KR101737753B1 - 페닐 아미노 피리미딘 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

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타오 리엔 티 응우엔
앤드류 프레드릭 윌크스
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Abstract

본 발명은 JAK 키나제 등의 단백질 키나제의 저해제인 페닐 아미노 피리미딘 화합물에 관한 것이다. 특히, 이 화합물은 JAK2 키나제에 선택적이다. 키나제 저해제는 장기 이식; 암 및 골수 증식성 질환 등의 과증식성 질환; 바이러스 질환; 대사 질환; 및 혈관 질환 등의 면역 및 염증성 질환과 같은 키나제 관련 질환의 치료에 사용할 수 있다.

Description

페닐 아미노 피리미딘 화합물 및 이의 용도{PHENYL AMINO PYRIMIDINE COMPOUNDS AND USES THEREOF}
본 발명은 JAK 키나제 등의 단백질 키나제의 저해제인 페닐 아미노 피리미딘 화합물에 관한 것이다. 특히 상기 화합물은 JAK2 키나제에 대해 선택적이다. 키나제 저해제는 장기 이식 등의 면역 질환 및 염증성 질환; 암 및 골수 증식성 질환(myeloproliferative disease) 등의 과증식성 질환; 바이러스성 질환; 대사 질환; 및 혈관 질환과 같은 키나제 관련 질환의 치료에 사용될 수 있다.
JAK는 신호 전이 및 전사 활성자 또는 STAT로 불리우는 단백질 그룹을 인산화하는 키나제이다. STAT가 인산화되면, 이량화되어 핵으로 전위된 다음 특히 세포 증식을 유도하는 유전자들의 발현을 활성화시킨다.
몇 가지의 주요 세포 타입의 증식과 최종 기능을 사이토카인 의존적인 방식으로 조절하는데 있어, 단백질 티로신 키나제의 JAK 패밀리가 주된 역할을 한다는 것은, JAK 키나제를 저해할 수 있는 제제가 이들 효소에 의존적인 질병 상태를 예방하고 화학요법으로 치료하는데 유용하다는 것을 시사한다. 현재 알려져 있는 4가지 JAK 패밀리 구성원 각각에 대한 강력하고 특이적인 저해제들은 면역 질환과 염증성 질환을 발생시키는 사이토카인의 기능을 저해하는 수단으로 제공될 것이다.
골수증식성 장애(MPD: meloproliferative disorder)에는, 특히 진성 적혈구 증가증(PV: polycythemia vera), 원발성 골수 섬유증, 혈소판 증가증, 본태성 혈소판 증가증(ET), 특발성 골수 섬유증(IMF), 만성 골수성 백혈병(CML), 전신 비만 세포증(SM), 만성 호중구성 백혈병(CNL), 전신 골수이형성 증후군(MDS) 및 전신 비만 세포 질환(SMCD)이 포함된다. JAK2는, 진성 적혈구 증가증(PV) 환자들의 99%와 본태성 혈소판 증가증(ET) 환자와 특발성 골수 섬유증(MF) 환자들의 50%에서 특이적인 돌연변이(JAK2V617F)가 발견되는, JAK 키나제 패밀리에 속한다. 이러한 돌연변이는 JAK2를 활성화시키는 것으로 생각되는데, 이는 JAK2 저해제가 이러한 타입의 질환 치료에 유용할 것이라는 주장에 무게를 실어준다.
천식은 국소 및 전신 알레르기성 염증과 가역적인 기도 폐색이 특징인 복합 장애이다. 천식 증상, 특히 숨가쁨은 기도 폐색의 결과이며, 사망의 대부분은 거의 질식이 원인이다. 기도 과민 반응(AHR)과 배상 세포(goblet cell)에 의한 점액의 과다 분비는 천식 환자들에서 기도 폐색을 유발하는 주된 2가지 요인들이다. 흥미롭게도 최근 천식 동물 실험 모델 연구에서, 천식 병태의 주 요인으로서 IL-13의 중요성이 부각되었다. 특이적인 IL-13 차단제를 이용하여, IL-13이, IgE의 유도 없이(즉, 비-아토피 양상으로), IL-14와 독립적으로 작용하며, 전체적인 알레르기성 천식 표현형을 유도할 수 있는 것으로 입증되었다. 이러한 모델과 그외 모델을 통해, 천식의 병리생리를 도출하는 중요한 제2차 메카니즘이 암시되었는데, 이는 상주 B 세포에 의한 IgE의 생산이나 또는 호산구의 존재에 의존적인 것은 아니다. IL-13에 의한 AHR의 직접 유도는, 새로운 치료법이 개재될 수 있는 탁월한 표적이 될 수 있는 중요한 과정이다. JAK2 저해제가 폐에 미치는 예상 작용은 IL-13-매개형 IgE 생산의 국소 분비 억제를 발생시켜, 비만 세포와 호산구에 의한 히스타민 방출을 감소시키는 것이다. 이러한 사항과 그외 IL-13의 부존재에 따른 결과들은, JAK2 저해제를 폐에 투여함으로써 수많은 천식 작용들을 완화시킬 수 있음을 시사한다.
만성 폐색성 폐 질환(COPD)은 정상적인 호흡을 방해할 수 있는 더 큰 폐 질환 그룹을 지칭하는 용어이다. 현행 임상 가이드라인은 COPD를, 완전히 가역적이지는 않은 기류 폐쇄(airflow limitation)가 특징인 질병 상태로 정의하고 있다. 기류 패쇄는 진행성이며, 독성 입자 및 가스, 특히 담배 연기 및 오염원에 대한 비정상적인 폐의 염증 반응과 관련있다. 여러가지 연구들을 통해, IL-13의 생산 증가와 COPD 간의 관련성이 지적되었으며, 이는 JAK2 저해제를 이용하여 천식 증식을 완화시킬 가능성을 COPD에서도 달성할 수 있다는 가능성을 뒷받침한다. COPD 환자는 기침, 숨가쁨 및 과도한 가래 발생 등의 다양한 증상을 가지고 있다. COPD에는 만성 기관지염 및 폐기종 등의 몇가지 임상적인 호흡기 증후군이 포함된다.
만성 기관지염은 점액 생산 증가 및 그외 변화를 초래하는 기관지의 오랜 염증 상태를 의미한다. 환자 증상은 기침과 가래 뱉기이다. 만성 기관지염은 또한 보다 빈번하고 심각한 호흡기 감염, 기관지 좁아짐과 막힘, 호흡 곤란 및 호흡 불능으로 이어질 수 있다.
폐기종은 폐포 및/또는 가장 작은 기관지 말단에 침범하는 만성적인 폐 질환이다. 폐는 탄성을 상실하게 되어, 탄성을 상실한 부분이 확장되게 된다. 이렇게 확장된 영역은 신선하지 않은 공기를 포착하고, 이를 신선한 공기로 효율적으로 교체하지 못한다. 그 결과, 호흡 곤란이 발생하게 되며, 혈액으로 전달되는 산소의 부족이 발생될 수 있다. 폐기종 환자에서 현저한 증상은 숨가쁨이다.
부가적으로, 폐암, 유방암, 결장암, 난소암, 전립선암 및 간암에서의 악성 종양 뿐만 아니라 호지킨스 림프종, 다발성 경화증 및 간세포성 카시노마에서, STAT의 활성화에 대한 증거가 있다. Tel, Bcr 및 PCM1과의 JAK2 융합과 관련된 염색체의 전좌는, 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 호산구성 백혈병(CEL), 골수 이형성 증후군(MDS), 골수 증식성 질환(MPD) 및 급성 림프성 백혈병(ALL) 등의 다수의 조혈 악성 종양에서 언급되었다. 이는, 다발 경화증; 전립선암, 유방암 및 폐암; 호지킨스 림프종; CML; AML; CEL; MDS; ALL; B-세포 만성 림프구성 백혈병; 전이성 흑색종; 신경아교종; 및 간암 등의 암과 같은 과증식성 장애를 JAK 저해제를 이용하여 치료하는 것을 시사한다.
전술한 바 외에도, JAK2의 강력한 저해제는 또한 고혈압, 비대증, 심장 허혈증, 심부전(수축기 심부전과 이완기 심부전 포함), 편두통 및 관련 뇌혈관 장애, 뇌졸증, 레이노(Raynaud) 현상, POEMS 증후군, 프린즈메탈 협심증, 타카야수(Takayasu) 대동맥염 및 베그너(Wegner) 사구체신염 등의 혈관병증, 말초 동맥 질환, 심장병 및 폐동맥 고혈압과 같은 혈관 질환에 유용할 것이다.
폐 동맥 고혈압(PAH)은 폐 세동맥에 발생하는 폐 혈관 질환으로, 좌측 충만압을 정상으로 유지하거나 약간 상승시키면서 폐 동맥압과 폐 혈관 저항성을 증가시킨다. PAH는 폐 혈관계에서 발생하는 여러 질환들의 조합에 의해 유발된다. PAH는 전신 경화증(경피증), 교정되지 않은 선천성 심장 질환, 간 질환, 간문 고혈압, HIV 감염, C형 간염, 특정 독소, 비장 절제술, 유전성 출혈 모세혈관확장증 및 원발성 유전적 이상과 같은 콜라겐 혈관 장애에 의해 유발되거나 이와 관련있을 수 있다. 특히, 골 형성 단백질 타입 2 수용체(TGF-b 수용체)의 돌연변이가 가족성 원발성 폐 고혈압(PPH)의 원인으로서 동정되었다. PPH 사례의 6%는 가족성이며, 나머지는 "돌발적"인 것으로 추산된다. PPH의 발생은 인구 약 백만명에 1건인 것으로 추산된다. PAH의 제2 원인은 훨씬 더 발생 빈도가 높다. PAH의 병리학적 증후는 폐쇄성 내피세포 증식 및 작은 모세 혈관 폐 세동맥에서의 혈관의 평활근 세포 비대증으로 이루어진, 폐의 망상 병변이다. PAH는 사망율이 높은 진행성 질환이다. PAH 환자에서는 좌심실(RV) 부전이 발병할 수도 있다. RV 부전의 정도로 결과를 예측한다. JAK/STAT 경로는 현재 PAH의 병리생리와 관련있는 것으로 보고 있다. JAK는 신호 전이 및 전사의 활성자, 또는 STAT라고 하는 단백질 그룹을 인산화시키는 키나제이다. STAT가 인산화되면, 핵으로 전위되어 내피 세포와 평활근 세포의 증식을 유도하여 심근세포의 비대증을 야기하는, 유전자들의 발현을 활성화시킨다. JAK의 이소형으로는 3가지, AK1, JAK2, 및 JAK3가 있다. JAK와 상동성이 높은 다른 단백질로 Tyk2가 있다. 데이타를 수득한 소스로부터, JAK2의 기질인 STAT3의 인산화가 PAH 동물 모델에서 증가된다는 것이 확인되었다. 랫의 모노크로탈린 모델에서, 프로미토제닉(promitogenic) 전사 인자 STAT3의 인산화가 증가되었다. 동일한 연구에서, 모노크로탈린을 처리한 폐 동맥 내피 세포(PAEC)에서 STAT3의 과활성화가 이루어졌다. 프로미토제닉 제제 또는 단백질은 세포 증식을 유도하거나 유도에 기여하는 물질 또는 단백질이다. 따라서, JAK2 저해의 한가지 효과는 내피 세포나 평활근 세포와 같은 다른 세포의 증식 감소일 것이다. JAK2 저해제로부터 예상되는 효과는, 폐 동맥 내강(lumen)을 막는 내피 세포나 그외 세포의 증식을 감소시키는 것이다. 세포의 폐색성 증식을 감소시킴으로써, JAK2 저해제는 PAH의 효과적인 치료제가 될 수 있다.
또한, 바이러스 질환과 대사 질환 치료에 있어서의 JAK 키나제의 용도가 알려져 있다.
JAK 패밀리에 속하는 다른 구성원들은 본래 모든 조직들에서 발현되지만, JAK3의 발현은 조혈 세포로 한정된 것으로 보인다. 이는, 멀티체인 수용체에 공통적인 감마 체인과 JAK3와의 비공유적 조합에 의한, IL-2, IL4, IL-7, IL-9 및 IL-15에 대한 수용체를 통한 신호 전달에 있어서의, 이의 필수적인 역할과 부합된다. X-연계된 중증 복합형 면역부전증(XSCID)을 가진 남성은, 인터루킨-2(IL-2), IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-15의 수용체들 간에 공통되며 필수 요소를 코딩하는 공통적인 사이토카인 수용체 감마 체인(감마 c)에 결함을 가지고 있다. XSCID 증후군에서 JAK3 단백질이 돌연변이되었거나 그 수준이 현저하게 감소된 환자들이 동정되었는데, 이는 면역 억제가 JAK3 경로를 통한 신호 전달 차단으로부터 이루어진다는 것을 시사함에 틀림없다. 마우스 유전자 넉 아웃(knock-out) 연구를 통해, JAK3가 B 및 T 림프구 성숙화에 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, JAK3가 T 세포의 기능을 유지하는데 구성적으로 필요한 것으로 나타났다. IL-2 및 IL-4 수용체의 하류 신호 전달 발생에 JAK3가 참여한다는 생화학적 증거와 더불어, 인간과 마우스 돌연변이 연구를 통해, JAK3의 존재를 통한 면역 활성 조절이 이식 거부 및 자가면역 질환과 같은 T 세포와 B 세포의 증식성 장애 치료에 유용한 것으로 입증될 수 있었다. 반대로, JAK3의 부적절한 저해가 약물로 치료한 개체의 면역 상태를 파괴하는 효과를 보일 수도 있었다.
다양한 질병 상태를 타겟으로 하는 다양한 타입의 단백질 키나제의 저해가 확실히 이로움에도 불구하고, 이제까지 대상 단백질 키나제에 선택적이며 우수한 경구 생체이용성 등의 우수한 "약물 유사" 특성을 가진 화합물의 동정이 도전 과제로 남아있다. 또한, 타겟이 되는 효소들 간에 서열 유사성 수준과 무관하게, 키나제 저해제의 개발에 있어서 저해 또는 선택성의 예측 가능성은 매우 낮은 편이다.
장기 이식; 암 및 골수 증식성 질환 등의 과증식성 질환; 바이러스 질환; 대사 질환; 및 혈관 질환 등의 면역 질환 및 염증성 질환과 같은 키나제 관련 질환 치료에 사용하기 위해 치료적으로 적절한 JAK2 저해제의 개발에 있어서 과제는, 또한 우수한 약물-유사성을 가진 적절한 특이성을 보유한 화합물을 설계하는 것을 포함한다.
따라서, JAK 키나제 패밀리를 특이적으로 저해하는 화합물, 특히 다른 JAK 키나제에 비해 한가지 JAK 키나제, 특히 JAK2 키나제를 선호적으로 저해할 수 있는 화합물을 설계 및/또는 동정할 필요성에 대한 지속적인 필요성이 제기되고 있다. 또한, 다양한 질병 치료를 위한 상기한 화합물들이 요구되고 있다.
본 발명은 JAK 키나제 등의 단백질 키나제의 저해제인 페닐 아미노 피리미딘 화합물에 관한 것이다. 특히, 이 화합물은 JAK2 키나제에 선택적이다. 키나제 저해제는 장기 이식; 암 및 골수 증식성 질환 등의 과증식성 질환; 바이러스 질환; 대사 질환; 및 혈관 질환 등의 면역 및 염증성 질환과 같은 키나제 관련 질환의 치료에 사용할 수 있다.
발명의 개요
본 발명은, 제1 측면으로 식 I의 화합물, 또는 그의 거울상 이성질체, 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
Figure 112016086323913-pat00001
상기 식에서,
Q 및 Z는 독립적으로 N 및 CR1으로부터 선택되며;
n은 1, 2 또는 3이며;
R1은 독립적으로 수소, 할로겐, R2, OR2, OH, R4, OR4, CN, CF3, (CH2)nN(R2)2 , NO2, R2R4, SO2R4, NR2SO2R3, COR4, NR2COR3, CO2H, CO2R2, NR2COR4, R2CN, R2CN, R2OH, R2OR3 및 OR5R4로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는
2개의 R1은 여기에 부착된 탄소와 함께 5 또는 6원의 불포화된 헤테로사이클릴을 형성하며;
R2는 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬 또는 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬렌이고, 여기에서 탄소 최대 2개는 선택적으로 CO, NRY, CONRY, S, SO2 또는 O로 치환될 수 있으며;
R3는 R2, C2-4 알케닐 또는 치환되거나 비치환된 아릴이며;
R4는 NH2, NHR2, N(R1)2, 치환되거나 비치환된 모르폴리노, 치환되거나 비치환된 티오모르폴리노, 치환되거나 비치환된 티오모르폴리노-1-옥사이드, 치환되거나 비치환된 티오모르폴리노-1, 1-디옥사이드, 치환되거나 비치환된 피페라지닐, 치환되거나 비치환된 피페리디닐, 치환되거나 비치환된 피리디닐, 치환되거나 비치환된 피롤리디닐, 치환되거나 비치환된 피롤릴, 치환되거나 비치환된 옥사졸릴, 치환되거나 비치환된 이미다졸릴, 치환되거나 비치환된 테트라하이드로퓨라닐 및 치환되거나 비치환된 테트라하이드로피라닐이며;
R5는 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬렌이며;
R6-R10은 독립적으로 H, RXCN, 할로겐, 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬, OR1, CO2R1, N(R1)2, NO2, CON(R1)2, SO2N(RY)2, N(SO2R1)2, 치환되거나 비치환된 피페라지닐, N(RY)SO2R2 및 CF3 중에서 선택되며;
Rx는 존재하지 않거나 또는 치환되거나 비치환된 C1-6 알킬렌이며, 여기에서 2개 이하의 탄소 원자는 선택적으로 CO, NSO2R1, NRY, CONRY, S, SO2 또는 O로 치환될 수 있으며;
RY는 H 또는 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬이며; 및
R11은 H, 할로겐, 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬, OR2, CO2R2, CN, CON(R1)2 및 CF3 중에서 선택된다.
본 발명은, 제2 측면에서, 식 II의 화합물을 커플링하는 단계를 포함하는 전술한 식 I의 화합물의 제조 방법을 제공한다:
Figure 112016086323913-pat00002
상기 식에서,
Y 및 R11 및 n은 상기 정의와 동일하며, X는 식 III 및 IV의 화합물을 가진 이탈기이며;
Figure 112016086323913-pat00003
Figure 112016086323913-pat00004
상기 식에서,
n, Z, R1 및 R6-R10은 상기 정의와 동일하며;
M은 B 또는 Sn, Zn 또는 Mg 등의 금속이다.
식 I의 화합물은 키나제 저해제, 바람직하게는, JAK 저해제, 더 바람직하게는, JAK2 저해제이다. 이들 화합물들은 장기 이식; 암 및 골수 증식성 질환 등의 과증식성 질환; 바이러스 질환; 대사 질환 및 혈관 질환 등의 면역 및 염증성 질환과 같은 키나제 관련 질환의 치료에 유용하다.
본 발명은, 제3 측면으로, 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물을 포함하는 약학 제제 또는 그의 대사산물을 제공한다.
또한, 식 I의 화합물은 약학 제제 또는 그의 대사산물로서의 용도를 제공한다.
또한, 약학 제제 또는 그의 대사산물로서 이용하기 위한 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물을 제공한다.
제4 측면으로, 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물을 포함하는 키나제 저해제를 제공한다.
또한, 키나제 저해제로서의 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물의 용도를 제공한다.
또한, 키나제 저해제로서 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물을 제공한다.
제5 측면으로, 약학 제제 또는 그의 대사산물, 바람직하게는 키나제 저해제, 더 바람직하기로는 JAK 키나제 저해제, 가장 바람직하기로는 JAK2 선택적 저해제로서 이용하기 위한 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물을 제공한다.
또한, 식 I의 화합물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 약학적 조성물 형태로 투여될 수 있다.
제6 측면에서, 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 예로, 약학적 조성물은 또한 1종 이상의 부가적인 치료제를 포함한다.
식 I의 화합물은 약물 용출 스텐트와 같은 임플란트 내부에 포함되거나 또는 임플란트에 부착될 수 있다. 예로, 화합물이 폐 동맥 고혈압(PAH)의 치료제로 사용되는 경우, 화합물은 국소 작용하거나, 또는 스텐트에서 폐 순환계로 분비될 수 있는, 폐 동맥 스텐트 내부에 포함되거나 또는 스텐트에 부착될 수 있으며, 이때 화합물은 폐 혈관계에 치료 활성을 발휘한다.
제7 측면에서, 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물을 포함하는 임플란트를 제공한다.
제8 측면에서, 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물이나 약학적 조성물을 유효량으로 이를 필요로하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 장기 이식; 암 및 골수 증식성 질환 등의 과증식성 질환; 바이러스 질환; 대사 질환; 및 혈관 질환 등의 면역 및 염증성 질환과 같은 키나제 관련 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 장기 이식; 암 및 골수 증식성 질환 등의 과증식성 질환; 바이러스 질환; 대사 질환 및 혈관 질환 등의 면역 및 염증성 질환과 같은 키나제 관련 질환의 치료를 위한 약제 제조에 있어, 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물이나 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 장기 이식; 암 및 골수 증식성 질환 등의 과증식성 질환; 바이러스 질환; 대사 질환 및 혈관 질환 등의 면역 및 염증성 질환과 같은 키나제 관련 질환의 치료에 있어서의, 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물이나 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 장기 이식; 암 및 골수 증식성 질환 등의 과증식성 질환; 바이러스 질환; 대사 질환 및 혈관 질환 등의 면역 및 염증성 질환과 같은 키나제 관련 질환의 치료에 사용하기 위한, 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물이나 약학적 조성물을 제공한다.
제9 측면으로, 세포를 전술한 바와 같이 정의된 식 I의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 키나제를 저해하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 키나제, 특히 JAK2와 같은 JAK 키나제를 저해하며, 장기 이식; 암 및 골수 증식성 질환 등의 과증식성 질환; 바이러스 질환; 대사 질환 및 혈관 질환 등의 면역 및 염증성 질환과 같은 키나제 관련 질환의 치료에 유용한, 식 I의 화합물에 관한 것이다.
화합물
본 발명은 식 I의 화합물 또는 그의 거울상 이성질체, 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112016086323913-pat00005
상기 식 I에서,
Q 및 Z는 독립적으로 N 및 CR1으로부터 선택되며;
n은 1, 2 또는 3이며;
R1은 독립적으로 수소, 할로겐, R2, OR2, OH, R4, OR4, CN, CF3, (CH2)nN(R2)2 , NO2, R2R4, SO2R4, NR2SO2R3, COR4, NR2COR3, CO2H, CO2R2, NR2COR4, R2CN, R2CN, R2OH, R2OR3 및 OR5R4로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는
2개의 R1은 여기에 부착된 탄소와 함께 5 또는 6원의 불포화된 헤테로사이클릴을 형성하며;
R2는 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬 또는 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬렌이고, 여기에서 탄소 최대 2개는 선택적으로 CO, NRY, CONRY, S, SO2 또는 O로 치환될 수 있으며;
R3는 R2, C2-4 알케닐 또는 치환되거나 비치환된 아릴이며;
R4는 NH2, NHR2, N(R1)2, 치환되거나 비치환된 모르폴리노, 치환되거나 비치환된 티오모르폴리노, 치환되거나 비치환된 티오모르폴리노-1-옥사이드, 치환되거나 비치환된 티오모르폴리노-1, 1-디옥사이드, 치환되거나 비치환된 피페라지닐, 치환되거나 비치환된 피페리디닐, 치환되거나 비치환된 피리디닐, 치환되거나 비치환된 피롤리디닐, 치환되거나 비치환된 피롤릴, 치환되거나 비치환된 옥사졸릴, 치환되거나 비치환된 이미다졸릴, 치환되거나 비치환된 테트라하이드로퓨라닐 및 치환되거나 비치환된 테트라하이드로피라닐이며;
R5는 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬렌이며;
R6-R10은 독립적으로 H, RXCN, 할로겐, 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬, OR1, CO2R1, N(R1)2, NO2, CON(R1)2, SO2N(RY)2, N(SO2R1)2, 치환되거나 비치환된 피페라지닐, N(RY)SO2R2 및 CF3 중에서 선택되며;
Rx는 존재하지 않거나 또는 치환되거나 비치환된 C1- 6알킬렌이며, 여기서, 2개 이하의 탄소 원자는 선택적으로 CO, NSO2R1, NRY, CONRY, S, SO2 또는 O로 치환될 수 있으며;
RY는 H 또는 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬이며; 및
R11은 H, 할로겐, 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬, OR2, CO2R2, CN, CON(R1)2 및 CF3 중에서 선택된다.
일 예로, 식 I의 화합물은 식 Ia 또는 그의 거울상 이성질체, 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염을 가진다:
Figure 112016086323913-pat00006
상기 식 Ia에서,
Q 및 Z는 독립적으로 N 및CR1으로부터 선택되며;
R1은 독립적으로 H, 할로겐, R2, OR2, OH, R4,CN, CF3, NO2, R2R4, SO2R4, NR2SO2R3, COR4, CO2H, CO2R2, NR2COR3, NR2COR4, R2CN, R2OH, R2OR3 및 OR5R3로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는
2개의 R1 치환기는 여기에 부착된 탄소 원자들과 함께 불포화된 N-함유성 5 또는 6원 헤테로사이클릴을 형성하며;
R2는 C1-4 알킬, 또는 CF1-4 알킬렌이며;
R3는 R2, C2-4 알케닐 또는 아릴이며;
R4는 NH2, NHR2, N(R2)2, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 티오모르폴리노-1-옥사이드, 티오모르폴리노-1, 1-디옥사이드, 4-카르보닐메틸 피페라지닐, 4-메틸 피페라지닐, 3- 또는 4-하이드록시 피페리디닐, 4-하이드록시메틸 피페리디닐, 4-피롤리디닐 피페리디닐, 4 또는 5-메틸 옥사졸릴, 4-하이드록시 피리디닐, 3-하이드록시 피롤릴, 3-하이드록시 피롤리디닐, 피리디닐 피라졸릴 또는 이미다졸릴이며;
R5는 C2-4 알킬렌이며;
R6 - R9은 독립적으로 H, RXCN, 할로겐, 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, OR1, CO2R1,N(R1)2, NO2, CON(R1)2 및 CON(R1)2 중에서 선택되며;
RX는 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬렌이며, 여기에서 2개 이하의 탄소 원자는 선택적으로 CO, NSO2R1, NRY, CONRY, SO, SO2, 또는 O로 치환될 수 있으며;
RY는 H 또는 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬이며; 및
R11은 H, 할로겐, 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬, OR2, CO2R2, CN, CON(R1)2 및 CF3 중에서 선택된다.
바람직하게는, Q는 N이고, Z는 CR1이다.
바람직하게는, R1는 수소, 모르폴리닐, CH2 모르폴리닐, C1- 4알콕시, 티오모르폴리닐, 3-하이드록시피롤리디닐, 요오도, 플루오로, OH, 4-하이드록시 피페리디닐, 4-하이드록시메틸 피페리디닐, N-메틸 피페리디닐, 3-하이드록시 피페리디닐, 카르보닐 4-피롤리디닐 피페리디닐, 옥시-4-피페리디닐, 4-카르보닐메틸 피페라지닐, 4-메틸 피페라지닐, 4-NHSO2CH3-피페리디닐, 4-옥시 피페리디닐, 이미다졸릴 CON(R1)2, CF3 또는 R2OR3이다.
바람직하게는, R6는 H 또는 메틸이다.
바람직하게는, R7는 H, 메틸, 메톡시, 클로로와 같은 할로겐 또는 하이드록시이다.
바람직하게는, R8는 H, CONHCN, CH2NHCOCN, CN, CONHC(CH3)2CN, NCNSO2CH3, SO2NHCH2CN 또는 N(SO2CH3)CH2CN과 같은 RXCN, OH, CO2CH2CH3, CON(R1)2, N(R1)2 또는 CO2R1이다.
바람직하게는, R9는 H, CONHCN, CH2NHCOCN 또는 CFH2NHCN과 같은 RXCN, 메톡시, 할로겐, OCF3 또는 CF3이다.
바람직하게는, R11는 H, 할로겐, 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬, OR2, CO2R2, CN 또는 CF3이고, 더 바람직하게는, H, 메틸, 메톡시, Cl, Br, F 또는 CO2R2이고, 가장 바람직하게는, H 또는 메틸이다.
바람직한 예로, 식 I 또는 Ia의 화합물은 식 Ib 또는 그의 거울상 이성질체, 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염을 가진다:
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상기 식 Ib에서,
Z는 독립적으로 N 및 CH로부터 선택되며;
R1은 독립적으로 H, 할로겐, OH, CONHR2, CON(R2)2, CF3, R2OR2, CN, 모르폴리노, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리노-1, 1-디옥사이드, 치환되거나 비치환된 피페리디닐, 치환되거나 비치환된 피페라지닐, 이미다졸릴, 치환되거나 비치환된 피롤리디닐, 및 탄소 원자가 모르폴리노, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리노-1, 1-디옥사이드, 치환되거나 비치환된 피페리디닐, 치환되거나 비치환된 피페라지닐, 이미다졸릴 또는 치환되거나 비치환된 피롤리디닐로 치환된 NRY 및/또는 O로 선택적으로 치환된, C1-4 알킬렌 중에서 선택되며;
R2는 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬이며;
RY는 H 또는 치환되거나 비치환된 C1-4 알킬이며;
R8는 RXCN이며;
RX는 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬렌이며, 여기에서 2개 이하의 탄소 원자는 선택적으로 CO, NSO2R1, NRY, CONRY, SO, SO2 또는 O로 치환될 수 있으며;
R11는 H 또는 CF1-4 알킬이다.
식 I의 화합물의 예는 하기에 나타내나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
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용어 "C1-6 알킬" 및 "C1-4 알킬"은 탄소 원자 1-6개를 가지는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기이다. 예로는 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 네오펜틸 및 헥실이 있다.
용어 "C1-6 알킬렌" 및 "C1-4 알킬렌"은 "C1-6 알킬" 및 "C1-4 알킬"의 2가 당량(divalent equivalent)이다.
용어 "C2- 4알케닐"은 필요에 따라 E 또는 Z 입체 화학의 하나 이상의 이중 결합을 가지는 탄소수 2-4의 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기이다.
용어 "아릴"은 방향족 탄화수소의 단일 핵성, 다핵성, 접합되거나 융합된 잔기이다. 그 예로는 페닐, 비페닐, 테르페닐, 쿼터페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 안트라세닐, 디하이드로안트라세닐, 벤즈안트라세닐, 디벤잔트라세닐 및 펜아트레닐이 있다.
용어 "불포화된 N-함유성 5 또는 6원 헤테로사이클"은 하나 이상의 질소를 포함하는 불포화된, 사이클릭 탄화수소기이다.
적합한 N-함유성 헤테로사이클릭기로는 질소 원자 1-4개를 포함하는 불포화된 5 내지 6월 헤테로모노사이클기, 예컨대, 피롤릴, 피롤리닐, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 트리아졸릴 또는 테트라졸릴;
산소 원자 1 내지 2개와 질소 원자 1-3개를 포함하는, 불포환된 5 또는 6원 헤테로모노사이클릭기, 예컨대 옥사졸릴, 이속사졸릴 또는 옥사디아졸릴; 및
황 원자 1-2 및 질소 원자 1-3개를 포함하는 불포화된 5 또는 6원 헤테로모노사이클릭기, 예컨대, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴이 있다.
용어 "할로겐"은 F, Cl, Br 및 I이다.
용어 "치환된"은 C1-6 알킬, C3-6 사이클로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 알킬아릴, 아릴, 헤테로사이클릴, 할로, 할로 C1-6 알킬, 할로 C3-6 사이클로알킬, 할로 C2-6 알케닐, 할로 C2-6 알키닐, 할로아릴, 할로헤테로사이클릴, 하이드록시, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, 아릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 카르복시, 할로 C1-6 알콕시, 할로 C2-6 알케닐옥시, 할로 C2-6 알키닐옥시, 할로아릴옥시, 니트로, 니트로 C1-6 알킬, 니트로 C2-6 알케닐, 니트로아릴, 니트로헤테로사이클릴, 아지도, 아미노, C1-6 알킬아미노, C2-6 알케닐아미노, C2-6 알키닐아미노, 아릴아미노, 헤테로사이클아미노 아실, C1-6 알킬아실, C2-6 알케닐아실, C2-6 알키닐아실, 아릴아실, 헤테로사이클릴아실, 아실아미노, 아실옥시, 알데하이도, C1-6 알킬설포닐, 아릴설포닐, C1-6 알킬설포닐아미노, 아릴설포닐아미노, C1-6 알킬설포닐옥시, 아릴설포닐옥시, C1-6 알킬설페닐, C2-6 알클리설페닐, 아릴설페닐, 카르보알콕시, 카르보아릴옥시, 머캅토, C1-6 알킬티오, 아릴티오, 아실티오, 시아노 등 중에서 선택되는 하나 이상의 기로 치환된 기이다. 바람직한 치환기는 C1-4 알킬, C3-6 사이클로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 알킬아릴, 아릴, 헤테로사이클릴, 할로, 할로아릴, 할로헤테로사이클릴, 하이드록시, C1-4 알콕시, 아릴옥시, 카르복시, 아미노, C1-6 알킬아실, 아릴아실, 헤테로사이클릴아실, 아실아미노, 아실옥시, C1-6 알킬설페닐, 아릴설포닐 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염으로서 제조될 수 있지만, 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 염의 제조에서 중간체로서 유용하기 때문에, 이 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 약학적으로 허용가능한 염의 예로는, 소듐, 포타슘, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 및 알킬암모늄과 같은 약학적으로 허용가능한 양이온의 염; 하이드로클로르산, 오르쏘포스포르산, 설푸르산, 포스포르산, 니트르산, 카르본산, 보르산, 설팜산 및 하이드로브롬산과 같은 약학적으로 허용가능한 무기산의 산 부가염; 또는 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 타르타르산, 말레산, 하이드록시말레산, 퓨마르산, 시트르산, 락트산, 뮤식산, 글루콘산, 벤조익산, 숙신산, 옥살산, 페닐아세트산, 메탄설폰산, 트리할로메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 이소티온산, 살리실산, 설파닐산, 아스파르트산, 글루탐산, 에데트산, 스테아르산, 팔미트산, 올레산, 라우르산, 판토텐산, 타닌산, 아스코르브산, 발레르산 및 오로트산과 같은 약학적으로 허용가능한 유기산의 염을 포함한다. 또한, 아민기의 염은 아미노 질소 원자가 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 아르알키닐 모이어티와 같은 적정 유기기를 가지고 있는 4급 암모늄염을 포함할 수 있다.
염은 화합물의 유리 염기 형태를, 염이 용해되지 않는 용매나 매질, 또는 진공 또는 동결 건조에 의해 제거되는 물과 같은 용매 중에서 1 당량 이상의 적정 산과 반응시키거나, 또는 기존재하는 염의 양이온을 적합한 이온 교환 수지 상의 다른 양이온으로 교체하는 것과 같은, 통상적인 방법으로 만들 수 있다.
화합물이 키랄 센터를 포함하는 경우, 화합물은 정제된 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체로서, 또는 입체 이성질체가 임의 비율로 혼합된 혼합물로서 사용할 수 있다. 그러나, 혼합물은 바람직한 이성질체를 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5% 또는 99% 이상 포함하는 것이 바람직하며, 바람직한 이성질체는 원하는 수준의 효능과 선택성을 갖는다.
또한, 본 발명은 식 I의 화합물의 프로드럭을 포함한다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 화합물 약물 또는 프로드럭을 투여하는 단계를 포함하는 JAK와 같은 단백질 키나제의 저해에 의해 치료할 수 있는 장애의 치료 방법을 포함한다. 예로, 유리 아미노, 아미도, 하이드록시 또는 카르복실산기가 있는 식 I의 화합물을 프로드럭으로 변환시킬 수 있다. 프로드럭은, 아미노산 잔기이거나 또는 2개 이상의(예, 2, 3, 또는 4) 아미노산 잔기로 이루어져 있는 폴리펩타이드 체인이 펩타이드 결합을 통해 본 발명의 화합물의 유리 아미노, 하이드록시 및 카르복시산기가 공유 결합되어 있는 화합물을 포함한다. 아미노산 잔기는 일반적으로 3문자로 표시되는 20개의 천연 아미노산을 포함하며, 또한, 4-하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 데모신, 이소데모신, 3-메틸히스티딘, 노르블린, 베타-알라닌, 감마-아미노부티르산, 시트룰린, 호모시스테인, 호모세린, 오르니틴 및 메티오닌 설폰을 포함한다. 또한, 프로드럭은 카르보네이트, 카르바메이트, 아미드 및 알킬 에스테르가 카르보닐 카본 프로드럭 측쇄를 통해 본 발명의 화합물의 전술한 치환기에 공유 결합되어 있는, 화합물들을 포함한다. 또한, 프로드럭은 포스포러스-산소 결합을 통해 식 1의 화합물의 유리 하이드록실기에 연결된 화합물의 포스페이트 유사체(예, 산, 산의 염 또는 에스테르)를 포함한다. 또한, 프로드럭은 식 I에서 적절한 질소 및 황 원자이 N-옥사이드 및 S-옥사이드를 포함한다.
공정
일반식 I의 화합물은 일반적으로 디클로로피리미딘으로부터 제조된다.
공정의 1 단계는 일반적으로 2,4 디클로로피리미딘과 적절하게 관능화된 커플링 파트너 간의 교차-커플링 반응으로 시작된다. 다른 예로, 디클로로피리미딘을 디요오도피리미딘으로 변환시킬 수 있으며, 그 후 적절하게 관능화된 커플링 파트너와 커플링시킨다. 전형적인 커플링 파트너는 유기보론산 또는 에스테르(스즈키 커플링;예, Miyaura, N. and Suzuki, Chem Rev. 1995, 95 2457), 오가노스스탄난(organostannanes)(Stille coupling: Stille, J.K., Angew . Chem ., Int . Ed. Engl., 1986, 25, 508), 그리그나드 시약(Grignard reagent)(Kumada coupling: Kumada, M.; Tamao, K.; Sumitani, K. Org . Synth. 1988, Coll. Vol.6, 407) 또는 유리아연 종들(Negishi coupling: Negishi, E.; J. Organomet . Chem . 2002, 653, 34)이 있다. 스즈키 커플링이 바람직한 커플링 방법이며, 이는 전형적으로 DME, THF, DMF, 에탄올, 프로판올, 톨루엔, 아세토니트릴 또는 1,4-디옥산과 같은 용매 중에서 물을 첨가하거나 첨가없이, 소듐 카보네이트, 포타슘 카보네이트, 리튬 하이드록사이드, 세슘 카보네이트, 소듐 하이드록사이드, 포타슘 플루오라이드 또는 포타슘 포스페이트와 같은 염기의 존재 하에, 수행된다. 반응은 승온된 온도에서 수행될 수 있으며, 사용하는 팔라듐 촉매는 Pd(PPh3)4, Pd(OAc)2, [PdCl2(dppf)], Pd2(dba)3/P(t-Bu)3 중에서 선택할 수 있다.
공정의 2단계는, 상기로부터 수득한 것과 적절하게 치환된 아닐린의 친핵성 방향족 치환 반응을 포함한다. 친핵성 방향족 치환은 전형적으로 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, tert-부탄올, 디옥산, THF, DMF, 톨루엔 또는 자일렌과 같은 용매 중에서 1단계로부터 수득한 모노할로 헤테로사이클릭 중간체에 아닐린을 부가함으로써 수행된다. 반응은 전형적으로 HCl 또는 p-톨루엔설폰산과 같은 산의 존재 하에 또는 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민과 같은 비-친핵성 염기나 포타슘 카보네이트 또는 소듐 카보네이트와 같은 무기 염기 등의 염기의 존재 하에, 승온 조건에서 수행된다.
다른 예로, 아닐린 치환은 전이 금속 촉매된 아민화 반응을 통해 도입시킬 수 있다. 이러한 변형을 위한 전형적인 촉매로는 Pd(OAc)2/P(t-Bu)3, Pd2(dba)3/BINAP 및 Pd(OAc)2/BINAP가 있다. 이러한 반응은 전형적으로 디옥산이나 톨루엔과 같은 용매 중에서, 세슘 카보네이트 또는 소듐 또는 포타슘 tert-부톡사이드와 같은 염기의 존재 하에, 실온 내지 환류의 온도 범위에서 수행된다(예, Hartwig, J.F., Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2046).
이들 화합물의 합성의 제1 단계에서 사용되는 아닐린은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 제조하거나, 상업적으로 구입한다.
이러한 반응 단계로부터 만들어진 산물은, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 추가적으로 유도체화할 수 있다. 다르게는, 모노할로 중간체의 유도체화를 할로 치환기의 교체 이전에 수행할 수 있다. 당업자는 상기 합성에 기술된 반응들의 순서를 특정 조건에서 바꿀 수 있으며, 적당한 수율과 효율로 진행하기 위해 상기에 기술된 반응들에 대한 특정 경우에 특정 관능기가 유도체화된(즉, 보호될) 필요가 있음을 알 것이다. 관능기의 보호 타입은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예로 Greene (Greene, T., Wuts, P. (1999) Protective Groups in Organic Synthesis. Wiley-Interscience; 3rd edition.)에 기술되어 있다.
본 발명의 공정에서 사용되는 중간체인 식 II의 화합물에서 이탈기는, J. March, "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure" 4th Edition, pp 352-357, John Wiley & Sons, New York, 1992에 기술된 바와 같이 임의의 적합한 공지된 타입일 수 있으며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 바람직하기로는, 이탈기는 할로겐이고, 더 바람직하게는 Cl 또는 I이다.
JAK 저해
식 I의 화합물은 단백질 키나제, 특히 JAK 키나제, 가장 구체적으로는 JAK2에 대한 활성을 가진다. JAK2 저해제는 JAK2 활성을 선택적으로 저해하는 모든 화합물이다. JAK2의 한가지 활성은 STAT 단백질을 인산화하는 것이다. 따라서, JAK2의 작용의 예는 하나 이상의 STAT 단백질의 인산화를 줄이는 것이다. 저해제는 JAK2 또는 JAK2의 인산화되지 않은 형태를 저해할 수 있다.
또한, 본 발명은 JAK 키나제 저해제, 특히 JAK2 저해제와 같은 키나제 저해제의 용도를 제공한다.
약학적 조성물
본 발명은 1종 이상의 식 I의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 담체는 "약학적으로 허용가능한" 수단이어야 하며, 이는 조성물의 다른 성분과 혼용가능하며 개체에게 무해한 것이다. 본 발명의 조성물은 후술되는 다른 치료제를 포함할 수 있으며, 예로, 통상적인 고체 또는 액체 비히클 또는 희석제 뿐만 아니라 원하는 투여 방식에 적합한 타입의 약학적 첨가제(예, 부형제, 결합제, 보존제, 안정화제, 향료 등)를 약학 제형 분야에 잘 알려져 있는 기술 등의 기법(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Lippincott Williams & Wilkins)에 따라 이용하여, 제형화할 수 있다.
본 발명의 화합물들은 약학적으로 허용가능한 무독성 비히클 또는 희석제를 포함하는 단위 용량 제형의 형태로, 임의의 적절한 방식으로, 예컨대 정제, 캡슐제, 과립제, 또는 분말 형태로서의 경구; 설하(sublingually) 투여; 구강(buccally) 투여; 예컨대, 피하(subcutaneous), 정맥내, 근육내, 진피내(진피를 통해) 또는 수조내(intracisternal) 주사(injection) 또는 주입(infusion) 기술에 의한 비경구 투여(예를 들면, 멸균된 주사 가능한 수계 또는 비수계 용액, 또는 현탁액); 흡입 스프레이(inhalation spray) 또는 흡입(insufflation)에 의한 것과 같은 경비(nasally) 투여; 예컨대, 크림 또는 연고 형태로서의 국소 투여; 용액 또는 현탁액 형태로 눈내; 페세리, 탐폰 또는 크림 형태로 질내; 또는 예컨대, 좌약 형태로서의 직장(rectally) 투여가 가능하다. 화합물은, 예컨대 속방형(immediate release) 또는 서방형(extended release)에 적합한 형태로 투여될 수 있다. 속방형 또는 서방형 제형은 본 발명의 화합물을 포함하는 적절한 약학적 조성물을 사용함으로써 달성될 수 있거나, 또는 특히 서방형의 경우에는, 피하 임플란트(subcutaneous implant) 또는 삼투 펌프(osmotic pump)와 같은 기구를 사용함으로써 달성할 수 있다.
본 발명의 화합물을 투여하기 위한 약학적 조성물은, 단위 용량 형태로 편리하게 제시할 수 있으며, 약학 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 조제할 수 있다. 이러한 방법들은 일반적으로 식 I의 화합물을 하나 이상의 보조 성분(accessory ingredient)으로 구성되는 단체와 조합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 약학적 조성물은 식 I의 화합물을, 액상 담체 또는 미세하게 분쇄된 고상 담체 또는 이 둘 모두와 균일하고 친밀하게 조합함으로써 제조되며, 경우에 따라서는 이 산물을 원하는 제형으로 조제할 수 있다. 상기 약학적 조성물에서, 활성 대상 화합물은 질환의 진행 또는 증상에 대해 원하는 효과를 유도하기에 충분한 양으로 포함된다. 본원에 사용된 "조성물"이란 용어는, 특정 성분을 정해진 양으로 포함하는 산물, 및 상기 특정 성분들의 정해진 양의 조합을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 얻어지는 임의의 산물을 망라한다.
식 I의 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 경구용 용도, 예컨대 정제, 트로키(troche), 로젠제(lozenge), 수계 또는 오일계 현탁액, 분산성 산제 또는 과립제, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐제, 또는 시럽제 또는 엘릭시르제(elixir)에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 경구용 조성물은 약학적 조성물의 제조 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 조성물은, 예컨대 약학적으로 안정적이며 맛이 좋은 조제(preparation)를 제공하기 위하여, 감미제, 향료, 착색제, 및 보존제와 같은 1종 이상의 제제를 포함할 수 있다. 정제는 정제의 제조에 적합하며 약학적으로 허용가능한 비독성 부형제와 혼합된 식 I의 화합물을 포함한다. 상기 부형제를 예시하면, 불활성(inert) 희석제, 예컨대 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 락토오스, 칼슘 포스페이트, 또는 소듐 포스페이트; 과립화제 및 붕해제(disintegrating agent), 예컨대 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴, 또는 아카시아, 및 윤활제(lubricating agent), 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 또는 탈크일 수 있다. 정제는, 위장관 내에서의 붕해(disintegration) 및 흡수를 지연시킴으로써, 장기간에 걸친 지속된 작용을 제공하도록, 공지된 기술에 따라 코팅될 수도 있고, 코팅되지 않을 수도 있다. 예를 들면, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질(time delay material)이 사용될 수 있다. 이를 또한 코팅하여, 방출 조절을 위한 삼투성의 치료용 정제(osmotic therapeutic tablet)를 조제할 수 있다.
경구 용도의 제형은 또한, 식 I의 화합물이 불활성 고체 희석제, 예컨대 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트, 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐, 또는 식 I의 화합물이 물, 또는 오일 매질, 예컨대 피넛 오일, 액상 파라핀, 또는 올리브 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.
수계 현탁액은 수계 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 물질을 포함한다. 이러한 부형제로서는 현탁화제(suspending agent), 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시-프로필메틸셀룰로오스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐-피롤리돈, 트래거캔스 고무(gum tragacanth) 및 아카시아 고무가 있으며, 분산화제(dispersing agent) 또는 습윤화제(wetting agent)는 천연 포스파티드(phosphatide), 예컨대 렉시틴(lecithin), 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 산물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올, 예컨대 헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol)의 축합 산물, 또는 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트와 같은 헥시톨(hexitol) 및 지방산으로부터 유래된 부분 에스테르(partial ester)와 에틸렌 옥사이드의 축합 산물, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 산물, 예컨대 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트일 수 있다. 상기 수계 현탁액은 또한 1종 이상의 보존제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트, 1종 이상의 착색제, 1종 이상의 향료, 및 1종 이상의 감미제, 예컨대 수크로오스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
오일 현탁액은 식물성 오일, 예컨대 아라키스 오일(arachis oil), 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일, 또는 미네랄 오일, 예컨대 액상 파라핀에 식 I의 화합물을 현탁시킴으로써 제형화할 수 있다. 상기 오일 현탁액은 증점제(thickening agent), 예컨대 밀랍(beeswax), 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 포함할 수 있다. 전술한 바와 같은 감미제 및 향료는 좋은 맛의 경구용 조제를 제공하기 위하여 첨가할 수 있다. 이러한 조성물은 아스코르브산과 같은 항산화제를 첨가함으로써, 보존시킬 수 있다.
물을 첨가하여 수계 현탁액을 제조하는 데 적합한 분산성 분말 및 과립제는, 분산제 또는 습윤화제, 현탁화제, 및 1종 이상의 보존제와 혼합된 식 I의 화합물을 제공한다. 적절한 분산제 또는 습윤화제 및 현탁화제는 이미 앞에서 예시한 바 있다. 부가적인 부형제, 예컨대 감미제, 향료, 및 착색제도 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 O/W형 에멀젼(oil-in-water emulsion)의 형태일 수 있다. 상기 에멀젼에서, 유상(oily phase)은 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 또는 아라키스 오일, 또는 미네랄 오일, 예컨대 액상 파라핀 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적절한 유화제의 예로는, 천연 고무, 예컨대 아카시아 고무 또는 트래거캔스 고무, 천연 포스파티드, 예컨대 대두(soy bean), 렉시틴, 및 예컨대 소르비탄 모노올레이트와 같은 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르 또는 에스테르, 및 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트와 같은 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 산물일 수 있다. 상기 에멀젼은 또한 감미제 및 향료를 포함할 수도 있다.
시럽 및 엘릭시르는, 감미제, 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 또는 수크로오스와 조합하여 제형화할 수 있다. 이러한 제형은 진통제(demulcent), 보존제, 향료, 및 착색제를 더 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 살균된 주사 가능한 수계 또는 유성(oleagenous) 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 상술한 바와 같은 적절한 분산제 또는 습윤화제 및 현탁화제를 이용해 동 기술 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 상기 주사 가능한 살균 조제물은 또한 1,3-부탄 디올 중의 용액과 같은 비경구용으로서 허용가능한 무독성 희석제 또는 용매 중에 주사 가능한 살균된 용액 또는 현탁액일 수도 있다. 사용할 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매로는, 물, 링거 용액(Ringer's solution), 및 소듐 클로라이드 등장 용액(isotonic solution)이 있다. 또한, 멸균 고정(fixed) 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드 고정 오일을 사용할 수 있다. 그 외에도, 올레산과 같은 지방산을 주사용 제형의 제조에 사용한다.
비내 투여 등의 호흡기 투여를 위해, 활성 화합물은 호흡기 투여 분야에 사용되는 방법 및 제형들 중 임의의 형태로 투여할 수 있다.
따라서, 일반적으로 활성 화합물은 용액, 현탁액 또는 건조 분말 형태로 투여할 수 있다.
용액 및 현탁액은 일반적으로 수계, 예컨대 물 단독(예, 멸균 또는 발열원이 없는 물) 또는 물과 생리학적으로 허용가능한 공용매(예, 에탄올, 프로필렌 글리콜 또는 PEG 400과 같은 폴리에틸렌 글리콜)로부터 제조할 것이다.
이러한 용액 또는 현탁액은 부가적으로 다른 부형제, 예컨대 보존제(예, 벤즈알코늄 클로라이드), 가용화제/계면활성제, 예 폴리소르베이트(예, Tween 80, Span 80, 벤즈알코늄 클로라이드), 완충제, 등장성-조절제(예, 소듐 클로라이드), 흡수 증강제 및 점성 증강제를 포함할 수 있다. 현탁액은 부가적으로 현탁화제(예, 미세결정 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스 소듐)를 포함할 수 있다.
용액 또는 현탁액은 통상적인 수단에 의해, 예컨대 점적기, 파이펫 또는 스프레이로 비강에 직접 적용한다. 제형은 단일 투약 또는 다중 투약 형태로 제공될 수 있다. 후자의 경우, 투약 함량 측정 수단이 바람직하게 제공된다. 점적기 또는 파이펫의 경우, 이는 용액 또는 현탁액의 적절한 소정의 부피를 개체가 투여함으로써 달성할 수 있다. 스프레이의 경우, 예컨대 계측되는 원자화 스프레이 펌프에 의해 달성할 수 있다.
또한, 호흡기에 투여하는 것은, 화합물을 클로로플루오로카본(CFC), 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄 또는 디클로로테트라플루오로에탄, 카본 디옥사이드 또는 그외 적합한 가스와 같은, 적합한 추진체로 가압화된 팩으로 제공되는, 에어로졸 제형 수단에 의해 달성할 수 있다. 또한, 에어로졸은 렉시틴과 같은 계면활성제를 통상적으로 포함할 수 있다. 활성 화합물의 용량은 계량 밸브를 구비함으로써 조절할 수 있다.
다른 예로, 활성 화합물은 건조 분말, 예컨대 락토스, 전분, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스와 같은 전분 유도체 및 폴리비닐피롤리딘(PVP) 등의 적정 분말 베이스내 화합물의 분말 혼합의 형태로 제공할 수 있다. 편리하게는, 분말 담체는 비강에서 젤을 형성할 것이다. 분말 조성물은 단위 용량 형태(unit dose form), 예컨대 젤라틴의 캡슐 또는 카트리지나 분말을 흡입기 수단에 의해 투여하는 블리스터 팩(blister pack)으로 제시될 수 있다.
코내 제형 등의 호흡기 투여로 의도된 제형의 경우, 활성 화합물은 일반적으로 소형 입자 크기, 예컨대 약 5 미크론 이하의 크기를 가질 것이다. 이러한 입자 크기는 당업계에 공지된 수단 예컨대 마이크로화(micronisation)에 의해 달성할 수 있다.
바람직한 경우, 활성 화합물을 서방성(sustained release)으로 제공하도록 되어 있는 제형을 사용할 수도 있다.
활성 화합물은 "디스크할러(Diskhaler)"(Glaxo Group Ltd 사의 상표) 또는 정량 분무식 에어로졸(meter dose aerosol) 흡입기를 통해 유동성 분말로서 경구 흡입에 의해 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 약물의 직장 투여용 좌제 형태로 투여할 수도 있다. 이러한 조성물은 통상적인 온도에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이므로 따라서 직장에서 용융되어 약물을 방출시키는, 적합한 비-자극성 부형제를 약물과 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이다.
질 투여에 적합한 조성물은 활성 성분 이외에도 당업계에서 적합한 적으로 알려져 있는 담체를 포함하는, 페서리, 탐폰, 크림, 젤, 경고제, 폼, 또는 스프레이로 제시할 수 있다.
국소 이용을 위해서는, 본 발명의 화합물이 포함된 크림, 연고, 젤리, 용액 또는 현탁액 등을 사용한다(국소 적용을 위해, 국소 적용에 입세정제 및 가글제가 포함된다).
눈에 이용하기 위한 경우, 활성 화합물은 멸균 수계 또는 비수계 비히클 중의 용액이나 현탁액의 형태로 만들 수 있다. 첨가제, 예로 완충제, 페닐 머큐리 아세테이트 또는 나이트레이트, 벤즈알코늄 클로라이드, 또는 클로로헥시딘과 같은 살세균제 및 살진균제 등의 보존제, 및 하이프로멜로스와 같은 증점제도 포함시킬 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 리포좀 형태로 투여할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 리포좀은 일반적으로 인지질 또는 기타 지질 물질로부터 유래된 것이다. 리포좀은 수계 매질 내에 분산된 단일층(monolamellar) 또는 다층(multilamellar)의 수화된(hydrated) 액체 크리스탈로 만들어져 있다. 리포좀을 형성할 수 있는 생리학적으로 허용가능하고 대사 가능한 임의의 무독성 지질을 사용할 수 있다. 리포좀 형태의 본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물 이외에, 안정화제, 보존제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 천연 및 합성 인지질 및 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline)이다. 리포좀 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
이러한 유형의 화합물의 효능으로 인해 약물 용출 스텐트에 적용할 수도 있다. 이러한 화합물을 이용한 약물 용출 스텐트의 잠재적인 적용은 폐 동맥 협착증, 폐 정맥 협착증 뿐만 아니라 관상 동맥 협착증을 포함한다. 또한, 약물 용출 스텐트는 복재 정맥 그래프트 또는 동맥 그래프트나 도관(conduit)에 사용할 수도 있다. 이러한 유형의 화합물을 방출시키는 약물 용출 스텐트는 또한 대동맥이나 장골 동맥, 고동맥 또는 오금 동맥과 같은 말초 동맥의 협착증을 치료하는데 이용할 수도 있다. 화합물은 당업계에 공지된 다양한 임의의 방법으로 약물 용출성 스텐트 결합시킬 수 있다. 이러한 방법의 예는, 폴리머, 포스포릴 콜린 및 세라믹을 포함한다. 또한, 화합물은 생흡수성 스텐트에 스며들게 할 수도 있다.
또한, 활성 화합물은 예컨대 당업계에 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있는, 수의학적인 조성물 형태로 사용하기 위해 제시될 수도 있다. 이러한 수의학적인 조성물의 예는 하기 용도로 고안된 형태를 포함한다:
(a) 경구 투여, 외용(external application), 예컨대 물약(drenches)(예, 수계 또는 비수계 용액이나 현탁액); 정제 또는 볼루스; 사료와 혼합하기 위한 산제, 과립제 또는 펠렛제; 혀에 투여하기 위한 경고제;
(b) 비경구 투여, 예컨대, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사, 예컨대 멸균 용액 또는 현탁액; 또는 (적절한 경우) 현탁액이나 용액을 유두를 통해 유선에 도입하는 유방내 주사;
(c) 국소 적용, 예컨대, 피부에 적용하는 크림, 연고 또는 스프레이; 또는
(d) 직장이나 질내에, 예컨대 페서리, 크림 또는 폼.
본 발명의 약학적 조성물과 방법은 또한, 전술한 병리학적 병태를 치료하는데 통상적으로 적용하는, 전술한 다른 치료 활성 화합물을 더 포함할 수 있다. 병용 요법에 사용하기 위한 적정 제제의 선택은 통상적인 약학 원칙에 따라 당업자가 수행할 수 있다. 치료제의 병용은 전술한 다양한 장애의 치료 또는 예방을 실시하는데 상승적으로 작용할 수 있다. 이러한 방법을 이용하여, 각각의 제제의 투여량을 적게 사용하여 치료 효과를 달성할 수 있어, 부작용 가능성을 낮출 수 있다.
다른 치료제의 예로는 다음과 같다: 엔도텔린 수용체 길항제(예, 암프리센탄(ambrisentan), 보센탄(bosentan), 시탁센탄(sitaxsentan)), PDE-V 저해제(예, 실데나필(sildenafil), 타달라필(tadalafil), 바르데나필(vardenafil)), 칼슘 채널 차단제(예, 암로디핀(amlodipine), 펠로디핀(felodipine), 바레파밀(varepamil), 딜티아젬(diltiazem), 멘톨(menthol)), 프로스타사이클린(prostacyclin), 트레프로스티닐(treprostinil), 일로프로스트(iloprost), 베라프로스트(beraprost), 니트릭 옥사이드, 산소, 헤파린, 와파린, 이뇨제, 디그옥신(digoxin), 사이클로스포린(cyclosporin)(예, 사이클로스포린 A), CTLA4-Ig, 항체, 예컨대 ICAM-3, 항-IL-2 수용체(Anti-Tac), 항-CD45RB, 항-CD2, 항-CD3(OKT-3), 항-CD4, 항-CD80, 항-CD86, CD40과 gp39 사이의 상호작용을 차단하는 제제, 예컨대 CD40 및/또는 gp39에 대해 특이적인 항체(즉, CD154), CD40 및 gp39(CD401g 및 CD8gp39)로부터 구성되는 융합 단백질(fusion protein), 핵 전좌(nuclear translocation) 저해제와 같은, NF-kappa B 기능의 저해제, 예컨대 데옥시스페르구알린(deoxyspergualin; DSG), 콜레스테롤 생합성 저해제, 예컨대 HMG CoA 리덕타아제(reductase) 저해제(로바스타틴(lovastatin) 및 심바스타틴(simvastatin)), 비스테로이드계 항-염증제(non-steroidal anti-inflammatory drug; NSAID), 예컨대 이부로펜(ibuprofen), 아스피린, 아세트아미노펜, 레플루노마이드(leflunomide), 데옥시스페르구알린(deoxyspergualin), 사이클로옥시게나제 저해제, 예컨대 로셀레콕십(celecoxib), 스테로이드, 예컨대 프레드니솔론(prednisolone) 또는 덱사메타손(dexamethasone), 금(gold) 화합물, 베타-작용제, 예컨대 살부타몰(salbutamol), 살메테롤(salmeterol)과 같은 LABA's, 몬텔루카스트(montelukast)와 같은 루코트리엔 길항제, 항증식제(antiproliferative agent), 예컨대 메토트렉세이트, FK506(타크롤리무스(tacrolimus), 프로그라프(Prograf)), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 세포독성 약물, 예컨대 아자티오프린(azathioprine), VP-16, 에토포사이드(etoposide), 플루다라빈(fludarabine), 독소루비신(doxorubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 암사크린(amsacrine), 캄토테신(camptothecin), 사이타라빈(cytarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 플루오로데옥시유리딘(fluorodeoxyuridine), 멜팔란(melphalan) 및 사이클로포스파미드, 항대사산물, 예컨대 메톡트렉세이트, 토포아이소머라제 저해제, 예컨대 캄프토테신, DNA 알킬화제, 예컨대 시스플라틴, 키나제 저해제, 예컨대 소라페닙(sorafenib), 마이크로튜불 독소(microtubule poison), 예컨대 파클리탁셀, TNF-α 저해제, 예컨대 테니답(tenidap), 항-TNF 항체 또는 가용성(soluble) TNF 수용체, 하이드록시 유레아 및 라파마이신(rapamycin)(시롤리무스(sirolimus) 또는 라파문(Rapamune)) 또는 이들의 유도체.
기타 치료제를 본 발명의 화합물과 함께 사용하는 경우, 이들은 PDR(Physician Desk Reference)에 제시된 양으로 사용될 수 있으며, 또는 당업자에 의해 결정할 수 있다.
치료 방법
식 I의 화합물은 장기 이식; 암 및 골수 증식성 질환 등의 과증식성 질환; 바이러스 질환; 대사 질환 및 혈관 질환 등의 면역 및 염증성 질환과 같은 JAK 키나제 관련 질환 등의, 키나제 관련 질환의 치료에 사용할 수 있다.
일반적으로 용어 "치료"는 개체, 조직 또는 세포에 작용하여 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미하며, (a) 질병 소인이 있을 수 있지만 아직까지는 질환으로 진단받지 않은 개체에서 질병 발생을 예방; (b) 질병의 저해, 즉 진행을 정지; 또는 (c) 질병의 완화 또는 경감 효과, 즉 질병의 영향 퇴행을 포함한다.
용어 "개체"는 식 I의 화합물을 이용한 치료가 필요한 질병을 가진 모든 동물이다.
인간과 같은 영장류 외에도, 다양한 그외 포유류를 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법을 이용하여 치료할 수 있다. 예로, 비제한적으로 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 기니아 피그, 랫 또는 그외 소과 동물, 양(ovine), 말(equine), 개과(canine), 고양이과(feline), 설치류(rodent) 또는 뮤라인(murine) 종들을 치료할 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한 조류(예, 닭)과 같은 다른 종에서 실시할 수 있다.
용어 "투여"는 치료가 필요한 개체에게 본 발명의 화합물을 제공하는 것을 의미하는 것으로 이해하여야 한다.
용어 "키나제 관련 질환"은 비정상적인 키나제 활성, 특히 JAK 활성에 의해 직접 또는 간접적으로 초래되거나, 및/또는 이러한 키나제 효소들 중 하나 이상의 저해에 의해 완화되는, 장애 또는 장애들을 의미한다.
바람직한 예로, 키나제 관련 질환 상태에는 JAK 키나제, JAK1, JAK2, JAK3 또는 TYK2 중 하나 이상이 관여한다. 특히 바람직한 예로, 질환에는 JAK2 키나제가 관여한다. 이러한 질환으로는 하기 표에 나열된 것들이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
다양한 병태에서 JAK/STAT 경로의 활성
질병 타입 관련 세포 타입 관련 사이토카인 관련 JAK 키나제 관련
아토피
알레르기성 천식, 아토피 피부염(습진), 알레르기성 비염
비만 세포, 호산구, T-세포, B-세포,
IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-13　
JAK1, JAK2, JAK3, Tyk2　
상주 비만 세포 및 호산구의 IgE 매개 활성화에 의한 B 세포의 T 세포 활성화
CMI
알레르기성 접촉 피부염, 과민성 폐렴
T-세포, B-세포, 대식세포, 호중구
IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFNν, TNF, IL-7, IL-13,　
JAK1, JAK2, JAK3, Tyk2　
B 세포 및/또는 TDH 세포의 활성화
대식세포/과립구 활성화
자가 면역 질환
다발성 경화증, 사구체신염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 류마티스 관절염, 소아 관절염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 건선성 관절염
B-세포, T 세포, 단핵 세포, 대식세포, 호중구, 비만 세포, 호산구,
IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, Il-10, IL-13, IFNν, TNF, GM-CSF; G-CSF,
JAK1, JAK2, JAK3, Tyk2　
사이토카인 생산(예, TNFα/β, IL-1, CSF-1, GM-CSF), T-세포 활성화, B 세포 활성화, JAK/STAT 활성화
이식
이종이식 거부
GvHD
T 세포, B 세포,
대식세포
IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-13, TNF
JAK1, JAK2, JAK3,
대식세포/T 세포 매개 세포괴사,
Tc 세포 매개 세포자살, 및 외래 그래프트의 B 세포/Ig 매개 옵소니화(opsonization)/세포괴사
바이러스 질환
바이러스성 사이토카인, IL-2,
JAK1, JAK2, JAK3		 　
JAK/STAT 매개
EBV(Epstein Barr Virus) 림프구
B형 간염 간세포
C형 간염 간세포
HIV 림프구
HTLV 1 림프구
VZV(Varicella-Zoster Virus) 섬유모세포
HPV(Human Papilloma Virus) 상피세포
과증식성 질환 - 암

다양함 오토크린(Autocrine), 사이토킨, 내인성 활성화

JAK1, JAK2, JAK3

사이토카인 생산, JAK/STAT 활성화
백혈병 백혈구
백혈병 림프구
다발성 골수종 다양함
전립선암 다양함
유방암 다양함
호지킨스 림프종 다양함
B-세포 만성 림프구성 백혈병 다양함
폐암 다양함
간암 다양함
전이성 흑생종 다양함
신경교종 다양함
골수 증식성 질환
진성 적혈구 증가증(PV), 원발성 골수 섬유증, 혈소판 증가증, 본태성 혈소판 증가증(ET), 특발성 골수 섬유증, 만성 골수성 백혈병, 전신 비만 세포증(SM), 만성 호중구성 백혈병(CNL), 전신 골수이형성 증후군(MDS) 및 전신 비만 세포 질환(SMCD)

조혈 세포

인터루킨-3, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴

JAK2 돌연변이

JAK/STAT 활성화
혈관 질환
고혈압, 비대증, 심부전, 허혈성 폐 동맥 고혈압
내피세포, 폐 동맥 평활근 세포 등의 평활근 세포, 심근세포, 섬유모세포, 내피세포
IL6, 안지오텐신 II, LIF, TNF알파, 세로토닌, 카베올린1
JAK1, JAK2, TYK2
JAK/STAT 활성화
대사 질환
비만, 대사 증후군		 지방세포, 뇌하수체 세포, 뉴럽, 단핵 세포 렙틴 JAK2 JAK/STAT 활성화
용어 "면역 질환 및 염증성 질환"은 비제한적으로 류마티스 관절염, 다발 관절염, 류마티스 척추염, 골관절염, 통풍, 천식, 기관지염, 알레르기성 비염, 만성 폐색성 폐 질환, 낭성 섬유증, 염증성 장 질환, 과민성 장 증후군, 점액성 대장염, 궤양성 대장염, 디아브로틱 대장염(diabrotic colitis), 크론 질환, 자가면역성 갑상선 장애, 위염, 식도염, 간염, 췌장염, 신장염, 건선, 습진, 여드름(acne vulgaris), 피부염, 발진, 다발성 경화증, 알츠하이머 질환, 운동 신경 질환(Lou Gehrig's disease), 파제트 질환, 패혈증, 결막염, 카타르(neranl catarrh), 만성 아테로류마티즘(arthrorheumatism), 전신 염증성 반응 증휴군(SIRS), 다발성 근염, 피부성 근염(DM), 결절성 다발동맥염(PN: polaritis nodoa), 혼성 결합 조직 질환(MCTD), 쇼그렌 증후군, 크루존 증후군, 연골 형성 부전, 전신 홍반성 루푸스, 경피증, 혈관염, 치사성 이형성증(thanatophoric dysplasia), 인슐린 내성, 1형 당뇨병 및 당뇨병 합병증 및 대사성 증후군 등의, 면역성, 염증성 또는 자가면역성 질환을 의미한다.
용어 "과증식성 질환'은 암과 세포-증식성 질환 상태와 같은 골수 증식성 질환 상태를 포함하며, 비제한적으로 하기를 포함한다: 심장: 육종(혈관 육종, 섬유 육종, 횡문근 육종, 지방 육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종; 폐: 기관지원성 암종(편평 상피 세포, 미분화된 소세포, 미분화된 대세포, 선암종), 폐포(세기관지) 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 연골성 과오종(chondromatous hamartoma), 중피종(mesothelioma); 위장: 식도(편평 상피 세포 암종, 선암종, 평활근육종, 림프종), 위(암종, 림프종, 평활근육종), 췌장(관 선암종(ductal adenocarcinoma), 인슐린종, 글루카곤종, 가스트리노마(gastrinoma), 유암종 종양, VIP종(vipoma)), 소장(선암종, 림프종, 유암종 종양, 카포시 육종, 평활근육종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종), 대장(선암종, 관상 선종, 융모성 선종, 과오종, 평활근육조종); 비뇨생식관: 신장(선암종, 윌름 종양(신모세포종), 림프종, 백혈병), 방광 및 요도(편평 상피 세포 암종, 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma), 선암종), 전립선(선암종, 육종), 고환(정상 피종, 기형종, 배아 암종, 기형암종, 융모암종, 육종, 간질 세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 선종양(adenomatoid tumor), 지방종); 간: 간암(간세포성 암종), 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 간세포성 선종, 혈관종; 뼈: 골성 육종(골육종), 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 연골 육종, 유잉 육종, 악성 림프종(세망세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거대 세포 종양 척색종, 골 척색종(골연골성 외골증), 양성 척색종, 연골 모세포종, 연골근섬유종(chondromyxofibroma), 유골 골종 및 거대세포 종양; 신경계: 두개골(골종, 혈관종, 육아종, 활색종, 변형성 골염), 수막(수막염, 수막육종, 신경교종), 뇌(교모세포종, 수모세포종, 신경 교종, 뇌실막세포종, 종자세포종(송과체종), 다형성 교아종, 핍지교종, 신경초종, 망막모세포종, 선천성 종양), 척수 신경섬유종, 수막종, 신경 교종, 육종); 부인과: 자궁(자궁 내막 암종), 경부(경부 암종, 종양 전 경부 이형성증), 난소(난소 암종(장앵성 난소암, 점액성 난소암, 비분류 암종), 과립 기질 세포 종양, 세르톨리라이디히 세포 종양, 미분화 세포종, 악성 기형종), 외음부(편평상피 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 섬유육종, 흑생종), 음부(투명 세포 암종, 편평 세포 암종, 포상형 횡문근육종(배아성 암육종 횡문근육종)), 나팔관(암종); 혈관: 혈액(골수성 백혈병(급성 및 만성), 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종, 골수이형성성 증후군), 호지킨스 질환, 비-호지킨스 림프종(악성 림프종); 피부: 악성 흑생종, 기저 세포 암종, 편평 상피 세포 암종, 카포시 육종, 몰스 이형성 모반(moles dysplastic nevi), 지방종, 혈관종, 피부섬유종, 켈로이드, 건선; 부신: 신경모세포종; 및 골수 증식성 질환, 예컨대 진성 적혈구 증가증(PV: polycythemia vera), 원발성 골수 섬유증, 혈소판 증가증, 본태성 혈소판 증가증(ET), 특발성 골수 섬유증(IMF)이라고도 하는 원인 불명 골수화생(agnoneic myeloid metaplasia: AMM), 만성 골수성 백혈병(CML), 전신 비만 세포증(SM), 만성 호중구성 백혈병(CNL), 전신 골수이형성 증후군(MDS) 및 전신 비만 세포 질환(SMCD).
용어 "혈관 질환"은 심혈관 질환, 고혈압, 비대증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 혈전증 장애, 뇌졸증, 레이노이드 현상, POEMS 증후군, 안기나, 허혈증, 편두통, 말초 동맥 질환, 심장 부전, 재협착증, 죽상경화증, 좌심실 비대증, 심근 경색, 심장, 신장, 간 및 뇌의 허혈성 질환, 및 폐 동맥 고혈압 등의 질환을 의미하지만, 이들 질환들로 한정되는 것은 아니다.
JAK2 선택적 저해제에 대한 바람직한 질환으로는, 자가면역 질환, 예컨대, 아토피성 피부염, 천식, 류마티스 관절염, 크론 질환, 건선, 크루존 증후군, 연골 형성 부전, 전신 홍반성 루푸스, 결피증, 혼성 연결 조직 질환, 맥관염, 혈관염, 치사성 이형성증 및 당뇨병; 전립선암, 대장암, 유방암, 간종양과 같은 간암, 폐암, 신경 교종과 같은 두경부암, 전이성 흑색종과 같은 피부암, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종과 같은 과증식성 장애 및 진성 적혈구 증가증(PV), 골수 섬유증, 혈소판 증가증, 본태성 혈소판 증가증(ET), 특발성 골수 섬유증(IMF)이라고도 하는 원인 불명 골수화생(AMM) 및 만성 골수성 백혈병(CML)과 같은 골수 증식성 질환; 및 고혈압, 비대증, 뇌졸증, 레이노이드 현상, POEMS 증후군, 안기나, 허혈증, 편두통, 말초 동맥 질환, 심장 부전, 재협착증, 죽상경화증 및 폐 동맥 고혈압과 같은 혈관 질환 등의, 면역 질환 및 염증성 질환을 포함한다.
투여량(Dosage)
용어 "치료 유효량"은 연구자, 수의사, 의사, 또는 기타 임상의에 의해 연구 조사된 조직, 조직계(system), 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하게 될 식 I 및 II의 화합물의 양을 의미한다.
키나제 저해가 필요한 병태의 치료 또는 예방에 있어, 적정 투여량은 일반적으로 1일 당 환자 체중 1 kg 당 0.01 내지 500 mg일 것이며, 이는 단일 투약 또는 다중 투약으로 투여할 수 있다. 바람직하기로는, 투여량 수준은 1일 당 약 0.1 내지 약 250 mg/kg일 수 있으며, 더 바람직하게는, 1일 당 약 0.5 내지 약 100 mg/kg일 것이다. 적정 투여량 수준은 1일 당 약 0.01 - 250 mg/kg, 1일 당 약 0.05 - 100 mg/kg, 또는 1일 당 약 0.1 - 50 mg/kg일 수 있다. 이러한 범위내에서, 투여량은 1일 당 0.05 - 0.5, 0.5 - 5 또는 5 - 50 mg/kg일 수 있다. 경구 투여시, 조성물은 바람직하게는 활성 성분이 1.0 - 1000 mg, 특히 활성 성분이 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0, 및 1000.0 mg으로 포함된 정제 형태로 제공된다. 투여량은, 예컨대, 치료받을 환자에 맞게 투여량을 치료 효능 및/또는 증상에 따라 조정하기 위해, 상기한 범위내에서 임의 투여량으로 선택할 수 있다. 조성물은 바람직하게는 1일 당 1 내지 4회 용법으로, 바람직하게는 하루에 1 또는 2회 투여될 것이다.
임의의 특정 환자에 대한 구체적인 투약 수준과 투약 빈도는 변경할 수 있으며, 사용되는 특정 화합물, 상기 화합물의 대사 안정성과 작용 기간, 나이, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 식이, 투여 방식, 투여 시기, 배출율, 약물 병용, 특정 병태의 심각도 및 시술중인 요법(host undergoing therapy) 등의 다양한 인자에 따라 결정될 것임을 숙지할 것이다.
본 발명은 JAK 키나제 등의 단백질 키나제의 저해제인 페닐 아미노 피리미딘 화합물에 관한 것이다. 특히, 이 화합물은 JAK2 키나제에 선택적이다. 키나제 저해제는 장기 이식; 암 및 골수 증식성 질환 등의 과증식성 질환; 바이러스 질환; 대사 질환; 및 혈관 질환 등의 면역 및 염증성 질환과 같은 키나제 관련 질환의 치료에 사용할 수 있다.
도 1은 선택한 JAK 키나제의 아미노산 서열 정렬이다. 서열은 j2h= JAK2 (서열번호 1), jlh=JAK1 (SEQ. ID, NO. 2), j3h= JAK3 (서열번호 3), 및 tyk2= TYK2 (서열번호 4)로 나타낸다. 서열은 JAK2 서열(Genbank sequence NP_004963)의 833번 아미노산을 시작으로 1번 위치로 번호를 매기고 C-말단 아미노산이 말단이다. 나타낸 서열은 C-말단 키나제 도메인에 해당한다.
도 2는 무처리 적백혈병 세포(HEL 92.1.7) 대 화합물 0.25, 0.5, 1, 또는 2 mM이나 DMSO/STAT5py로 처리한 세포에서의 STAT5 인산화를 분석한 유세포 분석 결과이다. 세포를 처리한 후, 마우스 단일클론 항-STAT5(Y694) PE 항체로 염색하여 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 이용하여 분석하였다. 히스토그람은 이소형 대조군(뚜렷한 윤곽의 Isocont 레인)에 상대적인 중앙 형광값의 배수 변화에 따라 음영을 주었다.
도 3은 BaF3 세포에서의 IL-3 유발성 STAT5 인산화에 대한 화합물 3의 효과를 나타낸 것이다. BaF3 세포를 비히클 단독, 화합물 3을 농도를 증가시키면서 또는 양성 대조군 화합물과 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯을 STAT5 포스포-특이적인 항체로 처리하고, 5분(상단 블롯) 및 1분(중간 블룻)간 필름에 감광하였다. 하단 블럿에서는 화합물 3의 농도 증가에 따라 IL-3 자극된 BaF3 세포에서의 STAT5 인산화 감소가 나타난다.
도 4는 HEL 세포에서의 STAT5 인산화에 대한 화합물 3의 효과를 나타낸 것이다. HEL 세포를 비히클 단독, 화합물 3을 농도를 증가시키면서 또는 양성 대조군 화합물과 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯을 STAT5 포스포-특이적인 항체로 처리하고, 5분(상단 블롯) 및 1분(중간 블룻)간 필름에 감광하였다. 하단 블럿에서는 인산화 상태와 무관하게 총 STAT 단백질이 나타났다. 이들 블롯들에서는 화합물 3의 농도 증가에 따라 HEL 세포에서의 STAT5 인산화 감소를 보인다.
도 5는 마우스 혈장에서 성장 호르몬으로 자극한 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF- 1) 농도에 대한 화합물 3의 처리 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 누드 마우스에서 Ba/F3 TelJAK2 피하 종양 모델 세포에서의 화합물 3의 경구 투여 효능을 나타낸 것이다.
도 7은 JAK2 V617F 양성 ET 환자의 골수 유래 에리트로이드 세포에서의 CD71 (x 축) 발현에 대한 STAT5 인산화(y 축)와 화합물 3의 pYSTAT5에 대한 효과를 나타낸 점 그래프이다. 이 경우, 음성 대조군(A)에서는 에리트로포이에틴(B)(양성 대조군)으로 자극한 후 현저하게 증가하는 소량의 pYSTAT5 염색만 나타난다. 화합물 3의 첨가는 (C)에서 나타낸 바와 같이 pYSTAT5를 농도-의존적으로 증가하는 양상으로 저해한다. 이는 좌측 패널에서 양상 대조군의 pYSTAT5 활성 측정치의 저해율로서 나타나 있으며, 우측 패널에서 총 에리트로이드 집단의 형광 강도의 절대 이동(absolute shift)으로서 나타난다.
이하, 본 발명에 대한 보다 명확한 이해를 돕기 위해 본 발명의 특성의 예시하기 위해, 하기 비제한적인 실시예를 제시한다.
화합물 합성
본 발명의 화합물은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법과 선택한 화합물에 대한 하기 기술된 합성 및 실험 과정에 따라 제조할 수 있다.
정의:
PyBOP: 벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
DMF: N,N-디메틸포름아미드
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘
DCM: 디클로로메탄
NMP: 1-메틸-2-피롤리돈
n-PrOH: n-프로판올
ACN: 아세토니트릴
EDC.HCl: 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드
HOBT: N-하이드록시벤조트리아졸
TEA: 트리에틸아민
DIPEA: 디이소프로필에틸아민
p-TsOH: p-톨루엔 설폰산
HATU: o-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N ',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
실시예 1 - 화합물 3의 합성
4-에톡시카르보닐페닐 보론산(23.11 g, 119 mmol), 2,4-디클로로피리미딘 (16.90 g, 113 mmol), 톨루엔(230 mL) 및 수계 소듐 카보네이트 (2 M, 56 mL)의 혼합물을 격하게 교반한 후, 15분간 현탁액을 통해 질소를 거품이 일게 하였다. 여기에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐[0] (2.61 g, 2.26 mmol)을 첨가하였다. 다시 10분간 질소 거품을 일게 한 다음, 혼합물을 100 ℃로 열처리한 다음 밤새 75 ℃로 열처리하였다. 이 혼합물을 냉각한 후, 에틸 아세테이트 (200 mL)로 희석하고, 물(100 mL)을 첨가하여, 층을 분리하였다. 수층은 에틸 아세테이트 (100 ml)로 추출하고, 2가지의 유기 추출물을 합하였다. 유기물을 브린으로 세정하고, 소듐 설페이트로 여과한 다음, 농축시키고, 수득되는 고형물을 메탄올(100 mL)로 저작(triturate)한 다음 여과하였다. 고형물을 메탄올(2 x 30 mL)로 헹구고, 공기 중에서 건조하였다. 이 물질을 아세토니트릴 (150 mL) 및 디클로로메탄(200 mL)에 용해시켜, MP.TMT Pd-포착 수지(scavenging resin)(Agronaut part number 800471)(7.5 g)와 함께 2일간 교반하였다. 이 용액을 여과하고, 고형물을 디클로로메탄(2 x 100 mL)으로 헹군 다음, 여과물을 농축하여, 오프-화이트 고형물 에틸 4-(2-클로로피리미딘-4-일)벤조에이트를 수득하였다(17.73 g, 60%) - 디클로로메탄으로 더욱 헹구어, 산물 1.38 g 및 0.5 g을 추가로 수득함. 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) δ 8.89 (1H, d, J = 5.0 Hz); 8.32 (2H, d, J = 8.7 Hz); 8.22 (1H, d, J = 5.5 Hz); 8.12 (2H, d, J = 8.7 Hz); 4.35 (2H, q, J = 7.1 Hz); 1.34 (3H, t, J = 7.1 Hz); LC-ESI-MS (method B): rt 7.3 min.; m/z 263.0 / 265.0 [M+H]+.
에틸 4-(2-클로로피리미딘-4-일)벤조에이트 (26.15 g, 99.7 mmol) 및 4-모르폴리노아닐린(23.10 g, 129.6 mmol) 혼합물을 1,4-디옥산(250 mL)에 현탁하였다. 여기에 p-톨루엔설폰산모노하이드레이트 (17.07 g, 89.73 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 40시간 동안 환류 가열하고, 주변 온도로 냉각시킨 후, 농축시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트 및 1:1 포화 소듐 바이카보네이트/물(총 1L)로 분별하였다. 유기상을 물(2 x 100 mL)로 헹구고, 농축하였다. 수상은 디클로로메탄(3 x 200 mL)으로 추출하였다. 이러한 과정 중에 침전된 물질을 여과를 통해 모아 보관하였다. 액체 유기물을 모아, 농축하고, 메탄올(200 mL)로 저작한 다음 여과하여 부가적인 노란색 고형물을 수득하였다. 이 고형물을 모아, 메탄올(500 mL)에 현탁하고, 밤새 정치시킨 다음, 초음파 처리와 여과를 수행하였다. 고형물을 메탄올(2x 50 mL)로 헹구고, 건조시켜, 에틸-4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤조에이트(35.39 g, 88%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) δ 9.49 (1H, s); 8.54 (1H, d, J = 5.0 Hz); 8.27 (2H, d, J = 8.7 Hz); 8.10 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.66 (2H, d, J = 9.1 Hz); 7.38 (1H, d, J = 5.0Hz); 6.93 (2H, d, J = 8.7 Hz); 4.35 (2H, q, J = 6.9 Hz), 3.73 (4H, m); 3.04 (4H, m); 1.34 (3H, t, J = 6.9 Hz); LC-ESI-MS (method B): rt 7.5 min.; m/z 404.1 [M+H]+.
3:1 메탄올/테트라하이드로퓨란(350 mL) 중의 에틸-4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤조에이트(35.39 g, 87.6 mmol) 용액을, 물(90 mL) 중의 리튬 하이드록사이드(4.41 g, 183.9 mmol)로 처리하였다. 이 혼합물을 2시간 환류 가열하고, 냉각, 농축시킨 다음, 하이드로클로르산(2M, 92.5 mL, 185 mmol)으로 산성화하였다. 검은 침전물을 여과하고, 물로 헹군 다음 진공하 건조하였다. 고형물을 막자 사발로 분말로 간 후, 메탄올(500 mL)로 저작하고, 다시 여과하여, 4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤조산을 질척한 고형물로 수득하였다. 이 물질을 에테르로 헹구고, 밤새 공기 중에서 건조시킨 후, 막자 사발로 곱게 빻았다. 회수 중량의 기초로(34.49 g), 수율을 정량적으로 추측하였다. 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) δ 9.47 (1H, s); 8.53 (1H, d, J = 5.2 Hz); 8.24 (2H, d, J = 8.5 Hz); 8.08 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.66 (2H, d, J = 9.1 Hz); 7.37 (1H, d, J = 5.2Hz); 6.93 (2H, d, J = 9.1 Hz); 3.73 (4H, m); 3.04 (4H, m). LC-ESI-MS (method C): rt 7.3 min.; m/z 377.1 [M+H]+.
DMF(400 mL) 중의 4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤조산(이론상 32.59 g, 86.6 mmol) 현탁액에 트리에틸아민(72.4 mL, 519.6 mmol, 6 eq.)을 첨가하였다. 이 혼합물을 초음파 처리하여 완전히 용해시켰다. 아미노아세토니트릴 하이드로클로라이드(16.02 g, 173.2 mmol)를 첨가한 후, N-하이드록시벤조트리아졸(무수, 14.04 g, 103.8 mmol) 및 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(19.92 g, 103.8 mmol)를 첨가하였다. 현탁액을 밤새 격렬하게 교반하였다. 감압하에 용매를 제거하고, 잔류물을 5% 소듐 바이카보네이트(400 mL) 및 물(300 mL)로 희석하고, 이를 수거하여 여과하여 노란색 고형물을 수득하였다. 고형물을 총 물 100 ml을 사용하여 수차례 세정하고, 핫 메탄올/디클로로메탄(500 mL, 1:1)로 저작하고, 약 300 mL로 농축시키고, 냉각 및 여과하였다. 고형물을 차가운 메탄올(3 x 100 mL), 에테르(200 mL) 및 헥산(200 mL)으로 헹군 다음 건조하여, 화합물 3(31.69 g, 88%)을 수득하였다. M.p. 238-243 ℃. 미량 분석: 측정 C, 66.52; H, 5.41; N, 20.21. C23H26N6O10S2 requires C, 66.65; H, 5.35; N 20.28%. 13C NMR (75.5MHz, d 6-DMSO) δ 166.04, 162.34, 160.26, 159.14, 146.14, 139.87, 134.44, 132.73, 127.80, 126.84, 120.29, 117.49, 115.50, 107.51, 66.06, 49.16, 27.68.
실시예 2 - 화합물 47의 합성
톨루엔(3 mL) 중의 2,4-디클로로-5-메틸피리미딘(244 mg, 1.5 mmol) 및 메틸 2-메톡시-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(210 mg, 1.0 mmol) 용액에, n-프로판올(1 mL), 수계 소듐 바이카보네이트(2 M, 1.5 ㎕) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐[0](116 mg, 0.1 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 40시간 동안 110 ℃로 가열한 다음, 에틸 아세테이트 및 포화 소듐 바이카보네이트 수용액으로 분별하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 2번 추출하고, 모은 유기 분획을 물, 염수로 헹군 다음 건조(소듐 설페이트), 여과 및 농축하였다. 30-60% 에틸 아세테이트/페트롤륨 스피리트를 용출액으로 사용한 실리카 겔 크로마토그래피를 실시하여, 메틸 4-(2-클로로-5-메틸피리미딘-4-일)-2-메톡시벤조에이트를 크림 고형물로 수득하였다(165 mg, 56%); LC-ESI-MS (method B): rt 6.2 min.; m/z 293.3/295.3 [M+H]+.
1,4-디옥산(5 mL) 중의 메틸 4-(2-클로로-5-메틸피리미딘-4-일)-2-메톡시벤조에이트 (165 mg, 0.56 mmol) 용액에 4-모르폴리노아닐린(96 mg, 0.54 mmol) 및 p-톨루엔설폰산모노하이드레이트(97 mg, 0.51 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 40시간 동안 환류 가열하고, 실온으로 냉각 후, 에틸 아세테이트 및 포화 소듐 바이카보네이트 수용액으로 분별하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 2회 추출하고, 모은 유기 분획을 5% 시트르산 수용액, 물 및 브린으로 2번 헹군 다음, 건조(소듐 설페이트), 여과 및 농축하여, 조산물을 수득하였다. 메탄올을 이용한 저작으로, 메틸 4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)-5-메틸피리미딘-4-일)-2-메톡시벤조에이트를 노란색 고형물로 수득하였다(77 mg, 32%); 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) δ 9.36 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.76 (d, J = 8.1Hz, 1H), 7.62 (d, J = 9.0Hz, 2H), 7.38 (s, 1H), 7.27 (d, J = 8.1Hz, 1H), 6.88 (d, J = 9.0Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.72 (m, 4H), 3.01 (m, 4H), 2.12 (s, 3H); LC-ESI-MS (method B): rt 6.7 min.; m/z 435.3 [M+H]+.
1,4-디옥산(5mL) 중의 메틸 4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)-5-메틸피리미딘-4-일)-2-메톡시벤조에이트(70 mg, 0.16 mmol) 용액에, 소듐 하이드록사이드 수용액(5 M, 5 mL)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 환류 가열하고, 실온으로 냉각하였다. 여과에 의해 침전물로 모은 노란색 고형물을 물로 세정하여, 정량적인 수율로 화합물 40의 소듐염을 수득하였다.
4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)-5-메틸피리미딘-4-일)-2-메톡시벤조산(화합물 40)의 소듐염(0.16 mmol)을, 에틸 아세테이트에 현탁하여 산성화한 다음, 5% 시트르산 수용액에 대해 분별하였다. 에틸 아세테이트로 더욱 추출한 다음, 용매를 증발시키고, 디클로로메탄 (3 mL)에 현탁한 유리산을 첨가하였다. 이 용액에, 트리에틸아민(111 ㎕, 0.8 mmol), 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(58 mg, 0.3 mmol), 아미노아세토니트릴 하이드로클로라이드(61 mg, 0.4 mmol)와, 촉매량의 N,N-디메틸 아미노피리딘을 첨가하였다. 용해를 돕기 위해 N,N-디메틸 포름아미드(2 mL)를 첨가하여, 반응물을 64시간 교반하였다. TLC 분석에서 반응이 불완전한 것으로 확인되어, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N ',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(76 mg, 0.2 mmol)를 첨가하여, 다시 24시간 더 교반한 다음, 디클로로메탄 및 포화 소듐 바이카보네이트 수용액으로 분별하였다. 수층을 디클로로메탄으로 2번 추출하고, 유기층을 모아 물 및 브린로 헹군 다음, 건조(소듐 설페이트), 여과 및 농축하여, 조산물을 수득하였다. 0-3% 메탄올/에틸 아세테이트를 용출액으로 이용한 실리카겔 크로마토그래피를 수행하여, 초록/노란색 고형물로 화합물 47(13.2 mg, 18%)을 수득하였다.
실시예 3 - 화합물 90의 합성
DMF (5 mL) 및 디클로로메탄 (200 mL) 중의 4-카르복시페닐보론 현탁액에, 0 ℃에서, 옥살릴클로라이드(5.9 mL, 66 mmol)를 점적하였다. 가스 발생이 느려졌을 때, 얼음조를 제거하고, 반응물을 30분간 실온에서 승온되게 두었다. 그런 후, 반응물을 고형물 모두가 용해되는 3시간 동안 40 ℃로 가열하였다. 증류에 의해 디클로로메탄을 제거하고, DMF 용액을 0 ℃로 냉각시켰다. DMF (80 mL) 및 DIPEA (13 mL, 75 mmol) 중의 아미노아세토니트릴 하이드로클로라이드 (3.05 g, 33 mmol) 용액을 점적 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 얼음조를 치우고, 반응물을 16시간 동안 실온에서 승온되게 두었다. DMF 대부분을 진공 제거하고, 반응물을 에틸 아세테이트 및 2 M 하이드로클로르산 수용액으로 분별하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 2번 추출하고, 모은 유기 분획을 건조(Na2SO4), 여과 및 감압 농축하여, 4-(시아노메틸카바모일)페닐보론산을 광택성의 페일 노란색 고형물로 수득하였다(5.34 g, 87%). 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO): 9.18 (br. t, J = 5.1Hz, 1H), 7.8-7.9 (m, 4H), 4.31 (d, J = 5.4 Hz, 2H); LC-ESI-MS (method B): rt 0.9 min.; m/z 203.3 [M-H]-.
톨루엔(146 mL) 중의 2,4-디클로로피리미딘(3.2 g, 0.22 mmol) 및 4-(시아노메틸카바모일)페닐보론산(3.0 g, 15 mmol) 용액에, n-프로판올 44 mL), 수계 소듐 바이카보네이트(2M, 22 mL) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐[0] 850 mg, 0.7 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 90 ℃로 24시간 동안 가열하고 에틸 아세테이트 및 물로 분별하였다 . 수층을 에틸 아세테이트로 2번 추출하고, 모은 유기 분획을 브린으로 헹구고, 건조(Na2SO4), 여과 및 농축하였다. 30-70% 에틸 아세테이트/페트롤륨 스피리트를 용출액으로 사용한 실리카겔 크로마토그래피를 수행하여, 4-(2-클로로피리미딘-4-일)-N-(시아노메틸)벤즈아미드를 페일 노란색의 광택성 고형물을 수득하였다(1.35 g, 33%). 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) δ 9.40 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.88 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.32 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.23 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.36 (d, J = 5.4 Hz, 2H); LC-ESI-MS (method B): rt 5.3 min.; m/z 273.2/275.2 [M+H]+.
진공 하에 2분간 열총으로 Schlenck 플라스크를 건조시킨 다음, 실온에서 질소를 충진하였다. 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(9 mg, 0.01 mmol), (2-비페닐릴)디-tert-부틸포스핀(5.7 mg, 0.02 mmol), 포타슘 포스페이트(56 mg, 0.27 mmol), 4-(2-클로로피리미딘-4-일)-N-(시아노메틸)벤즈아미드(52 mg, 0.19 mmol) 및 4-[(1,1-디옥시도티오모르폴린-4-일)메틸]아닐린(40 mg, 0.17 mmol)을 첨가하고, 질소의 일정한 기류 하에 플라스크에서 혼합하였다. 플라스크를 막고, 진공 하에 배출시킨 후, 질소를 충진하였다. 이러한 과정을 2번 반복하였다. 고무로된 셉텀을 통해 1,2-디메톡시에탄(1.9 mL)을 첨가하였다. 플라스크를 막고, 격렬한 교반을 시작하였다. 그런 후, 혼합물을 액체 질소로 동결시킨 후, 높은 진공 하에 탈기하고, 질소를 충진시켰다(이 조작을 2번 반복함). 밀폐한 플라스크를 다시 100 ℃로 밤새 가열하였다. 소량의 트리스(디벤질리덴아세톤) 디팔라듐 및 (2-비페닐릴)디-tert-부틸포스핀을 첨가하고, 혼합물을 동결, 높은 진공하 탈기한 다음, 질소를 충진시키고, 다시 16시간 동안 100 ℃로 가열하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고, 혼합물을 소결 깔대기로 여과하였다. 그런 후, 여과물을 농축시키고, 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 수득되는 혼합물을 시트르산 용액(2%)과 소듐 클로라이드 포화 수용액으로 헹구었다. 유기층을 건조(소듐 설페이트), 여과 및 증발시켜, 조산물을 수득하였고, 이를 페트롤륨 스피리트를/에틸 아세테이트 (1/4)로 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 잔사를 메탄올로 저작하여, 화합물 90을 수득하였다(5.5 mg, 7%).
실시예 4 - 화합물 73의 합성
둥근 바닥 플라스크에 4-메탄설포닐아미노페닐보론산(4.30 g, 20 mmol) 및 2,4-디클로로피리미딘(5.97 g, 40 mmol, 2 eq.), 톨루엔(75 mL), n-프로판올(25 mL) 및 수계 소듐 카보네이트 용액(2M, 18 mL, 1.8 eq.)을 넣었다. 반응 혼합물을 비우고, 질소를 충진하고, 이를 3회 반복한 다음, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) 촉매(1.02 g, 4.4 mol%)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 다시 비우고, 질소 충진하는 과정을 3번 반복한 다음, 질소 대기 하에 100 ℃로 66시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 실온에서 반응 혼합물에서 산물이 침전되는 수시간 동안 교반하였다. 이를 진공 여과, 메탄올로 헹구고, 높은 진공하에 건조하여, 미세 노란색 고형물(3.45 g, 61% yield)을 모았다. 1H NMR 및 LC MS 데이타로, N-(4-(2-클로로피리미딘-4-일)페닐)메탄설폰아미드라는 것을 확인하였다. 1H NMR (300 MHz, d 6 -DMSO) δ 10.26 (1H, brs); 8.75 (1H, d, J = 5.5 Hz); 8.17 (2H, d, J = 9.1 Hz); 8.05 (1H, d, J = 5.5 Hz); 7.35 (2H, d, J = 8.7 Hz); 3.10 (3H, s). LC-ESI-MS (method B): rt 5.5 min.; m/z 284.2/286.1 [M+H]+.
N-(4-(2-클로로피리미딘-4-일)페닐)메탄설폰아미드(750 mg 2.64 mmol) 및 포타슘 카보네이트(730 mg, 2 eq.)를 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 아세톤(50 mL)에 현탁하였다. 혼합물을 수분간 교반한 다음 브로모아세토니트릴(368 ㎕, 2 eq.)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 조반응 혼합물을 진공 농축하고, 잔사를 에틸 아세테이트 (200 mL) 중에서 취하고, 물(2 x 100 mL), 브린(100 mL)으로 헹군 다음, 건조(소듐 설페이트)하였다. 유기상을 진공 농축하여, N-(4-(2-클로로피리미딘-4-일)페닐)-N-(시아노메틸)메탄설폰아미드(762 mg, 89% yield)를 엷은 황갈색 고형물로 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) δ 8.86 (1H, d, J = 5.0 Hz); 8.28 (2H, d, J = 8.7 Hz); 8.18 (1H, d, J = 5.5 Hz); 7.66 (2H, d, J = 8.7 Hz); 4.97 (2H, s); 3.22 (3H, s). LC-ESI-MS (method B): rt 5.9 min.; m/z 323.2/325.2 [M+H]+.
N-(4-(2-클로로피리미딘-4-일)페닐)-N-(시아노메틸)메탄설폰아미드(171 mg, 0.53 mmol), 5-아미노-2-모르폴리노벤조산(142 mg, 1.2 eq.) 및 p-톨루엔설폰산 모노하이드레이트(98 mg, 0.98 eq.)를 1,4-디옥산(8 mL)에 현탁하고, 100 ℃로 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 진공 농축하였다. 잔사를 에틸 아세테이트(80 mL)로부터 취하여, 물(20 mL) 및 브린(20 mL)으로 헹구었다. 그런 후, 유기상을 건조 및 진공 농축하였다. 잔사를 메탄올 (5 mL -> 3 mL)로 반복 저작하여, 크림 고형물로서 5-(4-(4-(N-(시아노메틸)메틸설폰아미도)페닐)피리미딘-2-일아미노)-2-모르폴리노벤조산(101 mg, 37%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) δ 17.23 (1H, s) CO2H; 9.99 (1H, s); 8.74 (1H, d, J = 2.7 Hz); 8.62 (1H, d, J = 5.0 Hz); 8.33 (2H, d, J = 8.7 Hz); 8.01 (1H, dd, J = 2.8, J = 8.7 Hz); 7.69 (1H, d, J = 9.1 Hz); 7.63 (2H, d, J = 8.7 Hz); 7.52 (1H, d, J = 9.1 Hz); 4.97 (2H, s); 3.81 (4H, m); 3.21 (3H, s); 3.06 (4H, m). LC-ESI-MS (method C): rt 5.4 min.; m/z 509.3 [M+H]+.
5-(4-(4-(N-(시아노메틸)메틸설폰아미도)페닐)피리미딘-2-일아미노)-2-모르폴리노벤조산(50 mg, 0.098 mmol) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N ',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(41 mg, 1.1 eq.)를 무수 N,N-디메틸포름아미드(4 mL)에 용해시키고, 5분간 초음파 처리하였다. 트리에틸아민(41 mL, 3 eq.) 및 N,N-디메틸에틸렌디아민(21 mL, 2 eq.)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(50 mL)로 희석하고, 바이카보네이트 용액(20 mL), 물(20 mL) 및 브린(20 mL)으로 헹구었다. 유기상을 건조(소듐 설페이트) 및 진공 농축하여, 노란색 고형물로서 화합물 73 (48 mg, 86% yield)을 수득하였다.
실시예 5 - 화합물 65의 합성
-5 ℃에서 유지시킨, 디클로로메탄 (3 mL) 중의 5-브로모-2,4-디클로로피리미딘 (300 mg, 1.3 mmol) 용액에, 차가운 57% 하이드로요오드산 수용액(5 mL)을 첨가하였다. 수득되는 용액을 2시간 동안 -5 ℃에서 교반하였다. 소듐 카보네이트 고형물을 용액의 pH가 7이 될 때까지 소량씩 첨가하고, 이 혼합물에 5% 소듐 메타바이설파이트 수용액을 첨가하여, 탈색시켰다. 고형물이 전부 용해될 때까지 물을 첨가하고, 유기상을 분리하였다. 수상을 디클로로메탄으로 2번 추출한 다음, 유기상을 모아 무수 소듐 설페이트 상에서 건조한 다음, 여과 및 농축하여, 조산물 5-브로모-2,4-디요오도피리미딘을 백색 고형물(410mg)로 수득하였다. 이 물질은 추가적인 정제없이 다음 단계에 사용하였다. LC-ESI-MS (method B): rt 6.8 min.; m/z 410.9/412.9 [M+H]+.
1,4-디옥산(10 mL) 중의 4-(시아노메틸카바모일)페닐보론산(실시예 3 참조)(185 mg, 0.9 mmol) 및 5-브로모-2,4-디요오도피리미딘(410 mg,1.0 mmol) 혼합물에, 2M 포타슘 카보네이트 수용액(100 ㎕)을 첨가하였다. 수득되는 혼합물을 5분간 질소 하에 교반하고, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(52 mg, 0.045 mmol)을 질소 대기하에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 80 ℃로 가열하였다. 냉각된 반응 혼합물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 2번 추출하였다. 유기 추출물을 모아 물로, 그리고 브린으로 차례로 헹군 다음, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조하고, 여과 및 농축하여, 갈색 고형물의 조산물을 수득하였다. 조산물을 50% 에틸 아세테이트 / 페트롤륨 스피리트를 이용한 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 4-(5-브로모-2-요오도피리미딘-4-일)-N-(시아노메틸)벤즈아미드 (200 mg, 2단계에 걸쳐 35%)를 수득하였다. LC-ESI-MS (method B): rt 6.2 min.; m/z 443.0/445.0 [M+H]+.
1,4-디옥산(3 mL) 중에 4-(5-브로모-2-요오도피리미딘-4-일)-N-(시아노메틸)벤즈아미드 (45 mg, 0.1 mmol) 및 4-모르폴리노아닐린(27 mg, 0.15 mmol) 용액이 있는 둥근 바닥 플라스크에, 이이소프로필아민(26 mg, 0.2 mmol)을 첨가하였다. 플라스크에 환류 콘덴서를 장착하고, 반응 혼합물을 밤새 환류 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트으로 추출하고, 물 및 브린으로 순차적으로 헹군 다음, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조하고, 농축시켜, 조산물을 갈색 고형물로 수득하였다. 조산물은, 50% 에틸 아세테이트 / 페트롤륨 스피리트 및 80% 에틸 아세테이트 / 페트롤륨 스피리트를 순차적으로 사용하여 용출시키는 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 노란색 고형물의 화합물 65 (12 mg, 24%)를 수득하였다.
실시예 6 - 화합물 3으로부터 염 형성
화합물 3(10.0 g)을 메탄올(1 L)에 현탁하였다. 농축 황산(10.52 g, 90% w/w)을 교반중인 용액에 점적하였다. 맑은 갈색 용액이 형성되었고, 고형 덩어리가 형성되었다. 그런 후, 용액을 신속하게 여과하고, 3시간(이차 침전물이 수분내에 나타남) 동안 계속 교반시켰다. 그런 후, 페일 노란색 침전물을 여과로 수득하고, 메탄올 (10 mL)로 헹군 후, 진공하에 밤새 건조하여, 4-(4-(4-(4-(시아노메틸카바모일)페닐)피리미딘-1-이움-2-일아미노)페닐)모르폴린-4-이움 하이드로겐설페이트를 페일 노란색 고형물로 수득하였다(10.20 g, 69%). m.p. 205 ℃. Microanalysis: Found C, 45.18; H, 4.36; N, 13.84; S, 10.24. C23H26N6O10S2 requires C, 45.24; H, 4.29; N 13.76; S 10.50%. 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) δ 9.85 (br. s, 1H), 9.34 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.59 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.27 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.34 (br. s, 2H), 4.36 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 3.89 (br. s, 4H), 3.37 (br. s, 4H); 13C NMR (75.5MHz, d 6-DMSO) δ 166.07, 163.36, 159.20, 158.48, 140.19, 139.34, 136.45, 134.89, 128.00, 127.22, 121.13, 119.89, 117.59, 109.05, 64.02, 54.04, 27.82. LC-ESI-MS (method D): rt 10.0 min.; m/z 415.1 [M+H]+.
화합물 3 (0.25 g)을 메탄올(25 ml)에 현탁하였다. 메탄 설폰산(0.255 g)을 교반 중인 용액에 점적 첨가하였고, 투명한 갈색 용액이 형성되었다. 이 용액을 3시간 교반하였고, 교반 후 부피가 9 ml로 감소되었다. 수득되는 침전물을 모아, 진공 하에 8시간 건조하여, 4-(4-(4-(4-(시아노메틸카바모일)페닐)피리미딘-1-이움-2-일아미노)페닐)모르폴린-4-이움 메탄설포네이트를 페일 노란색 고형물(0.22 g)로 수득하였다. m.p. 208 ℃. 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) δ 9.83 (br. s, 1H), 9.35 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 8.59 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.04 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.36 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 3.88 (m, 4H), 3.35 (br. s, 4H), 2.36 (s, 6H); LC-ESI-MS (method D): rt 10.2 min.; m/z 415.3 [M+H]+.
화합물 3(0.50 g)을 메탄올 (45 ml)에 현탁하였다. 막 제조한 메탄올 중의 하이드로클로르산 용액(2.6 ml, HCl conc. 40 mg/ml)을, 교반 중인 용액에 점적 첨가하였고, 투명한 갈색 용액이 만들어졌다. 이 용액을 2시간 교반한 후, 수득되는 침전물을 모아, 메탄올(5 mL)로 헹구고, 진공 하에 8시간 동안 건조하여, 4-(4-(4-(4-(시아노메틸카바모일)페닐)피리미딘-1-이움-2-일아미노)페닐)모르폴린-4-이움 클로라이드를 페일 노란색 고형물(0.30 g)로 수득하였다. m.p. 210 ℃. 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) 1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 9.92 (br. s, 1H), 9.42 (t, J = 5.3, 1H), 8.62 (d, J = 4.8, 1H), 8.29 (d, J = 8.1, 2H), 8.06 (d, J = 8.1, 2H), 7.89 (d, J = 9.0, 2H), 7.53 (br. s, 3H), 4.36 (d, J = 5.4, 2H), 3.82 (br. s, 4H), 3.43 (br. s, 4H)
LC-ESI-MS (method D): rt 10.3 min.; m/z 415.3 [M+H]+.
실시예 7 - 화합물 79의 합성
50 mL의 둥근 바닥의 2구 플라스크에, 자석 교반 막대와 드롭핑 깔때기를 장착하였다. 테트라하이드로퓨란(100 mg, 2.4 mmol/10 mL) 중의 NaBH4 현탁액을 첨가한 다음, 5-아미노-2-모르폴리노벤젠카르복시산(222 mg, 1.0 mmol)을 한번에 첨가하였다. 환류 콘덴서를 끼워, 반응 혼합물을 질소 대기하에 0 ℃로 냉각시켰다. 테트라하이드로퓨란(250 mg, 1.0 mmol/15 mL) 중의 요오드 용액을 반응 혼합물에 점적 첨가하였다. 요오드 첨가를 완료하고, 가스 발생이 멈춘 후, 반응 혼합물을 6시간 동안 환류 가열하고, 실온에서 밤새 교반 방치하였다. 혼합물이 투명해질때까지 메탄올을 서서히 첨가하였다. 수득되는 혼합물을 실온에서 30분간 교반한 후, 용매를 감압하에 제거하였다. 잔사를 20% KOH(30 mL)에 용해하고, 4시간 동안 교반한 다음 디클로로메탄(3 x 30 mL)으로 추출하였다. 모은 유기 추출물을 브린으로 헹구고, 무수 Na2SO4에서 건조한 다음, 농축하여, 5-아미노-2-모르폴리노벤질 알코올을 오프-화이트 고형물로 수득하였다(150 mg, 72% yield). 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 7.05 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.59 (dd, J = 8.4, 2.7 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 5.51 (br s, 1H), 4.71 (s, 2H), 3.84 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 3.60 (br s, 2H), 2.91 (t, J = 5.1 Hz, 4H). LC-ESI-MS (method B): rt 2.31 min.; m/z 209.2 [M+H]+.
차가운 테트라하이드로퓨란(80 mg/20 mL) 중의 NaH 현탁액에 5-아미노-2-모르폴리노벤질 알코올(400 mg, 2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 15분간 교반한 다음, 알릴 클로라이드(150 mg, 2 mmol) 및 테트라부틸암모늄 요오드(37 mg, 5 mol %)를 첨가하였다. 수득되는 혼합물을 실온에서 2시간 교반한 다음 60 ℃에서 밤새 교반하였다. 이를 실온으로 냉각한 후, 물(200 ㎕)을 첨가하여, 혼합물을 10분 교반한 다음, 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기상을 10% 암모늄 클로라이드 수용액 및 브린으로 순차적으로 헹구고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과 및 농축하여, 노란색 고형물을 수득하였다. 조산물을 페트롤륨 스피리트 중의 50% 에틸 아세테이트로 정제하여, 3-((알릴옥시)메틸)-4-모르폴리노벤젠아민을 밝은 오렌지 오일로 수득하였다(250 mg, 50% yield). 1H NMR (300MHz, CDCl3) δδ6.95 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.61 (dd, J = 8.2, 2.7 Hz, 1H), 6.10- 5.90 (m, 1H), 5.34-5.28 (m, 1H), 5.23 (dd, J = 10.5, 1.9 Hz, 1H), 4.57 (s, 2H), 4.07-4.05 (m, 2H), 3.80 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.55 (br s, 2H), 2.83 (t, J = 4.6 Hz, 4H). LC-ESI-MS (method B) rt 5.91 min.; m/z 249.3 [M+H]+.
화합물 3 및 화합물 47의 합성에 기술된 방법과 유사한 방법으로 p-톨루엔설폰산의 존재하에 4-(2-클로로피리미딘-4-일)-N-(시아노메틸)벤즈아미드와 반응시켜, 3-((알릴옥시)메틸)-4-모르폴리노벤젠아민을 화합물 79로 변환시켰다.
화합물 분석
1H 및 13C NMR 데이타는 Brucker AV-300 AVANCE NMR 스펙트로미터로 수득하였다.
LC-EI-MS 및 EI-MS
일반적인 파라미터들:
LC-EI-MS 및 EI-MS 데이타는 Waters 2996 포토다이오드 어레이 검출기 및 인테그리티 TMD 전자 충돌 스펙트로미터가 연결된 Waters 2795 Alliance HPLC를 Waters Millenium32 소프트웨어 버전 4.0과 하기 설정 조건으로 운영하여, 수득하였다.
질량 스펙트로미터 파라미터들:
헬륨 흐름 약 0.36 L/min.; 스캔 취득 모드 세트; 샘플링 속도 1 spectra/sec; 소스 온도 200 ℃; 분무기 온도 80 ℃; 확장 영역 온도 75 ℃; 질량 범위는 필요에 따라 m/z 100-550, m/z 100-650 또는 m/z 100-700.
HPLC 파라미터들:
LC-MS 파라미터는 하기 각각의 방법에 기술되어 있다. EI-MS 샘플을 주입하고, 컬럼이 없는 상태로 용매 유속 0.25 mL/min으로 분석하였다.
모델 A1 (LC-EI-MS)
용매 구배:
시간 % MilliQ 물 % ACN % (0.5% 포름산 수용액) 커브
0 90 0 10 -
0.5 90 0 10 6
7.5 0 90 10 6
10.5 0 90 10 6
11.5 90 0 10 6
14.5 90 0 10 6
유속: 0.25 mL/min.
컬럼: 하기 중 한가지
- Alltima HP C18 2.1 x 150 mm, 5 미크론
- XTerra MS C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 미크론
- XBridge C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 미크론
방법 A2 (LC-EI-MS)
용매 구배:
시간 % MilliQ 물 % ACN 커브
0 90 10 -
7 0 100 6
9 0 100 6
10 90 10 6
13 90 10 6
유속: 0.25 mL/min
컬럼: 하기 중 한가지
- Alltima HP C18 2.1 x 150 mm, 5 미크론
- XTerra MS C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 미크론
- XBridge C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 미크론
LC-ESI-MS
일반적인 파라미터들:
LC-ESI-MS 데이타는, Waters 2996 포토다이오드 어레이 검출기 및 Waters ZQ 질량 스펙트로미터가 연결된 Waters 2695Xe HPLC를 전자분무 이온화 조건 하에서 Masslynx 소프트웨어 버전 4.1과 하기 설정 조건으로 운영하여, 수득하였다.
질량 스펙트로미터 파라미터들:
질량 범위: m/z 100-650
스캔 시간: 0.5
인터 스캔 지연: 0.1
탈용매 가스: 500 L/h N2
Cone 가스: 100 L/h N2
탈용매 온도: 400 ℃
소스 온도: 120 ℃
Cone 전류: +30 V (ESI + 모드), 또는 -45 V(ESI - 모드)
HPLC 파라미터들:
하기 나타낸 조건 설정 중 어느 한가지를 사용하였다.
방법 B
용매 구배:
시간 % MilliQ 물 % ACN 커브
0 90 10 1
5 0 100 6
6 0 100 6
7 90 10 6
10 90 10 6
유속 : 0.25 mL/min.
컬럼: XTerra MS C18, 2.1 x 50 mm, 3.5 미크론
방법 C
용매 구배:
시간 % MilliQ 물 % ACN % 0.5% 포름산 수용액 커브
0 90 0 10 1
0.5 90 0 10 1
5.5 0 90 10 1
7.5 0 90 10 6
8.5 90 0 10 6
11.5 90 0 10 6
유속 : 0.25 mL/min.
컬럼: XTerra MS C18, 2.1 x 50 mm, 3.5 미크론
방법 D
용매 구배:
시간 % MilliQ 물 % ACN 커브
0 90 10 1
10 0 100 6
12 0 100 6
13 90 10 6
16 90 10 6
유속 : 0.25 mL/min.
컬럼: XTerra MS C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 미크론
실시예 8 - 효소 스크리닝
화합물 희석
스크리닝을 위해, 화합물들을(100% DMSO에 용해) 사용하기 전에 적어도 20분 동안 37 ℃로 가온하였다. 20 μM 스톡을 분석 완충액을 사용하여 먼저 만들고, 이때 DMSO의 최종 농도는 0.3%였다. 이 스톡을 화합물의 최종 농도가 5 μM이 되도록, 384 웰 옵티플레이트(Packard)에서 희석하였다.
JAK 타이로신 키나제 도메인의 생산
JAK 키나제 도메인을 하기 방법으로 제조하였다:
JAK2
인간 JAK2의 키나제 도메인을, 하기 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응으로 U937 mRNA로부터 증폭시켰다:
SALI-jk2 5'-ACG CGT CGA CGG TGC CTT TGA AGA CCG GGA T-3'(서열번호 7)
jk2-NOTI 5'-ATA GTT TAG CGG CCG CTC AGA ATG AAG GTC ATT T-3'(서열번호 8)
JAK2 PCR 산물을 pDest20 데스티네이션 벡터(Gibco)에 클로닝하였다. 그런 후, JAK2 플라스미드를 컴피턴트 DH10Bac 세포(Gibco)에 형질전환시키고, 재조합 베큘로바이러스를 Sf9 곤충 세포 형질감염을 통해 제조하였다.
JAK3
인간 JAK3의 키나제 도메인을, 하기 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응으로 U937 mRNA로부터 증폭시켰다:
XHOI-J3 5'-CCG CTC GAG TAT GCC TGC CAA GAC CCC ACG-3'(서열번호 9)
J3-KPNI 5'-CGG GGT ACC CTA TGA AAA GGA CAG GGA GTG-3'(서열번호 10)
JAK3 PCR 산물을 pDest20 데스티네이션 벡터(Gibco)에 클로닝하였다. 그런 후, JAK3 플라스미드를 컴피턴트 DH10Bac 세포(Gibco)에 형질전환시키고, 재조합 베큘로바이러스를 Sf9 곤충 세포 형질감염을 통해 제조하였다.
카나제 도메인의 대량 생산
각 JAK 패밀리 구성원으로부터 제조한 베큘로바이러스 제조물을 SF900II 무혈청 배지(Invitrogen)에서 배양한 Sf9(Spodoptera frugiperda) 세포(Invitrogen) 1 L에 약 2 x 106 cells/ml의 세포 밀도로 감염시켰다. 세포에는, 세포 배양물 대 바이러스 스톡 20:1 비율로 바이러스를 감염시켰다. 감염 48시간 후 세포를 수거하여 세포용해시켰다. GST-테깅된 AK 키나제 도메인을 GSH 아가로스 컬럼(Scientifix)의 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
분석 프로토콜
키나제 분석은 Alphascreen 단백질 타이로신 키나제 P100 검출 키트를 이용하여 384 웰 옵티플레이트(Packard)에서 수행하였다. 화합물을 포스포타이로신 분석 완충액(10mM HEPES, pH 7.5, 100mM MgCl2, 25mM NaCl, 200mM 소듐 바나데이트 및 0.1% Tween 20)의 존재 하에 20분 동안 친화성으로 정제한 PTK 도메인과 미리 인큐베이션하였다. 그런 후, 화합물을 기질과 80 또는 625um ATP의 존재 하에 60분 또는 90분간 인큐베이션하였다. 사용한 기질은 서열이 바이오틴-EGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(서열번호 13)인 기질-1(최종 농도 111 μM) 또는 서열이 바이오틴-EQEDEPEGDYFEWLEPE(최종 농도 133 μM)인 기질-2이다. 알파스크린 포스포타이로신 어셉터 비드와 이후의 스트렙타비딘 공여체 비드를 정지 완충액 중에 1/100 농도로 각 웰에 부드러운 빛 하에 첨가하여 2-3시간 인큐베이션하였다. 알파스크린 플레이트는 Packard Fusion Alpha 장치에서 판독하였다.
선택한 화합물에 대한 효소 분석 결과와 구조 데이타는 하기 표 7에 나타내었으며, 표에서 +++는 < 100nM이고, ++는 < 500nM이고, +는 <1μM이다.
실시예 9 - 세포 스크리닝
화합물 희석
스크리닝을 위해, 화합물을 96웰 플레이트에 20μM에 희석하였다. 플레이트는 분석하기 전에 30분간 37 ℃에서 가온하였다.
TEL의 확립:JAK2 세포주
TEL의 뉴클레오티드 1-487을 포함하는 코딩 영역을 올리고뉴클레오티드 5TEL (5'-GGA GGA TCC TGA TCT CTC TCG CTG TGA GAC-3'(서열번호 14) 및 3TEL (5'-AGGC GTC GAC TTC TTC TTC ATG GTT CTG-3'(서열번호 15)와 주형으로서 U937 mRNA를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. BamHI 제한효소 부위를 5TEL 프라이머에 삽입하고, SalI 제한효소 부위를 3TEL 프라이머에 삽입하였다. JAK2 (뉴클레오타이드 2994-3914; JAK2F 5'-ACGC GTC GAC GGT GCC TTT GAA GAC CGG GAT-3'[서열번호 16]; JAK2R 5'-ATA GTT TAG CGG CCG CTC AGA ATG AAG GTC ATT T-3'[서열번호 17]) 및 JAK3(뉴클레오타이드 2520-3469; JAK3F 5'-GAA GTC GAC TAT GCC TGC CAA GAC CCC ACG ATC TT-3'[서열번호 18])의 키나제 도메인을 포함하는 영역을, Taq DNA 중합효소(Gibco/BRL) 및 U937 mRNA 주형을 이용하여 PCR로 제조하였다. SalI 제한효소 부위를 JAK2 및 JAK3의 정방향 프라이머에 삽입하고, Not I 부위를 JAK2 역방향 프라이머에 삽입하고, Xba I 부위를 JAK3 역방향 프라이머에 삽입하였다.
TEL PCR 산물을 BamH I/Sal I 제한 효소를 이용한 절단과 JAK2 PCR 산물의 Sal I/Not I 제한효소를 이용하여 절단한 후, BamH I- Not I으로 잘라 준비한 포유류 발현 벡터 pTRE 2(Clontech)에 연결 산물을 삽입 및 서브클로닝하여, TEL/Jak2 융합체를 제조하여, TEL/Jak2 융합 플라스미드 pTELJAK2를 수득하였다.
JAK3 Sal I/Not I 절단한 키나제 도메인 PCR 산물을 BamH I/Sal I 제한효소로 절단한 TEL 산물과 연결한 다음, 이 연결 산물을 BamH I/Not I로 절단한 pTRE2에 연결하여 TEL/Jak3 융합제를 제조하여, TEL/Jak3 융합 플라스미드 pTELJAK3을 수득하였다.
pTET-off 플라스미드(Clontech)를 보유하고 있는 성장 인자 의존적인 골수단핵 세포주 BaF3에, pTELJAK2 또는 pTELJAK3를 형질감염시키고, 형질감염된 세포는 성장 세포 의존적인 세포 성장으로 선별하였다. BaF3 천연형 세포를 10% FCS가 포함되어 있는 DMEM, 10% WEHI 3B로 컨디셔닝화된 배지인 DMEM에서 배양하였다. BaF3 TELJAK 세포(BafT_J2 또는 BafT_J2)를 DMEM 10% Tet-System Approved FBS (WEHI 3B 컨디셔닝화된 배지 없이)에서 배양하였다.
세포 분석을 하기와 같이 수행하였다:
세포 현탁액을 세포를 배양물로부터 회수하여 제조하였다(본 테스트에서 사용되는 세포는 생활성이 높은 후기 성장 단계임). 세포는 전술한 바와 같이, 적절한 성장 배지에 최종 농도 1.1x(세포주에 따라 50,000 cell/mL 내지 200,000 cell/mL)로 희석하였다. 테스트할 화합물을 바닥이 편평한 96웰 플레이트에 (10㎕, 10X 최종 농도) 첨가하였다. 그런 후, 세포 현탁액(웰 당 90㎕)을 첨가하고, 플레이트를 48-72 시간 동안, 37 ℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 웰 당 Alamar Blue 10㎕를 첨가하고, 플레이트를 다시 4-6시간 동안 인큐베이터에 넣었다. 그런 후 플레이트는 544 nm에서 판독하였다.
결과
결과는 하기 표 7에 나타내며, +++는 <1μM, ++는 <5μM, +는 <20μM이다.
(NT= 테스트 안함)
화합물 번호 JAK2_IC50_nM JAK3_IC50_nM BafT _J2_IC50_μM BAF3wt_IC50_μM CTLL2_IC50_μM
1 +++ >20 >20 >20
3 +++ ++ +++ ++ ++
5 ++ >20 NT NT
6 + >20 NT NT
7 >1000
8 ++
9 ++ ++ ++ ++ ++
11 +++ ++ ++ ++
16 >1000 >1000 >20 >20 >20
17 ++ + ++ + >20
18 ++ + ++ >20 +
19 >1000 >1000 >20
20 +++ +++ +++ +++ ++
21 ++ ++ + + +
22 >1000 ++ >20
23 + ++ ++
25 +++ ++ ++ ++ ++
31 +++ ++ ++ ++ ++
34 +++ ++ + ++ ++
36 +++ +++ +++ ++ ++
39 +++ +++ +++ ++ ++
42 +++ ++ ++ ++ ++
44 +++ ++ +++ ++ ++
45 +++ +++ +++ +++ +++
46 +++ +++ +++ ++ +++
50 +++ + ++ + >20
53 +++ ++ +++ ++ ++
55 +++ +++ +++ ++ ++
56 +++ +++ +++ ++ ++
57 +++ + ++ ++ ++
58 +++ +++ +++ ++ +++
59 +++ ++ ++ +++ ++
65 +++ +++ +++ +++ +++
75 +++ + ++ ++ ++
76 +++ + ++ ++ ++
79 +++ ++ +++ +++ ++
80 +++ ++ +++ ++ ++
81 +++ >1000 +++ ++ ++
82 +++ >1000 +++ ++ ++
85 +++ +++ +++ ++ +++
89 +++ ++ ++ ++ ++
90 +++ ++ ++ +++ +
92 +++ +++ +++ +++ +++
93 +++ ++ +++ +++ +++
실시예 10 - 형광 활성화된 세포 분류(FACS)
STAT5 인산화의 다중 파라미터 세포내 유세포측정 분석
인간 적백혈병 세포주 HEL 92.1.7(ATCC, TIB-180)을, 1mM 소듐 피류베이트가 보충된 10% FCS가 포함된 RPMI 1640에서 배양하였다. 포스포르-STAT 5 결정을 위해, HEL 세포를 RPMI 1640 + 1% FCS에서 37 ℃로 18시간 배양하였고, 분석 포인트대별로 2 X 105 세포를 DMSO/테스트 화합물에 2시간 동안 37 ℃에서 노출시켰다. 세포는 3분간 1300 rpm으로 원심분리하고, 37 ℃에서 15분간 파라포름알데하이드(2% 최종 농도)에서 고정시켰다. 원심분리 후, 세포를 90% 메탄올 중에서 30분간 4 ℃에서 투과화하였다. PBS-2% FCS에서 3번 세정한 후, BD PharMingen 피코에리트린-접합된 마우스 면역글로불린 이소형 대조군(Cat. No. 551436 및 STAT 5에 대한 피코에리트린-접합된 마우스 IgG1 항체(Y694) (Cat.No.612567)을 이용하여 하기와 같이 염색하였다.
암실에서 실온으로 1시간 동안 염색한 후, PBS-2% FCS로 3번 헹구었다. 그런 후, FACS 분석을 위해 세포를 800 ㎕에 재현탁하였다. Beckman Cell Lab Quanta SC System을 이용하여 3색 및 사이드 분산력(side scatter capability)으로 유세포 측정을 수행하였다. 데이타 분석은 CXP 분석 소프트웨어(버전 2.2)로 수행하였다. 중앙 형광 강도(MFI)를 이용하여, 특정 저해제 화합물로 세포를 처리하였을 때 배수(fold) 변화를, 포스포특이적인 항체 형광 채널(FL2)에 대한 MFI자극/ MFI무자극 비율로서 계산하여, 정하였다.
도 2에 나타낸 결과는, 화합물 3의 처리에 따른 STAT5 인산화의 농도-의존적인 효과를 명확하게 나타낸다.
실시예 11 - 웨스턴 블롯
실험 1
방법
뮤라인 프로-B 세포주 BaF3를 10% FCS가 포함된 RPMI 배지에서 통상적으로 유지시켰다. 실험 당일, 세포를 PBS로 2번 헹구고, 0.1% FCS가 포함된 RPMI 배지에 재현탁하였다. 혈청 상실 2시간 후, 세포를 원하는 농도의 화합물 3, 대조군 화합물 또는 비히클(DMSO) 단독과 2시간 처리하였다. 그런 후, 마우스 IL-3을 최종 농도 5 ng/ml로 15분간 세포에 첨가하였다. 이후, 세포를 얼음위에 위치시키고, 차가운 PBS로 2번 헹구었다. 헹군 세포 펠렛을 액체 질소에 순간 동결시키고, -80 ℃에서 저장하였다.
세포 펠렛을 얼음 위에서 RIPA 완충액으로 세포용해시키고, 용해물은 원심분리(20,000 x g, 4 ℃, 5 min)로 투명하게 하였다. 용해물의 단백질 농도를 브래드포드 방법으로 결정하고, 동량의 단백질(60mg/레인)을 SDS-PAGE로 분리하였다. 그런 후, 단백질을 PVDF로 옮기고, 타이로신 695번이 인산화된 STAT5를 특이적으로 인지하는 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그런 후, 막을 탈착시키고, 총 STAT5 단백질을 인지하는 항체로 다시 반응시켰다.
도 3에 나타낸 결과는 화합물 3의 처리에 의한 STAT5의 인산화에 대한 농도-의존적인 효과를 명확하게 나타낸다.
실험 2
방법
인간 적백혈병 세포주 HEL 92.1.7을, 10% FCS가 포함된 RPMI 1640에서 통상적으로 배양하였다. 실험 전날에, 세포를 PBS로 2번 헹구고, 1% FCS가 포함된 RPMI 1640 배지에 현탁한 다음 밤새 배양하였다.
다음날, 세포에 원하는 농도의 화합물 3, 대조군 화합물 또는 비히클(DMSO) 단독으로 2시간 처리하였다. 그런 후, 세포를 얼음위에 위치시키고, 차가운 PBS로 2번 헹구었다. 헹군 세포 펠렛을 액체 질소에 순간 동결시키고, -80 ℃에서 저장하였다.
세포 펠렛을 얼음 위에서 RIPA 완충액으로 세포용해시키고, 용해물은 원심분리(20,000 x g, 4 ℃, 5 min)로 투명하게 하였다. 용해물의 단백질 농도를 브래드포드 방법으로 결정하고, 동량의 단백질(60mg/레인)을 SDS-PAGE로 분리하였다. 그런 후, 단백질을 PVDF로 옮기고, 타이로신 694번이 인산화된 STAT5를 특이적으로 인지하는 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그런 후, 막을 탈착시키고, 총 STAT5 단백질을 인지하는 항체로 다시 반응시켰다.
도 4에 나타낸 결과는 화합물 3의 처리에 의한 STAT5의 인산화 감소를 나타낸다.
실시예 12 - JAK2-의존적인 생리 및 종양 세포 성장에 있어 화합물 3의 효과
마우스 혈장내 성장 호르몬 - 자극받은 인슐린 - 유사 정상인자 -1 농도에 대한 화합물 3의 효과
화합물 3(50 mg/kg) 또는 비히클 단독(대조군, +GH)을 경구 위관 영양 제공에 의해 성장 호르몬(+GH, 30마이크로그람/마우스) 또는 염수(대조군)를 시간0에 피하 투여하기 전 8시간 30분에 투여한 후, 순환성 IGF-1의 농도(평균 ± 표준편차)를 C3/H 암컷 마우스 (n = 6/그룹)에서 측정하였다. 혈액 샘플은 -GH 투여한 후 6시간에 채집하고, 혈장 IGF-1 농도는 마우스 IGF-1(R & D Systems)에 대한 ELISA로 측정하였다. 여러가지 기호들은 일원식 ANOVA 및 Bonferroni's test post - hoc에 의해 검출한 그룹들 간의 유의한 차이(p < 0.05)를 나타낸다.
도 5에 나타낸 결과는, 화합물 3으로 처리한 후의 혈장내 IGF-1의 현저한 농도 감소를 나타낸다.
E누드 마우스에서 Ba /F3 TelJAK2 피하 종양 모델에 화합물 3의 경구 투여 효과
Balb/Cnu / nu 마우스에, 마우스 Ba/F3 TelJAK2 세포(2.5 x 106/mouse)를 피하 접종하고, 화합물 3 (20 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 5 mg/kg)나 비히클 단독(5% N-메틸피롤리돈, 0.1 M Captisol®, 또는 Taxol®(5 mg/kg i.v. 1주일에 3회, n = 15 마우스/그룹루)을 b.i.d. 투약하였다. 종양이 인지되었을 때인 (평균 종양 크기 6 mm3) 종양 세포 접종 후 11일부터 투약을 시작하였다. 종양의 크기를 1주일에 2번 측정하였다. 14일 투약시, 평균 퍼센트 T/C 수치는 화합물 3 20 mg/kg b.i.d.는 39%, 10 mg/kg b.i.d. 는 25% 및 5 mg/kg/day는 82%였다. 투약을 14일간 실시한 후 t-테스트(Mann Whitney Rank Sums Tests)에 의한 종양 부피의 비교를 통해, 화합물 3을 20 mg/kg b.i.d., 및 10 mg/kg b.i.d., 및 탁솔을 처리한 그룹들에서는, 서로간 차이는 없는 비히클 대조군 처리 그룹과 5 mg/kg 화합물 3 처리 그룹에 비해 종양 부피가 더 작은 것으로 확인되었다(p < 0.05). 보다 엄격한 통계 테스트(Kruskal Wallis One way ANOVA)와 이후의 대조군 post - hoc에 대한 둔의 다중 비교를 통해, 비히클 대조군 처리 그룹과 화합물 3으로 처리한 그룹(10 또는 20 mg/kg b.i.d.) 또는 탁솔 처리 그룹 간에 유의한 차이(p < 0.05)가 확인되었다. 결과는 도 6에 나타낸다.
결과는, 화합물 3이 시험관내에서 JAK2 효소를 저해할 뿐만 아니라 Baf3Tel Jak2 세포의 시험관내 성장을 저해하며, 이는 성장 및 생육에 대한 구성적으로 활인 Jak2에 의존적인 것으로 보인다. 종양으로 생체내에서 성장시킨 Baf3Tel JAK2 세포는 또한 용량 의존적인 양상으로 화합물 3에 의해 저해된다. 또한, 화합물 3는 생체내에서 마우스 간으로부터의 성장 호르몬 (및 따라서 JAK2 의존적인) - 유래 IGF-1 합성 및 분리를 저해한다는 것을, 입증한다.
실시예 13 - 추가 화합물의 평가
화합물을 JAK2V617F-양성 골수증식 질환(MPD)의 뮤라인 모델에서도 테스트하였다.
JAK2 V617F - 양성 MPD의 확립
5-플루로우라실-처리한 Balb/c 수컷 마우스로부터 취한 골수에 JAK2-V617F - GFP 레트로바이러스를 감염시킬 수 있었으며, 치사량으로 조사한 암컷 수용체에 수사적으로 주입할 수 있었다. 21일부터 마우스를 매일 검사와 1주일에 2번씩 혈액 카운트 + GFP-양성 세포에 대한 FACS로 모니터링할 수 있었다. 헤마토크릿 증가는 약 28일에 이루어지고, 백혈구 세포는 약 40일에 증가할 것으로 예상되었다.
화합물의 처리
초기 개입 그룹: 21일에 화합물 또는 경구 위관 공급으로 제공되는 담체 처리를 시작한다(각 그룹 당 12마리). 21일부터 마우스를 매일 검사와 1주일에 2번씩 혈액 카운트 + GFP-양성 세포에 대한 FACS로 모니터링할 수 있었다. 마지막 약물 투약한지 8-12시간에, 60일에 동물을 희생시켰다. 사망 직전의 마우스나 화이트 세포 카운트가 200,000/nl이거나 체중 감소가 > 20%인 마우스는 더 일찍 희생시킬 수 있었다.
후기 개입 그룹: 마우스 3마리로 이루어진 그룹들을 29, 36, 43, 50 및 57일에 희생시키고, 골수와 비장을 레티큘린 섬유증에 대해 분석할 수 있었다. 처리는 섬유증이 3/3 마우스에서 나타나면 곧 화합물 또는 담체를 경구 위관 공급으로 ㅅ시작할 수 있었다. 마우스를 매일 검사와 1주일에 2번씩 혈액 카운트 + GFP-양성 세포에 대한 FACS로 모니터링할 수 있었다. 마지막 약물을 투약한 지 8-12시간에, 30일에 동물을 희생시킬 수 있었다. 사망 직전의 마우스나 백세포 카운트가 200,000/nl이거나 체중 감소가 > 20%인 마우스는 더 일찍 희생시킬 수 있었다. 동물을 검시할 수 있었다.
조직의 분석 및 생존
간과 비장의 중량을 결정할 수 있었다. 골수, 간 및 비장의 조직 섹션을 HE 염색으로 분석할 수 있었다. 또한, 골수와 비장을 음 염색하여, 레티쿨린 섬유증을 평가할 수 있었다. 비장 및 골수 세포를 GFP, 계통 마터, JAK2 및 STAT5 인산화에 대한 FACS로 분석할 수 있었다. 심장 천공으로 혈액을 채혈하고, 혈장을 분리하여 약물 농도 측정을 위해 냉동시킬 수 있었다. 그룹들 간의 생존을 카플랜-메이어 방법으로 비교할 수 있었다.
인간 조혈 세포의 콜로니-형성 분석에 대한 JAK2 저해의 활성 분석
JAK2V617F 돌연변이(각각 N = 10)가 있거나 없는 MPD(우열 골수 섬유증)를 앓고 있는 환자와 5건의 정상 대조군(상업 제공)으로부터 말초 혈액 단핵구 세포를 밀도 구배 원심분리(Ficoll)로 분리할 수 있었다. 상업적인 키트를 이용하여 CD34+ 세포를 선택하고, 전구체 세포를 농축시킬 수 있었다. CD34+ 세포를 소 태아 혈청과 사이토카인(+/- EPO)이 보충된 메틸셀룰로스 중에 3배수로 접종하였다. 2주간 플레이트를 인큐베이션한 후, 에리트로이드와 마이엘로이드 콜로니 형성을 도립 현미경 하에서 분석할 수 있었다.
암
종양의 개시, 진행 및 전이에 있어서의 화합물의 효과를 해당되는 생체내 동물 효능 모델에서 평가할 수 있다. 모델은 면역-결핍 마우스에서 인간 종양 세포주나 또는 바람직하게는 원발성 또는 전이성 인간 종양으로부터 인간 종양 이종이식된 모델일 수 있었다. 그외 모델로는 정위(orthotopic) 부위에서 증식시킨 인간 종양 이종이식편, 전파된 질병 모델 및 형질전환 또는 표지된 종양 모델일 수도 있었다. 또한, 모델은 원발성 종양의 외과적 절제와 전이성 질환의 평가를 포함할 수 있었다.
모델은 표적화된 분자 약물의 발현이 보장되도록 선정될 수 있었다. JAK/STAT 경로의 탈규제를 보이는 종양의 예로는, 전립선 암종, 유방암, 대장암이 있으며, 백혈병, 림프종, 골수종, 난소암, 흑색종, 폐암종, 신경교종, 신장 세포 종양이 포함된다.
효능은 종양 타입(고형, 백혈병 또는 전이성)에 따라 다양한 결과로 이들 모델들에서 측정할 수 있으며, 종양 발병, 종양 성장율, 종양 중량, 종양 성장 지연, 종양 세포 사멸, 전이 발생, 종양의 이미지 및 표지된 세포나 시약, 생존, 혈관신생, 조직병리 등의 다양한 방법에 의한 침투성/전이성 측정치를 포함할 수도 있다.
생체내 동물 효능 모델은 또한 화합물과 다른 약물의 상가적인 효과 또는 상승적인 효과를 결정하는데에도 사용할 수도 있다.
천식은 인간 종에 제한되지만, 동물 모델을 종종 사용하여 이러한 인간 질환의 특정 측정을 조사한다. 천식 환자로부터 회수한 기관지 생검 및 기관지폐포 세정(BAL) 유액에 활성화된 T 세포, B 세포, 호산구 및 비만 세포를 증가된 수로 포함되어 있는 것으로 확인하였다. 많은 천식 환자들은 한가지 이상의 흡입 알레르기원에 대해 민감하며 특이적인 면역글로불린 E(IgE) 항체를 가지고 있다. 아토피는, 천식의 주된 요인으로 간주하고 있다. 아토피 개체에서, 알레르기원의 흡입은 선호적으로 T-헬퍼 2 세포(Th2) 반응을 유도한다. 대부분의 현 모델에서는, 마우스를 종종 알룸(alum)과 같은 Th2 편향 보강제와 함께 오발부민(OVA)의 복막내(ip) 주사에 의해 감작화시킨다. 고전적인 천식 마우스 모델에서, C57/BL6 마우스는 알룸 1mg에 흡착시킨 OVA 10 ㎍을 ip 주사에 의해 0일에 활성적으로 감작화한다. 14일 -21일에, 마우스를 매일 30분간 에어로졸화된 OVA에 노출시킨다. 22일에, 기도 감염이 나타난다. 이 동물로부터 수득한 BAL 유액에서는, 단핵구 세포와 호산구의 혼성 세포 침투로 이루어진 주변 세기관지 공간 증가가 나타난다. OVA 특이적인 IgE 항체는 감작화된 동물의 혈청에서 나타날 수 있다. 단핵구 세포 집단은 주로 사이토카인 IL-4 및 IL-5를 분비하는 Th2 표현형 세포로 구성된다. IL-4는 IgE 합성 쪽으로의 B 세포의 이소타입 스위칭을 촉진시키고, IL-5는 호산구의 생산, 성숙화 및 활성화에 영향을 준다.
PAH
식 I의 화합물은 Gust, R and Schuster, D.P. Experimental Lung Research, 27:1-12, 2001에 기술된 바와 같이, 폐 고혈압 개 모델에서 테스트할 수 있다. 또한, 이는 모노크로탈린 유도성 폐 고혈압의 토끼 모델에서도 테스트할 수 있다. 식 I의 화합물은 또한 폐 동맥 고혈압을 가진 인간을 치료할 수 있다. 식 I의 화합물의 효과는 심폐 혈액 역학에 있어 이의 신속한 효과 측정에 의해 폐 동맥 고혈압을 앓고 있는 인간에서 테스트할 수 있다. 우심실 압력, 폐 동맥압, 폐 혈관 저항 및 심박출량에 대한 화합물의 효과를 결정할 수 있다. 6분 보행 시간 및 최대 산소 소비에 대한 화합물의 효과를 PAH를 앓고 있는 인간을 대상으로 결정할 수도 있다. 삶의 질(앙케이트로 측정), 입원 및 생존에 대한 화합물의 효과를 PAH를 앓고 있는 인간을 대상으로 결정할 수도 있다. 인간에서, PAH는 유전적 이상(예, 원발성 또는 가족성 PAH) 또는 경피증, 비교정 선천성 심장 질환, 혼성 골라겐 혈관 장애, C형 간염 또는 그외 간 질환, HIV 감염 또는 유전성 출혈성 모세혈관 확장증과 같은 이차 요인들에 의해 야기될 수도 있다. 또한, 화합물의 효과는 인간 내피 세포, 섬유모세포 및/또는 평활근 세포주, 예컨대, 인간 폐 동맥 평활근 세포주에서의 STAT3 인산화에 대한 IC50의 결정을 테스트할 수 있다. 다른 종, 예컨대 랫 유래의 세포주도 조사할 수도 있다. 인간 혈관으로부터 수축된 혈관 링이나 다른 종, 예컨대 랫의 혈관에 대한 화합물의 효과를 조사할 수도 있다. 예를 들면, 페닐에프린, 엔도텔린, 세로토닌, 바소프레신, 안지오텐신 II 또는 KCl로 수축시킨 랫의 폐 동맥 링을, 혈관 이완에 대한 화합물의 용량 반응을 결정할 수 있다. 다른 혈관 수축제도 조사할 수 있다.
저산소혈증 유도성 폐 혈관 수축에 대한 화합물의 효과를 조사할 수 있다. 저산소혈증 유도성 폐 고혈압 모델은 저산소(예, 5% 산소)에 노출시킨 Fawn-Hooded 랫과 같은 랫 연구를 포함할 수도 있다. 다른 저산소혈증 유도성 폐 고혈압 모델은 높은 곳의 챔버에서 유지시킨 소 태아를 포함할 수도 있다.
화합물의 효과는 형질전환 폐 고혈압 모델, 예컨대 IL6 처리한 BMPR2 낫아웃 마우스, 카베올린1 낫아웃 마우스 또는 혈관작용성 장 펩타이드 낫아웃 마우스에서 평가할 수 있다.
PAH 인간 및 동물 모델 둘다에서의 조직 혈관 변화에 있어 화합물의 효과를 측정할 수 있다. 예컨대, 화합물은 병든 폐의 폐 세동맥에서 망상 병변 범위를 감소시킬 수 있다. 망상 병변은 다양한 수준으로 증식시키고 폐색시키는, 내피세포, 평활근 세포 및 섬유모세포, 폐 세동맥 루멘으로 이루어진다.
실시예 14 - JAK2V617F 양성 환자 유래의 세포에서의 화합물 3의 생체외 분석
JAK2의 소분자 저해제의 활성을 평가하기 위해, 하류 단백질 STAT5의 인산화 상태를 측정하여 JAK-STAT 경로의 활성을 정량하기 위한 분석을 개발하였다. 리간드 결합 후, 조혈 사이토카인 수용체는 관련 JAK2 단백질을 활성화시키는 구조적 변화를 겪는다. 그런 후, 활성화된 JAK2는 세포내 시그널링 단백질의 보급을 위한 결합 부위를 형성하는 수용체의 세포내 영역을 인산화시킨다. STAT5는 활성화된 사이토카인 수용체 복합체에 동원되는 한가지 단백질로, 인산화된 다음 핵으로 전좌되어 세포 성장과 분화를 매개하는 유전자 세트의 발현을 조절한다.
세포내 유세포 측정을 이용하여, 계통-특이적인 조혈 표면 마커 상의 게이팅(gating)에 의해 특정 세포 집단에서의 타이로신 인산화된 STAT5(pYSTAT5)를 측정할 수 있다. 오직 돌연변이만 포함하는 클론은 골수내 모든 조혈 세포의 가변 분획을 형성하므로, 이는 특히 JAK2 V617F 양성 골수 증식 질환에서 중요하다. 이러한 계통은 PV에서 증식성(Hyperplastic)이기 때문에, 본 실험에서 시험하기 위한 에리트로이드 세포를 선택하였다.
방법
JAK2 V617F 양성의 골수 증식성 질환을 가진 환자의 회장 능(ileal crest)으로부터 골수를 채집하였다. 유세포 분석을 생검한 날에 신선한 골수에서 수행하였다. 골수 단핵구 세포는 밀도 구배 원심분리에 의해 회수한 다음, 세포 0.75 - 1.0 x106을 다양한 농도의 화합물 3과 1시간 동안 인디케이터-결핍 RPMI에서 37 ℃ 조건으로 인큐베이션하였다. 세포는 10분간 에리트로포이에틴으로 최대로 자극시킨 다음, 배양 배지에 4% 포름알데하이드를 직접 첨가하여 고정시켰다. 그런 후, 세포를 차가운 메탄올로 투과한 다음, 최적 농도의 형광 표지된 항체를 첨가하였다. 세포 표면 단백질 발현을 기반으로 pYSTAT5를 측정하기 위한 에리트로이드 세포를 선별하였다(CD45lo, CD71hi 집단).
결과
화합물 3을 3 μM 내지 0.0041 μM의 다양한 농도로 에리트로이드 세포 집단에서 테스트하였다. 1차 골수 표본을 3 μM - 0.037 μM 농도 범위의 저해제를 이용하여 조사하였다. 다음 2가지 환자 표본을 1 μM - 0.0041 μM의 농도 범위에서 조사하였다.
저해제(도 7A - 음성 대조군)을 이용하지 않은 자극받지 않은 골수 샘플에서는, 베이스라인 PYSTAT5 인산화 정도는 게이팅한 전체 에리트로이드 집단의 6 - 32%로 다양한 것으로 나타났다. 에리트로포이에틴(EPO) 자극은 테스트한 모든 표본에서 에리트로이드 세포의 pYSTAT5 활성을 증가시켰다. 이러한 자극을 이용한 pYSTAT5 증가는 CD71 최대 발현을 보이는 세포 서브세트에서 가장 명확하였고(도 7B), 이는 에리트로이드 집단내에서 훨씬 미성숙한 세포의 활성화와 일치된다.
모든 환자 샘플에서는, 저해제를 증가시키는 농도로 이용시 STAT5 인산화의 농도-의존적인 감소가 나타났다. 유세포 실험 결과는 2가지 다른 포맷으로 제시한다(도 7C). pYSTAT5 양성 집단은 점선 그래프의 사분면 상위 우측에 세포 퍼센트로서 나타낸다(도 7A 및 B). 이들 그래프에서 pYSTAT5 양성 건의 역치는 이소형 대조군 항체 염색을 기초로 하며, 실험들에서 일치되었다. 전체 에리트로이드 집단의 서브세트만 EPO에 의해 양성으로 되었고, 이는 양성 대조군 샘플에서 최대였다. 저해제의 농도 증가에 따라, pYSTAT5 양성 건 수는 감소되었으며, 이는 도 7C의 좌측 패널에서 양성 대조군에서의 pYSTAT5 양성 건에 대한 pYSTAT5 양성 건의 백분율로 나타낸다. 이는 각 개별 환자 표본에서의 상대 측정이다.
2번째 제시 형태는 도 7C의 우측 패널에 나타낸다. 이 측정치는 pYSTAT5 채널에서의 평균 형광 세기이고, EPO로 자극한 에리트로이드 세포와 자극하지 않은 에리트로이드 세포가 포함된다. 이는 절대 형광 측정치이며, 테스트한 3가지 개별군 간의 수치들에 가변성이 있었다. 저해제의 농도 감소에 따라 총 에리트로이드 개체의 평균 형광은 양성 대조군의 수치로 이동하였다.
본 명세서에 언급된 모든 공개 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행위, 물질, 장치, 기사 등은 단지 본 발명의 내용을 제공하기 위한 목적이다. 이들 모든 내용은, 본원의 각 청구항의 우선일 전에 오스트레일리아나 그외 지역에 존재하는 바와 같은 본 발명에 대한 종래 기술의 일부를 형성하거나, 또는 본 발명의 해당 분야에서 통상적인 일반 지식인 것으로서 용인되는 것은 아니다.
당업자라면, 광범위하게 개시된 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서, 특정 일면으로 제시된 본 발명에 대한 수많은 변경 및/또는 변형이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본원에 제시된 일면들은 모든 견지에서 단지 예시적인 것이며, 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
하기 청구항과 본 발명의 선행된 설명에서, 문맥상 언어 또는 필수 함축을 표현하기 위해 필요한 경우를 제외하고는, 용어 "포함한다" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형어는, 예컨대 본 발명의 다양한 구현예의 제시나 또는 추가적인 특성 부가를 배제하지 않으면서 언급된 특성을 구체화하기 위한 포괄적인 의미로 사용된다.

Claims (23)

  1. N-(2-시아노프로판-2-일)-4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)-벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(3-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(4-티오모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(4-이오도페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-N-(4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)페닐)-메탄설폰아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(4-(모르폴리노메틸)페닐아미노)피리미딘-4-일)-벤즈아미드;
    N-(2-(시아노메틸아미노)-2-옥소에틸)-4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(4-(4-히드록시피페리딘-l-일)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(4-(3-히드록시피페리딘-l-일)페닐아미노)-5-메틸피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    4-(2-(4-(1-벤즈일피페리딘-4-일옥시)페닐아미노)피리미딘-4-일)-N-(시아노메틸)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(6-모르폴리노피리딘-3-일아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    4-(2-(4-(4-아세틸피페라진-l-일)페닐아미노)피리미딘-4-일)-(시아노메틸)벤즈아미드;
    N-(4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)페닐)-N-(prop-2-이닐)메탄설폰아미드토실레이트;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(4-(피페리딘-4-일옥시)페닐아미노)피리미딘-4-y1)벤즈아미드;
    5-(4-(4-(시아노메틸카바모일)페닐)피리미딘-2-일아미노)-N,N-디메틸-2-모르폴리노벤즈아미드;
    N-tert-부틸-5-(4-(4-(시아노메틸카바모일)페닐)피리미딘-2-일아미노)-2-모르폴리노벤즈아미드;
    5-(4-(4-(시아노메틸카바모일)페닐)피리미딘-2-일아미노)-N-에틸-2-모르폴리노벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(3-플루오로-4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(4-모르폴리노-3-(트리플루오로메틸)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    5-(4-(4-(N-(시아노메틸)메틸설폰아미도)페닐)피리미딘-2-일아미노)-N-(2-(디메틸아미노)에틸)-2-모르폴리노벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-N-(4-(2-(4-모르폴리노-3-(트리플루오로메틸)페닐아미노)피리미딘-4-일)페닐)메탄설폰아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(3-(프로폭시메틸)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    4-(2-(3-(알릴옥시메틸)-4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)-N-(시아노메틸)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(4-(1-에틸피페리딘-4-일옥시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-N-(4-(2-(3-플루오로-4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)페닐)메탄설폰아미드;
    N-(4-(2-(3-시아노-4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)페닐)-N-(시아노메틸)메탄설폰아미드;
    2-시아노-N-(4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)페닐)아세트아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-(4-(2-모르폴리노에톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-(2-{[4-(1,l-디옥소-1λ6,4-티오모르폴린-4-일)페닐]아미노}피리미딘-4-일)벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-4-[2-({4-[(1,l-디옥소-1λ6,4-티오모르폴린-4-일)메틸]페닐}아미노)피리미딘-4-일]벤즈아미드;
    N-(시아노메틸)-N-메틸-4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드; 및
    N-(시아노메틸)-4-(5-메틸-2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  2. 제1항의 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 진성 적혈구 증가증(PV), 원발성 골수 섬유증, 혈소판 증가증, 본태성 혈소판 증가증(ET), 특발성 골수 섬유증, 만성 골수성 백혈병, 전신 비만 세포증(SM), 만성 호중구성 백혈병(CNL), 전신 골수이형성 증후군(MDS) 및 전신 비만 세포 질환(SMCD)으로 이루어진 군에서 선택되는 골수 증식성 질환 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항의 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 골수섬유증, 진성 적혈구 증가증(PV) 및 본태성 혈소판 증가증(ET)으로 이루어진 군에서 선택되는 과증식성 질환 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항의 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 장기 이식인 면역 또는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항의 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암 또는 골수 증식 질환인 과증식성 질환 치료용 약학적 조성물.
  6. 생체 외(in vitro)에서 제1항의 화합물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 세포 내 키나제를 억제하는 방법.
  7. 삭제
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