CN103789358A

CN103789358A - 一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法

Info

Publication number: CN103789358A
Application number: CN201410041209.2A
Authority: CN
Inventors: 贾薇; 张劲松; 白岩岩; 冯娜; 张忠; 冯杰; 唐传红
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-01-28
Filing date: 2014-01-28
Publication date: 2014-05-14

Abstract

本发明涉及一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，包括：（1）菌种活化；（2）种子液制备；（3）液体深层发酵培养；（4）发酵液的固液分离和萃取。本发明生产工艺简便，具有广泛的工业化发展前景，发酵培养液过滤后分为菌丝体和发酵液，对发酵液进行萃取后获得2-苯乙醇，发酵菌丝体可用于其它生物学研究，对有效利用农产品副产物、废弃物，对提高食、药用菌产业的附加值和农林资源的综合利用具有重要的意义。

Description

一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法

技术领域

本发明属于2-苯乙醇的制备领域，特别涉及一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法。

背景技术

2-苯乙醇因其柔甜的香气而颇受人们欢迎，在日常生产及生活中，2-苯乙醇在日化用品、食品、烟草等工业领域应用广泛。而且还具有增强香气的作用，可以用于调配多种不同的香型。在香料生产领域2-苯乙醇也应用广范，是第二大香料成分，可以调配多种香型的香精和作为食品添加剂使用，增加食品中的香味。在国内外，目前已被应用于医药、化妆品等产业中，而且以其为原料生产的多种衍生物应用价值也非常巨大，如其酯类衍生物-乙酸苯乙酯等，这些衍生物也因其香气似玫瑰且带蜜甜，同样可用于日化和食用香精。

截止到目前，2-苯乙醇基本上都为廉价材料化学合成的，只有很少的是从玫瑰中直接提取的。而化学合成的2-苯乙醇市场价格约为3.5$/kg，天然的2-苯乙醇价格却高达1000$/kg。随着科技的发展，人民物质生活水平的显著提高，健康意识的增强，随之而来的便是食品安全的问题。为了人们的健康，世界各国对于食品加工方面的限制也会更加明确，“绿色”这个字眼也越来越多的出现在我们的视野当中。当前，国际上天然2-苯乙醇的生产，主要集中在法国、德国等发达国家，我国在这方面比较欠缺，需要加强研究。

微生物体积小、繁殖快，吸收快，原料来源广且低，故采用生物-微生物转化法生产“绿色”的2-苯乙醇周期短，效率高，没有其他化合物的干扰等，优点显著，故产品的质量也比较容易达到国际标准。中国专利CN1403581A公开了一种以烟草作为原料，酵母发酵法生产香料苯乙醇的工艺，但该方法使用烟草做原料，有机溶剂萃取后，离子交换树脂纯化获得苯乙醇，是一种新颖的微生物法生产天然苯乙醇的方法，但成本较高，且烟草原料在发酵过程中的潜在的毒素情况并未涉及，而使用廉价、安全的农副产品，通过微生物法获得天然的2-苯乙醇的方法，成为一种迫切需求。

樟芝（Antrodia camphorata）又称牛樟芝、牛樟菇等，属担子菌门，担子菌亚门，担子菌纲，无褶菌目，多孔菌科，台芝属，是台湾特有的药用真菌，主要分布在中国台湾山区。其营养成分丰富，含有多糖、三萜类、固醇类及抗氧化物质等多种生理活性成分，具有保肝、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、解毒、抗炎等多种功效，近年来已成为研究和开发的热点。由于牛樟树被列为珍稀保护树种，而樟芝的固体培养周期也比较长，故樟芝的深层发酵技术越来越为人们所重视。野生樟芝的子实体极少，且资源越发匮乏，而大规模的人工种植还未能真正实现，故液体深层发酵技术，以其可以在短时间内获得大量的菌丝体，且无季节的限制等优点，逐渐成为樟芝培养的主要方法。近十几年，中国台湾、大陆都进行了与之相关的各方面的研究，但大部分的研究主要集中在菌丝体以及菌丝体活性成分方面。工艺过程中一般作为废弃物的发酵滤过液，都倾倒了，但研究发现其中含有香味物质2-苯乙醇，故通过优化培养基条件及发酵条件，提高樟芝发酵液中2-苯乙醇的含量，可以有效的利用发酵液，进行天然2-苯乙醇的生产，在医药、食品、香料工业等方面具有很大的开发利用价值。由于材料安全，成本低亷，可以加入到口香糖、糖果、茶点、软饮料、运动型饮料和奶制品中，也可以用于化妆品中洗发精、肥皂、浴液和牙膏的生产以及香水和除臭剂的生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，该方法生产工艺简便，具有广泛的工业化发展前景，发酵培养液过滤后分为菌丝体和发酵液，对发酵液进行萃取后获得2-苯乙醇，发酵菌丝体可用于其它生物学研究，对有效利用农产品副产物、废弃物，对提高食、药用菌产业的附加值和农林资源的综合利用具有重要的意义。

本发明的一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，包括：

（1）无菌条件下，将樟芝菌株（ATCC200183）转接到PDA斜面上，26～30℃恒温避光培养12～20d，待菌丝长满斜面后备用，期间转接2-3次；

（2）将上述培养好的斜面菌种切割成菌块（0.2～0.5cm×0.2～0.5cm）接入PD液体培养基(称取200g马铃薯，洗净去皮切片，加水1000mL煮沸15min，纱布过滤后加去离子水补足至1000mL，再加12g葡萄糖，煮沸至固体充分溶解后分装灭菌，得到PD液体培养基)中，150～200rpm、26～30℃摇床恒温培养6～10d；无菌条件下匀浆后，接入新鲜PD液体培养基中，接种量为10%～20%，150～200rpm、26～30℃摇床恒温培养5～8d，即得液体种子液；

（3）将上述液体种子液匀浆后，接入发酵培养基中，接种量为10%～20%，100～200rpm、23℃～28℃恒温发酵5～6d得到樟芝发酵液；其中，发酵培养基的组成为：3%～8%的糖类物质，0.3%～0.8%的氮源，0.08%～0.2%的K₂HPO₄，0.03%～0.08%的MgSO₄，0.01%的V_B1，其余为去离子水，121℃下灭菌20～30min；

（4）将上述樟芝发酵液过滤后获得上清液，上清液减压浓缩，得到发酵浓缩液；将发酵浓缩液与有机溶剂等体积超声萃取，合并萃取液，减压浓缩，即得2-苯乙醇的浓缩液（HPLC检测含量超过50%）。

所述步骤（3）中的糖类物质为葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉、麦芽糖、麸皮中的一种。其中麸皮需要100℃沸水1小时，5000g离心10min。

所述步骤（3）中的氮源为酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、黄豆粉、硫酸铵中的一种。其中黄豆粉粒度为通过100～200筛孔，100℃沸水浴1小时，5000g离心10min。

所述步骤（3）中的发酵培养基的组成为：5%葡萄糖，0.5%酵母粉，0.05%MgSO₄，0.1%K₂HPO₄以及0.01%V_B1，其余为去离子水，121℃下灭菌30min。

所述步骤（3）放大培养时通入无菌空气，每升培养基通气量为1L/min。

所述步骤（3）中接种量为20%，150rpm、26℃～28℃恒温发酵。

所述步骤（4）中上清液减压浓缩10倍；萃取液减压浓缩40倍。

所述步骤（4）中的有机溶剂为氯仿、乙酸乙酯、***、石油醚、正戊烷、正戊烷：二氯甲烷=2:1（V/V）、正戊烷：***=1:1（V/V）、二氯甲烷中的一种。以正戊烷：二氯甲烷=2:1（V/V）为最佳。

所述步骤（4）中的萃取温度为10～40℃，发酵浓缩液的pH为3～5。

有益效果

本发明生产工艺简便，具有广泛的工业化发展前景，发酵培养液过滤后分为菌丝体和发酵液，对发酵液进行萃取后获得2-苯乙醇，发酵菌丝体可用于其它生物学研究，对有效利用农产品副产物、废弃物，对提高食、药用菌产业的附加值和农林资源的综合利用具有重要的意义。

附图说明

图1为接种量对产生2-苯乙醇的影响；

图2为转速对产生2-苯乙醇的影响；

图3为培养温度对产生2-苯乙醇的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

樟芝深层发酵2-苯乙醇的工艺，具体发酵工艺如下：

一级种子培养：将培养好的新鲜斜面菌种切割成0.2～0.5cm×0.2～0.5cm的菌块接入PD液体培养基中4～5块，150rpm，26℃摇床恒温培养6d，小菌丝球布满摇瓶后备用。

二级种子培养：一级种子液，无菌条件下均质仪匀浆后，接入新鲜的PD液体培养基中，接种量为10%～20%，150rpm，26℃恒温振荡培养5d后，小菌丝球布满摇瓶即为液体种子液。取出，均质仪匀浆后，接入发酵培养基中。

摇瓶发酵：摇瓶发酵的培养基配方为：50g/L葡萄糖（或是其他糖类物质中的一种），5g/L酵母粉，0.5g/L硫酸镁，1g/L的磷酸氢二钾，V_B1100mg/L，自然pH，接种量为5-30%，装液量为120mL/250mL三角瓶，转速为150r/min，26℃恒温培养5d，发酵结束后，取样用HPLC方法测定樟芝发酵液中的2-苯乙醇含量，结果见图1所示。

由图1可见，优选的发酵条件为：接种量以20%（V/V）最好，接种量直接影响发酵周期的长短，在培养基中接入大量的菌丝体，可以缩短发酵周期，从而节约发酵过程中的动力消耗，但是，接种量过多，会引起培养基中养料和供氧的不足，从而影响菌体的生长和代谢。发酵温度26-28℃，最终发酵液中2-苯乙醇的含量达1.13g/L。

实施例2

除了摇瓶发酵步骤中摇床转速为90-170rpm,其余工艺条件均同实施例1。

发酵结束后，取样用HPLC方法测定樟芝发酵液中的2-苯乙醇含量，结果见图2所示。

由图2可见，适宜的发酵条件是：

接种量20%（V/V）为最好，摇床转速为150rpm为最佳（摇床转速通过影响溶氧进而影响微生物的代谢生长，但是当转速太快的时候，就会对菌体影响，特别是大型真菌的菌丝会被切断）。此时发酵液中2-苯乙醇的含量达到1.18g/L。

实施例3

除了培养温度为23-38℃,其余工艺条件均同实施例1。

发酵结束后，取样用HPLC方法测定樟芝发酵液中的2-苯乙醇含量，结果见图3所示.

由图3可见，适宜的发酵条件是：

接种量20%（V/V）为最好，摇床转速为150rpm为最佳，培养温度为26-28℃最好（温度可以影响生物体内酶活性进而影响到微生物的生长代谢，而不同的微生物以及代谢产物所需要的最适温度皆不相同），此时发酵野种2-苯乙醇的含量达到1.19g/L。

由实施例1～3可见，在最佳条件下，樟芝液体深层培养产生2-苯乙醇，获得了较好的效果，为此，下面的放大培养进一步阐述本发明的内容。

实施例4

放大试验：在一30L的发酵罐中，以樟芝菌株为菌种，起种子的培养方法，发酵培养基的配比，以及发酵培养基的灭菌条件等均同实施例1，放罐体积为20L，发酵条件为接种量20%（V/V），通入无菌空气，通气量为20L/min，搅拌转速为100-200rpm，26℃～28℃恒温发酵5天，放罐后，发酵液10-30℃，5000g离心10min，可得樟芝菌丝体和发酵上清液，其中上清液约20L，2-苯乙醇的含量为1.25g/L，总量为25g。发酵上清液减压浓缩后得到2L的发酵浓缩液，待用。

发酵上清液有机溶剂萃取法提取2-苯乙醇，萃取工艺条件为：

正戊烷：二氯甲烷=2:1（V/V）为有机相，发酵浓缩液为水相，水相/有机相=1（V/V），萃取温度为10-40℃，水相的pH=3～5，超声萃取三次，合并萃取液，萃取液减压浓缩后，可得2-苯乙醇产品50mL，2-苯乙醇含量为458g/L，总回收率为91.6%（以发酵液中2-苯乙醇的总含量为标准），回收溶剂，循环使用。

实施例5

除了有机萃取相为氯仿外，其它条件同实施例4，萃取液减压浓缩后，可得2-苯乙醇产品49mL，2-苯乙醇含量为437g/L，总回收率为85.7%（以发酵液中2-苯乙醇的总含量为标准），回收的氯仿循环使用。

从实施例4～5可见，有机溶剂萃取，几种常用的有机溶剂都可以达到比较好的萃取得率，都是从发酵液中分离纯化2-苯乙醇的好方法；可以满足工业化生产化生产的需要。

Claims

1.一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，包括：

（1）无菌条件下，将樟芝菌株转接到PDA斜面上，26～30℃恒温避光培养12～20d，待菌丝长满斜面后备用，期间转接2-3次；

（2）将上述培养好的斜面菌种切割成菌块接入PD液体培养基中，150～200rpm、26～30℃摇床恒温培养6～10d；无菌条件下匀浆后，接入新鲜PD液体培养基中，接种量为10%～20%，150～200rpm、26～30℃摇床恒温培养5～8d，即得液体种子液；

（4）将上述樟芝发酵液过滤后获得上清液，上清液减压浓缩，得到发酵浓缩液；将发酵浓缩液与有机溶剂等体积超声萃取，合并萃取液，减压浓缩，即得2-苯乙醇的浓缩液。

2.根据权利要求1所述的一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的糖类物质为葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉、麦芽糖、麸皮中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的氮源为酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、黄豆粉、硫酸铵中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的发酵培养基的组成为：5%葡萄糖，0.5%酵母粉，0.05%MgSO₄，0.1%K₂HPO₄以及0.01%V_B1，其余为去离子水，121℃下灭菌30min。

5.根据权利要求1所述的一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，其特征在于：所述步骤（3）放大培养时通入无菌空气，每升培养基通气量为1L/min。

6.根据权利要求1所述的一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，其特征在于：所述步骤（3）中接种量为20%，150rpm、26℃～28℃恒温发酵。

7.根据权利要求1所述的一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，其特征在于：所述步骤（4）中上清液减压浓缩10倍；萃取液减压浓缩40倍。

8.根据权利要求1所述的一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的有机溶剂为氯仿、乙酸乙酯、***、石油醚、正戊烷、二氯甲烷中的一种或几种。

9.根据权利要求8所述的一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，其特征在于：所述有机溶剂为体积比为2:1的正戊烷和二氯甲烷。

10.根据权利要求1所述的一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的萃取温度为10～40℃，发酵浓缩液的pH为3～5。