CN107916229B - 一株桦褐孔菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株桦褐孔菌（Inonotus obliquus），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14549。本发明还提供了一种上述菌株深层发酵获得发酵产物的方法：菌株通过母种培育，摇瓶培养，种子培养获得种子液，将种子液进行深层发酵获得发酵液，将发酵液通过沉淀，浓缩步骤获得发酵产物。本发明还提供了上述桦褐孔菌发酵产物作为家禽饲喂添加剂的应用。本发明筛选获得的桦褐孔菌菌株，遗传性能稳定、生长速度快，产量高，适于深层发酵。由该菌种获得的发酵产物添加于家禽日粮中能够显著增强机体的生产性能，降低生产成本；有效减少甚至替代激素等添加剂的使用。

Description

一株桦褐孔菌及其应用
技术领域
本发明属于生物工程和生物技术领域，具体涉及真菌桦褐孔菌的发酵技术及其发酵产物在增强家禽生产性能中的应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，对于畜产品的质量要求日益增强，近年来食品安全问题的不断显现，更是让全社会对动物源性食品安全的重视达到了前所未有的高度。如何在禽类疫病持续高发的背景下减少甚至杜绝抗生素的使用、降低禽类耐药性和其他毒副作用，实现禽类的绿色健康养殖和食品安全，寻找安全、高效、绿色新型饲料添加剂和免疫增强剂代替药物成为养殖业发展的重中之重。药用真菌以其独特的功效成为新型饲料添加剂和免疫增强剂的潜在研究目标，相关研究已表明真菌提取物或制剂能够有效促进动物的生产和免疫性能。
桦褐孔菌（Inonotus obliquus）作为药用真菌的一种，富含多糖、三萜、甾醇、总酚等活性成分，早已被人类应用于胃癌、肠癌、心脏病、糖尿病等疾病，近期研究显示其子实体和提取物在人类抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、降血糖、抗病毒、抗细菌、抗寄生虫等方面也有独特的疗效。但桦褐孔菌品种现存较少，也很少形成子实体，故野生资源十分有限。进行真菌的菌株选育及人工培育是获得优质桦褐孔菌的重要手段，但经长期探索，始终没能取得突破性进展。发酵工程技术的进步使资源难题的破解成为可能。真菌的发酵一般采用深层发酵技术，它是在通气工艺技术的改进的基础上将微生物细胞置于液体底物里进行培养，以此获得大量菌丝体及其他代谢物质。适合深层发酵的真菌应具有以下特点：（1）菌丝体蛋白质含量丰富且适应液体通气条件下的培养；（2）生长速度快且高产；（3）具有稳定的遗传特性和可鉴别的形态特征。同时，同种真菌的不同菌株对深层发酵培养的适应能力存在差异，所以要进行真菌的深层研究和产品开发首先要解决的问题就是适宜菌株的筛选。
桦褐孔菌功效显著，但能否筛选到合适的菌株及其发酵产物能否提高禽类的生产性能，用于新型饲料添加剂的开发尚不清楚。
发明内容
针对桦褐孔菌适于深层发酵的菌株稀少和禽类养殖缺乏安全、高效、绿色新型饲料添加剂等问题，本发明的目的之一在于提供一株适宜深层发酵的桦褐孔菌；本发明的目的之二在于提供上述桦褐孔菌发酵产物的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种桦褐孔菌发酵产物在增强家禽生产性能中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一株桦褐孔菌（Inonotus obliquus）YU，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 14549；其ITS序列如SEQ No. 1所示。
一种获得上述桦褐孔菌发酵产物的方法，采用以下步骤：
（1）母种培育：将桦褐孔菌接种于试管斜面上培养得到母种；
（2）摇瓶培养：将母种接种于液体培养基培养，得到接种液；
（3）种子培养：将接种液接种于种子罐中的液体培养基内，通气搅拌发酵获得种子液；
（4）深层发酵：将种子液接种于发酵罐的液体培养基内，通气搅拌发酵；
（5）沉淀：将发酵液转入沉淀罐，加入絮凝剂，沉淀后过滤，得上清液；
（6）浓缩：将上清液转入真空浓缩罐，浓缩至一定密度出料，即得发酵产物。
所述液体培养基包括以下组分（g/L）：淀粉10，蛋白胨10，葡萄糖15，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，维生素B1 0.1，豆油0.2；可选地，液体培养基的pH为6.8-7.4。
可选地，步骤（1）中，斜面为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），培养温度为25-28℃，培养时间为5-7天。
可选地，步骤（2）中，接种为母种的菌丝体或孢悬液；优选为菌丝体。
可选地，培养温度为25-28℃；培养时间为3-10天；摇床转速为150-200转/分钟。
可选地，步骤（2）中，母种经多级摇瓶培养获得接种液；二级及以上摇瓶培养的接种量为8-15%；优选地，母种经二级培养获得接种液。
可选地，步骤（3）和步骤（4）中，接种量为8-15%；罐中液体总体积为发酵罐容量的50-80%；培养温度为25-28℃；培养时间为7-15天；搅拌转速为100-200转/分钟；通气量为0.1-0.5vvm。
可选地，步骤（3）中，接种液经多级种子培养获得种子液；优选地，接种液经二级培养获得种子液。
步骤（5）中所述絮凝剂为壳聚糖，优选的添加量为发酵液重量的0.05-0.2%。
优选地，步骤（5）中发酵液的生物量为20g/L以上。
作为优化，沉淀前加热并保持一段时间；更为优化地，加热温度为70-95℃；保温时间为4-6h。
可选地，步骤（6）浓缩至相对密度为1.035-1.065。
优选地，步骤（6）之后还包括将浓缩液干燥成固体的步骤。
一种上述方法制备的桦褐孔菌发酵产物作为家禽饲喂添加剂的应用。
可选地，桦褐孔菌发酵产物在家禽饲料中的添加量为0.2-2wt%；最优选为0.8wt%。
可选地，桦褐孔菌发酵产物在家禽饮水的添加量为0.1-5wt%，优选为0.5-2.0wt%。
本发明的有益效果：本发明筛选获得的桦褐孔菌YU菌株，遗传性能稳定、生长速度快，产量高，适于深层发酵，可作为深层发酵的菌种。由该菌种获得的发酵产物添加于家禽日粮中能够显著增强机体的生产性能，有效提升家禽的平均日增重，降低饲料消耗率和料肉比。本发明提供的发酵产物能够实现家禽的高效养殖，降低生产成本；有效减少甚至替代激素、抗生素等添加剂的使用，保障食品安全，有力促进行业的健康发展。
附图说明
图1为桦褐孔菌发酵产物饲喂对鸡日增重影响；
图2为桦褐孔菌发酵产物饲喂对鸡料肉比影响；
图3为黄芪多糖与桦褐孔菌发酵产物饲喂对鸡日增重影响；
图4为黄芪多糖与桦褐孔菌发酵产物饲喂对鸡料肉比影响。
菌种保存信息
桦褐孔菌（Inonotus obliquus）于2017年9月5日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国北京中国科学院微生物研究所，保存编号为CGMCC No. 14549。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 桦褐孔菌的分离鉴定。
桦褐孔菌JX株引自河北省科学院生物研究所，已鉴定为桦褐孔菌。桦褐孔菌YU株为野生菌株，采集自云南省大理市。采集时将无病虫害的子实体从树木表面取下，采集深度为树木表层1-3厘米，装入标本盒中返回实验室进行下一步的分离与纯化。分离菌种采用伞菌分离法，先用蒸馏水去掉子实体表面木屑及杂质，再用75%乙醇进行表面消毒，转入超净台后掰开子实体，并无菌剖取深部组织，迅速放入虎红固体培养基，置于恒温培养箱（28℃）中培养3天，后将纯化的菌转入PDA固体培养基中，每日观察菌落生长状况。随后以改良CTAB法提取的桦褐孔菌基因组为模板，ITS-rDNA通用引物ITS1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’和ITS2：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’为特异性引物进行PCR扩增，进行菌株的鉴定。扩增获得的ITS序列如SEQ No. 1所示，其与GeneBank中的桦褐孔菌（DQ103883）ITS-rDNA序列具有99%以上的同源性，判定分离的野生菌为桦褐孔菌，并名为YU株，该菌株于2017年9月5日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保存编号为CGMCC No. 14549。
实施例2 桦褐孔菌发酵产物的获得。
制备液体培养基：根据液体培养基用量，分别称取下列组分（g/L）：蛋白胨10、葡萄糖15、磷酸二氢钾1、硫酸镁0.5、维生素B1 0.1、豆油0.2，灭菌水补至所需体积，调整pH至7.0，121℃灭菌 30min，备用。
（1）母种培育：将实施例1中桦褐孔菌保存的菌种接种于试管斜面马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）中，转接2次，每次在25℃条件下活化7天，为母种，备用；
（2）摇瓶培养：将母菌转于500mL一级培养液中，培养10天，然后转入二级培养液，继续培养5天，摇床温度28℃，转速180转/分，培养结束取少量培养物进行显微镜镜检，无杂菌进入下步；
（3）种子培养：按10%的量将液体种菌接种于7L液体培养基并装入10L发酵罐中，25℃通气培养10天，再将其转入装有70L液体培养基的100L发酵罐中，25℃通气混合培养10天；
（4）深层发酵：将发酵物转入装有700kg液体培养基的1000kg发酵罐中，25℃通气混合培养10天；
（5）沉淀：检测发酵罐内生物量达20g/L时，停止发酵，将发酵罐升温到90度，保温4小时，再将发酵液转入沉淀罐，加入0.1%发酵液重量的壳聚糖，沉淀48小时，用半框过滤器过滤上清液；
（6）浓缩：将上清液转入真空浓缩罐进行浓缩，测得相对密度为1.035时完成发酵产物的制备，分装。
实施例3 桦褐孔菌深层发酵性能。
将实施例1中桦褐孔菌YU和JX菌种按实施例2中步骤（1）-（4）进行深层发酵，分别取发酵液各100mL，离心，收集沉淀，用去离子水水洗后再离心，重复3次后收集沉淀，在105℃条件下烘干称重，测定生物量。结果如表1所示。通过表1数据可知，菌株YU株发酵指标最优，菌丝形态优，生长势强，生物量增长明显；而JX株几乎未见生长，不适宜深层发酵。
表1 不同菌株液体培养结果
菌株 有无杂菌 菌丝形态 生物量（g/L）
YU 无 菌丝粗，内部充实 28.43
JX 无 菌丝少，较细 2.15
实施例4 桦褐孔菌发酵产物对家禽生产性能的增强。
4.1 不同添加量桦褐孔菌发酵产物对鸡日增重与料肉比的影响
将40只1日龄SPF鸡分为I、II、III、IV、V组，其中I-IV组分别在饲料中添加实施例2中的桦褐孔菌发酵产物，添加量为0.2%、0.4%、0.8%、2%，剩余一组为对照组，日粮中不添加桦褐孔菌发酵产物。分别饲养于隔离器中，饲养期42天，期间自由采食。分别于第7、14、21、28、35、42天对鸡只进行称重，称重前绝食12h。计算鸡体的增重及消耗的饲料量，进而得到不同时期的平均日增重、平均日采食量和料肉比，其计算方式为：
平均日增重（ADG）=（期末重量-期初始重量）/饲喂天数
平均日采食量（ADFI）=期间总耗料量/饲喂天数
料肉比（F/G）=平均日采食量/平均日增重。
以测定时间为横坐标，以增重为纵坐标作图1；以测定时间为横坐标，以料肉比为纵坐标作图2。结果显示，在平均增重值指标上，相比于对照组，21天之前，不同添加浓度的桦褐孔菌发酵物对鸡的增重均有促进效果；21天之后，除Ⅱ组外，其他组增重效果依然高于对照组。在料肉比指标方面，各组的料肉比均低于对照组，表明桦褐孔菌添加物可有效提高饲料的报酬率。综上所述，本发明的桦褐孔菌发酵产物能够增强家禽的生产性能，0.8%的添加浓度效果最佳。
4.2 桦褐孔菌发酵产物与黄芪多糖对鸡日增重与料肉比的影响
黄芪多糖是目前研究较为深入、使用较为广泛的重要多糖类免疫增强剂。研究表明，在饲料中添加适宜浓度的黄芪多糖能够增强家禽的生产性能和免疫性能。为了更直观的体现桦褐孔菌在增强家禽生产性能方面的效果，以黄芪多糖为参照，进行两者的比较研究。
设试验组2组（Ⅰ和Ⅱ），对照组1组（III），每组1日龄SPF鸡20只。Ⅰ组在日粮中添加0.8%浓度的桦褐孔菌发酵产物，Ⅱ组在日粮中添加黄芪多糖（购自北京生泰尔科技股份有限公司，建议饲喂添加量0.2%）。试验方法如4.2所述，以测定时间为横坐标，以增重为纵坐标作图3；以测定时间为横坐标，以料肉比为纵坐标作图4。结果显示，两种添加物均能够促进各试验期平均体重的增加和耗料量及料肉比的下降，但相互比较，桦褐孔菌的效果更为显著：在42天试验期内，桦褐孔菌发酵物组重量增加值平均高出黄芪多糖组9.67mg，料肉比平均则降低0.156。
<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所
秦皇岛高通生物科技有限公司
<120> 一株桦褐孔菌及其应用
<130> 20170915
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<212> DNA
<213> Inonotus obliquus
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tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgagtttat tttgaaatcg aggggcctgt 60
gctggcacgg aaacgtttgc atgtgcacgg cctttcgtgc tcaaatccaa ctctcaaacc 120
cctgtgcacc tatacaagtt gaaggtctta gtagtttctg taatcgaacg gcaagtcaag 180
tacgtcgagt aatcaagtac gagggtttcg gcccttggaa agtgtgaaag atggaaaggc 240
aagcttcaga gacaaggaga cgaaaagctt ttggcttcat tacaaacacc aatataattg 300
ttatgtgaat gaaatgctcc ttgtgggcga taataaatac aactttcaac aacggatctc 360
taggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat 420
tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcacc ttgcgcccct tggtattccg aggggcatgc 480
ctgtttgagt gtcatgttaa tctcaaatcg ctcgtctatt cttaattgaa gtggctttcg 540
atttggactt ggaggttttg ctggcccggg cgactttggt tgcccttggt ttgtcggctc 600
ctctcaaata cattagctgg actttggttc gcgtttacgg tgtaataatg taatgttcac 660
taagacgctt gcctaacaag tctgcttcta atagtcctta agttggacaa ggatcccttc 720
gttgggcctt cttgacacct ttgacctcaa atcaggtagg attacccgct gaacttaagc 780
atatcaataa gcggagga 798

Claims (10)

1.一株桦褐孔菌（Inonotus obliquus），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 14549。
2.一种获得如权利要求1所述的桦褐孔菌的发酵产物的方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）母种培育：将桦褐孔菌接种于试管斜面上培养得到母种；
（2）摇瓶培养：将母种接种于液体培养基培养，得到接种液；
（3）种子培养：将接种液接种于种子罐中的液体培养基内，通气搅拌发酵获得种子液；
（4）深层发酵：将种子液接种于发酵罐的液体培养基内，通气搅拌发酵；
（5）沉淀：将发酵液转入沉淀罐，加入絮凝剂，沉淀后过滤，得上清液；
（6）浓缩：将上清液转入真空浓缩罐，浓缩至一定密度出料，即得发酵产物；
步骤（1）中，斜面为马铃薯葡萄糖琼脂培养基；
步骤（2）-（4）中，所述液体培养基包括以下组分（g/L）：淀粉10，蛋白胨10，葡萄糖15，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，维生素B1 0.1，豆油0.2，液体培养基的pH为6.8-7.4。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中，接种量为8-15%；通气量为0.1-0.5vvm。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中发酵液的生物量为20g/L以上。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（5）中沉淀前还包括发酵液加热过程，加热温度为70-95℃；保温时间为4-6h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（5）中絮凝剂为壳聚糖。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（6）之后还包括将浓缩液干燥成固体的步骤。
8.一种如权利要求2-7任一方法制备的桦褐孔菌发酵产物作为家禽饲喂添加剂的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，桦褐孔菌发酵产物在家禽饲料中的添加量为0.2-2wt%。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，桦褐孔菌发酵产物在家禽饮水的添加量为0.1-5wt%。
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