CN103156052A

CN103156052A - 液体深层发酵生产桦褐孔菌免疫增强活性物质的工艺

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Publication number: CN103156052A
Application number: CN2013100550295A
Authority: CN
Inventors: 徐向群
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-02-21
Filing date: 2013-02-21
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2033-02-21
Also published as: CN103156052B

Abstract

本发明涉及发酵工程技术领域，公开了一种液体深层发酵生产桦褐孔菌免疫增强活性物质的工艺。本发明包括菌种活化、液体菌种培养、液体深层发酵及桦褐孔菌免疫增强活性物质制备等主要步骤。本发明提供一种优化的液体深层发酵生产桦褐孔菌免疫增强活性物质的工艺，获得的免疫增强活性物质含量更高，活性更好，产品更利于工业化应用。

Description

液体深层发酵生产桦褐孔菌免疫增强活性物质的工艺

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，特别涉及一种液体深层发酵生产桦褐孔菌免疫增强活性物质的工艺。

背景技术

中国是最早利用真菌来防病治病的国家，真菌是我国传统中药的重要组成部分。近年来研究表明，真菌多糖是药用真菌的主要活性物质，具有显著的免疫调节功能，同时还在抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、护肝、降血脂、降血糖等方面具有广泛的生物学功效。真菌多糖主要是从担子菌与子囊菌子实体、菌丝体和发酵液中分离出的代谢产物。到目前为此，国内外已从近300种真菌中获取到200余种具生物活性的多糖物质，其中我国发现有重要价值的真菌多糖如：云芝多糖、虫草多糖、猴头菇多糖、平菇多糖、猪苓多糖、灰树花多糖、茶树菇多糖、白桦茸多糖、姬松茸、灵芝多糖等约30多种。真菌多糖是公认的有较高效应的免疫增强剂，国内外对多糖做了大量的研究，结果发现，真菌多糖可通过多个层面、多条途径对免疫***发挥调节作用。大量免疫实验证实，多糖能激活T、B淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK)等免疫细胞的活性，此外其还有促进细胞因子的生成和活化补体等各方面的功效。真菌多糖是通过增强机体免疫器官、免疫细胞和免疫分子3个层次的免疫***实现免疫增强作用的^[1]。来源于药用真菌和酵母的β-1,3/1,6-葡聚糖是一种有效的免疫增强剂，人们已经知道了它们在免疫***中的作用方式。此外，β-1,3/1,6-葡聚糖是无毒性的，且它们在所有动物（从无脊椎动物到人）的免疫***中的作用机制是相同的。β-1,3/1,6-葡聚糖不单可以通过注射起作用，还可通过混入饲料投喂起作用。

桦褐孔菌，又名白桦茸，学名Inonotus obliquus，Fuscoporia oblique，欧洲人称之为“chaga”，是一种多孔菌科褐卧孔菌属食药用真菌。桦褐孔菌主要生长于白桦、银桦、榆树、赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上，形成不育的木腐菌，其菌核可以在砍伐后的枯干上生存达6年之久。它主要分布于俄罗斯北部、北欧、中国黑龙江、吉林长白山、日本北海道等北纬45-50°极寒地区。桦褐孔菌子实体一般呈瘤状，直径约25-40 cm，外表坚硬，有深的裂痕，较硬，干时脆，颜色呈黄褐色或更深。

从16世纪以来，桦褐孔菌在俄罗斯、北欧一些国家被广泛用于恶性肿瘤^[2]、糖尿病、心血管疾病、肝病^[3]和艾滋病^[4]等疾病的治疗。在俄罗斯，桦褐孔菌被广泛用作日常保健品。日本的研究人员则称桦褐孔菌为一种“万能药”。在日本，桦褐孔菌的粉末状冲剂经常作为保健茶来饮用。1955年莫斯科医科院(The Medical Academy of Science in Moscow)宣布将桦褐孔菌列为抗癌物质，政府批准桦褐孔菌可用于医药品开发。美国把桦褐孔菌列入“特殊的天然物质”。

桦褐孔菌子实体中富含β-D-葡聚糖和超氧化歧化酶，其含量分别是名贵菌类-红樟菌的30和23倍，超氧化歧化酶的含量是灵芝的55倍。多年来，桦褐孔菌一直作为纯中药在民间用于治疗疾病，桦褐孔菌亦被认为是21世纪的功能性保健食品。临床实验表明：桦褐孔菌没有任何毒副作用，且在治疗糖尿病、预防艾滋病、增强免疫力等方面具有明显的作用^[3]。目前的研究报道表明，桦褐孔菌的主要活性成份有多糖、多酚、甾体、桦褐孔菌素、黑色素、三萜、鞘胺酯类化合物、生物碱、叶酸衍生物、香草酸、丁香酸及γ-羟基苯甲酸等，最近还有报道指出有学者已分离出单宁化合物、类固醇、低分子多酚类及木质素类化合物^[5]。

桦褐孔菌多糖是桦褐孔菌的重要药理活性成分之一，桦褐孔菌的菌丝和菌核中的多糖主要由β-葡聚糖、杂多糖和蛋白复合物组成^[6]。研究表明，桦褐孔菌子实体多糖主要有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖和树胶醛糖等单糖组成。而葡萄糖是主要的单糖，占到了所有单糖组成的70%以上^[7]。单糖间是通过β-(1,3)糖苷键或者β-(1,4)糖苷键连接而成。主链与侧链间以β-(1,6)糖苷键连接。木糖和鼠李糖是桦褐孔菌多糖生物活性贡献最大的单糖^[8]。桦褐孔菌多糖的功能特性主要表现在其子实体多糖能够抑制S180肉瘤的生长^[9]，其菌丝体多糖能有效刺激巨噬细胞分泌IL21、IL26、TNF2A、NO等细胞因子，细胞因子通过调整机体的免疫状态间接地杀伤肿瘤细胞^[10]。此外，桦褐孔菌的水溶性和非水溶性多糖对糖尿病小鼠具有降低血糖的作用，尤其是桦褐孔菌多糖的粗提取液，它的降血糖作用可持续48h。

桦褐孔菌多酚主要由黑色素类物质和牛奶树碱同系物组成^[11]，桦褐孔菌子实体中主要有4-羟基-3,5二甲氧基苯甲酸-2’-羟基-1’-羟甲基乙酸乙酯，原儿茶酸(PCA)，咖啡酸(CA)，3,4-二羟基苯甲醛(DB)，2,5-二羟基-1,3-苯二甲酸(DTA)，紫丁香酸(SA)和3,4-二羟基苯乙烯基丙酮 (DBL)^[11]等小分子酚类，Lee^[12]等人通过对桦褐孔菌子实体进行提取纯化后，得到了六种大分子多酚类化合物，分别是Phelligridin D，Phelligridin E，Phelligridin G，Inonoblin A，Inonoblin B，Inonoblin C。Zheng^[13]等人用发酵罐对桦褐孔菌菌丝体进行液体深层发酵，经过提取分析后发现，桦褐孔菌菌丝体中主要有小分子酚类、糖苷化黄酮、黄酮苷元、多酚等4大类物质。

桦褐孔菌多酚具有抗氧化^[13,14]、抗肿瘤^[16]、护肝^[3]、免疫促进^[11]等功能。近年来报道指出，从桦褐孔菌子实体中提取的儿茶酚，具有显著的基因保护和抗氧化功能^[17]，对一些自由基尤其是DPPH自由基、O₂ ^-自由基和OH自由基均具有较强的清除活性，桦褐孔菌多酚清除氧自由基的清除率达到80%以上，相比D-VC钠和没食子酸丙酯等常用的抗氧化剂具有明显的优势，作为一种天然抗氧化剂具有广阔的应用前景。

桦褐孔菌寄生于桦树上，是极其耐寒的菌种，能在零下69℃的环境下生长，生长期达15年。野生的桦褐孔菌成年菌会吸干桦树的精华，导致树木干枯，故而其自然资源十分稀缺，其价格在国际市场上远胜珍贵药用真菌桑黄。而且目前尚没有有效的方法人工培育菌核和子实体，因此采用液体深层发酵培养菌丝体获得活性成分是一个可行的代替方法。采用液体深层发酵的方法，和传统的真菌培育方法相比，具有生产周期短、成本低、产量质量稳定、产品可以控制等优越性。

发明内容

本发明的目的是在发明人前期公开的技术CN102108371A基础上提供一种优化的液体深层发酵生产桦褐孔菌免疫增强活性物质的工艺，获得的免疫增强活性物质含量更高，活性更好，产品更利于工业化应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种液体深层发酵生产桦褐孔菌免疫增强活性物质的工艺，所述的工艺步骤如下：

（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基中，摇床培养至对数期得液体菌种；

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8-10，所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖30-32g/L，木质纤维素32-38g/L，促进剂0.9-1g/L，诱导剂3×10^-5 g/L，蛋白胨 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01g/L， K₂HPO₄ 0.4g/L，FeSO₄ ·7H₂O 0.05 g/L， MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g/L，CuSO₄ ·5H₂O 0.02 g/L，CoCl₂ 0.01 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.08 g/L，pH值6.0；

液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28℃，发酵罐空气流量0.5-1.0 vvm，发酵罐内部压力0.1-0.25 kg/cm³，搅拌转速70-150转/分钟，发酵周期12-14天；

（4）桦褐孔菌免疫增强活性物质制备：将发酵产物过滤，获得菌丝体和发酵液，将菌丝体超声波破壁，干燥粉碎后得菌丝体粉，将发酵液浓缩至原体积的30%-40%后得发酵浓缩液，按1 g菌丝体粉加30-40 ml发酵浓缩液的比例，将菌丝体粉和发酵浓缩液混合均匀，干燥后得粉状的桦褐孔菌免疫增强活性物质。

随着研究的进行，发明人发现，发明人前期公开的技术（CN102108371A）桦褐孔菌免疫增强活性物质即多糖、多酚的产量及其活性不是很理想，同时对木质纤维素的分解也不是很彻底，因此，发明人对工艺进行了再优化创造，主要体现在培养基的创新上：

在液体深层发酵培养基中添加促进剂，通过增加细胞的通透性和/或直接影响多糖和多酚合酶的产生，达到提高桦褐孔菌液体发酵产物胞外多糖、多酚、黑色素产量的目的，即提高了桦褐孔菌免疫增强活性物质的产量。

在液体深层发酵培养基中同时添加促进剂和木质纤维素，在促进剂的增加细胞透性及多糖、多酚合酶产生的基础上，促进了胞内合成的木质纤维素分解酶（漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶）的分泌，从而加强对培养基中木质纤维素的分解，木质纤维素分解更彻底，达到进一步提高多糖和多酚（桦褐孔菌免疫增强活性物质）产量的目的。特别是使多酚类化合物中的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、phelligridin G、davallialactone、inoscavin B的产率大幅提高。

在液体深层发酵培养基中添加诱导剂，促进了桦褐孔菌多酚类物质（桦褐孔菌免疫增强活性物质的一种）的生物合成。本发明利用诱导剂提高桦褐孔菌发酵多酚、特别是高活性多酚如表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）的产量。

在液体深层发酵培养基中同时添加促进剂和诱导剂，并与木质纤维素配合，在促进剂的增加细胞透性及多酚合酶产生的基础上，添加多酚生物合成的诱导剂，相互协同促进，从而极大促进了桦褐孔菌发酵多糖、多酚类物质的生物合成，木质纤维素分解更彻底达到进一步提高多糖、多酚，特别是高活性多酚如表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）产量的目的，使得获得的桦褐孔菌免疫增强活性物质的活性更好。

菌丝体富含胞内多糖和胞内多酚，发酵液富含胞外多糖及胞外多酚，发明人前期公开的技术（CN102108371A）是对菌丝体、发酵液分别提取处理，从而获得不同的活性物质，这样不但处理复杂，且成本高，不适合工业化应用，且不能发挥胞内多糖和胞内多酚与胞外多糖及胞外多酚的协同功效，本发明对菌丝体破壁后做干燥粉碎处理，对发酵液做浓缩处理，并控制菌丝体粉与发酵浓缩液的配比，这样菌丝体粉与发酵浓缩液混合均匀度好，干燥获得桦褐孔菌免疫增强活性物质，以到达胞内多糖和胞内多酚与胞外多糖及胞外多酚的最佳配比，且混合均匀度好，发挥最佳的功效，这样不但产品的活性、功效好，且处理简单，生产成本低，适合工业化生产，可直接用作各类动物饲料的添加剂使用。

作为优选，所述促进剂为油酸、甲醇或Tween-80。

作为优选，所述诱导剂为苯并噻二唑或茉莉酸甲酯。苯并噻二唑是植物内源性激素类似物水杨酸的功能类似物，能促进多酚类物质的产生，茉莉酸甲酯是天然存在的植物生长调节剂，能促进花青素的生物合成。

作为优选，所述木质纤维素选自农作物秸秆、木屑、花生壳、甘蔗渣中的一种。最优选的方案是在花生壳、甘蔗渣中选择一种作为木质纤维素原料，发明人通过大量研究发明，农作物秸秆、木屑等在作为木质纤维素原料时效果并不理想，这是因为材料本身的特质的限制，然后再经过研究探索后发现，花生壳、甘蔗渣作为木质纤维素原料，其发酵产物中多糖和多酚的活性会较高，木质纤维素的降解也更彻底，推其原因：主要是花生壳、甘蔗渣中木质纤维素的3个组分纤维素、半纤维素和木质素的比例构成更适合桦褐孔菌的降解。

作为优选，所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。

作为优选，斜面菌种培养基上培养的参数为：温度27-28℃，培养200-250小时。

作为优选，所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL。

作为优选，液体菌种培养的参数为：温度27-28℃，培养3.5-4.5d，摇床转速80-140转/分钟。

本发明的有益效果是：

1、在液体深层发酵培养基中添加促进剂，通过增加细胞的通透性和/或直接影响多糖和多酚合酶的产生，达到提高桦褐孔菌液体发酵产物胞外多糖、多酚、黑色素产量的目的，即提高了桦褐孔菌免疫增强活性物质的产量。

2、在液体深层发酵培养基中同时添加促进剂和木质纤维素，在促进剂的增加细胞透性及多糖、多酚合酶产生的基础上，促进了胞内合成的木质纤维素分解酶（漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶）的分泌，从而加强对培养基中木质纤维素的分解，木质纤维素分解更彻底，达到进一步提高多糖和多酚（桦褐孔菌免疫增强活性物质）产量的目的。特别是使多酚类化合物中的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、phelligridin G、davallialactone、inoscavin B的产率大幅提高。

3、在液体深层发酵培养基中添加诱导剂，促进了桦褐孔菌多酚类物质（桦褐孔菌免疫增强活性物质的一种）的生物合成。本发明利用诱导剂提高桦褐孔菌发酵多酚、特别是高活性多酚如表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）的产量。

4、产品的活性、功效好，且处理简单，生产成本低，适合工业化生产，可直接用作各类动物饲料的添加剂使用。

附图说明

图1是本发明发酵产物提取的多糖的促生细胞因子作用图，其中图1（a）TNF：肿瘤坏死因子，图1（b）IFN：干扰素，图1（c）IL-2：白细胞介素-2，图1（d）IL-1β：白细胞介素-1β。

图2是本发明发酵产物提取的多糖的促进巨噬细胞增殖效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

桦褐孔菌市售，购自徐州师范大学。

实施例1

（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上27℃，培养250小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基27℃，摇床上培养4.5d至对数期得液体菌种，摇床转速80转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL。

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27℃，发酵罐空气流量0.5vvm，发酵罐内部压力0.1 kg/cm³，搅拌转速70转/分钟，发酵周期14天；所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖30g/L，玉米秸秆32g/L，油酸1g/L，苯并噻二唑3×10^-5 g/L，蛋白胨 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01g/L， K₂HPO₄ 0.4g/L，FeSO₄ ·7H₂O 0.05 g/L， MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g/L，CuSO₄ ·5H₂O 0.02 g/L，CoCl₂ 0.01 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.08 g/L，pH值6.0；发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2%，镜检发现菌丝体开始衰老。

（4）桦褐孔菌免疫增强活性物质制备：将发酵产物过滤，获得菌丝体和发酵液，将菌丝体超声波破壁，干燥粉碎后得菌丝体粉，将发酵液浓缩至原体积的30%后得发酵浓缩液，按1g菌丝体粉加30ml发酵浓缩液的比例，将菌丝体粉和发酵浓缩液混合均匀，真空干燥后得粉状的桦褐孔菌免疫增强活性物质。

实施例2

（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上28℃，培养200小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基28℃，摇床上培养3.5d至对数期得液体菌种，摇床转速140转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL。

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1: 10，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度28℃，发酵罐空气流量1.0vvm，发酵罐内部压力0.25 kg/cm³，搅拌转速150转/分钟，发酵周期12天；所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖32g/L，花生壳38g/L，甲醇0.9g/L，茉莉酸甲酯3×10^-5 g/L，蛋白胨 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01g/L， K₂HPO₄ 0.4g/L，FeSO₄ ·7H₂O 0.05 g/L， MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g/L，CuSO₄ ·5H₂O 0.02 g/L，CoCl₂ 0.01 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.08 g/L，pH值6.0；发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2%，镜检发现菌丝体开始衰老。

（4）桦褐孔菌免疫增强活性物质制备：将发酵产物过滤，获得菌丝体和发酵液，将菌丝体超声波破壁，干燥粉碎后得菌丝体粉，将发酵液浓缩至原体积的40%后得发酵浓缩液，按1g菌丝体粉加40ml发酵浓缩液的比例，将菌丝体粉和发酵浓缩液混合均匀，冷冻干燥后得粉状的桦褐孔菌免疫增强活性物质。

实施例3

（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上28℃，培养220小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基28℃，摇床上培养4d至对数期得液体菌种，摇床转速100转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL。

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:9，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度28℃，发酵罐空气流量0.8vvm，发酵罐内部压力0.2 kg/cm³，搅拌转速100转/分钟，发酵周期13天；所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖31g/L，甘蔗渣35g/L，Tween-80 1g/L，苯并噻二唑3×10^-5 g/L，蛋白胨 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01g/L， K₂HPO₄ 0.4g/L，FeSO₄ ·7H₂O 0.05 g/L， MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g/L，CuSO₄ ·5H₂O 0.02 g/L，CoCl₂ 0.01 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.08 g/L，pH值6.0，发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2%，镜检发现菌丝体开始衰老。

（4）桦褐孔菌免疫增强活性物质制备：将发酵产物过滤，获得菌丝体和发酵液，将菌丝体超声波破壁，干燥粉碎后得菌丝体粉，将发酵液浓缩至原体积的35%后得发酵浓缩液，按1g菌丝体粉加35ml发酵浓缩液的比例，将菌丝体粉和发酵浓缩液混合均匀，冷冻干燥后得粉状的桦褐孔菌免疫增强活性物质。

按照发明人前期公开的技术CN102108371A的实施例1记载的对于胞外多糖（提取自发酵液）、胞内多糖（提取自菌丝体）、胞外多酚（提取自发酵液）的提取方法，胞内多酚提取方法为：菌丝体加入70%丙酮，用超声波细胞破碎仪破壁。将破壁后的浆液过滤、离心，上清液浓缩、干燥后的产品即为胞内多酚。

对本发明工艺获得的发酵液和菌丝体进行分析，并与CN102108371A（对比例）的数据对比，结果见下表。

由上表可知，通过本发明的改进方法桦褐孔菌液体发酵产物的多糖、多酚含量有显著提高，即提高了桦褐孔菌免疫增强活性物质的产量。木质纤维素分解更彻底，达到进一步提高多糖和多酚（桦褐孔菌免疫增强活性物质）产量的目的。特别是使多酚类化合物中的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、phelligridin G、davallialactone、inoscavin B的产率大幅提高。

产品的活性、功效好，且处理简单，生产成本低，适合工业化生产，可直接用作各类动物饲料的添加剂使用。

以本发明的发酵产物提取的多糖来揭示本发明产品的免疫活性，由图1可以看出，本发明的发酵产物提取的胞外多糖、胞内多糖均表现为促生效果明显，并且随着浓度的增大，这种促生作用加强。由图2可知本发明的发酵产物提取的胞外多糖、胞内多糖均表现为提高巨噬细胞增殖能力的作用。

本发明的产品桦褐孔菌免疫增强活性物质：以100克桦褐孔菌免疫增强活性物质计算，主要包括的成分多糖（胞外+胞内）8-10克，蛋白质15-20 克，多酚（胞外+胞内）2-3 克，黑色素1-2 克。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

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Claims

1.一种液体深层发酵生产桦褐孔菌免疫增强活性物质的工艺，其特征在于：所述的工艺步骤如下：

液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28℃，发酵罐空气流量0.5-1.0vvm，发酵罐内部压力0.1-0.25 kg/cm³，搅拌转速70-150转/分钟，发酵周期12-14天；

（4）桦褐孔菌免疫增强活性物质制备：将发酵产物过滤，获得菌丝体和发酵液，将菌丝体超声波破壁，干燥粉碎后得菌丝体粉，将发酵液浓缩至原体积的30%-40%后得发酵浓缩液，按1g菌丝体粉加30-40ml发酵浓缩液的比例，将菌丝体粉和发酵浓缩液混合均匀，干燥后得粉状的桦褐孔菌免疫增强活性物质。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：所述促进剂为油酸、甲醇或Tween-80。

3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：所述诱导剂为苯并噻二唑或茉莉酸甲酯。

4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：所述木质纤维素选自农作物秸秆、木屑、花生壳、甘蔗渣中的一种。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的工艺，其特征在于：所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。

6.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于：斜面菌种培养基上培养的参数为：温度27-28℃，培养200-250小时。

7.根据权利要求1或2或3或4所述的工艺，其特征在于：所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL。

8.根据权利要求7所述的工艺，其特征在于：液体菌种培养的参数为：温度27-28℃，培养3.5-4.5d，摇床转速80-140转/分钟。