CN105624133A - 一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺 - Google Patents

一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺，以桦褐孔菌为发酵菌种，采用液体深层发酵法，以木质纤维素基质为主要发酵原料，配合促进剂、诱导剂协同发挥作用，从而发酵获得木质纤维素降解酶。本发明具有发酵时间短、不容易感染杂菌、木质纤维素降解酶易于提取纯化等优点。

Description

一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，特别涉及一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺。
背景技术
木质纤维素是植物通过光合作用产生的主要生物质，它占总生物产量的60％以上。是自然界中含量最多的可用于食品、能源、医药的有机可再生资源。木质纤维素大量存在于各种农作物废弃物、纸屑、木屑和果壳中，是一种价格低廉可循环利用、来源丰富的资源。有效的利用这些资源是将碳转化为能源、食物和其他化学品的良好方式。
木质纤维素是生物圈最为丰富的天然高分子化合物，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素是由103-104个β-D-吡喃型葡萄糖单体通过β-1,4糖苷键联接而成的链状高分子聚合物。半纤维素是由高度分枝的杂多糖链组成，以木聚糖和葡聚糖为主。木质素是由多个苯丙烷单体组成的高分子芳香族类聚合物，它们相互之间通过C-O-C键和C-C键连接而成，苯丙烷单体的结构和连接键非常复杂，这使得木质素结构不容易被破坏，木质素在纤维素的降解中起到天然的屏障作用。木质素和半纤维素通过共价键的形式连接，而纤维素被木质素和半纤维素屏蔽在里面，因此，要想利用纤维素必须先破坏木质素，也就是预处理。对木质纤维素进行预处理必须满足以下要求：去除或改变木质素，降低纤维素结晶度，增加纤维素的可及表面积，提高纤维素的利用率；促进糖的形成，避免糖降解或损失；降低能量需求和成本投入。
在木质纤维素原料预处理中，对木腐菌木质纤维素降解酶的研究是目前国际热点。木腐菌包含三大类即软腐菌、褐腐菌、白腐菌，褐腐菌主要攻击对象是纤维素，而白腐菌和软腐菌攻击纤维素和木质素。白腐菌(whiterotfungi)是指着生在木材上，菌丝穿入木质，侵入木质细胞腔内，能释放降解木质素和其他木质组分的酶，以降解木材中的木质素、纤维素、半纤维素，引起木质白色腐烂的丝状真菌的集合。白腐菌的种类很多，绝大多数为担子菌，少数为子囊菌。属于担子菌门(Basidiomycota)，包括非褶菌(Aphyllophorales)、伞菌(Agaricales)等200多个品系。白腐菌是目前已知的自然界中唯一能彻底降解木质纤维素的微生物。
利用白腐菌专一性地降解木质素，以去除木质素和半纤维素(木质纤维素中最易被降解的成分)对纤维素的包裹，达到提高纤维素或半纤维素的可及度，并在纤维素酶和半纤维素酶的作用下降解纤维素和半纤维素，是目前木质纤维素生物转化和利用的最有潜力的途径之一。在自然界中，白腐菌能够产生木质素水解酶系，将木质素降解为CO2，并在木质纤维素的结晶区暴露出纤维素和半纤维素，再由多糖(纤维素、半纤维素)水解酶系降解纤维素和半纤维素。纤维素降解酶是一个复杂的酶***，主要包括三类酶：内切β-1,4-葡聚糖酶；外切葡聚糖酶；β-葡萄糖苷酶。半纤维素可以被降解为单糖和乙酸。半纤维素降解酶是内切-β-1,4-木聚糖酶和β-1,4-木糖苷酶，此外，半纤维素的降解还需要木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶、***呋喃糖酶和乙酰酯酶等辅助酶的作用。木质素降解酶主要有三类，即：木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)，此外，还包括乙二醛氧化酶和芳基醇氧化酶等。
黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)是最早被发现、其木质纤维素降解酶被研究最多的木质素降解白腐菌，大部分的固态发酵研究集中在黄孢原毛平革菌的降解作用和应用。近年来，研究发现其他白腐菌如Lentinusedodes(香菇)，Pycnoporuscinnabarinus,Crinipellissp.RCK-1,Ceriporiopsissubvermispora,Phlebiabrevispora,Pleurotusostreatus在培养中产生木质纤维素降解酶，并对木质素的降解具有选择性。只有很少的白腐菌种类能同时产生三种酶，一些仅产生两种甚至一种，根据文献3对87种白腐菌的列表显示，大部分的白腐菌都能产生漆酶Lac(E.C.1.10.3.2)，其次是锰过氧化物酶MnP(E.C.1.11.1.13)，例如作为选择性降解木质素的模型白腐真菌Ceriporiopsissubvermispora、Dichomitussqualens、Pleurotusostreatus都只产生Lac和MnP，而不产生木质素过氧化物酶Lip，只有很少的白腐菌能产生LiP(E.C.1.11.1.14)，实际上，在天然木质纤维素上白腐菌LiP的表达很难检测。研究表明不同来源植物的木质素需要不同比例的三种酶来提高降解效率。尽管漆酶是研究最多的木质素降解酶，但是漆酶仅能直接氧化酚型木质素单体，这类木质素单体仅构成少于10％的天然木质素聚合物。相反，木质素过氧化物酶是迄今为止最有效的氧化剂木质素降解酶，能够催化酚型或非酚型化合物、芳香氨、芳香酯和多环芳香碳氢化合物的氧化降解。因此，新发现能产生Lip的白腐菌、以及促进白腐菌两种或以上木质素降解酶的同时产生和酶活力的方法是研究方向之一。
目前对一些白腐菌(不包括桦褐孔菌)培养基和培养条件优化包括(1)木质纤维素基质类型：不同木质纤维素材料的木质素、半纤维素、纤维素三个组分的比例和物理、化学结构的不同会造成白腐菌降解不同类型木质纤维素效率上的差异。(2)碳氮源：它们影响白腐菌的生长和降解酶的产生和分泌，而且为了提高性价比，应尽可能选择价格便宜的碳氮源。(3)营养限制：有研究认为限制碳氮源能促进降解酶的产生，有的研究结论是营养限制不起作用，矛盾的结果可能源于不同的木质纤维素材料和白腐菌。(4)诱导剂的作用：金属离子如铜促进漆酶的产生、锰促进锰过氧化物酶的产生。一些小分子化合物如酚酸类化合物，黄酮类化合物，以及作为底物的化合物能促进木质素降解酶的产生。
桦褐孔菌，又名白桦茸，学名Inonotusobliquus，Fuscoporiaoblique，是一种多孔菌科褐卧孔菌属食药用白腐真菌。桦褐孔菌主要生长于白桦、银桦、榆树、赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上，形成不育的木腐菌，其菌核可以在砍伐后的枯干上生存达6年之久。桦褐孔菌子实体一般呈瘤状，直径约25-40cm，外表坚硬，有深的裂痕，较硬，干时脆，颜色呈黄褐色或更深。主要分布于俄罗斯北部、北欧、中国黑龙江、吉林长白山、日本北海道等北纬45-50°极寒地区，是极其耐寒的菌种，能在零下69℃的环境下生长，生长期达15年。
野生的桦褐孔菌成年菌会吸干桦树等寄主的精华，导致树木干枯，故而其自然资源十分稀缺，其价格在国际市场上远胜珍贵药用真菌桑黄。而且目前尚没有有效的方法人工培育菌核和子实体，因此采用液体深层发酵培养菌丝体获得活性成分或酶是一个可行的代替方法。采用液体深层发酵的方法，和传统的真菌培育方法相比，具有生产周期短、成本低、产量质量稳定、产品可以控制等优越性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺，具有发酵时间短、不容易感染杂菌、木质纤维素降解酶易于提取纯化等优点。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺，包括如下步骤：
(1)菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；
(2)液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基中，摇床培养至对数期得液体菌种；
(3)液体深层发酵：将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8-10，所述液体深层发酵培养基的配方为：玉米粉2-6g/L，木质纤维素基质40-48g/L，促进剂1.2-1.5g/L，诱导剂5×10-5-9×10-5g/L，蛋白胨2.3-2.5g/L，酵母粉1.2-1.5g/L，KH2PO40.8-1g/L，Na2HPO40.2-0.4g/L，MgSO4·7H2O0.5-0.6g/L，pH值6.0；
液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28℃，发酵罐空气流量0.5-1.0vvm，发酵罐内部压力0.1-0.25kg/cm3，搅拌转速70-150转/分钟，发酵时间3-11天；
(4)桦褐孔菌木质纤维素降解酶制备：发酵结束后，将发酵产物过滤，获得发酵液，在发酵液中加硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20wt％，离心10-15分钟后收集上清液，再往上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为80wt％，离心15-25分钟后收集沉淀，沉淀溶解在醋酸-醋酸钠缓冲液中，透析，冷冻干燥。硫酸铵的作用是纯化木质纤维素降解酶。
本发明首次以桦褐孔菌为发酵菌种，采用液体深层发酵法，以木质纤维素基质为主要发酵原料，配合促进剂、诱导剂协同发挥作用，从而发酵获得木质纤维素降解酶。本发明针对木质纤维素降解酶的发酵生产，开发了上述特定的液体深层发酵培养基的配方，并调整了发酵参数，从而实现了木质纤维素降解酶的发酵生产过程。
作为优选，步骤(3)中所述木质纤维素基质选自小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、山核桃壳、桦树枝、椰子壳、竹屑、香蕉皮、石榴皮中的一种或几种。更为优选，木质纤维素基质选自山核桃壳、桦树枝、椰子壳、竹屑、香蕉皮、石榴皮中的一种，这些木质纤维素基质生产木质纤维素降解酶的发酵效果更佳。
作为优选，步骤(3)中所述促进剂为乙醇、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、曲拉通(Triton-100)、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸中的一种或几种。
作为优选，步骤(3)中所述诱导剂为没食子酸、(+)儿茶素、黎芦醇、2.2-连氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸、硫酸铜中的一种或几种。
作为优选，步骤(4)中醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)的浓度为20-25mmol/L。作为优选，所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40g/100mL，蛋白胨4g/100mL，琼脂10g/100mL，pH值为5.4-5.6。
作为优选，斜面菌种培养基上培养的参数为：温度27-28℃，培养200-250小时。
作为优选，所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖5g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母浸膏0.1g/100mL，KH2PO40.1g/100mL，MgSO40.15g/100mL，CaCl20.01g/100mL。
作为优选，液体菌种培养的参数为：温度27-28℃，培养3.5-4.5d，摇床转速80-140转/分钟。
本发明的有益效果是：
1、桦褐孔菌在液体深层发酵培养基中产生木质纤维素降解酶，包括木质素降解酶(漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶)、半纤维素降解酶(木聚糖降解酶、甘露聚糖降解酶)、纤维素降解酶(纤维素全酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶、β-葡萄糖苷酶)。相比于固态发酵培养，液体深层发酵产生桦褐孔菌木质纤维素降解酶具有发酵时间短、不容易感染杂菌、木质纤维素降解酶易于提取纯化等优点。
2、在液体深层发酵培养基中添加木质纤维素基质，刺激桦褐孔菌利用木质纤维素基质作为后续碳源，从而促进木质纤维素降解酶的生物合成和分泌，达到提高桦褐孔菌液体发酵胞外木质纤维素降解酶产率和酶活性的目的，特别是在不同的木质纤维素基质作用下，三类酶会在不同发酵时间达到最大酶活性，可以根据需要选择合适的木质纤维素基质产生某一类降解酶。
3、在液体深层发酵培养基中添加促进剂，通过增加细胞的通透性和/或直接影响木质纤维素降解酶的生物合成和分泌，达到提高桦褐孔菌液体发酵胞外木质纤维素降解酶产率和酶活性的目的。特别是在不同的促进剂作用下，三类酶会在不同发酵时间达到最大酶活性，可以根据需要选择合适的促进剂产生某一类降解酶。
4、在液体深层发酵培养基中同时添加木质纤维素基质和促进剂，在促进剂的增加细胞透性及木质纤维素基质降解产物作为后续碳源的刺激下，促进了胞内的木质纤维素分解酶的产生和分泌，达到进一步提高木质纤维素降解酶产率和酶活性的目的。特别是在不同的木质纤维素基质和促进剂作用下，三类酶会在不同发酵时间达到最大酶活性，可以根据需要选择合适的木质纤维素基质和促进剂产生某一类降解酶。
5、在液体深层发酵培养基中添加木质素降解酶的底物类似物作为诱导剂，促进了液体发酵桦褐孔菌木质素降解酶的生物合成。本发明利用诱导剂提高桦褐孔菌发酵木质素降解酶的产率和活性。
6、液体发酵桦褐孔菌木质素纤维素降解酶的活性强、功效好，且处理简单，生产成本低，适合工业化生产，可直接用作各类木质纤维素基质降解使用。
附图说明
图1是本发明液体发酵桦褐孔菌三种木质素降解酶、半纤维素降解酶、三种纤维素降解酶在发酵过程中的产酶规律。
图2是本发明在液体培养基中添加山核桃壳，作为木质纤维素基质，桦褐孔菌三种木质素降解酶、半纤维素降解酶、三种纤维素降解酶在发酵过程中的产酶规律。
图3是本发明在液体培养基中添加竹屑作为木质纤维素基质，桦褐孔菌三种木质素降解酶、半纤维素降解酶、三种纤维素降解酶在发酵过程中的产酶规律。
图4是本发明在液体培养基中添加竹屑作为木质纤维素基质，同时添加乙醇作为促进剂和(+)儿茶素作为诱导剂，桦褐孔菌三种木质素降解酶、半纤维素降解酶、三种纤维素降解酶在发酵过程中的产酶规律。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
桦褐孔菌市售，购自江苏省微生物研究所菌种保藏库。
一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺，包括如下步骤：
(1)菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；
(2)液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基中，摇床培养至对数期得液体菌种；
(3)液体深层发酵：将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8-10，所述液体深层发酵培养基的配方为：玉米粉2-6g/L，木质纤维素基质40-48g/L，促进剂1.2-1.5g/L，诱导剂5×10-5-9×10-5g/L，蛋白胨2.3-2.5g/L，酵母粉1.2-1.5g/L，KH2PO40.8-1g/L，Na2HPO40.2-0.4g/L，MgSO4·7H2O0.5-0.6g/L，pH值6.0；所述木质纤维素基质选自小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、桦树枝、椰子壳、山核桃壳、竹屑、香蕉皮、石榴皮中的一种或几种。所述促进剂为乙醇、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、曲拉通、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸中的一种或几种。所述诱导剂为没食子酸、(+)儿茶素、黎芦醇、2.2-连氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸、硫酸铜中的一种或几种。
液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28℃，发酵罐空气流量0.5-1.0vvm，发酵罐内部压力0.1-0.25kg/cm3，搅拌转速70-150转/分钟，发酵时间3-11天；
(4)桦褐孔菌木质纤维素降解酶制备：发酵结束后，将发酵产物过滤，获得发酵液，在发酵液中加硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20wt％，离心10-15分钟后收集上清液，再往上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为80wt％，离心15-25分钟后收集沉淀，沉淀溶解在醋酸-醋酸钠缓冲液中，透析，冷冻干燥。
实施例1
(1)菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上27℃，培养250小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40g/100mL，蛋白胨4g/100mL，琼脂10g/100mL，pH值为5.4-5.6。
(2)液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基27℃，摇床上培养4.5d至对数期得液体菌种，摇床转速80转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖5g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母浸膏0.1g/100mL，KH2PO40.1g/100mL，MgSO40.15g/100mL，CaCl20.01g/100mL。
(3)液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27℃，发酵罐空气流量0.5vvm，发酵罐内部压力0.1kg/cm3，搅拌转速70转/分钟，发酵时间7天；所述液体深层发酵培养基的配方为：玉米粉2g/L，木质纤维素基质(山核桃壳，粉碎后使用)40g/L，促进剂(乙醇)1.2g/L，诱导剂(没食子酸)5×10-5g/L，蛋白胨2.3g/L，酵母粉1.2g/L，KH2PO40.8g/L，Na2HPO40.2g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH值6.0。
(4)桦褐孔菌木质纤维素降解酶制备：发酵结束后，将发酵产物过滤，获得发酵液，在发酵液中加硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20wt％，离心(10000×g)10分钟后收集上清液，再往上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为80wt％，离心(10000×g)15分钟后收集沉淀，沉淀溶解在醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0，浓度，20mmol/L)中，透析，冷冻干燥。
实施例2
(1)菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上28℃，培养200小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40g/100mL，蛋白胨4g/100mL，琼脂10g/100mL，pH值为5.4-5.6。
(2)液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基28℃，摇床上培养3.5d至对数期得液体菌种，摇床转速140转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖5g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母浸膏0.1g/100mL，KH2PO40.1g/100mL，MgSO40.15g/100mL，CaCl20.01g/100mL。
(3)液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:10，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度28℃，发酵罐空气流量1.0vvm，发酵罐内部压力0.25kg/cm3，搅拌转速150转/分钟，发酵时间11天；所述液体深层发酵培养基的配方为：玉米粉6g/L，木质纤维素基质(竹屑，粉碎后使用)48g/L，促进剂(曲拉通，市售)1.5g/L，诱导剂(黎芦醇)9×10-5g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母粉1.5g/L，KH2PO41g/L，Na2HPO40.4g/L，MgSO4·7H2O0.6g/L，pH值6.0。
(4)桦褐孔菌木质纤维素降解酶制备：发酵结束后，将发酵产物过滤，获得发酵液，在发酵液中加硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20wt％，离心(10000×g)15分钟后收集上清液，再往上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为80wt％，离心(10000×g)25分钟后收集沉淀，沉淀溶解在醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0，浓度，20mmol/L)中，透析，冷冻干燥。
实施例3
(1)菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上28℃，培养220小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40g/100mL，蛋白胨4g/100mL，琼脂10g/100mL，pH值为5.4-5.6。
(2)液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基28℃，摇床上培养4d至对数期得液体菌种，摇床转速100转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖5g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母浸膏0.1g/100mL，KH2PO40.1g/100mL，MgSO40.15g/100mL，CaCl20.01g/100mL。
(3)液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:9，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度28℃，发酵罐空气流量0.8vvm，发酵罐内部压力0.2kg/cm3，搅拌转速100转/分钟，发酵时间9天；所述液体深层发酵培养基的配方为：玉米粉4g/L，木质纤维素基质(竹屑，粉碎后使用)45g/L，促进剂(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸，CHAPS)1.3g/L，诱导剂(儿茶素)7×10-5g/L，蛋白胨2.4g/L，酵母粉1.3g/L，KH2PO40.9g/L，Na2HPO40.3g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH值6.0。
(4)桦褐孔菌木质纤维素降解酶制备：发酵结束后，将发酵产物过滤，获得发酵液，在发酵液中加硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20wt％，离心(10000×g)12分钟后收集上清液，再往上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为80wt％，离心(10000×g)20分钟后收集沉淀，沉淀溶解在醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0，浓度，20mmol/L)中，透析，冷冻干燥。
发酵中发酵液降解酶活性分析：
(1)木质素降解酶
木质素过氧化物酶(Lip)活性测定通过测定藜芦醇氧化成藜芦醛的速率。定义在1min产生1.0μmol藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)。锰过氧化物酶(MnP)活性的测定基于Mn2+被氧化成Mn3+。定义在1min产生1.0μmolMn3+所需的酶量为一个酶活力单位(U)。漆酶(Lac)活性的测定采用ABTS法。定义转化1mol/min的ABTS所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
(2)半纤维素降解酶
内切-β-1,4-木聚糖酶采用DNS法，用木聚糖作为底物，木聚糖酶活力通过反应1h内还原糖的变化表示。酶活力单位定义为每分钟转化木糖的微摩尔数。甘露聚糖酶的测定采用DNS法，槐角豆胶作为甘露聚糖酶测定的底物，甘露聚糖酶活力通过反应1h内还原糖的变化表示。酶活力单位定义为每分钟转化甘露糖的微摩尔数。
(3)纤维素降解酶
全酶活(FPase)的测定采用DNS法，定义在1min内由无淀粉新华滤纸产生1.0μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。纤维素内切酶(Endoglucanase)用CMCNa酶活表示，定义在1min内由CMCNa产生1.0μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。纤维素外切酶(Cellobiohydrolase)活力用微晶纤维素酶活表示，酶活力单位定义为微晶纤维素每分钟转化成葡萄糖的微摩尔数。β-葡萄糖苷酶(P-Gase)活力的测定采用Berghem方法，以p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside为底物，定义在1min产生1.0μmolp-nitrophenol所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
图1显示桦褐孔菌在液体发酵时不产生Lac，LiP和MnP酶活性分别在4天和3天时达到最大值(20.7U/mL和28.5U/mL)；半纤维素酶活性在5天达到峰值72U/L后；降解纤维素有关的酶均是在4天后开始产生，全酶活在5天时达到最大值42U/L，纤维素内切酶酶活在6天时达到最大值34U/L，β-葡聚糖酶活性在10天达到最大值44U/L。综上分析，各种酶活性随着时间的变化是不同的，木质素降解酶先产生，并达到最大值，其次是半纤维素酶和纤维素酶。
图2显示添加山核桃壳的液体培养基中，LiP和MnP酶活性分别在2天和3天时达到最大值为21.7U/mL和35.8U/mL；半纤维素酶活性在4天时达到最高值104U/L；与降解纤维素有关的酶在发酵后半段开始增加，全酶活在9天时达到最大值94U/L，纤维素内切酶酶活在7天时达到最大值38U/L，β-葡聚糖酶活性在7天达到最大值65U/L。与图1相比较，添加山核桃壳后，使得木质素、半纤维素降解酶、β-葡聚糖酶活性达到最大值的时间提前，推迟纤维素降解全酶达到最大酶活的时间。三类酶的最大活性都得到显著提高，尤其是在提高MnP和半纤维素酶酶活性的作用更强，表明稻草秸秆刺激桦褐孔菌产生和/或分泌木质纤维素降解酶。
图3显示添加竹屑的液体培养基中，LiP和MnP的酶活性分别在2天和3天时达到最大值22.1U/mL和35.7U/mL，半纤维素酶活性4天时达到最大值104U/L，与纤维素降解有关的酶均在6天以后呈现较高的活性，全酶活性在9天时达到65U/L，纤维素内切酶酶活性在7天时活性最高，达到43U/L，β-葡聚糖酶活性在6天达到最大值49U/L。与图1相比较，添加竹屑后，使得木质素降解酶、半纤维素降解酶、β-葡聚糖酶活性活性达到最大值的时间提前，三类酶的最大活性都得到显著提高，尤其是在提高MnP和半纤维素酶酶活性的作用更强，表明竹屑刺激桦褐孔菌产生和/或分泌木质纤维素降解酶，而且竹屑提高半纤维素降解酶活性的作用强于山核桃壳。
图4显示添加竹屑、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、儿茶素的液体培养基中，LiP和MnP在2天和3天时达到最大值22.7U/mL和46.2U/mL；半纤维素酶活性在5天时达到最大值57U/L；与纤维素降解有关的酶活性在5天后呈现较高水平。与纤维素降解有关的酶3天后开始产生，全酶酶活性在9天时达到10.9U/L，纤维素内切酶酶活性在7天时活性最高，达到48U/L，β-葡聚糖酶活性在6天达到最大值57U/L。与图1和图3比较发现，在添加竹屑的培养基中再加入促进剂和诱导剂，显著提高MnP、半纤维素酶、纤维素降解酶全酶酶活性，显示了促进剂和诱导剂的增强桦褐孔菌产生和分泌木质纤维素降解酶的作用。
本发明阐明了桦褐孔菌液体发酵能产生木质纤维素降解酶，在液体培养基中添加木质纤维素基质、促进剂、诱导剂能提高木质纤维素降解酶的酶活性。
本发明可以利用液体发酵制备系列桦褐孔菌木质纤维素降解酶粗制品和纯酶，即经过酶蛋白的分离提纯，可以分别制成木质素降解酶、半纤维素降解酶、纤维素降解酶分开或混合的粗酶制品和纯化的单一酶。这些酶制品可用于木质纤维素基质如农作物秸秆、木屑、竹屑、果壳、纸浆等的木质纤维素降解，降解物可用于二代生物能源、饲料、造纸等工农业应用。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (9)

1.一种液体深层发酵法生产桦褐孔菌木质纤维素降解酶的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；
(2)液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基中，摇床培养至对数期得液体菌种；
(3)液体深层发酵：将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8-10，所述液体深层发酵培养基的配方为：玉米粉2-6g/L，木质纤维素基质40-48g/L，促进剂1.2-1.5g/L，诱导剂5×10-5-9×10-5g/L，蛋白胨2.3-2.5g/L，酵母粉1.2-1.5g/L，KH2PO40.8-1g/L，Na2HPO40.2-0.4g/L，MgSO4·7H2O0.5-0.6g/L，pH值6.0；
液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28℃，发酵罐空气流量0.5-1.0vvm，发酵罐内部压力0.1-0.25kg/cm3，搅拌转速70-150转/分钟，发酵时间3-11天；
(4)桦褐孔菌木质纤维素降解酶制备：发酵结束后，将发酵产物过滤，获得发酵液，在发酵液中加硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20wt％，离心10-15分钟后收集上清液，再往上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为80wt％，离心15-25分钟后收集沉淀，沉淀溶解在醋酸-醋酸钠缓冲液中，透析，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤(3)中所述木质纤维素基质选自小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、桦树枝、椰子壳、山核桃壳、竹屑、香蕉皮、石榴皮中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于：步骤(3)中所述促进剂为乙醇、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、曲拉通、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸中的一种或几种。
4.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于：步骤(3)中所述诱导剂为没食子酸、(+)儿茶素、黎芦醇、2.2-连氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸、硫酸铜中的一种或几种。
5.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于：步骤(4)中醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度为20-25mmol/L。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40g/100mL，蛋白胨4g/100mL，琼脂10g/100mL，pH值为5.4-5.6。
7.根据权利要求6所述的工艺，其特征在于：斜面菌种培养基上培养的参数为：温度27-28℃，培养200-250小时。
8.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖5g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母浸膏0.1g/100mL，KH2PO40.1g/100mL，MgSO40.15g/100mL，CaCl20.01g/100mL。
9.根据权利要求8所述的工艺，其特征在于：液体菌种培养的参数为：温度27-28℃，培养3.5-4.5d，摇床转速80-140转/分钟。
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