CN102108371A

CN102108371A - 一种利用木质纤维素类农林废弃物液体深层发酵生产白腐真菌抗氧化活性物质的工艺

Info

Publication number: CN102108371A
Application number: CN2009101571644A
Authority: CN
Inventors: 徐向群; 陈辉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2011-06-29

Abstract

通过添加木质纤维素类农林废弃物提高白腐真菌液体深层发酵多糖、多酚类物质产量和抗氧化活性的方法。以通过液体深层发酵白腐真菌如桦褐孔菌多糖和多酚类物质为目标，以荷兰CBS菌种库桦褐孔菌为出发菌种，进行液体发酵罐发酵。在玉米淀粉水解糖为发酵碳源的基础上，添加农作物秸秆(玉米秸秆、水稻秸秆、麦秆)和/或木屑，使桦褐孔菌菌丝体在利用淀粉水解糖的同时，分解利用添加物中的木质纤维素。发酵条件：27-28℃，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌转速70-150转/分钟，内部压力0.1-0.25公斤/立方厘米，发酵周期12-14天。此方法提高桦褐孔菌液体深层发酵多糖、多酚类的产量和活性，同时有效分解木质纤维素。

Description

一种利用木质纤维素类农林废弃物液体深层发酵生产白腐真菌抗氧化活性物质的工艺

技术领域

本发明涉及一种利用木质纤维素类农林废弃物如农作物秸秆和木屑促进液体深层发酵生产白腐真菌活性物质的工艺，属于生物技术或生物工程领域。

技术背景

真菌被人类发现、认识、利用已经有很长的历史，最为人们所熟知的莫过于大型食药用真菌。它们不仅营养丰富，而且含有的许多成分有较强的生理和药理活性。现代研究表明高级担子菌具有广泛的治疗和预防疾病的功能。多孔菌真菌是担子菌中的一大类群，我国的菌类药物中许多属于这一类真菌，如有名的传统中药灵芝、猪苓、茯苓等等。

采用液体深层发酵的方法，和传统的真菌培育方法相比，具有生产周期短，成本低，产量质量稳定，产品可以控制等优越性。利用生物技术生产真菌的生物有效成分是必然的趋势，目前国际上已有许多药用真菌商业上采用液体深层发酵来获得有效成分。自1948年美国成功地对蘑菇进行深层发酵和1957年以发酵罐对羊肚菌的液体深层培养以来，液体深层发酵技术在食药用菌制种、综合利用等方面的应用日趋广泛。目前，世界上已有50多种食药用菌进行了液体发酵实验。国内已进行深层发酵并工业化生产应用的食药用菌有冬虫夏草、云芝、灵芝、银耳、猴头、竹荪、猪苓、蜜环菌、香菇、麦角菌、小杯珊瑚菌、小刺猴头等。

在食药用真菌所含有的各种活性成分中，真菌多糖是目前为止最有效，也是人们认识最为深入的活性成分，它具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等功能。近四十年来，随着对食药用真菌多糖研究的不断深入，多种多糖已经被制成药品，应用于临床治疗并大规模推向市场。

在液态发酵培养时，各种理化因素都会影响真菌的生长速度、生物量以及代谢途径，所以开发合适的培养基和发酵条件是提高食药用真菌活性物质产量，得到高活性产物的有效途径。

食药用真菌中的一类白腐真菌能够产生木质纤维素分解酶系，将木质素最终分解为CO2，暴露出纤维素和半纤维素，进而将纤维素和半纤维素水解为相应的单糖供菌体利用。由于酶蛋白分子的体积过于庞大，无法顺利通过木质素组成的致密网状结构，所以菌体首先氧化分解木质素。白腐真菌对木质素的生物降解是一个以自由基为主的链反应过程。为了提高白腐真菌在液体深层发酵中生物合成的多糖和多酚类化合物的产量和活性，本发明在液体深层发酵培养基中添加木质素纤维素类农林废弃物，如农作物秸秆(玉米秸秆、稻秆、麦秆等)和木屑，以诱导白腐真菌在分解木质纤维素的同时产生羟基自由基，从而刺激发酵菌丝体的自我保护机制，也就是刺激发酵菌丝体生物合成更多的抗氧化物质，如多酚类物质和多糖类物质。

本发明以属于白腐真菌的珍稀药用真菌桦褐孔菌(Inonotus obliquus)又名白桦茸为例。桦褐孔菌属担子菌亚门，层菌纲，非褐菌目，多孔菌科，褐卧孔菌属。生于白桦、银桦、榆树、赤杨等的树皮下或砍伐后的枯干上。十六世纪以来，桦褐孔菌作为一种民间药用真菌，在俄罗斯及西伯利亚、东欧地区被用来防治疑难杂症，包括糖尿病、传染性病毒及多种癌症，被认为是具有显著的药理活性而对人体没有任何副作用的一种药用真菌。桦褐孔菌多糖类和多酚类物质被认为是桦褐孔菌的活性成分之一，具有很强的抗氧化活性。

本发明利用木质纤维素的降解促进桦褐孔菌液体发酵多酚、多糖的产生和抗氧化活性的提高，其意义在于将木质纤维素作为桦褐孔菌发酵的后续碳源，在发酵生产活性物质的同时，分解利用木质纤维素类的农业废弃物，具有重要的科学意义和应用前景。

发明内容

本发明是以生产桦褐孔菌液体发酵抗氧化物质多酚和多糖为目标，建立了一种在桦褐孔菌液体发酵产活性物质的同时，分解利用农作物秸秆中的木质纤维素的工艺，大大提高了桦褐孔菌发酵活性多酚、多糖的产量。

本发明的技术方案：桦褐孔菌真菌为出发菌种，采用斜面菌种进行液体种子培养。在玉米淀粉水解糖为发酵碳源的基础上，添加一定量的农作物秸秆或木屑，进行液体深层发酵。使桦褐孔菌菌丝体在发酵利用淀粉水解糖的同时，分解利用秸秆或木屑中的木质纤维素。发酵条件为：27-28℃，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌转速为70-150转/分钟，内部压力0.1-0.25公斤/立方厘米，发酵周期10-14天。添加木质纤维素可使桦褐孔菌发酵胞外多糖的产量提高40％以上，胞外多酚的产量提高700％以上。

实现本发明的具体步骤如下：

(1)取出斜面菌株接入新鲜配置的斜面培养基中，斜面菌种培养温度为25-30℃，培养200-250小时。

(2)将步骤1中的斜面菌种转入装有液体种子培养基的摇瓶中，液体种子培养条件：温度为27-28℃，摇床转速70-150转/分钟。培养96-120小时。

(3)将步骤2中的液体菌种转入装有玉米秸秆液体发酵培养基的发酵罐中，进行液体深层发酵。发酵条件：温度为27-28℃，摇床转速70-150转/分钟。培养288小时。

本发明中斜面菌种培养基组成(g/100mL)：麦芽浸膏30，蛋白胨3，琼脂15。pH值为5.4-5.6。

本发明中摇瓶种子培养基组成(g/100mL)：葡萄糖2，蛋白胨0.3，酵母浸膏0.2，KH₂PO₄0.1，MgSO₄0.15，CaCl₂0.01。

本发明中秸秆液体深层发酵培养基组成(g/100mL)：玉米粉5，蛋白胨0.3，KH₂PO₄0.1，ZnSO₄·2H₂O 0.001，K₂HPO₄0.04，FeSO₄·7H₂O 0.005，MgSO₄·7H₂O 0.05，CuSO₄·5H₂O 0.002，CoCl₂0.001，MnSO₄·H₂O 0.008。pH值6.0。

本发明的发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2％，镜检发现菌丝体开始衰老。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体说明

实施例1：

在斜面培养基中接种荷兰CBS菌种保藏库的桦褐孔菌菌丝体。培养温度28℃，培养240小时。将新鲜的斜面菌种接入装有200mL液体种子培养基的500mL摇瓶中，28℃培养96小时，摇床转速150转/分钟。将培养好的液体种子按照10％(v/v)接入装有玉米秸秆发酵培养基的发酵罐中。28℃培养约288小时。空气流量1.0vvm，内部压力0.2公斤/立方厘米，搅拌转速为140转/分钟。

本实施例1中斜面菌种培养，培养基组成是(g/100mL)：麦芽浸膏30，蛋白胨3，琼脂15，pH值为5.4-5.6。

本实施例1中摇瓶种子培养，培养基组成(g/100mL)：葡萄糖2，蛋白胨0.3，酵母浸膏0.2，KH₂PO₄0.1，MgSO₄0.15，CaCl₂0.01。

本实施例1中玉米秸秆液体深层发酵培养，培养基组成(g/100mL)：玉米粉3.5，玉米秸秆粉末5％，蛋白胨0.3，KH₂PO₄0.1，ZnSO₄·2H₂O 0.001，K₂HPO₄0.04，FeSO₄·7H₂O 0.005，MgSO₄·7H₂O 0.05，CuSO₄·5H₂O 0.002，CoCl₂0.001，MnSO₄·H₂O 0.008。pH值为6.0。

本实施例1中发酵终止的标准为还原糖含量低于2％，镜检菌丝体出现衰老症状。

发酵胞外多糖的提取：发酵结束后用真空抽滤法分离出发酵液。发酵液浓缩至原体积的1/4后，加入4倍体积的无水乙醇，激烈搅拌，得到多糖沉淀，沉淀4℃过夜。多糖沉淀经离心分离，中性蛋白酶处理，Sevage法除蛋白，透析后冷冻干燥得胞外多糖。

发酵水溶性胞内多糖的提取：发酵结束后的菌丝，用蒸馏水洗涤后，悬浮于蒸馏水中，高温高压加热或超声波破壁后，提取热稳定性胞内多糖，滤液浓缩液加入4倍95％的乙醇，充分振动，置4℃过夜沉淀，沉淀用95％乙醇和丙酮洗涤、Sevage法除蛋白，冷冻干燥得胞内多糖。

发酵胞外多酚的提取：发酵结束后用真空抽滤法分离出发酵液，或是经乙醇沉淀分离多糖后的发酵浓缩液，用体积比1∶1乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩、真空或冷冻干燥获总多酚。采用色谱等方法进一步纯化。

图1为液体深层发酵过程中玉米秸秆纤维素、半纤维素、木质素含量随发酵时间的变化规律。在前144小时，木质纤维素的三种主要成份的残留率稳定的保持在较高水平上，且变化不大。144小时后，纤维素、半纤维素、木质素被快速分解，残留率迅速下降。发酵结束时培养基中纤维素、半纤维素、木质素的残留率分别为79.1，82.1，and 80.2％。

图2为液体深层发酵过程中胞外多糖含量随发酵时间的变化规律。桦褐孔菌在木质纤维素发酵培养基和无木质纤维素发酵培养基(对照)中所产生胞外发酵多糖的产量随发酵时间的延长而提高。144小时以后，两种培养基的多糖产量呈现较大差异。发酵结束时，木质纤维素发酵培养基和无木质纤维素发酵培养基中，桦褐孔菌发酵胞外多糖的产量分别为1.4g/L和1.0g/L。木质纤维素的加入显著提高了桦褐孔菌发酵胞外多糖的产量。发酵胞外多糖的产量与木质纤维素三种主要成份含量随时间的变化有着紧密的联系，伴随着木质纤维素三种主要成份分解速率的加快，胞外发酵多糖产量快速提高。

图3为液体深层发酵过程中胞外多酚含量随发酵时间的变化规律。桦褐孔菌在木质纤维素发酵培养基所产生胞外发酵多酚的产量随发酵时间的延长而提高，在发酵第8天达到最高。产量是无木质纤维素发酵培养基(对照)中所产生胞外发酵多酚的700％。

图4为木质纤维素发酵培养基和无木质纤维素发酵培养基发酵胞外多糖的抗氧化活性，(a)羟基自由基清除活性；(b)超氧自由基清除活性；(c)脂质过氧化抑制作用。与无木质纤维素发酵培养基发酵多糖相比，木质纤维素的加入显著提高了发酵胞外多糖的最高羟基自由基清除率、超氧自由基清除活性和对小鼠肝脏自发脂质过氧化的抑制作用。

实施例2：

在斜面培养基中接种荷兰CBS菌种保藏库的桦褐孔菌菌丝体。培养温度28℃，培养240小时。将新鲜的斜面菌种接入装有200mL液体种子培养基的500mL摇瓶中，28℃培养96小时，摇床转速140转/分钟。将培养好的液体种子按照10％(v/v)接入装有木屑发酵培养基的发酵罐中。28℃培养约302小时。空气流量0.5vvm，内部压力0.1公斤/立方厘米，搅拌转速为140转/分钟。

本实施例2中斜面菌种培养，培养基组成是(g/100mL)：麦芽浸膏30，蛋白胨3，琼脂15，pH值为5.4-5.6。

本实施例2中摇瓶种子培养，培养基组成(g/100mL)：葡萄糖2，蛋白胨0.3，酵母浸膏0.2，KH₂PO₄0.1，MgSO₄0.15，CaCl₂0.01。摇床转速为150转/分钟。

本实施例2中稻秆液体深层发酵培养，培养基组成(g/100mL)：玉米粉3.5，木屑3.5％，蛋白胨0.3，KH₂PO₄0.1，ZnSO₄·2H₂O 0.001，K₂HPO₄0.04，FeSO₄·7H₂O 0.005，MgSO₄·7H₂O0.05，CuSO₄·5H₂O 0.002，CoCl₂0.001，MnSO₄·H₂O 0.008。pH值6.0。

本实施例2中发酵终止的标准为还原糖含量低于2％，镜检菌丝体出现衰老症状。

附图说明

图1是桦褐孔菌液体发酵过程中木质纤维素三种主要成分的分解图，(●)半纤维素，(▲)木质素，(■)纤维素；

图2是桦褐孔菌液体发酵过程中胞外发酵多糖产量图，(●)无木质纤维素发酵基础培养基，(■)木质素发酵培养基；

图3是桦褐孔菌液体深层发酵过程中胞外多酚产量图，(●)木质纤维素发酵培养基，(■)无木质素发酵培养基；

图4是桦褐孔菌发酵胞外多糖对三种氧化活性自由基清除效果图，(●)木质素发酵培养基，(■)无木质纤维素发酵基础培养基。(a)羟基自由基清除活性；(b)超氧自由基清除活性；(c)脂质过氧化抑制作用。

Claims

1.一种利用木质纤维素类农林废弃物，如农作物秸秆和木屑，液体深层发酵生产桦褐孔菌发酵胞外多糖、多酚类物质的工艺。其特征是以白腐真菌为出发菌种，采用斜面菌种进行液体摇瓶种子培养，发酵罐发酵。发酵过程中除采用传统的玉米淀粉水解糖为发酵碳源，另补充一定量的农作物秸秆和/或木屑，使菌种在发酵过程中除利用玉米淀粉水解糖外，分解利用木质纤维素。此方法大大提高了液体深层发酵多糖、多酚类物质的产量和抗氧化活性，同时也有效分解了木质纤维素，达到了农业废弃物再利用的目的。

2.根据权利要求1所述的利用木质纤维素类农林废弃物液体深层发酵生产白腐真菌发酵多糖、多酚类物质的工艺，其特征是以白腐真菌如桦褐孔菌为出发菌种的。

3.根据权利要求1利用玉米秸秆液体深层发酵生产白腐真菌如桦褐孔菌发酵多糖、多酚类物质的工艺，其特征是农林废弃物为：玉米秸秆、水稻秸秆、大、小麦秸秆、木屑、废纸等木质纤维素类废弃物。

4.根据权利要求1利用木质纤维素类废弃物液体深层发酵生产白腐真菌如桦褐孔菌发酵多糖、多酚类物质的工艺，其特征是液体发酵罐培养基中添加木质纤维素，培养基组成(g/100mL)：玉米粉3.5，农作物秸秆粉末或木屑2-10％，蛋白胨0.3，KH₂PO₄ 0.1，ZnSO₄·2H₂O0.001，K₂HPO₄ 0.04，FeSO₄·7H₂O 0.005，MgSO₄·7H₂O 0.05，CuSO₄·5H₂O 0.002，CoCl ₂0.001，MnSO₄·H₂O 0.008。pH值6.0。液体发酵条件：27-28℃，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌转速70-150转/分钟，内部压力0.1-0.25公斤/立方厘米，发酵周期12-14天。