CN107550946A - 一种家禽免疫增强剂的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种家禽免疫增强剂，包含桦褐孔菌（Inonotus obliquus）的发酵产物，所述桦褐孔菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14549。上述桦褐孔菌发酵产物在家禽饲料中的添加量为0.2‑2wt%；在家禽饮水的添加量为0.1‑5wt%。用本发明的桦褐孔菌发酵产物饲喂家禽，能够显著增强机体的免疫器官生长、非特异性免疫反应和特异性免疫反应，包括免疫器官指数的提高、非特异性免疫相关指标的提升、外周血淋巴细胞增殖分化能力的增强、抗体和中和抗体滴度的增长、细胞因子含量的提升，为禽类疫病的防控提供了新的工具。

Description

一种家禽免疫增强剂的制备及应用

技术领域

本发明属于生物工程和生物技术领域，具体涉及真菌桦褐孔菌的发酵技术及其发酵产物在增强家禽免疫性能中的应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，对于畜产品的质量要求日益增强，近年来食品安全问题的不断显现，更是让全社会对动物源性食品安全的重视达到了前所未有的高度。如何在禽类疫病持续高发的背景下减少甚至杜绝抗生素的使用、降低禽类耐药性和其他毒副作用，实现禽类的绿色健康养殖和食品安全，寻找安全、高效、绿色新型饲料添加剂和免疫增强剂代替药物成为养殖业发展的重中之重。药用真菌以其独特的功效成为新型免疫增强剂的潜在研究目标，相关研究已表明真菌提取物或制剂能够有效促进动物的免疫性能。

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）作为药用真菌的一种，富含多糖、三萜、甾醇、总酚等活性成分，早已被人类应用于胃癌、肠癌、心脏病、糖尿病等疾病，近期研究显示其子实体和提取物在人类抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、降血糖、抗病毒、抗细菌、抗寄生虫等方面也有独特的疗效。但桦褐孔菌品种现存较少，也很少形成子实体，故野生资源十分有限。进行真菌的菌株选育及人工培育是获得优质桦褐孔菌的重要手段，但经长期探索，始终没能取得突破性进展。发酵工程技术的进步使资源难题的破解成为可能。真菌的发酵一般采用深层发酵技术，它是在通气工艺技术的改进的基础上将微生物细胞置于液体底物里进行培养，以此获得大量菌丝体及其他代谢物质。适合深层发酵的真菌应具有以下特点：（1）菌丝体蛋白质含量丰富且适应液体通气条件下的培养；（2）生长速度快且高产；（3）具有稳定的遗传特性和可鉴别的形态特征。同时，同种真菌的不同菌株对深层发酵培养的适应能力存在差异，所以要进行真菌的深层研究和产品开发首先要解决的问题就是适宜菌株的筛选。

桦褐孔菌功效显著，但发酵产物能否作为免疫增强剂提高禽类免疫性能，相关研究及产品的报道很少甚至空白。

发明内容

针对目前缺乏安全、高效、绿色新型免疫增强剂等问题，本发明的目在于提供一种桦褐孔菌发酵产物作为免疫增强剂在增强家禽免疫性能中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种家禽免疫增强剂，包含桦褐孔菌（Inonotus obliquus）的发酵产物，所述桦褐孔菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 14549。

所述桦褐孔菌（Inonotus obliquus）的发酵产物，采用以下方法制备：

（1）母种培育：将桦褐孔菌接种于试管斜面上培养得到母种；

（2）摇瓶培养：将母种接种于液体培养基培养，得到接种液；

（3）种子培养：将接种液接种于种子罐中的液体培养基内，通气搅拌发酵获得种子液；

（4）深层发酵：将种子液接种于发酵罐的液体培养基内，通气搅拌发酵；

（5）沉淀：将发酵液转入沉淀罐，加入絮凝剂，沉淀后过滤，得上清液；

（6）浓缩：将上清液转入真空浓缩罐，浓缩至一定密度出料，即得发酵产物。

所述桦褐孔菌发酵产物的相对密度为1.035-1.065。

所述液体培养基包括以下组分（g/L）：淀粉10，蛋白胨10，葡萄糖15，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，维生素B₁ 0.1，豆油0.2；可选地，液体培养基的pH为6.8-7.4。

可选地，步骤（1）中，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度为25-28℃，培养时间为5-7天。

可选地，步骤（2）中，接种为母种的菌丝体或孢悬液；优选为菌丝体。

可选地，培养温度为25-28℃；培养时间为3-10天；摇床转速为150-200转/分钟。

可选地，步骤（2）中，母种经多级摇瓶培养获得接种液；二级及以上摇瓶培养的接种量为8-15%；优选地，母种经二级培养获得接种液。

可选地，步骤（3）和步骤（4）中，接种量为8-15%；罐中液体总体积为发酵罐容量的50-80%；培养温度为25-28℃；培养时间为7-15天；搅拌转速为100-200转/分钟；通气量为0.1-0.5vvm。

可选地，步骤（3）中，接种液经多级种子培养获得种子液；优选地，接种液经二级培养获得种子液。

步骤（5）中所述絮凝剂为壳聚糖，优选的添加量为发酵液重量的0.05-0.2%。

优选地，步骤（5）中发酵液的生物量为20g/L以上。

作为优化，沉淀前加热并保持一段时间；更为优化地，加热温度为70-95℃；保温时间为4-6h。

可选地，步骤（6）浓缩至相对密度为1.035-1.065。

优选地，步骤（6）之后还包括将浓缩液干燥成固体的步骤。

一种上述桦褐孔菌发酵产物作为家禽免疫增强剂的应用。

可选地，桦褐孔菌发酵产物在家禽饲料中的添加量为0.2-2wt%；最优选为0.8wt%。

可选地，桦褐孔菌发酵产物在家禽饮水的添加量为0.1-5wt%，优选为0.5-2.0wt%。

本发明的有益效果：本发明的桦褐孔菌发酵产物饲喂家禽，能够显著增强机体的免疫器官生长、非特异性免疫反应和特异性免疫反应，包括免疫器官指数的提高、非特异性免疫相关指标的提升、外周血淋巴细胞增殖分化能力的增强、抗体和中和抗体滴度的增长、细胞因子含量的提升，为禽类疫病的防控提供了新的工具。

附图说明

图1为桦褐孔菌发酵产物对免疫器官指数的影响（21天）；

图2为桦褐孔菌发酵产物对免疫器官指数的影响（42天）；

图3为桦褐孔菌发酵产物对总抗氧化能力的影响；

图4为桦褐孔菌发酵产物对超氧化物歧化酶的影响；

图5为桦褐孔菌发酵产物对血清溶菌酶的影响；

图6为HI抗体检测结果；

图7为中和抗体检测结果；

图8为IL-2检测结果；

图9为IL-4检测结果；

图10为IFN-γ检测结果；

图11为IFN-γ/IL-4检测结果。

菌种保存信息

桦褐孔菌（Inonotus obliquus），于2017年9月5日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保存编号为CGMCC No. 14549。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 桦褐孔菌的分离鉴定。

桦褐孔菌YU株为野生菌株，采集自云南省大理市。采集时将无病虫害的子实体从树木表面取下，采集深度为树木表层1-3厘米，装入标本盒中返回实验室进行下一步的分离与纯化。分离菌种采用伞菌分离法，先用蒸馏水去掉子实体表面木屑及杂质，再用75%乙醇进行表面消毒，转入超净台后掰开子实体，并无菌剖取深部组织，迅速放入虎红固体培养基，置于恒温培养箱（28℃）中培养3天，后将纯化的菌转入PDA固体培养基中，每日观察菌落生长状况。随后以改良CTAB法提取的桦褐孔菌基因组为模板，ITS-rDNA通用引物ITS1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’和ITS2：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’为特异性引物进行PCR扩增，进行菌株的鉴定。扩增获得的ITS序列如SEQ No. 1所示，其与GeneBank中的桦褐孔菌（DQ103883）ITS-rDNA序列具有99%以上的同源性，判定分离的野生菌为桦褐孔菌（Inonotus obliquus），并名为YU株。该菌株于2017年9月5日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保存编号为CGMCC NO. 14549。

实施例2 桦褐孔菌发酵产物的获得。

制备液体培养基：根据液体培养基用量，分别称取下列组分（g/L）：蛋白胨10、葡萄糖15、磷酸二氢钾1、硫酸镁0.5、维生素B₁ 0.1、豆油0.2，灭菌水补至所需体积，调整pH至7.0，121℃灭菌 30min，备用。

（1）母种培育：将桦褐孔菌保存的菌种接种于试管斜面马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）中，转接2次，每次在25℃条件下活化7天，为母种，备用；

（2）摇瓶培养：将母菌转于500mL一级培养液中，培养10天，然后转入二级培养液，继续培养5天，摇床温度28℃，转速180转/分，培养结束取少量培养物进行显微镜镜检，无杂菌进入下步；

（3）种子培养：按10%的量将液体种菌接种于7L液体培养基并装入10L发酵罐中，25℃通气培养10天，再将其转入装有70L液体培养基的100L发酵罐中，25℃通气混合培养10天；

（4）深层发酵：将发酵物转入装有700kg液体培养基的1000kg发酵罐中，25℃通气混合培养10天；

（5）终止培养：检测发酵罐内生物量达20g/L时，停止发酵，将发酵罐升温到90度，保温4小时，终止发酵；

（6）沉淀：将发酵液转入沉淀罐，加入壳聚糖，沉淀48小时，用半框过滤器过滤上清液；

（7）浓缩：将上清液转入真空浓缩罐进行浓缩，测得相对密度为1.035时完成发酵产物的制备，分装。

实施例3 桦褐孔菌发酵产物对家禽的免疫增强效果。

黄芪多糖是目前研究较为深入、应用较为广泛的中药提取物，它能够显著提升动物的免疫力。为了更好的比较桦褐孔菌发酵物增强家禽免疫性能的效果，选取黄芪多糖为阳性对照，并对两种制剂的效果进行比较。动物试验共分为7个组（Ⅰ-Ⅶ），每组1日龄SPF鸡20只，分别饲养于隔离器中。Ⅰ-Ⅴ组分别饲喂含0.2%、0.4%、0.8%、1%、2%实施例2中桦褐孔菌发酵产物的饲料，Ⅵ组为空白对照组（饲料中不添加免疫增强剂），Ⅶ组饲喂含0.2%黄芪多糖（购自生泰尔公司，建议添加量为0.2%）的饲料作。饲养期42天，期间自由采食。

分别于饲喂的第21天和42天进行免疫器官（胸腺、脾脏和法氏囊）指数的测定：鸡称重后进行宰杀，每组3只，分别采集胸腺、脾脏和法氏囊并称重，按照免疫器官指数（%）=免疫器官质量/活体质量×100%的计算公式得到免疫器官指数。以免疫器官指数为纵坐标作两实验组胸腺、脾脏和法氏囊的柱状图，21天结果见图1，42天结果见图2。另外，在第7、14、21、28、35和42天对各试验组5只鸡进行外周血的分离，经3000r/min 离心10min分离血清，用于总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、血清溶菌酶（LSZ）的测定，以每毫升血清中的T-AOC单位数为纵坐标作T-AOC的柱状图，如图3所示；以每毫升血清中酶含量为纵坐标作SOD、LSZ的柱状图，如图4和图5所示。

结果表明，21日龄时，不同浓度桦褐孔菌发酵物能够显著促进免疫器官的发育。在胸腺指数中，除组低于阴性对照而高于阳性对照外，其余各组均高于阳性和阴性对照；各试验组的脾脏指数均显著高于阳性和阴性对照；法氏囊指数与脾脏指数相似，区别仅在于阳性对照高于阴性对照。横向比较，Ⅱ组各免疫器官指数均最高，在此时期促进器官发育最为显著。42日龄时，Ⅱ-Ⅴ组的胸腺指数分别达到52%、51%、51%和43%，与其他组差异显著（P<0.05）；Ⅱ和Ⅳ的脾脏指数明显高于其他组；而法氏囊指数中，Ⅲ组达到0.7，与其他组差异显著（P<0.05）。总体来看，除Ⅰ组的指数稍高于阴性对照外，其他添加浓度组促进免疫器官发育的效果显著，且优于阳性对照。

器官组织中的总抗氧化能力是反映机体抗氧化作用的重要指标之一，而超氧化物歧化酶作为机体关键性抗氧化酶，对生物体体内氧化与抗氧化平衡起着重要的作用。这两个指标的测定在一定程度上能够反映机体非特异性免疫里的变化。体内溶菌酶主要来自嗜中性白细胞、单核细胞及吞噬细胞溶酶体，所以当相关细胞被激活时，溶菌酶的含量会相应增加。T-AOC、SOD和LSZ的测定结果显示，当桦褐孔菌发酵物浓度低于0.8%时（Ⅰ-Ⅲ组），T-AOC值随饲喂时间呈现升高的趋势，且浓度越高变化越显著。随着桦褐孔菌发酵物添加浓度的继续增加（Ⅳ和Ⅴ组），T-AOC值有所降低，且42天时的T-AOC值表现低于21天的数值。表明在桦褐孔菌发酵物低浓度（0.8%）添加时，鸡体的总抗氧化能力与浓度呈正相关，而添加量超过1%时效果有所下降。与阴性对照相比，添加了桦褐孔菌发酵物各组的SOD均有明显提升；相较于阳性对照，Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组的效果更强，其中Ⅲ组效果最好。纵向比较，21天的SOD要高于42天的，各组趋势相同。在不同时间点，添加了桦褐孔菌发酵物组的LSZ均高于阴性对照。当桦褐孔菌发酵物浓度不高于0.8%时，LSZ随药物浓度的增加而升高；当药物浓度高于0.8%时，随药物浓度的增加而降低。纵向比较同样是21天的含量要高于42天。

综合免疫器官指数和非特异性免疫指标，0.8%的桦褐孔菌发酵物添加浓度是其最佳工作浓度，同时也显著优于黄芪多糖的作用效果。

然后利用筛选的桦褐孔菌发酵物最佳工作浓度，测定了其对机体外周血淋巴细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)增殖分化效果的影响。将30只1日龄SPF鸡分为3组，其中一组在饲料中添加桦褐孔菌发酵产物（H组），添加量为0.8%，一组添加黄芪多糖（Q组），添加量为0.2%，第三组为对照组，日粮中不添加任何药品。分别饲养于隔离器中，饲养期42天，期间自由采食。分别于21和42天无菌采集三组鸡的外周血并分离淋巴细胞，将PBMC密度调整至10⁷个/mL后加入96孔板，每孔100μL。随后每孔加入10μL工作浓度为2μg/mL的ConA，混匀后置于37℃、5% CO₂恒温箱培养，并设置阴性对照孔（加等量的PBS）和无细胞空白对照孔，每样品重复6孔。最后在酶标仪上读取OD₄₉₀值并计算均值，刺激指数（stimulation index, SI）按如下公式进行计算：

SI=（OD_试验组-OD_空白对照）/（OD_阴性对照-OD_空白对照）

结果如表1、表2所示，在两个时间点，试验组的刺激指数明显高于对照，可达到3.48，表明发酵产物能有效促进淋巴细胞的增殖、活化。

表1 21日龄PBMC的刺激指数

。

表2 42日龄PBMC的刺激指数

。

接下来结合疫苗的免疫进行了桦褐孔菌发酵物与黄芪多糖增强疫苗免疫效果的对比研究。以新城疫灭活疫苗为例，将21日龄SPF鸡分为在日粮中添加桦褐孔菌发酵产物+疫苗免疫组（H+V组）、不添加桦褐孔菌发酵产物疫苗免疫组（V组）和不免疫且不饲喂桦褐孔菌发酵产物组（C组）3组，每组10只。21日龄进行NDV灭活疫苗首免，间隔3周再加强免疫一次，颈部皮下注射，每支鸡0.2mL。于首免后3d、7d、14d、21d、28d、35d采集外周血，分离血清，利用血凝抑制试验测定抗体滴度（HI），并利用固定病毒稀释血清的方法测定7d、14d、21d、28d、35d中和抗体效价；利用ELISA试剂盒测定细胞因子（IL-2，IL-4，IFN-γ）的表达量，测定方法按照试剂盒说明书进行。HI检测结果见图6，中和抗体检测结果见图7。IL-2，IL-4，IFN-γ和IFN-γ/IL-4检测结果如图8-11所示。

结果显示，与C组和V组相比，饲喂桦褐孔菌组的抗体在每个测定时间点均高出2-3个滴度，而与黄芪多糖组（Q+V组，免疫且饲喂黄芪多糖）比较，也高出1-2个滴度。对于中和抗体效价，H+V组与Q+V组强弱区分更加明显：Q+V组的中和抗体与V组基本一致，而H+V组的中和抗体提升早且显著高于其他组。表明桦褐孔菌发酵物提升体液免疫的效果较市场化产品更为显著。

细胞因子具有调节细胞生长分化、免疫功能、参与炎症反应和创伤愈合的功能，根据免疫应答类型可将细胞因子分为Th1型和Th2型。Th1型包括IL-2、IFN-γ、肿瘤坏死因子（TNF）等，主要由细胞介导的免疫反应所产生，Th2型则包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-12等B细胞激活过程中产生的细胞因子。在免疫应答过程中，IL-2是细胞免疫的重要指标，它刺激Thp细胞向Th0细胞分化，Th0又分泌IL-2、IL-4和IFN-γ等细胞因子，故通常以IL-2衡量Th反应强度，IL-4衡量体液免疫水平，IFN-γ衡量细胞免疫水平，同时以IFN-γ/IL-4的比值反应Th1/ Th2细胞的平衡状态。由结果可知，桦褐孔菌发酵物和黄芪多糖均能够促进IL-2、IL-4和IFN-γ的表达及IFN-γ/IL-4的比值，两者差异不大，但H+V组稍高，表明在能够很好的促进体液免疫的前提下，桦褐孔菌发酵物还能显著增强细胞免疫的效果，在试验后期有效促进细胞免疫从Th2型向Th1型转化，是比黄芪多糖效果更佳、作用更全面的免疫增强剂。

35天时利用NDV强毒进行攻毒，以测定各组疫苗的保护力。攻毒3天后C组鸡只明显食欲不振，羽毛蓬松，精神萎靡，并全部死亡（5/5）；5天后，V组有2只鸡死亡（2/5），Q+V组有1只鸡死亡（1/5），H+V组无死亡（0/5）。可见，桦褐孔菌免疫增强剂能够有效提升疫苗的免疫效力，为试验动物提供完全的保护，其作用效果显著，优于黄芪多糖。

<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

秦皇岛高通生物科技有限公司

<120> 一种家禽免疫增强剂的制备及应用

<130> 20170915

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> Inonotus obliquus

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgagtttat tttgaaatcg aggggcctgt 60

gctggcacgg aaacgtttgc atgtgcacgg cctttcgtgc tcaaatccaa ctctcaaacc 120

cctgtgcacc tatacaagtt gaaggtctta gtagtttctg taatcgaacg gcaagtcaag 180

tacgtcgagt aatcaagtac gagggtttcg gcccttggaa agtgtgaaag atggaaaggc 240

aagcttcaga gacaaggaga cgaaaagctt ttggcttcat tacaaacacc aatataattg 300

ttatgtgaat gaaatgctcc ttgtgggcga taataaatac aactttcaac aacggatctc 360

taggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat 420

tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcacc ttgcgcccct tggtattccg aggggcatgc 480

ctgtttgagt gtcatgttaa tctcaaatcg ctcgtctatt cttaattgaa gtggctttcg 540

atttggactt ggaggttttg ctggcccggg cgactttggt tgcccttggt ttgtcggctc 600

ctctcaaata cattagctgg actttggttc gcgtttacgg tgtaataatg taatgttcac 660

taagacgctt gcctaacaag tctgcttcta atagtcctta agttggacaa ggatcccttc 720

gttgggcctt cttgacacct ttgacctcaa atcaggtagg attacccgct gaacttaagc 780

atatcaataa gcggagga 798

Claims (4)

1.一种家禽免疫增强剂，其特征在于，包含桦褐孔菌（Inonotus obliquus）的发酵产物；所述桦褐孔菌（Inonotus obliquus），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 14549。

2.根据权利要求1所述的家禽免疫增强剂，其特征在于，桦褐孔菌发酵产物，采用以下方法制备：

（1）母种培育：将桦褐孔菌接种于试管斜面上培养得到母种；

（2）摇瓶培养：将母种接种于液体培养基培养，得到接种液；

（3）种子培养：将接种液接种于种子罐中的液体培养基内，通气搅拌发酵获得种子液；

（4）深层发酵：将种子液接种于发酵罐的液体培养基内，通气搅拌发酵；

（5）沉淀：将发酵液转入沉淀罐，加入絮凝剂，沉淀后过滤，得上清液；

（6）浓缩：将上清液转入真空浓缩罐，浓缩至一定密度出料，即得发酵产物。

3.根据权利要求1所述的桦褐孔菌发酵产物，其特征在于，相对密度为1.035-1.065。

4.一种如权利要求1所述的家禽免疫增强剂在增强家禽免疫中的应用，其特征在于，桦褐孔菌发酵产物在家禽饲料中的添加量为0.2-2wt%；在家禽饮水的添加量为0.1-5wt%。