KR20190047655A

KR20190047655A - 차가버섯균 및 그의 응용

Info

Publication number: KR20190047655A
Application number: KR1020187029131A
Authority: KR
Inventors: 린 장; 지아치앙 우; 즈용 딩; 야링 딩; 샤오화 양; 원정 수; 옌옌 황
Original assignee: 인스티튜트 오브 애니멀 사이언스 앤드 베테리너리 메디컬 산동 아카데미 오브 어그리컬쳐 사이언스
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2019-05-08
Also published as: WO2019080454A1; KR102195870B1

Abstract

본 발명은 중국 보통 미생물 균종 보존 관리 센터에 보존되어 있으며, 보존 번호가 CGMCC No. 14549인 차가버섯균(Inonotus obliquus)을 제공한다. 본 발명은 또한 균주의 모종 재배, 진탕 배양, 종자 배양을 통해 종자액을 획득하고, 종자액을 심층 발효시켜 발효액을 획득하며, 발효액을 침전, 농축 단계를 거쳐 발효산물을 획득하는 균주의 심층 발효로 발효산물을 획득하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 상기 차가버섯균 발효산물의 가금 사료 첨가제와 면역 증강제로서의 응용을 더 제공한다. 본 발명이 선별 획득한 차가버섯균 균주는 유전성능이 안정적이고, 생장 속도가 빠르며, 생산량이 높아 심층 발효에 적합하다. 상기 균종으로 획득되는 발효산물을 가금의 일당 사료에 첨가하면 유기체의 생산성을 현저히 강화시킬 수 있고, 유기체의 면역기관의 생장, 비특이성 면역 반응과 특이성 면역 반응을 현저히 강화시킬 수 있으며, 호르몬 등 첨가제의 사용을 효과적으로 감소시키거나 심지어 대체할 수 있고, 가금의 내병 능력을 강화시킬 수 있다.

Description

차가버섯균 및 그의 응용

본 발명은 바이오공학 및 바이오기술 분야에 속하며, 구체적으로 진균 차가버섯균의 발효기술 및 그 발효산물의 가금의 생산, 면역 성능 강화에의 응용에 관한 것이다.

사람들의 생활수준이 향상됨에 따라, 축산물의 품질에 대한 요구가 나날이 증가하고 있고, 최근에는 식품 안전 문제가 끊임없이 발생하고 있어, 전 사회적으로 동물원성 식품 안전에 대한 관심이 전에 없이 높아졌다. 가금류의 역병이 지속적으로 높게 발병하는 배경하에, 어떻게 항생제의 사용을 감소시키거나 심지어 근절하고, 가금의 약물 내성과 기타 독성 부작용을 감소시켜 친환경적고 건강한 가금 양식과 식품 안전을 구현함으로써, 안전하고, 효율이 높으며, 친환경적인 신형 사료 첨가제와 면역 증강제로 약물을 대체할 것인가가 양식업 발전의 가장 중요한 과제가 되었다. 약용 진균은 그 독특한 효과로 인해 신형 사료 첨가제와 면역 증강제의 잠재적 연구 목표가 되었으며, 관련 연구를 통해 이미 진균 추출물 또는 제제가 동물의 생산과 면역성능을 효과적으로 촉진할 수 있음이 밝혀졌다.

차가버섯균(Inonotus obliquus)은 약물 진균의 일종으로서, 다당, 트리테르펜, 스테롤, 총페놀 등 활성 성분을 풍부히 함유하고 있어 일찍이 인류에 의해 위암, 대장암, 심장병, 당뇨병 등 질병에 응용되었으며, 최근 연구에서는 그것의 자실체(子實體)와 추출물이 인류의 항종양, 항산화, 면역조절, 혈당강하, 항바이러스, 항세균, 항기생충 등 방면에도 독특한 치료 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나 차가버섯균의 품종은 현존하는 것이 드물고, 자실체 형성이 매우 적기 때문에, 야생 자원이 매우 제한적이다. 진균 균주의 선별 육성 및 인공 배양은 양질의 차가버섯균을 획득하는 중요한 수단이나, 장기간의 탐색을 거친 후에도 시종 혁신적인 진전을 얻지는 못하였다. 발효공학 기술의 진보는 자원 난제의 해결을 가능하게 하였다. 진균의 발효는 일반적으로 심층 발효 기술을 이용하며, 이는 통기(通氣) 공정 기술의 개선을 기초로 미생물 세포를 액체 기질에 담아 배양함으로써, 다량의 균사체 및 기타 대사물질을 획득하는 방법이다. 심층 발효에 적합한 진균은 이하 특징을 지녀야 한다: (1) 균사체 단백질 함량이 풍부하면서 액체의 통기 조건하의 배양에 적응할 수 있다; (2) 생장속도가 빠르고 생산율이 높다; (3) 안정적인 유전 특성과 감별 가능한 형태 특징을 지닌다. 이와 동시에, 동종 진균의 상이한 균주는 심층 발효 배양의 적응 능력에 차이가 있기 때문에, 진균의 심층 연구와 제품 개발을 실시하기 위해 먼저 해결해야 할 문제는 바로 적합한 균주의 선별에 있다.

차가버섯균은 효과가 뛰어나나, 단 적합한 균주 선별 가능 여부 및 신형 사료 첨가제와 면역 증강제의 개발을 위해 그 발효산물이 가금의 생산과 면역 성능을 향상시킬 수 있는지 여부는 아직 명확하지 않다.

심층 발효에 적합한 차가버섯균의 균주가 희소하고 가금 양식의 안전성, 고효율성, 친환경성 신형 사료 첨가제가 부족한 점 등의 문제에 대하여, 본 발명의 첫 번째 목적은 심층 발효에 적합한 차가버섯균을 제공하고자 하는데 있고; 본 발명의 두 번째 목적은 상기 차가버섯균 발효산물의 제조방법을 제공하고자 하는데 있으며; 본 발명의 세 번째 목적은 차가버섯균 발효산물의 가금 생산성 강화에의 응용을 제공하고자 하는데 있고; 본 발명의 네 번째 목적은 면역 증강제로서 차가버섯균 발효산물의 가금류의 면역 성능 강화에의 응용을 제공하고자 하는데 있다.

상기 목적을 구현하기 위하여, 본 발명은 다음과 같은 기술방안을 채택하였다.

차가버섯균(Inonotus obliquus) YU, 중국 보통 미생물 균종 보존 관리 센터에 보존되어 있으며, 보존 번호는 CGMCC No. 14549이고; ITS 서열은 SEQ No.1을 참조한다.

상기 차가버섯균 발효산물을 획득하는 방법은 이하 단계를 포함한다.

(1) 모종(母種) 재배: 차가버섯균을 시험관 사면에 접종 배양하여 모종을 획득하는 단계;

(2) 진탕 배양: 모종을 액체 배지에 접종 배양하여 접종액을 획득하는 단계;

(3) 종자 배양: 접종액을 종자탱크 중의 액체 배지 내에 접종하고, 통기 교반 발효시켜 종자액을 획득하는 단계;

(4) 심층 발효: 종자액을 발효탱크의 액체 배지 내에 접종하고, 통기 교반 발효시키는 단계;

(5) 침전: 발효액을 침전조로 이송한 후 응집제를 투입하고, 침전 후 여과시켜 상청액을 획득하는 단계;

(6) 농축: 상청액을 진공 농축탱크로 옮긴 후 일정 밀도까지 농축시켜 발효산물을 획득하는 단계.

상기 액체 배지는 이하 성분(g/L): 전분 10, 펩톤 10, 포도당 15, 인산이수소칼륨 1, 황산마그네슘 0.5 비타민 B1 0.1, 대두유 0.2를 포함하며; 선택적으로, 액체 배지의 pH는 6.8-7.4이다.

선택적으로, 단계 (1)에서, 사면은 감자 포도당 한천 배지(PDA)이고, 배양 온도는 25-28℃이며, 배양 시간은 5-7일이다.

선택적으로, 단계 (2)에서, 접종은 모종(母種)의 균사체 또는 포자 현탁액이며; 균사체인 것이 바람직하다.

선택적으로, 배양 온도는 25-28℃이고; 배양 시간은 3-10일이며; 진탕 속도는 150-200r/min이다.

선택적으로, 단계 (2)에서, 모종은 다단계 진탕 배양을 거쳐 접종액을 획득하고; 2단계 이상의 진탕 배양 접종량은 8-15%이며; 모종은 2단계 배양을 거쳐 접종액을 획득하는 것이 바람직하다.

선택적으로, 단계 (3)과 단계 (4)에서, 접종량은 8-15%이고; 탱크 중 액체의 총 부피는 발효조 용량의 50-80%이며; 배양 온도는 25-28℃이고; 배양 시간은 7-15일이며; 교반 속도는 100-200r/min이고; 통기량은 0.1-0.5vvm이다.

선택적으로, 단계 (3)에서, 접종액은 다단계 종자 배양을 거쳐 종자액을 획득하며; 접종액은 2단계 배양을 거쳐 종자액을 획득하는 것이 바람직하다.

단계 (5)에서 상기 응집제는 키토산이고, 바람직한 첨가량은 발효액 중량의 0.05-0.2%이다.

바람직하게는, 단계 (5) 중의 발효액의 생물량(biomass)은 20g/L 이상이다.

바람직한 방안으로서, 침전 전 가열하여 일정 시간 동안 유지하며; 더욱 바람직하게는, 가열 온도는 70-95℃이고; 보온 시간은 4-6h이다.

선택적으로, 단계 (6)에서 상대 밀도가 1.035-1.065에 이르도록 농축시킨다.

바람직하게는, 단계 (6) 이후 농축액을 고체로 건조시키는 단계를 더 포함한다.

상기 방법으로 제조된 차가버섯균 발효산물의 가금 사료 첨가제와 면역 증강제로서의 응용.

선택적으로, 차가버섯균 발효산물의 가금 사료 중에의 첨가량은 0.2-2wt%이고; 0.8wt%인 것이 가장 바람직하다.

선택적으로, 차가버섯균 발효산물의 가금류 음용수에의 첨가량은 0.1-5wt%이고, 0.5-2.0wt%인 것이 바람직하다.

상기 방법으로 제조된 차가버섯균 발효산물이 함유된 가금류 사료와 면역 증강제.

본 발명에서 선별 획득한 차가버섯균 YU 균주는 유전성능이 안정적이고, 생장속도가 빠르며, 생산량이 높아 심층 발효에 적합하여, 심층 발효 균종으로 사용할 수 있다. 상기 균종으로 획득되는 발효산물을 가금 사료에 첨가하면 유기체의 생산 성능을 현저히 강화시킬 수 있고, 가금의 평균 일당 증체량이 효과적으로 향상되며, 사료 소모율과 사료 요구율을 저하시킬 수 있다. 본 발명이 제공하는 발효산물은 가금의 고효율 양식을 구현하고, 생산 원가를 낮출 수 있으며; 호르몬, 항생물질 등 첨가제의 사용을 효과적으로 감소시키거나 심지어 대체할 수 있다. 이와 동시에, 면역기관 지수의 향상, 말초혈 임파세포 증식 분화 능력의 강화, 항체 및 중화항체 역가의 증가, 세포인자 함량의 향상 및 공격바이러스 보호율의 개선을 포함하는 비특이성 면역 관련 지표의 향상, 유기체의 면역기관 생장, 비특이성 면역 반응 및 특이성 면역반응을 현저히 강화시킬 수 있다.

도 1은 차가버섯균 발효산물의 사육이 닭의 일당 증체량에 미치는 영향이다.
도 2는 차가버섯균 발효산물의 사육이 닭의 사료 요구율에 미치는 영향이다.
도 3은 황기 다당과 차가버섯균 발효산물의 사육이 닭의 일당 증체량에 미치는 영향이다.
도 4는 황기 다당과 차가버섯균 발효산물의 사육이 닭의 사료 요구율에 미치는 영향이다.
도 5는 차가버섯균 발효산물이 면역기관 지수에 미치는 영향이다(21일).
도 6은 차가버섯균 발효산물이 면역기관 지수에 미치는 영향이다(42일).
도 7은 차가버섯균 발효산물이 총항산화 능력에 미치는 영향이다.
도 8은 차가버섯균 발효산물이 과산화물 디스뮤타아제에 미치는 영향이다.
도 9는 차가버섯균 발효산물이 혈청 라이소자임에 미치는 영향이다.
도 10은 HI 항체 검출 결과이다.
도 11은 중화항체 검출 결과이다.
도 12는 IL-2 검출 결과이다.
도 13은 IL-4 검출 결과이다.
도 14는 IFN-γ 검출 결과이다.
도 15는 IFN-γ/IL-4 검출 결과이다.
균종 보존 정보
차가버섯균(Inonotus obliquus)은 2017년 9월 5일 중국 보통 미생물균종 보존 관리 센터에 보존된 것으로, 보존 주소는 베이징(北京)시 차오양(朝陽)구 베이천시(北辰西)로 1호원 3호 중국 북경 중국 과학원 미생물 연구소이고, 보존 번호는 CGMCC No. 14549이다.

이하 실시예와 첨부도면을 결합하여 본 발명에 대해 좀 더 구체적으로 설명하나, 단 본 발명은 하기 실시예의 제한을 받지 않는다.

실시예 1 : 차가버섯균의 분리 동정

차가버섯균 JX주는 허베이(河北)성 과학원 생물연구소로부터 도입하였으며, 이미 차가버섯균으로 감정된 것이다. 차가버섯균 YU주는 야생 균주로서, 윈난(云南)성 다리(大理)시에서 채집되었다. 채집 시 병충해가 없는 자실체를 수목의 표면에서 수목 표층으로부터 1-3cm 깊이로 채집하고, 표본상자에 담아 실험실로 돌아와 다음 단계의 분리와 정제를 실시하였다. 균종 분리는 주름버섯(agaric) 분리법을 이용하여, 먼저 증류수로 자실체 표면의 나무 부스러기 및 이물질을 제거한 다음, 75% 에탄올로 표면을 소독하고, 슈퍼 클린벤치로 이송한 후 자실체를 쪼개, 심부 조직을 무균 상태로 취한 다음, 신속하게 로즈벤갈 고체 배지에 담아, 항온 인큐베이터(28℃)에서 3일 동안 배양한 후, 정제된 균을 PDA 고체 배지로 옮기고, 균락의 생장 상황을 매일 관찰하였다. 이후 개량 CTAB법으로 추출된 차가버섯균 게놈을 템플릿으로 하고, ITS-rDNA 범용 프라이머 ITS1：5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'와 ITS2：5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'를 특이성 프라이머로 하여 PCR 증폭을 실시하고, 균주의 동정을 실시하였다. 증폭으로 획득된 ITS 서열은 SEQ No.1과 같으며, 이는 GeneBank 중의 차가버섯균(DQ103883) ITS-rDNA 서열과 99% 이상의 동원성을 지녀, 분리된 야생균을 차가버섯균으로 판정하고 YU주라 명하였다. 상기 균주는 2017년 9월 5일 중국 보통 미생물 균종 보존 관리 센터에 보존되었으며, 보존 번호는 CGMCC No.:14549이다.

실시예 2: 차가버섯균 발효산물의 획득

액체 배지의 제조: 액체 배지 용량에 따라, 각각 이하 성분(g/L): 펩톤 10, 포도당 15, 인산이수소칼륨 1, 황산마그네슘 0.5 비타민 B₁ 0.1, 대두유 0.2를 계량하고, 멸균수를 필요한 부피만큼 보충하여 pH를 7.0으로 조정하고, 121℃에서 30min 동안 멸균하여 준비해둔다.

(1) 모종 재배: 실시예 1에서의 차가버섯균이 보존된 균종을 시험관 사면의 감자 포도당 한천 배지(PDA)에 2회 옮겨 접종하며, 매 회 25℃ 조건하에서 7일 동안 활성화시킨 것을 모종(母種)으로서 준비해둔다.

(2) 진탕 배양: 모균을 500mL의 1급 배양액에 옮겨 담고 10일 동안 배양한 후, 2급 배양액에 옮겨 계속 5일 동안 배양하며, 진탕기의 온도는 28℃이고, 회전속도는 180r/min이며, 배양 종료 후 소량의 배양물을 취하여 현미경 검사 후 잡균이 없으면 다음 단계로 진입한다.

(3) 종자 배양: 10%의 양에 따라 액체 종균을 7L의 액체 배지에 접종하고 10L의 발효탱크에 장입하여 25℃에서 10일 동안 통기 배양한 다음, 이를 70L의 액체 배지가 담긴 100L 발효탱크로 옮겨 담고, 25℃에서 10일 동안 통기 혼합 배양한다.

(4) 심층 발효: 발효물을 700kg의 액체 배지가 담긴 1000kg의 발효탱크로 옮겨, 25℃에서 10일 동안 통기 혼합 배양한다.

(5) 침전: 발효탱크 내의 생물량이 20g/L로검출되면, 발효를 중지하고, 발효탱크를 90도로 승온시켜 4시간 동안 보온한 다음, 발효액을 침전탱크로 옮겨 담고, 0.1%의 발효액 중량의 키토산을 첨가하여 48시간 동안 침전시키고, 플레이트 프레임 필터를 이용하여 상청액을 여과한다.

(6) 농축: 상청액을 진공 농축탱크로 옮겨 농축시켜, 상대밀도가 1.035로 측정되면 발효산물의 제조가 완료된 것이며, 분리 포장한다.

실시예 3: 차가버섯균의 심층 발효 성능

실시예 1 중의 차가버섯균 YU와 JX균종을 실시예 2에서의 단계 (1)-(4)에 따라 심층 발효를 실시하고, 각각 발효액 각 100mL를 취하여 원심분리한 후, 침전물을 수집하고, 이온제거수로 수세 후 다시 원심분리하였으며, 3회 반복 후 침전물을 수집하고, 105℃의 조건하에 건조시키고 계량하여 생물량을 측정하였다. 결과는 표 1과 같으며, 표 1의 데이터를 통해 알 수 있듯이, 균주 YU주의 발효 지표가 가장 우수하고, 균사 형태가 우수하며, 생장활성이 강하고, 생물량 증가가 뚜렷하였으며; JX주는 생장이 거의 보이지 않아 심층 발효에 부적합 것으로 나타났다.

상이한 균주의 액체 배양 결과

균주	잡균 유무	균사 형태	?생물량（g/L）
YU	무	균사가 두껍고，내부가 충실하다	28.43
JX	무	균사가 적교 비교적 가늘다	2.15

실시예 4: 차가버섯균 발효산물의 가금 생산 성능 강화

4.1 상이한 첨가량의 차가버섯균 발효산물이 닭의 일당 증체량과 사료 요구율에 미치는 영향

1일령의 SPF 닭 40마리를 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ군으로 나누고, 그 중 Ⅰ-Ⅳ군은 실시예 2에서의 차가버섯균 발효산물을 0.2%, 0.4%, 0.8%, 2%의 첨가량으로 사료에 각각 첨가하였으며, 나머지 그룹은 대조군으로, 일당 사료에 차가버섯균 발효산물을 첨가하지 않았다. 각각 격리장치에서 42일 동안 사육하였으며, 사육 기간 동안 자유롭게 취식하게 하였다. 각각 7, 14, 21, 28, 35, 42일째에 닭의 체중을 측정하고, 체중 측정 전 12h 동안 금식시켰다. 닭의 체중 증가 및 소모된 사료량을 계산하여 상이한 시기의 평균 일당 증체량, 평균 일당 취식량 및 사료 요구율을 구하였으며, 그 계산 방식은 다음과 같다:

평균 일당 증체량(ADG) = (기간 말기 중량 - 기간 시작 중량)/사육일수

평균 일당 취식량(ADFI) = 기간 총 사료 소모량/사육일수

사료 요구율(F/G) = 평균 일당 취식량/평균 일당 증체량

측정 시간을 횡좌표로 하고, 증체량을 종좌표로 하여 도 1을 제작하였고; 측정 시간을 횡좌표로 하고, 사료 요구율을 종좌표로 하여 도 2를 제작하였다. 결과는 평균 증체값 지표에서, 대조군과 비교해보면, 21일 이전에는 첨가 농도가 다른 차가버섯균 발효물이 닭의 체중증가에 모두 촉진효과가 있었고; 21일 이후, Ⅱ군을 제외한 기타 그룹의 체중증가 효과가 여전히 대조군보다 높은 것으로 나타났다. 사료 요구율 지표 방면에서, 각 그룹의 사료 요구율은 모두 대조군보다 낮았으며, 이는 차가버섯균 첨가물이 사료효율을 효과적으로 높일 수 있음을 나타낸다. 결론적으로, 본 발명의 차가버섯균 발효산물은 가금의 생산성을 강화시킬 수 있으며, 0.8%의 첨가 농도 효과가 가장 바람직하다.

4.2 차가버섯균 발효산물과 황기 다당이 닭의 일당 증체량과 사료 요구율에 미치는 영향

황기 다당은 현재 연구가 비교적 심층적으로 이루어지고 있고, 사용이 비교적 광범위한 중요 다당류 면역 증강제이다. 연구에서, 사료에 적당한 농도의 황기 다당을 첨가하면 가금의 생산성을 강화시킬 수 있음이 밝혀졌다. 차가버섯균이 가금의 생산성을 강화시키는 방면의 효과를 보다 직관적으로 구현하기 위하여, 황기 다당을 참조로 하여 양자의 비교 연구를 실시하였다.

실험군을 그룹당 1일령의 SPF 닭 20마리씩 2그룹(Ⅰ과 Ⅱ)과 대조군 1그룹(Ⅲ)으로 설치하였다. Ⅰ군은 사료에 0.8% 농도의 차가버섯균 발효산물을 첨가하고, Ⅱ군은 사료에 황기 다당(베이징 CENTRE 과기주식유한공사, 권장 사료 첨가량 0.2%)을 첨가하였다. 실험 방법은 4.2에 설명한 바와 같으며, 측정 시간을 횡좌표로 하고, 증체량을 종좌표로 하여 도 3을 제작하였고; 측정 시간을 횡좌표로 하고, 사료 요구율을 종좌표로 하여 도 4를 제작하였다. 결과는 2종의 첨가물이 모두 각 실험 기간의 평균 체중 증가를 촉진하고 사료 소모량 및 사료 요구율을 저하시킬 수 있는 것으로 나타났으나, 단 서로 비교해보면, 차가버섯균의 효과가 더욱 뚜렷하여, 42일의 실험기간 내에, 차가버섯균 발효물 그룹의 증체량 평균이 황기 다당 그룹보다 9.67mg 높았으며, 사료 요구율 평균은 즉 0.156만큼 낮아졌다.

실시예 5: 차가버섯균 발효산물의 가금의 면역 증강에 대한 효과

황기 다당은 동물의 면역력을 현저히 향상시킬 수 있다. 차가버섯균 발효물의 가금의 면역 성능 강화 효과를 더욱 잘 비교하기 위하여, 황기 다당을 양성대조군으로 선택하고, 2종 제제의 효과에 대해 비교를 실시하였다. 동물 실험은 그룹당 1일령의 SPF 닭 20마리씩 총 7개 그룹(Ⅰ-Ⅶ)으로 나누어, 각각 격리장치에서 사육하였다. Ⅰ-Ⅴ군은 각각 0.2%, 0.4%, 0.8%, 1%, 2%의 실시예 2에서의 차가버섯균 발효산물을 함유한 사료를 공급하였고, Ⅵ군은 무처치 그룹(사료에 면역 증강제를 첨가하지 않았다)이며, Ⅶ군은 0.2%의 황기 다당(베이징 CENTRE 과기주식유한공사, 권장 사료 첨가량 0.2%)을 함유한 사료를 공급하였다. 사육기간은 24일이며, 기간 동안 자유롭게 취식하게 하였다.

각각 사육 21일째 및 42일째에 면역기관(흉선, 비장과 파브리시우스낭) 지수 측정을 실시하였다: 닭의 체중을 잰 후 각 그룹당 3마리를 도살하여, 각각 흉선, 비장과 파브리시우스낭을 채집하고 무게를 측정한 후, 면역기관 지수(%)=면역기관 질량/생체 질량 ×100%의 계산 공식에 따라 면역기관 지수를 획득하였다. 면역기관 지수를 종좌표로 하여 두 실험군의 흉선, 비장과 파브리시우스낭의 막대그래프를 제작하였으며, 21일째의 결과는 도 5이고, 42일째의 결과는 도 6을 참조한다. 또한, 7, 14, 21, 28, 35 및 42일째에 각 실험군마다 5마리씩 말초혈을 분리하고, 3000r/min으로 10min 동안 원심분리로 혈청을 분리하여, 총항산화능력(T-AOC), 과산화물 디스뮤타아제(SOD), 혈청 라이소자임(LSZ)을 측정하였으며, 도 7에 도시된 바와 같이, 밀리리터당 혈청 중의 T-AOC 단위수를 종좌표로 하여 T-AOC의 막대그래프를 제작하고; 도 8 및 도 9에 도시된 바와 같이, 밀리리터당 혈청 중 효소 함량을 종좌표로 하여 SOD, LSZ의 막대그래프를 제작하였다.

결과는 21일령일 때, 상이한 농도의 차가버섯균 발효산물이 면역기관의 발육을 현저하게 촉진시킬 수 있는 것으로 나타났다. 흉선 지수에서, 음성대조군보다 낮고 양성대조군보다 높은 Ⅴ군을 제외하고, 나머지 그룹은 모두 양성 및 음성 대조군보다 높으며; 각 실험군의 비장 지수는 모두 양성 및 음성대조군보다 현저히 높고; 파브리시우스낭 지수는 비장 지수와 비슷하며, 차이는 단지 양성대조군이 음성대조군보다 높다는데 있다. 횡방향으로 비교해보면, Ⅱ그룹의 각 면역기관 지수가 모두 가장 높았으며, 이 시기에 기관 발육의 촉진이 가장 현저하였다. 42일령일 때, Ⅱ-Ⅴ군의 흉선 지수는 각각 52%, 51%, 51% 및 43%에 달하여, 기타 그룹과의 차이가 뚜렷하였고(P<0.05); Ⅱ와 Ⅳ의 비장 지수는 기타 그룹보다 뚜렷하게 높았으며; 파브리시우스낭 지수에서, Ⅲ군은 0.7에 달하여 기타 그룹과 차이가 뚜렷하였다(P<0.05). 총체적으로 살펴보면, Ⅰ군의 지수가 음성대조군보다 약간 높은 것을 제외하고, 기타 첨가 농도 그룹은 면역기관의 발육을 촉진시키는 효과가 현저할 뿐만 아니라, 양성대조군보다 우수하다.

기관조직 중의 총항산화 능력은 유기체의 항산화 작용을 반영하는 중요 지표 중의 하나이고, 과산화물 디스뮤타아제는 유기체의 핵심적인 항산화 효소로서, 생물체의 체내 산화와 항산화 균형에 중요한 역할을 한다. 이 두 지표의 측정은 어느 정도 유기체의 비특이성 면역 내의 변화를 반영할 수 있다. 체내 라이소자임은 주로 호중성 백혈구, 단핵세포 및 대식세포 라이소좀으로부터 생성되기 때문에, 관련 세포가 활성화되었을 때, 라이소자임의 함량이 상응하게 증가할 수 있다. T-AOC, SOD와 LSZ의 측정 결과, 차가버섯균 발효물 농도가 0.8% 미만일 때(Ⅰ-Ⅲ군), T-AOC 값이 사육 시간에 따라 상승하는 추세를 나타내었고, 농도가 높을수록 변화가 뚜렷한 것으로 나타났다. 차가버섯균 발효물의 첨가 농도가 계속 증가함에 따라(Ⅳ와 Ⅴ군), T-AOC값이 저하되었으며, 또한 42일째의 T-AOC값은 21일째의 수치보다 낮게 나타났다. 이는 차가버섯균 발효물을 저농도(0.8%)로 첨가 시, 닭 체내의 총항산화 능력이 농도와 정적 상관관계를 나타내고, 첨가량이 1%를 초과하는 경우 효과가 떨어지는 것을 설명한다. 음성대조군과 비교하여, 차가버섯균 발효물을 첨가한 각 그룹의 SOD는 모두 뚜렷하게 상승하였으며; 양성대조군과 비교하여, Ⅲ군, Ⅳ군과 Ⅴ군의 효과가 더욱 높았고, 그 중 Ⅲ군의 효과가 가장 우수하였다. 종방향으로 비교해보면, 21일째의 SOD는 42일째보다 높으며, 각 그룹의 추세는 동일하다. 상이한 시간점에서 차가버섯균 발효물을 첨가한 그룹의 LSZ는 모두 음성대조군보다 높았다. 차가버섯균 발효물 농도가 0.8% 이하일 때, LSZ는 약물 농도가 증가함에 따라 상승하였고; 약물 농도가 0.8% 이상일 때, 약물 농도가 증가함에 따라 하강하였다. 종방향 비교는 마찬가지로 21일째의 함량이 42일째보다 높다.

면역기관 지수와 비특이성 면역 지수를 종합해보면, 0.8%의 차가버섯균 발효물 첨가 농도가 최적의 작용 농도이며, 이와 동시에, 황기 다당의 작용 효과보다도 현저히 우수하다.

이후 선별된 차가버섯균 발효물의 최적의 작용 농도를 이용하여 유기체의 말초혈 임파세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 증식 분화 효과에 미치는 영향을 측정하였다. 20마리의 1일령 SPF 닭을 3그룹으로 나누고, 그 중 한 그룹은 사료에 차가버섯균 발효산물을 0.8%의 첨가량으로 첨가하였고(H군), 한 그룹은 황기 다당을 0.2%의 첨가량으로 첨가하였으며(Q군), 제3그룹은 대조군으로서, 일당 사료에 어떠한 약품도 첨가하지 않았다. 각각 분리장치에서 사육하였으며, 사육 기간은 42일이고, 기간 동안 자유롭게 취식하게 하였다. 각각 21과 42일째에 3그룹의 닭의 말초혈을 채집하고 임파세포를 분리하여, PBMC 밀도를 10⁷개/mL로 조정한 후 96웰 플레이트에 웰당 100μL씩 투입하였다. 이어서 각 웰에 10μL의 작용 농도가 2μg/mL인 ConA를 투입하고, 고르게 혼합한 후 37℃, 5%의 CO₂ 항온조에 담아 배양시키고, 음성대조 웰(등량의 PBS 첨가)과 무세포 무처리대조 웰을 설치하여, 각 샘플마다 6웰을 중복하였다. 마지막으로 엘리사 분석기로 OD₄₉₀값을 독취하여 평균값을 계산하고, 자극지수(stimulation index, SI)를 하기 공식에 따라 계산하였다:

SI=（OD_실험군-OD_{무처리 대조군}）/（OD_{음성대조군}-OD_{무처리대조군}）

결과는 표 2, 표 3과 같이, 2개의 시간점에서, 실험군의 자극지수가 대조군보다 뚜렷하게 높아 3.48에 달하였으며, 이는 발효산물이 임파세포의 증식과 활성화를 효과적으로 촉진할 수 있음을 나타낸다.

21일령 PBMC의 자극지수

	H군	Q군	대조군	음성	무처리
OD ₄₉₀	1.306	1.169	0.862	0.862	0.683
SI	3.480	2.7151	1.000	\	\

42일령 PBMC의 자극지수

	H군	Q군	대조군	음성	무처리
OD ₄₉₀	3.765	2.553	1.507	1.507	0.437
SI	3.110	1.9776	1.000	\	\

이어서 백신의 면역을 결합하여 차가버섯균 발효물과 황기 다당이 백신의 면역 강화 효과를 비교 연구하였다. 뉴캣슬병 불활화 백신을 예로 들면, 21일령의 SPF 닭을 그룹당 10마리씩, 일당 사료에 차가버섯균 발효산물+백신 면역을 첨가한 그룹(H+V군)과, 차가버섯 발효산물을 첨가하지 않은 백신 면역 그룹(V군) 및 면역을 하지 않고 차가버섯균 발효산물도 첨가하지 않은 그룹(C군)의 3그룹으로 나누었다. 21일령에게 NDV 불활화 백신으로 1차 면역을 실시하고, 3주 간격으로 1회 더 면역을 강화하였으며, 마리당 0.2mL씩 경부 피하주사하였다. 1차 면역 후 3d, 7d, 14d, 21d, 28d, 35d에 말초혈을 채집하고 혈청을 분리한 후, 혈액응고 억제 실험을 이용하여 항체 역가(HI)를 측정하고, 고정 바이러스로 혈청을 희석하는 방법을 이용하여 7d, 14d, 21d, 28d, 35d의 중화항체 역가를 측정하였다. ELISA 키트를 이용하여 세포 인자(IL-2, IL-4, IFN-γ)의 발현량을 측정하였으며, 측정 방법은 키트 설명서 대로 실시하였다. HI 검출 결과는 도 10을 참조하며, 중화항체 검출 결과는 도 11을 참조한다. IL-2, IL-4, IFN-γ과 IFN-γ/IL-4의 검출 결과는 도 12-15와 같다.

결과는, C군 및 V군과 비교하여, 차가버섯균을 사육한 그룹의 항체는 매 측정 시간점마다 모두 2-3개의 역가가 높았고, 황기 다당 그룹(Q+V군, 면역 및 황기 다당 사육)과 비교해도 1-2개의 역가가 높았다. 중화항체 역가의 경우, H+V군과 Q+V군의 강약 구분이 더욱 뚜렷하여, Q+V군의 중화항체는 V군과 대체로 일치하였으나, H+V군의 중화항체는 일찍 상승하고 또한 기타 그룹보다 현저히 높았다. 이는 차가버섯균 발효산물의 체액 면역 향상 효과가 시판화 제품보다 현저하다는 것을 나타낸다.

세포 인자는 세포의 생장 분화 조절, 면역 기능, 염증 반응 및 상처 유합 참여 기능을 지니며, 면역 응답 유형에 따라 세포인자를 Th1형과 Th2형으로 구분할 수 있다. Th1형은 IL-2, IFN-γ, 종양괴사인자(TNF) 등을 포함하며, 주로 세포가 유도하는 면역 반응에 의해 생성된다. Th2는 즉 IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 등 B세포 활성화 과정에서 생성되는 세포 인자를 포함한다. 면역 응답 과정에서, IL-2는 세포 면역의 중요 지표로서, 이는 Thp 세포가 Th0 세포로 분화되도록 자극하며, Th0는 또한 IL-2, IL-4와 IFN-γ 등 세포 인자를 분비한다. 따라서 통상적으로 IL-2로 Th의 반응 강도를 판단하고, IL-4로 체액의 면역 수준을 판단하며, IFN-γ로 세포 면역 수준을 판단함과 동시에, IFN-γ/IL-4의 비율로 Th1/Th2 세포의 균형 상태를 반영한다. 결과를 통해 알 수 있듯이, 차가버섯균 발효물과 황기 다당은 모두 IL-2, IL-4와 IFN-γ의 발현 및 IFN-γ/IL04의 비율을 촉진시킬 수 있으며, 양자의 차이가 크지 않으나, 단 H+V군이 약간 높다. 이는 체액의 면역을 양호하게 촉진시킬 수 있다는 전제하에, 차가버섯균 발효물이 세포 면역을 강화시키는 효과가 더 현저하며, 실험 후기에 세포 면역이 Th2형으로부터 Th1형으로 전환되도록 효과적으로 촉진시킬 수 있어, 황기 다당의 효과보다 더욱 우수하고, 더욱 전면적인 면역 증강제 역할을 할 수 있음을 설명한다.

35일째에 NDV 맹독성 바이러스로 바이러스 공격을 실시하여, 각 그룹의 백신의 보호력을 측정하였다. 바이러스 공격 3일 이후 C군의 닭은 식욕부진, 깃털이 부스스해지며 정신이 혼미해지는 현상이 뚜렷하였고, 전부 사명하였으며(5/5); 5일 후, V군에서 2마리가 사망하였고(2/5), Q+V군에서는 1마리가 사망하였으며(1/5), H+V군에서는 사망이 없었다(0/5). 따라서, 차가버섯균 면역 증강제는 백신의 면역 효력을 효과적으로 향상시켜, 실험 동물을 완전하게 보호할 수 있었으며, 그 작용 효과가 현저하여, 황기 다당보다 우수하다는 것을 알 수 있다.

<110> Institute of Animal Science and Veterinary Medicine Shandong Academy of Agriculture Science <120> Strainm of Inonotus obliquues and its use <130> PI180058CN <150> CN 2017109902921 <151> 2017-10-23 <150> CN 2017109904221 <151> 2017-10-23 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 798 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Inonotus obliquus <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgagtttat tttgaaatcg aggggcctgt 60 gctggcacgg aaacgtttgc atgtgcacgg cctttcgtgc tcaaatccaa ctctcaaacc 120 cctgtgcacc tatacaagtt gaaggtctta gtagtttctg taatcgaacg gcaagtcaag 180 tacgtcgagt aatcaagtac gagggtttcg gcccttggaa agtgtgaaag atggaaaggc 240 aagcttcaga gacaaggaga cgaaaagctt ttggcttcat tacaaacacc aatataattg 300 ttatgtgaat gaaatgctcc ttgtgggcga taataaatac aactttcaac aacggatctc 360 taggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat 420 tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcacc ttgcgcccct tggtattccg aggggcatgc 480 ctgtttgagt gtcatgttaa tctcaaatcg ctcgtctatt cttaattgaa gtggctttcg 540 atttggactt ggaggttttg ctggcccggg cgactttggt tgcccttggt ttgtcggctc 600 ctctcaaata cattagctgg actttggttc gcgtttacgg tgtaataatg taatgttcac 660 taagacgctt gcctaacaag tctgcttcta atagtcctta agttggacaa ggatcccttc 720 gttgggcctt cttgacacct ttgacctcaa atcaggtagg attacccgct gaacttaagc 780 atatcaataa gcggagga 798

Claims

중국 보통 미생물 균종 보존 관리 센터에 보존되어 있으며, 보존 번호가 CGMCC No. 14549인 차가버섯균(Inonotus obliquus).
제1항의 상기 차가버섯균의 발효산물을 획득하는 방법에 있어서,
(1) 모종(母種) 재배: 차가버섯균을 시험관 사면에 접종 배양하여 모종을 획득하는 단계;
(2) 진탕 배양: 모종을 액체 배지에 접종 배양하여 접종액을 획득하는 단계;
(3) 종자 배양: 접종액을 종자탱크 중의 액체 배지 내에 접종하고, 통기 교반 발효시켜 종자액을 획득하는 단계;
(4) 심층 발효: 종자액을 발효탱크의 액체 배지 내에 접종하고, 통기 교반 발효시키는 단계;
(5) 침전: 발효액을 침전탱크로 이송한 후 응집제를 투입하고, 침전 후 여과시켜 상청액을 획득하는 단계;
(6) 농축: 상청액을 진공 농축탱크로 옮긴 후 일정 밀도까지 농축시켜 발효산물을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 차가버섯균의 발효산물을 획득하는 방법.
제2항에 있어서,
단계 (3)과 단계 (4)에서, 접종량은 8-15%이고; 통기량은 0.1-0.5vvm인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (2)-(4)에서, 액체 배지는 이하 성분(g/L): 전분 10, 펩톤 10, 포도당 15, 인산이수소칼륨 1, 황산마그네슘 0.5 비타민 B₁ 0.1, 대두유 0.2를 포함하며; pH는 6.8-7.4인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제2항에 있어서,
단계 (5) 중의 발효액의 생물량은 20g/L 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제2항에 있어서,
단계 (5) 중 응집제는 키토산인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
단계 (5)에서 침전 전 발효액 가열 과정을 더 포함하며, 가열 온도는 70-95℃이고; 보온 시간은 4-6h이며;
단계 (6) 이후 농축액을 고체로 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항 내지 제7항 중의 어느 한 방법으로 제조되는 차가버섯균 발효산물의 가금 사료 첨가제와 면역 증강제로서의 응용.
제8항에 있어서,
차가버섯균 발효산물의 가금 사료 중에의 첨가량은 0.2-2wt%이고; 차가버섯균 발효산물의 가금류 음용수에의 첨가량은 0.1-5wt%인 것을 특징으로 하는 응용.
제2항 내지 제7항 중의 어느 한 방법으로 제조되는 차가버섯균 발효산물을 함유한 가금 사료 첨가제와 면역 증강제.