CN102409015B

CN102409015B - 一种复合微生态制剂及其在饲料添加剂中的应用和预混料

Info

Publication number: CN102409015B
Application number: CN201110400531.6A
Authority: CN
Inventors: 杜建涛; 付维来; 刘鹏; 彭子欣; 王安如
Original assignee: BEIJING DBN AGRICULTURAL FEED Co Ltd; Hu'nan Dabeinong Agricultural Technology Co Ltd; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: Beijing Kegao Dabainong Biotechnology Co ltd; HUNAN DABEINONG AGRICULTURAL TECHNOLOGY CO LTD; Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2011-12-06
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2031-12-06
Also published as: CN102409015A

Abstract

本发明属于饲用微生态技术领域，涉及一种复合微生态制剂及其在饲料添加剂中的应用和预混料。该制剂含有嗜酸乳杆菌菌粉及地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌四种菌中的任二种、三种或四种的菌粉，制剂中的活菌含量高、水分含量低，具有耐胃酸、耐胆盐、耐高温及耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶及抑制病原菌等益生功能。本发明的复合微生态制剂能够提高饲料利用率，增加肉蛋奶等产量，促进动物生长，提高动物机体免疫力和抗病能力，部分替代抗生素，从而改变动物产品的品质。

Description

一种复合微生态制剂及其在饲料添加剂中的应用和预混料

技术领域

本发明属于饲用微生态技术领域，涉及一种复合微生态制剂及其在饲料添加剂中的应用和预混料。

背景技术

目前，对动物疾病的预防和治疗药物基本仍采用抗生素，但由于长期、大量使用抗生素，致病菌耐药性增强、菌群失调、免疫力下降、疾病复发率高、药物残留等种种弊端日益严重，同时也严重危害动物机体及人类健康。在此形势下，改变养殖观念、预防重于治疗，并开发应用无毒、无药残的新型绿色饲料添加剂是必然趋势。

微生态制剂室目前常用和研究较多的一种绿色、安全的饲料添加剂，此类制剂是用动物有益菌经工业化高密度发酵生产得到的，包含有很多的有益微生物及其代谢产物构成的活菌制剂，可以直接饲喂动物。微生态制剂通过维持肠道内微生态平衡而发挥作用，具有防病、增强机体免疫力、促进生长、增加体重等多种功能，且无污染，无残留，不产生抗药性，是一种绿色、安全的饲料添加剂。

市场上的微生态产品种类繁多，质量参差不齐，主要存在以下几个问题：(1)活菌含量低，而研究表明，如果一种菌在盲肠内容物中的浓度少于10⁷cfu/g，则该菌产生的酶及其代谢产物不足以影响宿主，难以满足治疗需要；(2)水分含量偏高，这样使得微生态制剂的保质期大大缩短，也是影响微生态制剂质量不好的重要原因之一；(3)不耐抗生素；(4)对胃酸和胆盐不稳定，致使只有少数菌株进入肠道后仍具有活性，达不到发挥作用所需的活菌数量。由于微生态制剂存在的这些质量问题，从而影响了其在动物饲喂中的应用效果，限制了微生态制剂的广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种包含多种全新益生菌的复合微生态制剂，此制剂包含具有耐胃酸、耐胆盐、耐高温及耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶及抑制病原菌等益生功能的多种益生菌，制剂中各益生菌活菌含量高、水分含量低。

本发明的另一目的在于提供该复合微生态制剂在制备禽畜饲料添加剂中的应用。

本发明还提供了包含该复合微生态制剂的预混料。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种复合微生态制剂，该制剂含有嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CGMCC No.5093菌粉及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.5094、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No.4756、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCCNo.5092、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.4628四种菌中的任二种、三种或四种的菌粉。

其中，本发明的复合微生态制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094菌粉、短小芽孢杆菌CGMCC No.4756菌粉和粪肠球菌CGMCC No.5092菌粉，上述四种菌粉的重量配比为0.8-2.5∶1∶0.8-1.2∶1.5-2.5，即可制成仔猪专用型复合微生态制剂，总有益菌含量为6-10×10⁹cfu/g。

其中，本发明的复合微生态制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094菌粉和枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628菌粉，上述三种菌粉的重量配比为0.8-3.5∶1-3.5∶0.8-2.5，即可制成饲料厂母猪产品专用复合型微生态制剂，益生菌数量在3-6×10¹⁰cfu/g。

其中，本发明的复合微生态制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094菌粉和粪肠球菌CGMCC No.5092菌粉，上述三种菌粉的重量配比为1.5-2.5∶0.8-1.2∶1，即可制成蛋鸡专用复合型微生态制剂，益生菌数量在2-5×10⁹cfu/g。

其中，本发明的复合微生态制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌粉、短小芽孢杆菌CGMCC No.4756菌粉和粪肠球菌CGMCC No.5092菌粉，上述三种菌粉的重量配比为2-2.5∶2-2.5∶1-1.5。

为更好的达到本发明的发明效果，本发明复合微生态制剂中所述的嗜酸乳杆菌CGMCCNo.5093菌粉的制备方法如下：按1-2％的接种量向发酵培养基中接入8h-12h菌龄的嗜酸乳杆菌种子液，发酵条件为：30-40℃，转速为60-100rpm，培养12-16h，得发酵液，发酵液离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量体积百分比为15-20％的冻干保护剂，混匀，于-25℃--45℃冷冻干燥，即得，所述的发酵培养基的成分及其质量体积比如下：葡萄糖1-2％，大豆蛋白胨1-2％，酵母膏1-2％，硫酸铵0.5-1.0％，磷酸氢二钾0.2-0.5％、氯化钠0.2-0.8％，硫酸镁0.01-0.05％；所述的地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094菌粉的制备方法如下：按质量体积比0.5-2％的接种量向发酵培养基中接入10-14h菌龄的地衣芽孢杆菌种子液，发酵条件为：30-40℃，转速为200-300rpm，培养15-22h，得发酵液，发酵液中加入质量体积比为20％-25％的填充物麦芽糊精，混匀，进行喷雾干燥，进风温度140-160℃，排风温度40-50℃，雾化器转速15000-18000rpm，即得，所述发酵培养基的成分及其质量体积比如下：麸皮1-2％，玉米粉0.5-1.5％，豆粕1-2％，硫酸铵0.5-2％，硫酸镁0.01-0.05％，柠檬酸铵0.3-1.2％、消泡剂0.05-0.1％，pH为6.2-7.4；所述的短小芽孢杆菌CGMCC No.4756菌粉的制备方法如下：按质量体积比1-2％的接种量向发酵培养基中接入12h-16h菌龄的短小芽孢杆菌种子液，发酵条件为：30-40℃，转速为100-300rpm，培养16-24h，得发酵液，发酵液中加入质量体积比为20-25％的填充物玉米淀粉，混匀，进行喷雾干燥，进风温度150-170℃，排风温度40-70℃，雾化器转速15000-20000rpm，即得，所述发酵培养基的成分及其质量体积比如下：葡萄糖1-2％，大豆蛋白胨1-2％，豆粕1-2％，硫酸铵0.5-1.0％，氯化钠0.2-0.8％，硫酸镁0.01-0.05％。

进一步，本发明的微生态制剂还包含载体，载体为麦芽糊精、硫酸钾铝、玉米芯粉、葡萄糖、油糠粉中的任一种或者两种。

本发明的复合微生态制剂可用于制备禽畜饲料添加剂。

本发明还提供了包含该复合微生态制剂的预混料，其中，预混料中复合微生态制剂添加的质量体积比为0.5-10‰。

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为申请人从牛肠道中分离、经定向初筛和复筛得到。其营养细胞杆状，其芽孢为椭圆或长筒形，为中生或次端生，孢囊稍膨大。孤立或呈短链，杆端半圆形。在12～16h内能形成菌落，菌落为圆形，或不规则，边缘毛发状，菌落白色，不透明，无褶皱。革兰氏阳性。申请人对此株地衣芽孢杆菌进行了耐酸性、耐胆盐、耐高温性、发酵特性和抑菌活性等实验，此株地衣芽孢杆菌具有对逆环境耐受性强、粘附性强、生长快、生物量大、抑菌活性好等特点。本发明的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)申请人已于2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.5094。本发明的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)为申请人从猪大肠中分离得到，其生物学特征如下：菌落圆整，表面光滑，不透明，乳白色，边缘光滑，革兰氏阳性菌；单个菌体为球状或椭圆状。本发明的粪肠球菌经过人工胃液、胆汁液及耐热性的筛选；又经过产酶能力筛选和抑菌能力筛选，可以耐受pH2.0，1％胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3％的人工胆汁液，可以耐受85℃的制粒温度，也可以抑制致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，具有较强的产酸和抑制豆粕、棉粕、玉米秸秆中霉菌的能力。本发明的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)申请人已于2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址同上，保藏编号为CGMCC No.5092。本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为申请人从猪粪便中分离得到，其生物学特征如下：菌落圆整，表面光滑，不透明，乳白色，边缘光滑，革兰氏阳性菌；单个菌体为杆状。本发明的嗜酸乳杆菌经过人工胃液、胆汁液及抗逆性的筛选；可以耐受pH2.0，1％胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3％的人工胆汁液，也可以抑制致病性大肠杆菌K88，痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌，具有较强的产酸和抑菌能力。本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)申请人已于2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址同上，保藏编号为CGMCC No.5093。本发明的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)为申请人首次在国内分离到的一株来源于动物消化道的新的短小芽孢杆菌，为申请人从牛的瘤胃中分离得到的一株芽孢杆菌优势菌株，经过生理生化及16s RNA分析鉴定，表明该菌属于短小芽孢杆菌，其分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，已于2011年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址同上，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.4756。本发明所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为申请人从传统发酵豆豉中分离得到，其生物学特征如下：菌落表面粗糙，不透明，污白色，菌落圆形，边缘呈锯齿状，革兰氏阳性菌；芽孢形态为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。本发明的枯草芽孢杆菌显著区别于现有的枯草芽孢杆菌，可以耐受pH2.0，1％胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3％的人工胆盐，可以耐受80℃的制粒温度，可以抑制致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，具有较强的产纤维素酶的能力，可以降解纤维素。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)已于2011年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址同上，保藏编号为CGMCC No.4628。

本发明中所选育的地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和短小芽孢杆菌在制备中采用液体深层高密度发酵技术和喷干或冷冻干燥等一系列的后处理加工工艺技术制成菌粉，制剂中的活菌含量高、水分含量低，具有耐胃酸、耐胆盐、耐高温及耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶及抑制病原菌等益生功能。本发明的复合微生态制剂能够提高饲料利用率，增加肉蛋奶等产量，促进动物生长，提高动物机体免疫力和抗病能力，部分替代抗生素，从而改变动物产品的品质。

通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何形式限制本发明的范围。

具体实施方式

实施例1、优良菌种的分离、筛选、选育及鉴定

1)增菌培养：将健康动物(猪或家禽)的新鲜粪便、肠道内容物样品接种于BPY液体培养集中，在37℃恒温培养增殖48h；

2)地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的分离纯化：对步骤1)增菌培养物100℃水浴5min，然后在BPY培养基平板上进行划线培养，从中挑取各个具有特征形态的菌落再划线培养和分离，直至为纯菌落为止，革兰氏染色镜检，将分离的疑似纯菌落接种试管斜面中增殖，然后保存于4℃冰箱中，待用；

菌落形态：菌落表面粗糙，无光泽，乳白色不透明，边缘不整齐，直径2-3mm，随着培养时间的延长，变为红褐色；镜检：细胞为杆菌1.6-3.8μm×0.6-1.2μm，革兰氏阳性，芽孢中生，椭圆形，不膨大，初步确定为芽孢杆菌；

通过对这几株疑似芽孢杆菌的菌进行16SrRNA鉴定，确定地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌两种。

3)嗜酸乳杆菌的分离纯化：对步骤1)增菌培养基在MRS培养基平板上进行划线培养，将分离的疑似纯菌落接种斜面中增殖，然后保存于4℃冰箱中，待用；

菌落形态：菌落圆整，表面光滑，有光泽，乳白色不透明，直径0.5-1.2mm，随着时间延长，颜色变暗发黄，细菌革兰氏阳性，单个菌体细长杆状。经鉴定，为嗜酸乳杆菌。

4)粪肠球菌CGMCC No.5092的筛选：

A、初筛

取样品猪粪、牛粪和鸡粪等样品各5g，浸泡于20ml无菌0.85％生理盐水中，震荡打散样品，使样品充分与生理盐水接触，70℃恒温水浴锅静置3分钟，取上清，5000rpm离心10分钟，弃去上清。将离心后的菌体沉淀加入10ml人工胃液中，37℃静置2h，然后离心，收集菌体后，将菌体沉淀加入10ml人工胆盐中，37℃静置4h，收集菌体，稀释涂布于LB培养基。37℃培养箱培养12-24h后，对菌落进行纯化分离。对得到的菌进行保存，并进一步复筛。

生理盐水的配制方法是：0.85％氯化钠溶液，高压灭菌后备用。

人工胃液的配制方法是：1％胃蛋白酶，0.85％氯化钠，用浓盐酸调pH值到2.0，经细菌过滤器过滤除菌后备用。

人工胆盐的配制方法是：在液体肉汤中添加0.3％的猪胆盐(分析纯)，高压灭菌后备用。

LB固体培养基的制作方法是：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂1.5％，pH7.0，高压灭菌后备用。

B、复筛

(1)将配置好、灭完菌的LB培养基温度冷却至45℃，加入过夜培养的大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌(每毫升培养基加入1微升菌液)，震荡混匀，倒入无菌平板，水平凝固后，每个平板利用四个牛津杯进行打孔，每只牛津杯中加入200μl待测菌液，盖好皿盖，小心移至37℃培养箱，平皿正放静置培养。培养20h后，打开皿盖，移去牛津杯，用卡尺测量抑菌圈直径。

5)枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628的筛选

A、初筛

纳豆、豆豉、腐乳、猪粪、鸡粪、牛粪等样品各5克，浸泡于20ml灭菌0.85％生理盐水，震荡打散样品，使样品充分和生理盐水接触，90℃恒温水浴锅静置10分钟，取上清5ml，5000rpm离心10分钟，弃去上清。菌体沉淀加入10ml人工胃液中，37℃静置2小时。5000rpm离心10分钟，弃去上清，将菌体沉淀加入10ml人工胆盐中，37℃静置4小时。震荡混匀后，梯度稀释涂LB培养基。30℃培养箱培养12-24个小时后，纯化菌落。得到纳豆样品中分离出的N-1、N-2菌，豆豉样品中分离出的C-1(CGMCC No.4628)、C-2菌，腐乳样品中没有分离到菌落，猪粪中分离出Z-1、Z-2菌，鸡粪中分离出J-1、J-2菌，牛粪中分离出F-1、F-2菌。初筛得到的菌株再进行进一步复筛。

生理盐水的配置方法是：0.85％的氯化钠，高压灭菌后备用。

人工胃液的配制方法是：1％胃蛋白酶，0.85％的氯化钠，用浓盐酸调pH值到2.0，细菌过滤器过滤备用。

人工胆盐的配置方法是：在液体肉汤中添加0.3％的猪胆盐(分析纯)，高压灭菌后备用。

B、复筛

(1)产纤维素酶能力的筛选

用无菌牙签将分离纯化出的菌株在0.5％羧甲基纤维素的LB-CMC培养基上进行点菌，30℃培养24h，用0.1％刚果红染色1小时，弃去染料，再用1M NaCl溶液洗涤1小时，根据菌落周围有无出现水解透明圈，测定透明圈与菌落直径，计算透明圈直径与菌落直径比值(H/C)，发现N-1、C-1(CGMCC No.4628)、C-2的水解透明圈较大，其中C-1的水解透明圈最大(表1)。

LB-CMC培养基的配置方法是：羧甲基纤维素0.5％，胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，高压灭菌20min。

表1水解透明圈与菌落直径比值(M/C)

实施例2、优良菌种的抗逆性和生物学性能的测定

1、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的生物学性能和抗逆性测定：

1)地衣芽孢杆菌的培养物的制备：将冰箱保藏的斜面菌种接种到BPY种子培养基中活化，37℃、200rpm培养18h，得到芽孢率在95％以上的培养物。

2)短小芽孢杆菌的培养物的制备：将冰箱中保藏的斜面菌种接种到BPY种子培养基中活化，35℃、100rpm培养16h，即得；

3)嗜酸乳杆菌培养物的制备：将冰箱中保藏的斜面菌种接种到MRS种子培养基中活化，37℃、静置培养16h，即得；

4)耐酸性测定：将上述制备的培养物按5％接种量分别接种于pH值2.0、3.0、4.0的人工模拟胃液中，0h计数作对照，2h、6h取样用磷酸缓冲液按10倍系列稀释，进行平板活菌技术，计算存活率。

本发明选育的3株菌种：地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在胃酸中存活率结果见表1.

人工模拟胃液的制备：量取9.5％-10.5％浓盐酸16.4mL，加蒸馏水至1000毫升，做基础人工胃液，用盐酸或氢氧化钠调pH值2.0、3.0、4.0，各取10ml(9ml)，分装于试管中，100℃下蒸汽灭菌15分钟，在无菌条件下，每10ml液体中加入0.100g胃蛋白酶，其试验结果如表2所示。

表2三株菌种在人工模拟胃液中的存活率

5)耐胆盐测定：将上述制备的3株菌种的培养物，按5％接种量分别接种于0.03％、0.1％、0.2％、0.3％不同浓度的猪胆盐溶液中，0h计数作对照，2h、6h取样用生理盐水按10倍系列稀释计数，进行平板活菌计数，计算存活率。

本发明所选育的3株菌种在胆盐中存活率结果见表3。

胆盐的制备：0.85生理盐水中各9毫升，分装于试管中，121℃下蒸汽灭菌30分钟，在无菌条件下，制成0.03％、0.1％、0.2％、0.3不同浓度的猪胆盐溶液，3种菌种在不同浓度猪胆盐中处理6h后的存活率结果见表3。

表3 3株菌种在不同浓度猪胆盐中处理6h的存活率

6)耐高温测定：将上述制备的3株菌种的培养物，分别于50℃、60℃、70℃、80℃水浴处理15min、30min，计算存活率，结果如表4所示。

表4三种菌种在不同高温下处理不同时间的存活率(％)

7)抑菌试验：采用牛津杯法对常见致病菌进行抑菌测定。

a、在装有10ml营养肉汁培养基的试管中活化4株致病菌：K88、K99、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌，37℃恒温培养20h；

b、双层平板的制备：取直径90mm的平板，注入灭菌的营养琼脂15-20ml，水平放置使之凝固，作为底层，另取营养琼脂(冷至50℃左右)与37℃、24h培养的指示菌液适量(50ml培养基加8ml左右)混匀，吸取10ml浇在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层；

c、加样品：用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。在牛津杯中加满相同量的发酵液上清液(约200uL)，每个样品2个重复。将加完样的双碟小心放入37℃恒温箱内，培养16-18h后，取出测量抑菌圈大小，结果如表5所示。

表5 3株菌种对常见致病菌的抑菌效果

2、粪肠球菌抗逆性的验证

(1)耐高温性

将培养12h的粪肠球菌进行离心收集，置入生理盐水中进行重悬后，取样涂布，计活菌数；再将生理盐水在70℃的水浴锅里加热十分钟后，迅速冷却，再进行平板计数，残存活菌数为85.3％。

(2)人工胃液的耐受性

取0.5ml培养12h粪肠球菌的菌液，溶于4.5ml生理盐水中，用平板计数法计活菌数。再取定量上述菌液加入4.5ml人工胆盐培养基中，37℃静置2h，平板计数法计残存活菌数，残存活菌数为92.2％。

(3)人工胆汁液的耐受性

取0.5ml培养12h粪肠球菌的菌液，溶于4.5ml生理盐水中，用平板计数法计活菌数。而后另取0.5ml上述菌液加入4.5ml人工胆汁液培养基中，37℃静置2h，平板菌落计数法计残存活菌数，残存活菌数为86.2％。

结果：以上几个实验表明，本发明中从猪大肠中分离到的粪肠球菌的抗逆性较强，可以耐受较高的温度，耐受人工胃液，人工胆盐，因此作为饲料添加剂使用，能够保证大量的菌体顺利通过动物的肠道，在肠道中存活，发挥其益生功能。

3、粪肠球菌(CMGCC No.5092)的益生功能

(1)抑菌功能验证

过夜培养的致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌菌液用平板计数法计数。分别在3管5ml的大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌中加入5ml粪肠球菌菌液。37℃培养4h，平板菌落计数法计算残存的大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌的活菌数。残存致病性大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌的活菌数为24.7％、30.2％和31.8％。

(2)在豆粕或者玉米粉中抑制霉菌的验证

取培养12h的粪肠球菌的菌液20ml，与30g玉米粉或者豆粕进行均匀混合，空白实验为20ml无菌水与30g玉米粉或者豆粕进行均质混合，然后分别在3d、5d、8d和10d对两瓶里面的玉米或豆粕及霉菌的生长情况进行观察。通过实验表明，在5天后，没有加入粪肠球菌菌液的玉米粉和豆粕中均有霉菌丝长出，而加入粪肠球菌菌液的玉米粉和豆粕的颜色仍然新鲜，有所分解但无霉菌斑或者霉菌丝的出现。

4、枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628抗逆性的验证

(1)制粒高温的耐受性

将0.5g菌粉溶于4.5mL灭菌生理盐水的玻璃试管中，用平板菌落计数法计算活菌数。将玻璃试管在90℃水浴锅中加热10分钟后，迅速冷却到室温，平板菌落计数法计算残存活菌数，残存活菌数为95.4％。

(2)人工胃液的耐受性

将0.5g菌粉溶于4.5mL灭菌生理盐水的玻璃试管中，用平板菌落计数法计活菌数。取0.5mL上述菌液加入4.5mL人工胃液中，37℃静置2小时，平板菌落计数法计残存活菌数，残存活菌数为93.7％。

(3)人工胆盐的耐受性

将0.5g菌粉溶于4.5mL灭菌生理盐水的玻璃试管中，用平板菌落计数法计活菌数。取0.5mL上述菌液加入4.5mL人工胆盐培养基中，37℃静置2小时，平板菌落计数法计残存活菌数，残存活菌数为97.7％。

验证性实验表明本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628的抗逆性强，可以耐受制粒高温，耐受人工胃液，人工胆盐，因此在经过饲料制粒，动物胃肠道环境后，还有大量活菌可以顺利进入动物的肠道，在肠道中存活，发挥益生功能。

5、枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628益生功能验证

(1)抑菌功能验证

过夜培养的致病性大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌菌液用平板菌落计数法计数。分别在3管4.5ml的大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌菌液中加入0.5g枯草芽孢杆菌CGMCCNo.4628的菌粉，37℃培养4小时，平板菌落计数法计算残存的大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌的活菌数。残存致病性大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌的活菌数为24.7％、28.8％和30.4％。

(2)产纤维素酶能力的验证

以2％接种量接种枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628菌粉到1000ml LB培养基，28℃发酵14小时，滴20uL发酵液在含0.5％羧甲基纤维素的LB-CMC培养基平板上，观察纤维素水解透明圈大小，计算水解透明圈直径与菌落直径比值为3.0。

实施例3、菌粉的制备

1、粪肠球菌(CMGCC No.5092)

(1)粪肠球菌(CMGCC No.5092)的高密度发酵

发酵粪肠球菌时用的发酵培养基由以下成分组成：红糖18g/L，蛋白胨4g/L，牛肉膏3g/L，酵母浸粉，0.8/L，七水合硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.005g/L，pH为7.2。

发酵条件为：发酵温度为37℃，发酵时间为12h，pH值为7.2，转速为100rpm，初始接种量为2％。发酵结束后，得到7.3×10⁹cfu/ml的菌液。

(2)粪肠球菌(CMGCC No.5092)菌粉的制备

对粪肠球菌进行高温喷雾干燥，保护剂与发酵液的质量体积比为1∶3的比例配制保护剂，其保护剂成分为：黄原胶∶海藻糖∶甘油∶谷氨酸钠∶麦芽糊精＝10∶10∶2.5∶2.5∶75，进风180℃，出风70℃，得到流散性好，易溶于水、活菌数在4×10¹⁰cfu/g的粪肠球菌菌粉。

2、枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628菌粉的制备

取过夜培养的枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628 10mL转接入500ml发酵培养基(初始接种量为2％)，28℃发酵14小时，pH值为7.0，转速为180rpm。发酵后，菌体离心，60℃烘干，菌粉4℃保存。

平板菌落计数法检测菌粉的活菌数约为10¹⁰CFU/g。

发酵培养基的组成为：蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，酵母浸粉1g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.0005g/L，pH 7.0。

平板菌落计数法的操作方法为：待测样品经适当倍数稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样品涂布到平板上，经过培养，每个单细胞生长繁殖形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的活菌数。

3、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094菌粉的制备

a.地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法，包括如下的步骤

1)平板培养复壮：将地衣芽孢杆菌菌种接种于BPY平板培养基上，于37℃培养16h，使地衣芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，37℃培养24h；

2)一级种子的制备：将步骤1)培养的枯草芽孢杆菌菌种转接茄子瓶BPY斜面培养基上，37℃培养16h，使处于对数后期，得一级种子；

3)二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有60L BPY种子培养基的100L种子罐中，温度37℃，转速220rpm，罐压0.05MPA，通风比：1∶0.7，培养12h，得二级种子液。

4)地衣芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照1％的接种量接种到5-8m³发酵培养基的发酵罐中，温度37℃，转速220rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1∶0.7，培养20h，至芽孢生成率90％以上，活菌数为1.6×10¹⁰cfu/ml，则终止发酵，得地衣芽孢杆菌发酵液；

所述的发酵培养基为：麸皮1.8％，玉米粉1.5％、豆粕2％，硫酸铵2％，硫酸镁0.04％；柠檬酸铵0.8％、消泡剂0.06％，pH为6.8。

5)地衣芽孢杆菌菌粉的制备：在步骤4)制备的发酵液中加入25％的填充物麦芽糊精，混匀，进行喷雾干燥，进风温度160℃，排风温度50℃，雾化器转速16000rpm，得到水分含量4.78％的地衣芽孢杆菌菌粉。

4、嗜酸乳杆菌菌粉的制备

1)平板培养复壮：将嗜酸乳杆菌菌种接种于MRS平板培养基上，于37℃培养16h，使嗜酸乳杆菌菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，37℃培养14h；

2)一级种子的制备：将步骤1)培养的嗜酸乳杆菌菌种转接装有300ml MRS液态培养基2L摇瓶里，37℃静置培养18h，至对数后期，得一级种子；

3)二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子转接到装有75LMRS种子培养基的100L种子罐中，温度37℃，转速80rpm，培养18h，得二级种子液。

4)嗜酸乳杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照1.5％的接种量接种到0.75m³发酵培养基的发酵罐中，温度37℃，转速80rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1∶0.2，培养18h，得到活菌数为4.67×10⁹cfu/ml嗜酸乳杆菌发酵液。

所述的发酵培养基为：葡萄糖2％，大豆蛋白胨1.8％，酵母膏1.5％，硫酸铵0.75％，磷酸氢二钾0.4％、氯化钠0.6％，硫酸镁0.04％；

嗜酸乳杆菌菌粉的制备：将步骤4)制备的发酵液，4000rpm离心，得到菌泥，加入与菌泥的质量/体积百分比为20％的冻干保护剂，混匀，于-40℃冷冻干燥，得到水分含量为4.5％的粪肠球菌菌粉。

冻干保护剂的组成为：脱脂奶粉、甘油、乳糖、玉米淀粉和谷氨酸钠的混合物，按照脱脂奶粉：甘油∶乳糖∶玉米淀粉∶谷氨酸钠＝2∶1∶1∶0.8的比例混合而成。

5、短小芽孢杆菌菌粉的制备

1)平板培养复壮：将短小芽孢杆菌菌种接种于BPY平板培养基上，于37℃培养18h，使短小芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，37℃培养30h；

2)一级种子的制备：将步骤1)培养的短小芽孢杆菌菌种转接茄子瓶BPY斜面培养基上，36℃培养14h，使处于对数后期，得一级种子；

3)二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有60L BPY种子培养基的100L种子罐中，温度37℃，转速300rpm，罐压0.05MPA，通风比：1∶0.8，培养12h，得二级种子液。

4)短小芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照1％的接种量接种到6m³发酵培养基的发酵罐中，温度30-40℃，转速280rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1∶0.8，培养24h，得到芽孢生成率90％以上，活菌数为5.48×10⁹cfu/ml的短小芽孢杆菌发酵液；

所述的发酵培养基为：葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨1.5％，豆粕1.5％，硫酸铵0.75％，氯化钠0.6％，硫酸镁0.05％；pH自然。

5)短小芽孢杆菌菌粉的制备：在步骤4)制备的发酵液中加入25％的填充物玉米淀粉，混匀，进行喷雾干燥，进风温度165℃，排风温度60℃，雾化器转速16000rpm，得到水分含量3.85％的短小杆菌菌粉。

实施例4、复合微生态制剂的制备

实施例3中得到的几种菌粉根据不同的比例与载体混合后，可以得到适用于不同的禽畜的专用性复合微生态，其中仔猪专用、母猪专用和蛋鸡专用型复合微生态如表6所示。

表6几种复合微生态的制备方法

实施例5、实施例4制备的仔猪专用型复合微生态制剂对仔猪的功效试验

试验动物：选用35日龄断奶，体重在9KG左右的杜长白仔猪做为试验动物300头，一批选齐，出生日期相差不超过7天。试验期为30天，预饲期为7天。饲养采用地面平养饲养，各组件除日粮不同外，其他条件完全一致，按常规进行，人工投料、自由采食、自由饮水、保持猪舍清洁。

测试指标及方法：在试验开始和结束时早晨空腹对猪只进行称重，分别以重复组为单位进行全群称重、计算耗料量、日增重、料肉比、腹泻率等指标，并进行差异性显著检验，试验结果如表7所示：

表7仔猪专用型微生态制剂对仔猪饲喂功效试验结果

从表中可以看出，在平均增重仔猪试验组I、试验组II和试验组III比对照组分别提高了7.5％、7.3％、9.5％；在料肉比方面试验I、试验组II和试验组III比对照组分别降低了5.5％、5.2％、8.0％；在腹泻率方面试验I、试验组II和试验组III比对照组分别降低了67.3％、47.7％、70.1％。试验I组和试验II相比在日增重、料肉比方面差异不显著，但是在预防腹泻方面差异显著，说明仔猪专用型复合微生态制剂可以替代饲料中预防腹泻的抗生素。

实施例6、实施4中制备的母猪专用型复合微生态制剂对哺乳母猪的试验

1、试验方法

试验猪的选择：从猪场选择临产前一周左右的母猪，选取健康无病、猪龄、胎次、体重基本一致的母猪18头随机分成两组，试验组和对照组9头。

饲料组成：对照组饲喂基础日粮，试验组为基础日粮基础上添加1‰母猪专用型复合微生态制剂。

饲养管理：试验在本场的同一产房内进行，由同一饲养人员饲喂，饲养管理条件一致，饲料采取干料加水拌湿后饲喂，在试验母猪转入产床时开始饲喂试验料，日喂3次，自由采食，以吃饱不剩料为原则。试验组和对照组分别统计耗料量、仔猪出生重和28天断奶体重，采取全天供水的办法，任猪自由饮水。每日清扫圈舍，随时观察生长和健康情况。

2、试验结果分析

在试验期内，添加饲喂0.1％母猪专用型复合微生态制剂的试验组28天断奶均重为8.27kg，而未添加母猪专用型复合微生态制剂的对照组28天断奶均重为7.54，试验组比对照组多增重0.73kg，经检验，两组差异显著(p＜0.05)，且试验组成活率明显高于对照组，其成活率分别为85.83％和91.67％。结果见表8。

表8母猪专用型复合微生态制剂对哺乳母猪生产性能的影响

	对照组平均值	试验组平均值
			出生活仔数	9.11	9.44

出生均重(kg)	1.60	1.56
			3日龄调整数	10.67	10.67
3日龄调整均重(kg)	1.90	1.79
			7日龄补饲前均重(kg)	2.53	2.50
28天断奶数	9.78	10.22
			断奶均重	7.54	8.27

实施例7实施4中制备的蛋禽专用型复合微生态制剂对蛋鸡的功效试验

试验动物：随机选用60周龄矮小蛋鸡3000只，随机分为2组，每组1500只，按照随机分组安排试验。试验组I为空白对照组(基础日粮)；试验组II为试验组(基础日粮+0.1％蛋禽专用型复合微生态制剂)，试验鸡尾三层笼养，每笼3只，自由采食和饮水，按常规进行饲养和管理。

测定指标：每天观察记录每重复产蛋数、蛋重、不合格蛋数和鸡汁死淘情况；每周末统计耗料量；分别统计每组鸡产蛋后期的产蛋率、蛋重、破损率、死亡率、采食量和料蛋比。

表9蛋禽专用型复合微生态制剂对矮小蛋鸡生产性能的影响

结果分析：1、在饲料中添加0.1％蛋禽专用型复合微生态制剂能够显著提高蛋鸡的产蛋率，产蛋率提高2.80％；2、在饲料中添加0.1％蛋禽专用型复合微生态制剂能够减少疾病的发生和降低蛋鸡的死亡率；3、在饲料中添加0.1％蛋禽专用型复合微生态制剂能够提高机体的免疫力，预防由于热应激或接种疫苗等方面引起的应激反应。

综上所述，本发明的微生态制剂添加至饲料中，对保证鸡只监控状态、协调促进机体消化吸收能力、提高蛋鸡生产性能和饲料的消化利用率等均有很好的作用。

Claims

1.一种复合微生态制剂，其特征在于该制剂含有嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) CGMCC No.5093菌粉，及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.5094、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No.4756、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCCNo.5092、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.4628四种菌中的任二种、三种或四种的菌粉。

2.如权利要求1所述的复合微生态制剂，其特征在于制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094菌粉、短小芽孢杆菌CGMCC No.4756菌粉和粪肠球菌CGMCC No.5092菌粉，上述四种菌粉的重量配比为0.8-2.5∶1∶0.8-1.2∶1.5-2.5。

3. 如权利要求1所述的复合微生态制剂，其特征在于制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094菌粉和枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628菌粉，上述三种菌粉的重量配比为0.8-3.5∶1-3.5∶0.8-2.5。

4. 如权利要求1所述的复合微生态制剂，其特征在于制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094菌粉和粪肠球菌CGMCC No.5092菌粉，上述三种菌粉的重量配比为1.5-2.5∶0.8-1.2∶1。

5. 如权利要求1所述的复合微生态制剂，其特征在于制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌粉、短小芽孢杆菌CGMCC No.4756菌粉和粪肠球菌CGMCC No.5092菌粉，上述三种菌粉的重量配比为2-2.5∶2-2.5∶1-1.5。

6. 如权利要求1所述的复合微生态制剂，其特征在于所述的嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌粉的制备方法如下：按1-2％的接种量向发酵培养基中接入8h-12h菌龄的嗜酸乳杆菌种子液，发酵条件为：30-40℃，转速为60-100rpm，培养12-16h，得发酵液，发酵液离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量体积百分比为15-20％的冻干保护剂，混匀，于-25℃--45℃冷冻干燥，即得，所述的发酵培养基的成分及其质量体积比如下：葡萄糖1-2％，大豆蛋白胨1-2％，酵母膏1-2％，硫酸铵0.5-1.0％，磷酸氢二钾0.2-0.5％、氯化钠0.2-0.8％，硫酸镁0.01-0.05％；所述的地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094菌粉的制备方法如下：按质量体积比0.5-2％的接种量向发酵培养基中接入10-14h菌龄的地衣芽孢杆菌种子液，发酵条件为：30-40℃，转速为200-300rpm，培养15-22h，得发酵液，发酵液中加入质量体积比为20％-25％的填充物麦芽糊精，混匀，进行喷雾干燥，进风温度140-160℃，排风温度40-50℃，雾化器转速15000-18000rpm，即得，所述发酵培养基的成分及其质量体积比如下：麸皮1-2％，玉米粉0.5-1.5％，豆粕1-2％，硫酸铵0.5-2％，硫酸镁0.01-0.05％，柠檬酸铵0.3-1.2％、消泡剂0.05-0.1％，pH为6.2-7.4；所述的短小芽孢杆菌CGMCC No.4756菌粉的制备方法如下：按质量体积比1-2％的接种量向发酵培养基中接入12h-16h菌龄的短小芽孢杆菌种子液，发酵条件为：30-40℃，转速为100-300rpm，培养16-24h，得发酵液，发酵液中加入质量体积比为20-25％的填充物玉米淀粉，混匀，进行喷雾干燥，进风温度 150-170℃，排风温度40-70℃，雾化器转速15000-20000rpm，即得，所述发酵培养基的成分及其质量体积比如下：葡萄糖1-2％，大豆蛋白胨1-2％，豆粕1-2％，硫酸铵0.5-1.0％，氯化钠0.2-0.8％，硫酸镁0.01-0.05％。

7. 如权利要求1-6任一项所述的复合微生态制剂，其特征在于进一步包含载体，载体为麦芽糊精、硫酸钾铝、玉米芯粉、葡萄糖、油糠粉中的任一种或者两种。

8. 权利要求1-7任一项所述的复合微生态制剂在制备禽畜饲料添加剂中的应用。

9. 一种包含权利要求1-7任一项所述的复合微生态制剂的畜禽预混料，其特征在于预混料中复合微生态制剂添加的质量体积比为0.5-10‰。