CN115191523B - 一种水质改良型发酵饲料的生产方法及在水产养殖中的应用 - Google Patents

一种水质改良型发酵饲料的生产方法及在水产养殖中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物饲料领域，涉及一种水质改良型发酵饲料生产方法及在水产养殖中的应用；步骤为：筛选发酵菌种中无机氮转化能力较好的产朊假丝酵母，协同乳双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌活化得到发酵种子液，接种到厌氧发酵培基中进行发酵，发酵后得到饲料成品；并利用PMA‑qPCR方法检测发酵饲料中产朊假丝酵母活菌的数量；可进一步添加α‑淀粉和黄原胶后作为粘合剂，用于水产养殖时提升饲料在水中的稳定性。本发明饲料的使用可以有效净化水质、高效转化无机氮，显著提高水产养殖效益；此外，还可加入碳源控制碳氮比为10‑20，能更好更快的转化水体中的无机氮、优化水体菌群结构、抑制病害杂菌，提高动物生产性能、改善免疫指标。

Description

一种水质改良型发酵饲料的生产方法及在水产养殖中的应用
技术领域
本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种水质改良型发酵饲料的生产方法及在水产养殖中的应用。
背景技术
近年来，水产养殖存在因饲料投放过量，饲料利用率低，养殖动物***导致的水质差、饲养效益低等问题。生物絮团技术被应用于解决水产养殖中无机氮过多和水体频繁换水问题，且添加益生菌也是帮助净化水质，减少病害菌，提高动物免疫力的常用手段。但在盲目添加碳源改善水质的同时，水体中杂菌大量生长，给水产养殖带来一定的风险。微生物是水体中重要组成单元，微生物群落结构的变化影响着生物絮团的功能。如何人为定向控制菌群结构是水产养殖调控中的关键技术。投放菌种的方式有菌液直接投放、菌液混合饲料饲喂使用、制备活菌发酵料使用等，其中菌液直接投放工作量增加，成本也增加。
目前已有一些研究将产朊假丝酵母应用于各类饲料制剂，如专利CN202210051444.2中将植物提取物和含产朊假丝酵母的益生菌菌剂复配进行使用提高动物免疫力。CN202011394949.6采用不同中药组合作为发酵原料，利用含产朊假丝酵母的益生菌进行发酵制备制剂。此两个授权发明专利均未从菌种影响方面阐述选用产朊假丝酵母及其他菌种搭配的理由，且对应用实例中产朊假丝酵母活菌的影响也无准确探究。尤其像专利CN202011394949.6中已在步骤3中将产朊假丝酵母培养液与固体基料混合发酵24h，后又在45℃下干燥48h，其活菌数很难保证，故在后期步骤6中又补充活菌来保证产朊假丝酵母活菌数，制作步骤上比较复杂，且效果还有待提高。总体来讲这些文献所用产朊假丝酵母不是从水质改良角度去发挥作用；同时针对水产养殖中对于改善水质的发酵饲料研究也鲜有报道。
发明内容
本发明从菌种筛选出发，通过对益生菌筛选得到高效利用三态无机氮的产朊假丝酵母，并发现其活菌能有效抑制嗜水气单胞菌活菌的生长，以确定产朊假丝酵母为主要发酵菌种制备发酵饲料，并保证在发酵过程中产朊假丝酵母一定的活菌含量，为水质改善提供基础。本发明的目的在于提供一种水质改良型水产发酵饲料的特别制作方法，既能提高饲料利用率改善肠道，特别又能改善水质、转化氨氮、控制菌群，抑制有害菌。通过筛选高效转化氨氮的产朊假丝酵母，搭配乳双歧乳杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌进行厌氧固态发酵豆粕、豆渣和次粉，控制发酵条件，从而制备一种富含产朊假丝酵母活菌的发酵饲料，小肽含量高，具有酸香味，含有产朊假丝酵母活菌菌量高，适口性好，饲料利用率高，生产成本低，具有较强的养殖塘水质改善作用。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案具体如下：
(1)将枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌、植物乳酸菌和乳双歧杆菌分别接种到相应的液体培养基中进行活化培养，经培养后得到各菌种的发酵种子液；
(2)将步骤(1)得到的种子液分别接种到厌氧发酵培养基中，混合均匀，得到厌氧发酵混合物，所述厌氧发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：豆粕40％～55％、豆渣35％～40％、次粉8％～10％；
调整发酵温度为20～35℃，培养基含水量为38～55％，在密封条件下进行厌氧发酵，厌氧发酵4-30天后获得成品，得到产朊假丝酵母发酵饲料，即为水质改良型发酵饲料。
优选的，步骤(2)中所述产朊假丝酵母种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的2％～4％(v/m，mL/g；即每100g培养基添加2～4mL种子液；下同)；所述产朊假丝酵母种子液的活菌总数为1.3×107～2.7×108cfu/mL。
优选的，步骤(2)中所述枯草芽孢杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的1％～3％；所述枯草芽孢杆菌种子液的活菌总数为1.0×108～2.1×109cfu/mL。
优选的，步骤(2)中所述乳酸菌种子液包括乳双歧杆菌种子液和植物乳杆菌种子液的一种或多种；乳双歧杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的4％～6％(v/m，mL/g)，所述乳双歧杆菌种子液的活菌总数为2.5×108～5.3×109cfu/mL；植物乳杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的1％～4％(v/m，mL/g)，所述植物乳杆菌种子液的活菌总数为1.1×108～3.7×109cfu/mL。
优选的，步骤(2)中所述发酵的温度为25～32℃，时间为5～15天。
优选的，步骤(2)中所述调整培养基的含水量为40％～50％。
本发明所制备的水质改良型发酵饲料用于添加到水产养殖饲料中进行水产养殖的用途，具体操作是：将产朊假丝酵母发酵饲料添加到水产养殖饲料中得到混合饲料进行喂养；所述产朊假丝酵母发酵饲料的添加量占混合饲料的重量为25％～50％，同时添加占混合饲料重量0.2～0.6％的黄原胶和/或2.5％～5％的α-淀粉。
优选的，当产朊假丝酵母发酵饲料的添加量占混合饲料的重量为25％时，添加0.2％～0.4％的黄原胶。
优选的，当产朊假丝酵母发酵饲料的添加量占混合饲料的重量为50％时，添加2.5％～5％的α-淀粉。
优选的，所述混合饲料进行喂养时，当混合饲料投入水体后，再投入碳源，使得碳源与混合饲料整体的碳氮比为10～20；所述碳源为葡萄糖或糖蜜。
优选的，产朊假丝酵母发酵饲料制备完成后，当产朊假丝酵母发酵饲料的添加量占混合饲料的重量比为25％时，添加0.4％黄原胶；当产朊假丝酵母发酵饲料的添加量占混合饲料的重量比为50％时，添加2.5％～5％的α-淀粉；其能够增加饲料在水中的稳定性。
使用的α-淀粉为对土豆淀粉、α-淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、羧甲基淀粉、大麦淀粉、绿豆淀粉共8种淀粉进行搭配产朊假丝酵母发酵饲料和鱼粉全价料进行制备软团，测定失重率进行比较筛选后得到。
使用的黄原胶为选取市面上不同厂家及种类的粘合剂共12种：卡拉胶、魔芋粉、瓜尔胶、海藻酸钠、黄原胶、L型卡拉胶、K型卡拉胶、瓜尔胶1600、瓜尔胶6000等，进行生物饲料替代25％、50％鱼粉全价料的搭配使用，测定失重率进行比较筛选后得到。
优选的，为使得效益更好，在搭配碳源投放养殖水体控制C/N为10～20时候效果最佳。通过配合益生菌使用，添加碳源控制进入水体的碳氮比为10～20，能够有效促进投放的益生菌定植水体，优化水体中菌群结构，增强水体净化功能，减少病害杂菌的生长。其中C/N为15时产朊假丝酵母定植水体菌数最多，效果最为显著。
菌种来源：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC1.921、乳双歧杆菌(Bifidobacterim animalis subsp.lactis)CGMCC1.15623、产朊假丝酵母(Candidautilis)为CGMCC2.587及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC1.557；上述菌种均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
工艺小结：通过扩培各发酵菌种，并将发酵菌种种子液接种固态培养基中进行厌氧发酵，产朊假丝酵母(接种2％～4％)、枯草芽孢杆菌(接种1％～3％)、乳双歧杆菌(接种4％～6％)和植物乳杆菌(接种1％～4％)，而后发酵温度为20～35℃，含水量为38％～55％，发酵至6～30天最佳。替代鱼粉全价料的时候搭配2.5％α-淀粉和0.4％黄原胶能提高稳定性，实现饲料更好的应用；该饲料搭配碳源投放养殖水体控制C/N为10～20时候效果最佳。
一、筛选水质无机氮处理和转化较好的益生菌
芽孢杆菌、酵母、乳酸菌共十五株的无机氮转化能力测定：选取五种芽孢杆菌、四种酵母菌、六种乳酸菌用不同培养基进行活化扩培，活化后得到种子液；
在人工养殖废水接种1％(V/V，即每100ml废水中接种1ml种子液)的种子液，加入单一不同形式的无机氮源，给予充足的速效碳源(葡萄糖)在150rpm、30℃培养24h后进行测定废水中各无机氮剩余含量；每组设置三个平行。
由图1、图2、图3可看出以上益生菌中产朊假丝酵母为无机氮转化利用能力最佳的菌种；由图4可得产朊假丝酵母可对三种无机氮直接利用转化为菌体蛋白。
二、产朊假丝酵母抑菌实验
分别在100mL培养基中接入活化后的嗜水气单胞菌1mL，设置组别为单独的嗜水气单胞菌、添加1mL产朊假丝酵母活菌菌液(活化后的)+嗜水气单胞菌、添加1mL产朊假丝酵母死菌菌液(活化后进行煮沸、冷冻)+嗜水气单胞菌，接入后摇床30℃，150rpm培养。12h后取菌液进行PMA处理，再提取基因进行嗜水气单胞菌引物qPCR。
在固体培养基平板上涂布活化后的嗜水气单胞菌，再放置小圆滤纸片(6mm)，在滤纸片上滴10uL液体：分别为培养基液体、氨苄抗生素(0.2mg/mL)、产朊假丝酵母活菌菌液、产朊假丝酵母死菌菌液；放置恒温培养箱30℃培养24h后观察抑菌圈大小。
由图5PMA-qPCR数据可得，产朊假丝酵母活菌可有效抑制嗜水气单胞菌的活菌生长(P＜0.01)，但灭活后的菌体无作用。
由图6得平板C处产朊假丝酵母抑菌圈可看出产朊假丝酵母活菌可在涂布着嗜水气单胞菌的平板上生长，且长出圆形滤纸片范围，并有小范围的抑菌圈。以上说明产朊假丝酵母活菌对嗜水气单胞菌存在抑制作用。但灭活的产朊假丝酵母不能抑制活的嗜水气单胞菌。所以保证微生物饲料中产朊假丝酵母的活菌数量是非常重要的。
选用的发酵酵母为筛选得到的产朊假丝酵母，能够直接有效转化水体中三态无机氮，合成自身菌体蛋白，帮助净化水体，并能够优化水体菌群结构，抑制水产养殖病害菌，如嗜水气单胞菌的生长，减少养殖动物感染细菌病害，利于水产养殖效益提高。
三、产朊假丝酵母发酵搭配菌种筛选
选用产朊假丝酵母制备发酵饲料时，选用的搭配菌种为PMA-qPCR检测发酵活菌实验后所选择的：
称取5kg豆粕、4kg豆渣和1kg次粉作为发酵原料，以按照表一和表二接种3％(V/m，mL/g；即每100g发酵原料接种菌种种子液3mL，下同)接种量分别接入以下菌种组合(表1、表2)，控制发酵体系的含水量45％，在30℃直接封包发酵。在发酵0、1、3、5、7天时取样进行PMA处理后提取DNA，准备后续qPCR实验。
表1不同菌种属搭配发酵测定产朊假丝酵母活菌数
表2不同乳酸菌单菌搭配发酵测定产朊假丝酵母活菌数
测定结果：
由图7可得，各组别产朊假丝酵母活菌峰值的比较可看到单独加入乳酸菌组别(c)＞乳酸菌枯草芽孢杆菌组别(d)＞产朊假丝酵母单独组别(a)＞加入枯草芽孢杆菌组别(b)。而后面的发酵过程中，各组别产朊假丝酵母活菌均开始下降。
由图8可得，各组别产朊假丝酵母活菌数量峰值也是在第一天出现，峰值最大的几个组别为乳双歧杆菌组别(F)(2.528×107copies/g)植物乳杆菌组别(A)(2.498×107copies/g)、干酪乳杆菌组别(D)(2.254×107copies/g)，产朊假丝酵母(H)单独生长峰值活菌数较低，而与单独产朊假丝酵母组别活菌数差不多的为副干酪乳杆菌组别(E)、六种乳酸菌共同添加组别(G)。可看到发酵至七天时，鼠李糖乳杆菌组别(B)和全部乳酸菌(G)添加组别能保持较高活菌，但随着时间延长，产朊假丝酵母活菌数一直下降，到两周时候各组活菌数已经很低，但所剩活菌数较高的为植物乳杆菌组别(A)、乳双歧杆菌组别(F)和全部乳酸菌(G)添加组别。如发酵第十一天，添加植物乳杆菌组别(A)产朊假丝酵母活菌数还能维持8.34×105copies/g。对比产朊假丝酵母单菌组别可看到，无论加入单个还是多个乳酸菌均能够有效提高产朊假丝酵母的活菌数，效果最佳的为植物乳杆菌和乳双歧杆菌。
设计将产朊假丝酵母与乳酸菌和枯草芽孢杆菌共同发酵，虽然枯草芽孢杆菌的存在减少产朊假丝酵母活菌数，但枯草芽孢杆菌能高效产酶降解蛋白、植酸和高聚糖等，是发酵过程中经常研究，应用最广的发酵菌种。且实验中乳酸菌组别和乳酸菌加枯草芽孢杆菌组的产朊假丝酵母活菌均高于产朊假丝酵母单菌对照组，在乳酸菌存在情况下，枯草芽孢杆菌的抑制效果不明显，故选用该菌种搭配进行后续发酵。
一步法发酵采用植物乳酸菌和乳双歧杆菌搭配产朊假丝酵母，能够有效提升固态发酵中的酵母活菌数量，可便捷制备，无需后续补充菌液保证投放的活菌。并通过该饲料添加产朊假丝酵母活菌进入养殖水体，免去水产养殖过程中向水体额外倾倒产朊假丝酵母菌液的步骤，更加便利。同时在配合鱼粉全价料使用，减少鱼粉使用压力，提高饲料吸收率。
四、产朊假丝酵母发酵饲料工艺优化
由图9可得，发酵时间单因素实验中可看到发酵5天后小肽含量才较高，故产朊假丝酵母发酵饲料的发酵货架期需选择在6天以后。
发酵原料组成为：5kg豆粕，4kg豆渣，1kg次粉；
根据图9单因素实验结果，接种产朊假丝酵母、植物乳杆菌、乳双歧杆菌、枯草芽孢杆菌，确定接菌量5％(V/m，mL/g)，发酵时间为7天，添加蛋白酶种类为0.33％酸性蛋白酶+0.33％菠萝蛋白酶+0.33％木瓜蛋白酶。以小肽含量为响应值，酶添加量、发酵温度、固态发酵含水量为响应变量，用Design Expert 8.0.6的Box-Behnken Design(BBD)设计响应面优化实验。
设计的实验组别和数据见表3；
表3响应面实验设计与结果
将数据进行多元回归拟合，得到A(酶添加量)、B(发酵温度)、C(固态发酵含水量)与产朊假丝酵母发酵饲料中小肽含量(X)之间的二次多项式模型方程为：
X＝-838.058+9.183*A+6.95515*B+29.24425*C+0.059*A*B+0.019*A*C0.0216*B*C-3.984*A2-0.12114*B2-0.29214*C2
响应面3D图和等高线图见图10。响应面模型方程预测的最佳发酵工艺为：接种产朊假丝酵母、植物乳杆菌、乳双歧杆菌、枯草芽孢杆菌菌，菌接种量15％、使用蛋白酶为酸性蛋白酶+木瓜蛋白酶+菠萝蛋白酶，酶添加量1.351％、发酵温度33.954℃、固态发酵含水量51.607％。此时，小肽含量理论值为36.61％。为了便于验证，对各参数进行了修正：发酵原料为：称取5kg豆粕，4kg豆渣，1kg次粉；接种量15％(V/m，mL/g)，发酵温度34℃，固态发酵含水量51.5％。实验重复3次，小肽含量平均值为36.54％，与理论值接近。故选用该工艺发酵能使得产朊假丝酵母小肽含量更高。本发明方法采用豆渣和豆粕这种价格低廉的豆制品作为发酵原料，生产成本低；并采用一步法混菌协同厌氧发酵工艺，物料损失少，生产过程中不易污染，生产工艺简便易操作，并能保留较高产朊假丝酵母活菌的同时保证发酵饲料的小肽含量。
五、产朊假丝酵母发酵饲料活菌测定方法
制作产朊假丝酵母标准曲线:将产朊假丝酵母基因组DNA用产朊假丝酵母特异性引物进行PCR扩增，该引物是以产朊假丝酵母基因internal transcribed spacer和5.8Sribosomal RNA gene作为目标基因所设计，上游引物F:GCGGCTCCAACCAATACACA，下游引物R:GTATCGCATTTCGCTGCGTT，扩增片段大小为178bp；获得的PCR产物经切胶、回收后，稀释至1×102～1×109拷贝/μL，作为标准品进行荧光定量PCR(qPCR)反应，记录荧光定量PCR反应过程中产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数(Ct值)；将测得的标准品DNA浓度换算成拷贝数，以拷贝数的对数值为横坐标，对应Ct值为纵坐标，生成标准曲线；
其中拷贝数计算公式如下：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)；
取实施例1制备的产朊假丝酵母发酵饲料，进行PMA处理后提取DNA进行qPCR检测，称取2g产朊假丝酵母发酵饲料，加入20L PBS缓冲液，振荡20分钟后用8层纱布过滤，取1L滤液，12000pm离心5分钟，弃上清，加入400L TE Buffer，在400μL待测样品中加入PMA稀释液使得PMA终浓度为50μM，多次颠倒晃动，充分混匀后避光反应10min。避光完毕后将样品放置冰中，用卤素灯照射5min控制距离为20cm左右。光照反应时间结束后在12000rpm离心2min，舍去上清，用PBS缓冲液洗涤2次沉淀后保存于-20℃，用于后续的DNA提取。之后100℃煮沸3分钟，-20℃冷冻10分钟，再100℃煮沸3分钟，冷却后8000rpm离心1分钟，吸取上清液，得到饲料样品DNA模板；再进行qPCR得到Ct值，根据所得标准曲线计算产朊假丝酵母数量。所述qPCR反应体系为SYBR Green Premix Ex Taq 10μL，Rox Reference Dye 0.4μL，上、下游引物各0.8μL，DNA模板2μL，ddH2O 6μL；所述qPCR反应条件：95℃预变性30s，扩增95℃5s、60℃30s共40个循环。
本发明应用PMA-qPCR方法检测产朊假丝酵母发酵饲料发酵过程中产朊假丝酵母的活菌数量，检测时间短、灵敏度高，为本发明生物饲料固态发酵过程中活菌菌群变化的准确检测提供保障。
六、对于甲鱼和鳗鲡进行剂型配比设计，优化粘合剂添加工艺
其中水产养殖饲料选择鱼粉全价料；鱼粉全价料饲料购买自广东省佛山市南强牌配合饲料。
应用实施例1制备的产朊假丝酵母发酵饲料于甲鱼和鳗鲡养殖中替代部分鱼粉全价料，针对替代全价料鱼粉饲料25％和50％进行粘合剂搭配使用，考虑实际应用，测定所制饲料丸子的水中稳定性。
组别1：25％产朊假丝酵母发酵饲料+75％鱼粉全价料饲料；
组别2：50％产朊假丝酵母发酵饲料+50％鱼粉全价料饲料；
参考中华人民共和国水产行业标准渔用配合饲料通用技术要求SC/T 1077-2004。为满足粉状饲料(面团)龟鳖类要求浸泡时间60min，溶失率要在5％以内。将不同组别的饲料制备成软团，一份制备12颗，分为四组，每组每颗称重，一组做对照放入105℃烘箱烘干称重，计算干重率，另外三组均进行浸泡60min后捞出，进行105℃烘箱进行烘干称重，再与之前计算的对应干重进行比较，根据式1计算失重率。
M0为浸泡实验各组丸子初始湿重，M1为浸泡实验组丸子浸泡后烘干的干重，A为对照组烘干计算的干重率。
组别3：为50％产朊假丝酵母发酵饲料+50％鱼粉全价料饲料，进行粘合剂剂型优化。
各种组别设置三个水平(2.5％、5％、10％)添加不同种类淀粉(分别为α-淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、羧甲基淀粉、大麦淀粉、玉米淀粉、绿豆淀粉)，由图11可得，发现α-淀粉对提高饲料粉团的水中稳定性有较好效果。而有些淀粉在添加后反而会提高失重率，可能跟不同淀粉品质及种类不同有关；故选用α-淀粉进行后续试验。
在添加25％产朊假丝酵母发酵饲料时(即为25％产朊假丝酵母发酵饲料+75％鱼粉全价料饲料)，计划通过添加(配伍后)全部饲料总重的0.4％不同的粘合剂(分别为瓜尔胶、魔芋粉、卡拉胶、海藻酸钠、黄原胶)来提升饲料粉团水中稳定性，减少水中营养物质散失。如图12所示，失重率能够符合标准的为：魔芋粉、黄原胶、卡拉胶L、瓜尔胶。因考虑价格因素，选用黄原胶进行后续试验。
如图13所示，与0.4％的黄原胶对比，0.2％的黄原胶与0.2％其他四种粘合剂搭配效果并不好，故继续采用黄原胶单独添加。
故应用该产朊假丝酵母发酵饲料替代25％鱼粉全价料时添加0.4％黄原胶能有更好的水中稳定性，替代50％鱼粉全价料时添加2.5％α-淀粉能有更好的水中稳定性。通过α淀粉和黄原胶的配合使用能够保证该产朊假丝酵母发酵饲料配合鱼粉全价料使用时，软团饲料的水中溶散率低，营养物质溶散的部分更少，保证了养殖动物摄入的高效，减少饲料氮污染，利于水质，提高养殖动物利用效率，减少成本。
本发明的有益效果是：
(1)选用的发酵酵母为筛选得到的产朊假丝酵母，能够直接有效转化水体中三态无机氮，合成自身菌体蛋白，帮助净化水体，并能够优化水体菌群结构，抑制水产养殖病害菌，如嗜水气单胞菌的生长，减少养殖动物感染细菌病害，利于水产养殖效益提高。
(2)一步法发酵采用植物乳酸菌和乳双歧杆菌搭配产朊假丝酵母，能够有效提升固态发酵中的酵母活菌数量，可便捷制备，无需后续补充菌液保证投放的活菌。并通过该饲料添加产朊假丝酵母活菌进入养殖水体，免去水产养殖过程中向水体额外倾倒产朊假丝酵母菌液的步骤，更加便利。同时在配合鱼粉全价料使用，减少鱼粉使用压力，提高饲料吸收率。
(3)通过α淀粉和黄原胶的配合使用能够保证该产朊假丝酵母发酵饲料配合鱼粉全价料使用时，软团饲料的水中溶散率低，营养物质溶散的部分更少，保证了养殖动物摄入的高效，减少饲料氮污染，利于水质，提高养殖动物利用效率，减少成本。
(4)通过配合益生菌使用，添加碳源控制进入水体的碳氮比为10～20，能够有效促进投放的益生菌定植水体，优化水体中菌群结构，增强水体净化功能，减少病害杂菌的生长。
(5)本发明方法采用豆渣和豆粕这种价格低廉的豆制品作为发酵原料，生产成本低；并采用一步法混菌协同厌氧发酵工艺，物料损失少，生产过程中不易污染，生产工艺简便易操作，并能保留较高产朊假丝酵母活菌的同时保证产朊假丝酵母发酵饲料的小肽含量。
(6)本发明应用PMA-qPCR方法检测产朊假丝酵母发酵饲料中产朊假丝酵母的活菌数量，检测时间短、灵敏度高，为生物饲料固态发酵过程中活菌菌群变化的研究提供方法参考。
附图说明
图1为五种芽孢杆菌对无机氮转化利用能力比较图，其中(a)氨氮、(b)亚硝酸盐氮、(c)硝酸盐氮；
图2为四种酵母对无机氮转化利用能力比较图，(a)氨氮、(b)亚硝酸盐氮、(c)硝酸盐氮；
图3为六种乳酸菌对无机氮转化利用能力比较图，(a)氨氮、(b)亚硝酸盐氮、(c)硝酸盐氮；
图4为产朊假丝酵母转化三态氮规律，(a)氨氮、(b)亚硝酸盐氮、(c)硝酸盐氮；
图5为产朊假丝酵母与嗜水气单胞菌菌液共存实验；
图6为产朊假丝酵母对嗜水气单胞菌平板滤纸片抑菌实验；其中：A:抗生素、B：灭活产朊假丝酵母、C：产朊假丝酵母活菌、D：无菌培养基；
图7为产朊假丝酵母与不同种属菌种搭配发酵活菌数；
图8为产朊假丝酵母与不同乳酸菌搭配发酵活菌数；
图9为单因素实验；其中(a)发酵时间、(b)接菌量、(c)发酵温度、(d)含水量、(e)蛋白酶添加量、(f)好氧发酵时间；
图10为响应面3D图和等高线图；其中(a)酶添加量和发酵温度对产朊假丝酵母发酵饲料小肽含量影响的响应面3D图和等高线图、(b)酶添加量和固态发酵含水量对产朊假丝酵母发酵饲料小肽含量影响的响应面3D图和等高线图、(c)发酵温度和固态发酵含水量对产朊假丝酵母发酵饲料小肽含量影响的响应面3D图和等高线图；
图11为不同淀粉添加比例的筛选；
图12为产朊假丝酵母发酵饲料替代25％鱼粉全价料添加不同粘合剂筛选实验；
图13为黄原胶单一添加及协同其他粘合剂添加实验；
图14为发酵前后饲料蛋白的SDS-PAGE图；(a)三氯乙酸浸提饲料后上清中可溶性蛋白、(b)饲料全蛋白；其中M：蛋白质Marker(5～245kDa)；1：发酵前的原料；2：发酵后的饲料；3鱼粉全价料；
图15为固态发酵饲料产朊假丝酵母活菌数；
图16为不同处理下六组养殖水体氨氮，其中(a)C/N＝20的实验组和对照组、(b)C/N＝15的实验组和对照组、(c)C/N＝10实验组和对照组；
图17为水体特定菌群qPCR结果，其中(a)总菌、(b)产朊假丝酵母、(c)气单胞菌、(d)肠杆菌；
图18为高通量测序结果；(a)各组别细菌属水平上群落丰度百分比(b)各组别细菌门水平上群落丰度百分比；
图19为水体中产朊假丝酵母qPCR结果；(a)总菌、(b)产朊假丝酵母、(c)气单胞菌、(d)肠杆菌；
图20为不同碳氮比下产朊假丝酵母发酵饲料替代15％鱼粉全价料水质氨氮；
图21为养殖实验水质，其中(a)氨氮、(b)亚硝酸盐氮、(c)总氮、(d)硝酸盐氮；
图22为甲鱼血涂片染色，其中(a)、(b)鱼粉全价料组别，(c)、(d)产朊假丝酵母发酵饲料部分替代组别；
图23为小肠石蜡切片，其中(a)、(b)鱼粉全价料组别，(c)、(d)产朊假丝酵母发酵饲料部分替代组别。
具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活化培养和发酵种子液的制备：
A、菌种培养基的配制：斜面和平板培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌30min；
液体培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌30min；
B、各菌种的活化和发酵种子液的制备：
枯草芽孢杆菌的活化和发酵种子液的制备：将保存于4℃的枯草芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基，37℃培养36h；再在平板上划单菌落，37℃倒置培养36h，挑选单菌落接种于含有50mL种子液培养基的250mL锥形瓶中，在37℃、150r/min条件下培养18h得到种子液。按需要以3％接种量(v/v，即100mL培养基接种3mL种子液，下同)进行扩大培养制得发酵种子液，培养条件为37℃、150r/min培养24h。
产朊假丝酵母的活化和发酵种子液的制备：将保存于4℃的产朊假丝酵母菌种接种于斜面培养基，30℃培养36h。再在平板上划单菌落，30℃倒置培养36h，挑选单菌落接种于含有50mL种子液培养基的250mL锥形瓶中，在30℃、150r/min条件下培养18h得到种子液。按需要以3％接种量(v/v)进行扩大培养制得发酵种子液，培养条件为28℃、150r/min培养24h。
植物乳杆菌、乳双歧杆菌的活化和发酵种子液的制备：将保存于4℃的植物乳杆菌和乳双歧杆菌菌种分别接种于斜面培养基，37℃培养48h。再在平板上划单菌落，37℃倒置培养48h，挑选单菌落接种于装有230mL种子液培养基的250mL厌氧瓶中，在37℃条件下培养18h得到种子液。按需要以3％接种量(v/v)进行扩大培养制得发酵种子液，培养条件为37℃培养24h。
(2)固体发酵培养基的制备：各组分质量占比为：豆粕50％，豆渣40％，次粉10％；
(3)将制得的枯草芽孢杆菌发酵种子液按接种量为固体发酵培养基质量的3％接种于发酵培养基中，加水使含水量为45％，搅拌均匀，装入含有单向排气孔的发酵袋中，进行厌氧发酵，发酵温度为32℃，得到产朊假丝酵母发酵饲料；即为水质改良型发酵饲料。
将制备的产朊假丝酵母发酵饲料进行蛋白电泳对比发酵前后蛋白分子量分布，全饲料蛋白电泳方法为样品处理时使用烘干后饲料样品与蛋白上样缓冲液(loadingbuffer)直接1：10混合煮沸制备，而后进行蛋白电泳。而可溶性蛋白电泳方法为称取1.00g烘干产朊假丝酵母发酵饲料，加入30mL 0.03mol/L Tris-HCl溶液，摇晃浸泡1h，10000rpm离心10min，取上清混合蛋白上样缓冲液进行SDS-PAGE分析。
如图14，与未发酵原料相比，七天时产朊假丝酵母发酵饲料中27kDa以上的蛋白质条带基本消失。这表明产朊假丝酵母发酵饲料中的大分子蛋白质基本被水解为27kDa左右以下的小分子蛋白和小肽，而对照中可看到鱼粉全价料中还含有大分子蛋白。
由图15可得，发酵第一天产朊假丝酵母活菌数达到峰值，且优化后的组别活菌数能够达到1.698*108copies/g，且在前30天内均使得产朊假丝酵母活菌高于对照组(只有产朊假丝酵母添加发酵)。在发酵时间上可看到发酵30天内时候该菌种搭配对产朊假丝酵母活菌的提升效果较明显，同时考虑发酵时间对小肽量提升效果，故该产朊假丝酵母发酵饲料的制备使用需在6～30天时候使用效果最佳。
实施例2：
在江苏省丹阳市司徒镇迪飞生态循环农业基地甲鱼养殖试验场，养殖池长1.57m，宽1.22m，高0.72m，水深调整为0.5m。每个组别设置三个平行组，每个平行组养殖20只大小体重相近的中华鳖(雌雄各半)，养殖水源为沉淀过滤后的池塘水。试验周期为25天，每天投喂两次饲料(12:00，21:00)，投喂量为动物质量的2％。
投喂饲料为鱼粉全价料，购自广东省佛山市南强牌配合饲料。设置额外添加产朊假丝酵母菌的实验组和无添加产朊假丝酵母的对照组。
每星期随机称重，根据体重变化调整投喂量。养殖期间，在饲喂后再添加葡萄糖或糖蜜至各组别养殖水体中，根据不同C/N为10、15、20设置来添加葡萄糖。
每日三次取样(8:00,16:00,21:00)在养殖池中采取三点取样混匀后测定氨氮(氨氮(NH4 +-N)、亚硝酸盐氮(NO2 --N)的浓度。每天(8:00)取样测定硝酸盐氮(NO3 --N)和总氮(TN)的浓度。
由图16可见，不同的碳氮比对水体的脱氮效果不同。三组对照组中，碳氮比越高，氨氮减少得越快。在水产养殖水体中，当C/N＞10，能有效促进异养菌生长，利用无机氮源改善水质。在水产养殖环境中当C/N<10，异养微生物主要利用有机氮源，尤其是氨化作用，会导致氨氮含量增加；当C/N>10，水体中微生物可以利用碳源同时利用养殖环境中的有机氮和无机氮，形成生物絮凝体，同时消耗氨氮和亚硝酸盐氮。这一结论与实验结果一致，可以看出，三组对照组增加碳氮比的同时，水中氨氮含量立即以不同速率下降。随着碳氮比的增加，氨氮的转化速率加快，这可能是由于较高的C/N水平将促进异养菌利用其生长，通过生长竞争抑制自养菌,同时更好地转化利用无机氮。通过对三组试验组的观察发现，即使在低碳氮比(C/N＝10)组，水体中氨氮的转化速度也很快，而C/N＝15和C/N＝20组的氨氮转化速度都非常快，并保持在较低水平。结果表明，产朊假丝酵母能在一定程度上吸收和同化水中氨氮，对水质有明显的调节作用。
表4第30天取样时水体各态氮含量测定
注：CG20是指碳氮比水平为20的对照组(control group)、EG20指碳氮比水平为20的实验组(control group)、CG15指碳氮比水平为15的对照组(control group)、EG15指碳氮比水平为15的实验组(control group)、CG10指碳氮比水平为15的对照组(controlgroup)、EG10指碳氮比水平为10的实验组(control group)。
由表4可以看出各组别总氮含量的不同，各碳氮比水平实验组均大于对照组(P<0.05)，而和总氮相比，其他三个无机氮含量较小，占总氮份额较少，表明实验组的有机氮的含量较高。同时也证明了添加产朊假丝酵母组能有效地将无机氮转化为微生物蛋白，提高了生物絮团的含量。
由图17从产朊假丝酵母数量可得产朊假丝酵母可在养殖水体中定植，最适碳氮比为15。随着碳氮比的增加，每100mL总细菌数量增加，碳氮比的增加促进了总细菌的生长，这也是异养菌去除无机氮效果的原因。还可看到每个碳氮比水平，对照组的总菌数量要大于实验组(P<0.01)。推测认为是产朊假丝酵母的加入生长竞争导致抑制总细菌数量要小于对照组。随着碳氮比的增加同时，每100mL水体气单胞菌和肠杆菌的数量增加。在各碳氮比水平下，对照组的气单胞菌和肠杆菌数量均高于加入产朊假丝酵母的组别(P<0.05)。认为是产朊假丝酵母抑制了两种细菌的生长。该两种菌属都是引起甲鱼养殖疾病的主要病害菌。
可发现添加产朊假丝酵母可以有效降低养殖水体中气单胞菌和肠杆菌的数量，有利于水产养殖。
表5各组别饲料系数
由表5可得随着碳氮比的增加，饲料系数降低，实验组的饲料系数略低于对照组(P<0.05)。故水中产朊假丝酵母对甲鱼的生长有一定的影响，导致试验组的饲料系数低于对照组。
如图18，而随着碳氮比的增加，气单胞菌的比例增加，这与qPCR实验结果一致，每100mL水中气单胞菌的拷贝数增加了。而实验组的气单胞菌数量明显低于对照组，这与qPCR实验结果也是一致的，说明添加产丝假丝酵母可以有效地减少气单胞菌的数量和比例。
实施例3：
江苏省丹阳市司徒镇迪飞生态循环农业基地甲鱼养殖试验场，养殖池长1.57m，宽1.22m，高0.72m，水深调整为0.5m。每个组别设置三个平行组，每个平行组养殖20只大小体重相近的中华鳖。养殖水源为沉淀过滤后的池塘水，试验周期25天。每天投喂饲料两次(12:00，21:00)，一组饲喂鱼粉全价料作为对照(100％鱼粉全价料)；另两组和对照组相比，饲喂产朊假丝酵母发酵饲料替代鱼粉全价料25％(实验组1)和50％(实验组2)作为实验组。投喂量为体质量的2％。每周随机称重，根据体重变化调整投喂量。养殖期间，根据C/N＝15计算调控所需添加葡萄糖的质量，在投放饲料后，将葡萄糖添加各组别养殖水体中。在养殖一个月后进行提取水样DNA进行qPCR。
如图19通过产朊假丝酵母qPCR结果可得，在产朊假丝酵母发酵饲料替代25％和50％鱼粉全价料饲喂时，也是可以将产朊假丝酵母定植于水体中，且通过数据分析比较发现两组水体中产朊假丝酵母copies数相差不大(P＞0.05)。虽然相比直接加入菌液，所定植水体的产朊假丝酵母copies数量要少，但还是说明了通过饲喂，可以通过部分直接散失水体或经过肠胃后***出体外从而保留菌体。
表6养殖实验组别
由表6可得，25％生物饲料添加导致饲料系数略微降低，提高吸收效率和体重增长率，50％生物饲料添加显著升高饲料系数，但最主要的是本生物饲料成本为5000元每吨左右，大大低于上万元每吨的鱼粉全价料，因此，经济效益明显。选择25％生物饲料继续后续实验。
实施例4：
江苏省丹阳市司徒镇迪飞生态循环农业基地甲鱼养殖试验场，养殖池长1.57m，宽1.22m，高0.72m，水深调整为0.5m。每个组别设置三个平行组，每个平行组养殖20只大小体重相近的中华鳖。养殖水源为沉淀过滤后的池塘水，试验周期25天。每天投喂饲料两次(12:00，21:00)，分组如表7。投喂量为体质量的2％。每周随机称重，根据体重变化调整投喂量。
表7甲鱼饲养饲料分组
如表8所示，在产朊假丝酵母发酵饲料替代25％鱼粉全价料时，添加粘合剂黄原胶0.2％、0.4％、0.6％时饲料系数均略小于对照组，在本发明要求保护范围提高粘合剂黄原胶比例时，并无明显影响。但在产朊假丝酵母发酵饲料替代鱼粉全价料50％时候，发现饲料系数明显上升，在粘合剂α-淀粉添加量提升至5％时，饲料系数明显上升，说明过多的α淀粉-添加导致饲料氮源明显减少导致甲鱼增重减少。
表8养殖组别饲料系数
实施例5：
养殖方案与案例三协同，一组饲喂鱼粉全价料作为对照，另一组饲喂产朊假丝酵母发酵饲料替代鱼粉全价料15％，作为实验组。投喂量为体质量的2％。每周随机称重，根据体重变化调整投喂量。养殖期间，根据C/N＝0、5、10、15、20计算调控所需添加葡萄糖的质量，在投放饲料后，将葡萄糖添加各组别养殖水体中。
如图20，可观察到使用产朊假丝酵母发酵饲料替代鱼粉全价料25％时候，会将降低氨氮含量，在提高碳氮比的时候，转化氨氮的程度将上升，即氨氮的含量将更快减少。
实施例6：
养殖方案如案例3进行饲养，选用不同替代比的饲料饲喂，碳氮比控制为15，每日两次取样(9:00，21:00)在养殖池中采取三点取样混匀后测定氨氮(氨氮(NH4 +-N)、亚硝酸盐氮(NO2 --N)的浓度。每天测取样测定硝酸盐氮(NO3 --N)和总氮(TN)的浓度。对照组(CG)使用鱼粉全价料饲料饲喂，实验组(EG)使用产朊假丝酵母替代鱼粉全价料25％饲喂。
如图21可以看到氨氮、亚硝酸盐氮在七天内大部分都是低于对照组别的。而总氮两组组变化不大，但硝酸盐氮也是产朊假丝酵母发酵饲料添加组别要远小于鱼粉全价料对照组。说明该饲料添加能够有效净化水质，且配合碳氮比为15时，对水中无机氮转化效果更快更好。
综上所述，产朊假丝酵母发酵饲料替代25％鱼粉全价料组别的水体中各项无机氮要低于鱼粉全价料对照组别，水质净化效果更好。
实施例7：
一组饲喂鱼粉全价料作为对照，另一组饲喂产朊假丝酵母发酵饲料替代鱼粉全价料25％，作为实验组。投喂量为体质量的2％。每周随机称重，根据体重变化调整投喂量。养殖期间，根据C/N＝15计算调控所需添加葡萄糖的质量，在投放饲料后，将葡萄糖添加各组别养殖水体中。饲喂三个月后，对甲鱼机体进行测定血常规、血清生化指标、免疫指标及小肠切片绒毛观察。
如图22，由于甲鱼为两栖动物，血常规测得其红细胞数量很低，将新鲜甲鱼血液制成血涂片观察到甲鱼的红细胞为有核红细胞，因此血液分析仪测定其血细胞含量有误差。因此，甲鱼的红细胞数量采用血细胞计数板计数。可以看到鱼粉全价料的甲鱼血涂片中红细胞数量要少一些，而白细胞的数量要多一些，结果显示，产朊假丝酵母发酵饲料的饲喂对甲鱼的造血功能，及红细胞参与的免疫功能有一定的增益作用。
表9产朊假丝酵母发酵饲料对中华鳖生化指标的影响
注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)
如表9，甲鱼生化指标测定可看出，实验组谷丙转氨酶和谷草转氨酶均低于对照组，这两种酶是肝细胞分泌酶，主要参与体内转氨基作用，均是判断肝细胞受损最灵敏的指标。可能是组织受损提升该酶进入血液，也可能是对照组的蛋白过量或大分子蛋白含量过高，导致其肝脏负担过重。
表10发酵饲料对中华鳖血清抗氧化免疫指标的影响
注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)
如表10可看出实验组的总抗氧化能力(T-AOC)明显高于对照组，说明实验组的甲鱼机体免疫力较强。溶菌酶是一种碱性蛋白质，能够通过水解革兰氏阳性菌细胞壁起到吞噬细胞杀除细菌的作用。实验组溶菌酶高于鱼粉全价料组别，这体现了甲鱼机体生理防御水平，可能是机体接触抗原性物质或免疫刺激剂导致，也一定程度上反应甲鱼的非特异性体液免疫状态。以上两种酶活能够表示甲鱼抵抗机体氧化和免疫病菌能力提高。实验组酸性磷酸酶(ACP)与对照组差异不明显，但碱性磷酸酶(AKP)明显要高。碱性磷酸酶通常在成骨细胞和肝细胞中，能通过对有机磷酸化合物进行转化，形成能与钙离子结合成磷酸钙的无机磷酸盐离子，从而沉淀于骨组织内。该酶活高可以反映骨细胞和肝细胞的状态，也说明对骨质和脏器的钙供应更好，成骨细胞活性、状况及磷的代谢均高于鱼粉全价料组。也可认为产朊假丝酵母发酵饲料的添加可能提高中华鳖对于钙、磷等元素的吸收，有益于中华鳖的背甲、腹甲等骨骼的矿化。推测可能是产朊假丝酵母发酵饲料中形成螯合钙，使得甲鱼机体更容易吸收。这推测是益生菌发酵饲料中小肽螯合矿物离子更能帮助吸收。
表11小肠绒毛高度及隐窝深度
注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)
甲鱼小肠作为同化饲料营养的重要器官，测定甲鱼小肠绒毛高度及其与隐窝深度比值能够较直观评价甲鱼消化吸收功能。作为小肠基本功能单位，小肠绒毛越长，其与隐窝深度比值越大，说明该机体消化吸收功能越好。如图23及表11所示，其根据小肠形态显微结构图可以看出，对照组小肠绒毛更短，隐窝更深。对照组的小肠绒毛长度与隐窝深度比值VH/CD数值确实比实验组的VH/CD比值低很多，即认为是消化吸收不好。
综上，甲鱼血常规测定发现生物饲料部分替代鱼粉全价料中25％组别血常规各项正常，红细胞数量更多。生理生化指标测定可看出，实验组谷丙转氨酶和谷草转氨酶均低于鱼粉全价料组别，但血清GLU含量高于对照组。在甲鱼血清抗氧化免疫指标测定中发现实验组总抗氧化能力，碱性磷酸酶和溶菌酶酶活高于对照组。小肠切片发现产朊假丝酵母发酵饲料的添加能明显提高甲鱼小肠绒毛及绒毛高度和隐窝深度的比值；进一步说明产朊假丝酵母发酵饲料的添加具有显著的效果。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (7)

1.一种水质改良型发酵饲料用于添加到水产养殖饲料中进行水产养殖以及水质改良的用途，其特征在于，制备步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌、植物乳酸菌和乳双歧杆菌分别接种到相应的液体培养基中进行活化培养，经培养后得到各菌种的发酵种子液；
(2)将步骤(1)得到的种子液分别接种到厌氧发酵培养基中，混合均匀，得到厌氧发酵混合物；所述厌氧发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：豆粕40％～55％、豆渣35％～40％；次粉8％～10％；
调整发酵温度为20～35℃，培养基含水量为38～55％，在密封条件下进行厌氧发酵，厌氧发酵4～30天后获得成品，得到产朊假丝酵母发酵饲料，即为水质改良型发酵饲料；
(3)将产朊假丝酵母发酵饲料添加到水产养殖饲料中得到混合饲料进行喂养，实现水产养殖以及水质改良的用途；所述产朊假丝酵母发酵饲料的添加量占混合饲料的重量为25％～50％，同时添加占混合饲料重量0.2～0.6％的黄原胶和/或2.5％～5％的α-淀粉；
所述混合饲料进行喂养时，当混合饲料投入水体后，再投入碳源，使得碳源与混合饲料整体的碳氮比为10～20；所述碳源为葡萄糖或糖蜜。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述产朊假丝酵母种子液的接种量与厌氧发酵培养基重量比为2～4mL：100g；所述产朊假丝酵母种子液的活菌总数为1.3×107～2.7×108cfu/mL。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述枯草芽孢杆菌种子液的接种量与厌氧发酵培养基重量的比为1～3mL：100g；所述枯草芽孢杆菌种子液的活菌总数为1.0×108～2.1×109cfu/mL。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述乳酸菌种子液包括乳双歧杆菌种子液和植物乳杆菌种子液的一种或多种；乳双歧杆菌种子液的接种量与厌氧发酵培养基重量的比为4～6mL：100g，所述乳双歧杆菌种子液的活菌总数为2.5×108～5.3×109cfu/mL；植物乳杆菌种子液的接种量与厌氧发酵培养基重量的比为2～4mL：100g，所述植物乳杆菌种子液的活菌总数为1.1×108～3.7×109cfu/mL。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述发酵的温度为25～32℃，时间为5～15天；所述调整培养基的含水量为40％～50％。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，当产朊假丝酵母发酵饲料的添加量占混合饲料的重量为25％时，添加0.2％～0.4％的黄原胶。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，当产朊假丝酵母发酵饲料的添加量占混合饲料的重量为50％时，添加2.5％～5％的α-淀粉。
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