肝和脾的重量。可以通过HE染色分析来自骨髓、肝和脾的组织切片。也可以银染色骨髓和脾，来评价网状纤维化。可以通过GFP FACS、谱系标记、JAK2和STAT5磷酸化来分析脾和骨髓细胞。可以通过心脏穿刺采集血液，分离血浆，冷冻，用来测量药物浓度。可以用Kaplan-Meyer法比较组间存活。
在人类造血细胞的集落形成测定中评价JAK2抑制剂的活性
可以通过密度梯度离心(Ficoll)，分离来自具有和不具有JAK2V617F突变的MPD(显著地骨髓纤维化)患者(对于各情形均为N＝10)和5个正常对照(商业提供者)的外周血单核细胞。可以使用商业试剂盒筛选CD34+细胞，以富集祖细胞。可平行三份地将CD34+细胞接种在添加胎牛血清和细胞因子(+/-EPO)的甲基纤维素中。温育板2周后，可以在倒置显微镜下评价红系细胞和髓系细胞集落形成。
癌症
可以在有关的体内动物功效模型中评价化合物对肿瘤发生、进展和转移的影响。模型可以是免疫缺陷性小鼠的人类肿瘤异种移植物模型，所述移植物来自人类肿瘤细胞系，或者优选来自原发性或转移性人类肿瘤。其它模型可以是在常位生长的人类肿瘤异种移植物、播散性疾病模型和转基因的或标记的肿瘤模型。模型还可以包括原发性肿瘤的外科手术切除和转移性疾病的评价。
可以选择模型以确保所述分子药物靶点被表达。显示JAK/STAT途径失调的肿瘤的实例包括***癌、乳腺癌、结肠癌、包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、卵巢瘤、黑色素瘤、肺癌、神经胶质瘤、肾细胞瘤。
在这些模型中，根据肿瘤类型(实体瘤、白血病或转移性肿瘤)，可以通过各种结果来测量功效，并且，可以包括通过各种方法包括标记细胞或药剂、存活、血管发生、组织病理学，来测量肿瘤发生、肿瘤生长速率、肿瘤负荷、肿瘤生长延迟、肿瘤细胞杀灭、转移的发生率、肿瘤成像和侵袭性/转移。
所述体内动物功效模型还可以用于测定所述化合物与其它药物联用时效力的相加作用或协同作用。
哮喘仅限于人类，但是通常用动物模型研究这种人类疾病的特定方面。已表明，支气管活组织检查和回收自哮喘患者的支气管肺泡灌洗(BAL)液包含数量增加的活化的T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞。许多哮喘患者被致敏，并且具有对抗一种或多种吸入性变应原的特异性免疫球蛋白E(IgE)抗体。特应性被认为是哮喘的主要原因。在特应性个体中，吸入变应原优先地诱导辅助性T2细胞(Th2)应答。在大部分的现行模型中，通过腹膜内(ip)注射卵清蛋白(OVA)，通常与偏Th2的佐剂(Th2skewed adjuvant)例如明矾一起注射，来致敏小鼠。在哮喘的经典小鼠模型中，在第0天，通过ip注射吸附于1mg明矾上的10μg的OVA，有效地致敏C57/BL6小鼠。从第14-21天，使小鼠每天暴露于雾化的OVA中30分钟。在第22天，气道炎症明显。回收自这些动物的BAL液显示：由单核细胞和嗜酸性粒细胞的混合型细胞侵润构成的细支气管周围空间增大。在致敏动物的血清中，可以证明有OVA特异性IgE抗体。单核细胞群主要由分泌细胞因子IL-4和IL-5的Th2表型细胞构成。IL-4促使B细胞向IgE合成的同种异型转换，IL-5影响嗜酸性粒细胞的产生、成熟和活化。
PAH
可以按照Gust，R和Schuster，D.P.Experimental Lung Research，27∶1-12，2001中所述，在狗肺动脉高压模型中测试式I的化合物。也可以在野百合碱诱导的兔肺动脉高压模型中测试它们。还可以在患有肺动脉高压的人类中测试式I的化合物。可以通过测量式I的化合物对心肺血液动力学的急性效力，在患有肺动脉高压的人类中测试其效力。可以测定化合物对右心室压、肺动脉压、肺血管阻力和心输出量的影响。在患有PAH的人类中，可以测定化合物对6分钟步行时间和最大耗氧量的影响。在患有PAH的人类中，可以测定化合物对生活质量(如通过问卷调查测量)、入院治疗和存活的影响。在人类中，PAH可以由基因异常引起(即原发性或家族性PAH)，或由继发性原因例如硬皮病、未矫正的先天性心脏病、混合型胶原血管疾病、丙型肝炎或其它肝病、HIV感染，或遗传性出血性毛细管扩张引起。还可以测试化合物对人类内皮细胞、成纤维细胞和/或平滑肌细胞系的影响：例如，在人类肺动脉平滑肌细胞系中测定使STAT3磷酸化的IC50。还可以检测来自其它物种即大鼠的细胞系。可以检测化合物对来自人类血管或来自其它物种即大鼠的血管的预收缩的(precontracted)血管环的影响。例如，可以研究用去氧肾上腺素、或内皮缩血管肽、或5-羟色胺、或加压素、血管紧张素II、或KCL预收缩的大鼠肺动脉环，以测定血管舒张对化合物的剂量反应。可以检测其它血管收缩药。
可以检测化合物对低氧诱导的肺血管收缩的影响。低氧诱导的肺动脉高压模型可能包括研究大鼠，例如暴露于低氧(即5％的氧气)的Fawn-Hooded大鼠。低氧诱导的肺动脉高压的另一模型可能包括在高海拔室内饲养的胎小牛。
可以在肺动脉高压的转基因模型中检测化合物的效力：即用IL6处理的BMPR2基因敲除小鼠、小窝蛋白1基因敲除小鼠、或血管活性肠肽基因敲除小鼠。
可以测量化合物对在PAH的人类和动物模型中都发生的组织病理学变化的影响。例如，化合物可以降低患病肺的肺小动脉内的丛状损伤的程度。所述丛状损伤由增殖并且不同程度地阻塞肺小动脉腔的内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞组成。
实施例14-在来自JAK2V617F阳性患者的细胞中离体分析化合物3
为了评价JAK2的小分子抑制剂的活性，已研发了测定方法，通过测量下游蛋白STAT5的磷酸化状态来定量JAK-STAT途径的活性。配体结合后，造血细胞因子受体发生构像变化，激活结合的JAK2蛋白。然后激活的JAK2使受体的细胞内部分磷酸化，形成募集细胞内信号转导蛋白的结合位点。STAT5是被募集至激活的细胞因子受体复合物的一种蛋白，它在该复合物中被磷酸化，然后转移至细胞核以调节介导细胞生长和分化的基因组的表达。
可以使用细胞内流式细胞术，通过门控谱系特异性造血细胞表面标记，来测量特异性细胞群中酪氨酸磷酸化的STAT5(pYSTAT5)。这对于JAK2V617F阳性骨髓增殖性疾病特别重要，因为包含突变的克隆仅形成骨髓中所有造血细胞的可变部分。在此研究中，红系细胞已被选择用于检测，因为此细胞系在PV中过度增殖。
方法
骨髓采集自JAK2V617F阳性骨髓增殖性疾病患者的回肠脊。在活检操作当天，对新鲜的骨髓样品进行流式细胞术测定。通过密度梯度离心采集骨髓单核细胞，然后在37℃，在无指示剂的RPMI中，使0.75-1.0x106细胞与各种浓度的化合物3一起温育1小时。用红细胞生成素最大程度地刺激细胞10分钟，然后通过将4％甲醛直接加入培养基中固定细胞。然后用冷甲醇透化细胞，随后加入最佳浓度的荧光标记的抗体。选择红系细胞，基于细胞表面蛋白表达(CD45lo，CD71hi细胞群)测量pYSTAT5。
结果
在红系细胞群中，以3μM至0.0041μM的各种浓度测试化合物3。用3μM至0.037μM浓度范围的抑制剂测定第一个骨髓标本。用1μM至0.0041μM浓度范围测定另两个患者标本。
未接受抑制剂的被刺激的骨髓样品(图7A-阴性对照)显示了可变量的基线pYSTAT5磷酸化，为全部门控的红系细胞群的6-32％。在检测的所有标本中，红细胞生成素(EPO)刺激使红系细胞内pYSTAT5的活性增强。这种由于刺激引起的pYSTAT5增加，在具有最高CD71表达的细胞亚群中表现最明显(图7B)，与红系细胞群中更多的未成熟细胞的活化一致。
所有患者的样品均表明：随着抑制剂剂量增加，STAT5的磷酸化呈剂量依赖性地减少。以两种不同的格式表示流式细胞术实验的结果(图7C)。在点图的右上象限中，pYSTAT5阳性细胞群用细胞百分比量化(图7A和B)。在这些图中，pYSTAT5阳性事件的阈值是基于同型对照抗体染色，并且在实验之间是一致的。用EPO刺激时，全部红系细胞群中仅一个亚群变为阳性，而这在阳性对照样品中是最大的。随着抑制剂剂量增加，pYSTAT5阳性事件的数量减少，这在图7C的左幅中，以pYSTAT5阳性事件对比阳性对照中的pYSTAT5阳性事件的百分比表示。这是在各个体患者的标本内的相对测量值。
在图7C的右幅中，显示了表达的第二种格式。此测量表示在pYSTAT5通道中的平均荧光强度，并且包括受EPO刺激和未受EPO刺激的两种红系细胞。这是荧光的绝对测量值，并且在测试的三个个体的这些值之间存在着差异性。随着抑制剂的浓度降低，全部红系细胞群的平均荧光向阳性对照值移动。
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在以下权利要求和以上本发明的说明中，除了上下文由于语言表达或必要的含义而另有要求之外，英文单词“comprise”或者各种变形例如“comprises”或“comprising”均以表示包含在内的含义加以使用，即具体说明本发明的各种实施方案中存在所述特征，但不排除其它特征的存在或增加。

Claims (8)

1.化合物或其药学可接受的盐，所述化合物选自
4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯；
N-(2-羟基乙基)-4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺；
4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)-N-(吡啶-4-基甲基)苯甲酰胺；
4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺；
4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)-N-((四氢呋喃-2-基)甲基)苯甲酰胺；
4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)-N-(1H-吡唑-3-基)苯甲酰胺；
2-甲氧基-4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯酚；
1-(4-(4-(4-氨基-3-硝基苯基)嘧啶-2-基氨基)苯基)吡咯烷-3-醇；
4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺；
4-(2-(4-碘苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯；
4-(5-甲基-2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯磺酰胺；
N-(4-(2-(3-羟基苯基氨基)嘧啶-4-基)-2-甲氧基苯基)-N-(甲磺酰基)甲磺酰胺；
4-(2-(6-吗啉代吡啶-3-基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯；
4-(2-(4-(1H-咪唑-1-基)苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯；
2-甲氧基-4-(5-甲基-2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸；
4-(4-氨基-3,5-二氯苯基)-N-(4-吗啉代苯基)嘧啶-2-胺.柠檬酸盐；
N-甲基-5-(4-(4-(甲基磺酰胺基)苯基)嘧啶-2-基氨基)-2-吗啉代苯甲酰胺；
2-羟基-4-(2-(3-羟基苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸丙酯；和
4-(4-氨基-3-硝基苯基)-N-(6-吗啉代吡啶-3-基)嘧啶-2-胺。
2.药物组合物，其包含权利要求1的化合物和药学可接受的载体。
3.植入物，其包含权利要求1的化合物。
4.权利要求1的化合物或者权利要求2的药物组合物在制备用于治疗激酶相关性疾病的药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述激酶相关性疾病是免疫性疾病或炎性疾病；过度增殖性疾病；病毒性疾病；代谢性疾病；或血管疾病。
6.权利要求5的用途，其中所述免疫性疾病或炎性疾病是器官移植。
7.权利要求5的用途，其中所述过度增殖性疾病是癌症或骨髓增殖性疾病。
8.权利要求1的化合物在制备用于抑制细胞的激酶的药物中的用途。
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