CN103907749A - 生物发酵活性载体型复合预混合饲料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
生物发酵活性载体型复合预混合饲料及其制备方法和应用，益生菌生物发酵活性载体的制备：由嗜酸乳杆菌LA0912、粪肠球菌EF1109、枯草芽孢杆菌BS0903、酿酒酵母SC1203分别液体发酵培养，所获得的发酵培养液按体积比1:1:1:1混合后进行固体发酵培养，所获得的固体发酵培养物经低温烘干、粉碎后得生物发酵活性载体；以生物发酵活性载体复配维生素、氨基酸、矿物质、有机微量元素、氯化胆碱及食盐即获得适用于不同阶段猪群的生物发酵活性载体型复合预混合饲料。该生物发酵活性载体型复合预混合饲料既发挥了益生菌的保健功能，又充分利用了益生菌发酵代谢产物的多种生物活性作用，可以满足不同阶段猪的生理性营养需要。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵动物饲料技术领域，特别涉及一种生物发酵活性载体型复合预混合饲料及其制备方法和应用。
背景技术
多年来，由于畜禽疾病的复杂性以及现代畜牧业节约化生产防病促生长的需要、在畜禽饲料中添加抗生素类药物的现象普遍存在。然而，在饲料中长期使用抗生素类药物会产生严重的负面效应，已直接或间接威胁到人类的身体健康，主要表现为养殖内外环境的恶化、病原菌的抗药性增加、抗菌药物失效、人和动物的免疫力下降等。近年来，酶制剂、植物提取物、酸化剂、基因工程抗菌肽等产品的出现，对减少抗生素类药物的使用起到了一定的促进作用，但此类产品仍然未能使全价饲料或预混合饲料摆脱对抗生素类药物的依赖。随着现代生物科学技术的发展，不添加抗生素的微生态制剂、微生物发酵饲料由于其安全性、有效性已被认为有希望发展成为一类新型绿色饲料添加剂和饲料应用于畜牧养殖业。但由于微生物菌种的筛选和发酵工艺等一系列技术问题使得微生态制剂、微生物发酵饲料的生产和使用尚有诸多问题有待解决。
发明内容
解决的技术问题：为了促进饲料中营养物质的消化吸收利用，提高猪的生产性能和抵御疾病的能力，减少抗生素类药物的使用，本发明提供了一种生物发酵活性载体型复合预混合饲料及其制备方法和应用。本发明所述生物发酵活性载体型复合预混合饲料不添加任何抗生素类药物，由四种益生菌通过液体、固体二次发酵产生的活菌及其代谢产物制成的生物发酵活性载体与多种维生素、氨基酸、矿物质、有机微量元素、氯化胆碱、食盐复配而成。该生物发酵活性载体型复合预混合饲料既发挥了益生菌的保健功能，又充分利用了益生菌发酵代谢产物的多种生物活性作用，不仅可以满足不同阶段猪的生理性营养需要，还能提高其免疫力，拮抗致病微生物，改善体内外生态环境，提高饲料消化吸收利用率，提高猪的生产性能。
技术方案：一种生物发酵活性载体型复合预混合饲料，由以下步骤制备而得：
（1）益生菌生物发酵活性载体的制备：由嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）LA0912（CCTCC M2013577）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）EF1109（CCTCC M2013576）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS0903（CCTCC M2012078）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）SC1203（CCTCC M2013578）分别液体发酵培养，所获得的发酵培养液按体积比1:1:1:1混合后进行固体发酵培养，所获得的固体发酵培养物经低温烘干、粉碎后作为生物发酵活性载体型复合预混合饲料的母料，简称生物发酵活性载体；
（2）以生物发酵活性载体复配维生素、氨基酸、矿物质、有机微量元素、氯化胆碱及食盐即获得适用于不同阶段猪群的生物发酵活性载体型复合预混合饲料。
一种生物发酵活性载体型复合预混合饲料及其制备方法，生产工艺步骤为：
1、益生菌生物发酵活性载体的制备：由嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）LA0912（CCTCC M2013577）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）EF1109（CCTCC M2013576）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS0903（CCTCC M2012078）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）SC1203（CCTCC M2013578）分别液体发酵培养，所获得的发酵培养液按体积比1:1:1:1混合后进行固体发酵培养，所获得的固体发酵培养物经低温烘干、粉碎后作为生物发酵活性载体型复合预混合饲料的母料，简称生物发酵活性载体；2、以生物发酵活性载体复配维生素、氨基酸、矿物质、有机微量元素、氯化胆碱及食盐即获得适用于不同阶段猪群的生物发酵活性载体型复合预混合饲料。
所述生物发酵活性载体的具体制备步骤为：
⑴液体发酵
①嗜酸乳杆菌LA0912菌液的制备：将保藏的嗜酸乳杆菌LA0912菌种接种至装有20mLMRS培养基的厌氧管中，37℃恒温培养20h后即为嗜酸乳杆菌种子液，再将制备好的种子液按体积比1%-10%的接种量进行二级培养，每级37℃恒温培养20h后获得供固体发酵用的嗜酸乳杆菌菌液；
所述的MRS培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；酵母膏，4.0g/L；牛肉膏，8.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；吐温80，1mL/L；三水乙酸钠，5.0g/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；柠檬酸三铵，2.0g/L；七水硫酸镁，0.2g/L；硫酸锰，0.05g/L；pH6.2±0.2；
②粪肠球菌EF1109菌液的制备：将保藏的粪肠球菌EF1109菌种接种至装有100mL的YPD液体培养基的锥形瓶中，37℃恒温静置培养20h即为粪肠球菌种子液，再将制备好的种子液按体积比1%-10%的接种量进行二级培养，每级37℃静置恒温培养10-20h后获得供固体发酵用的粪肠球菌菌液；
所述的YPD液体培养基配方如下：蛋白胨，20.0g/L；酵母浸粉，10.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；pH6.5±0.2；
③枯草芽孢杆菌BS0903菌液的制备：将保藏的枯草芽孢杆菌BS0903菌种接种至装有100mL的MNR培养基的锥形瓶中，30℃、摇床转速为225rpm、恒温培养16h后即为枯草芽胞杆菌种子液，再将制备好的种子液按体积比1%-6%的接种量进行二级培养，每级37℃静置恒温培养10-20h后获得供固体发酵用的枯草芽孢杆菌菌液；
所述的MNB培养基配方如下：蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；葡萄糖，5.0g/L；七水硫酸镁，0.5g/L；硫酸锰，0.005g/L；pH7.0±0.2；
④酿酒酵母SC1203菌液的制备：将保藏的酿酒酵母SC1203菌种接种至装有100mL的YPD液体培养基的锥形瓶中，在转速为250rpm摇床中30℃恒温培养16h后即为酿酒酵母菌种子液，再将制备好的种子液按体积比1%-3%的接种量进行二级培养，摇床转速为250rpm、30℃恒温培养16h后获得供固体发酵用的酿酒酵母菌液；
所述的YPD液体培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；酵母浸粉，5.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；丙酸钠，2.5g/L；pH4.0±0.1；
⑤复合菌菌液的配制：按体积比1:1:1:1配比量取嗜酸乳杆菌LA0912菌液、粪肠球菌EF1109菌液、枯草芽孢杆菌BS0903菌液及酿酒酵母SC1203菌液，混匀获得复合菌菌液；
⑵固体发酵
①固体发酵培养基的配制：按质量比豆粕22%、玉米蛋白粉25%、米糠粕23%、麸皮25%、红糖5%配制混合；
②固体发酵培养的条件：复合菌菌液在固体发酵培养基中的接种量按体积质量比为3-6%(mL/g)，蛋白酶的添加量为100-120U/g，水与固体发酵培养基的比例按体积质量比1:1-0.4:1(mL/g)，复合菌菌液、蛋白酶及固体发酵培养基混匀后发酵，发酵温度35-40℃，发酵时间为72-120h；
③固体发酵产物的烘干粉碎：上述所获得的固体发酵培养物经40-60℃低温烘干、粉碎后即为配制生物发酵活性载体型复合预混合饲料所需的生物发酵活性载体。
所述生物发酵活性载体型复合预混合饲料的复配方法为：每千克生物发酵活性载体型复合预混合饲料含有：铜，200-360mg；铁，600-1200mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，40000-60000IU；维生素D3，10000-15000IU；维生素E，120-200IU；维生素K3，8-16mg；维生素B1，10-20mg；维生素B2，20-40mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.12-0.32mg；烟酸，200mg；叶酸，4-6mg；泛酸100mg；生物素，0-1mg；氯化胆碱，2000mg；赖氨酸，0.4-2.8g；钙，40-80g；总磷，15g；食盐，30-60g。
⑴乳仔猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料的复配方法为：每千克生物发酵活性载体型复合预混合饲料含有：铜，360mg；铁，1200mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，60000IU；维生素D3，15000IU；维生素E，160IU；维生素K3，16mg；维生素B1，20mg；维生素B2，20mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.12mg；烟酸，200mg；叶酸，6mg；泛酸100mg；氯化胆碱，2000mg；赖氨酸，2.8g；钙，65g；总磷，15g；食盐，30g。
⑵生长育肥猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料的复配方法为：每千克生物发酵活性载体型复合预混合饲料含有：铜，240mg；铁，600mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，40000IU；维生素D3，10000IU；维生素E，120IU；维生素K3，8mg；维生素B1，20mg；维生素B2，20mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.08mg；烟酸，200mg；泛酸，100mg；叶酸，4mg；氯化胆碱，2000mg。赖氨酸，2.4g；钙，58g；总磷，15g；食盐，30g。
⑶妊娠母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料的复配方法为：每千克生物发酵活性载体型复合预混合饲料含有：铜，200mg；铁，1200mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，50000IU；维生素D3，15000IU；维生素E，200IU；维生素K3，8mg；维生素B1，10mg；维生素B2，40mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.32mg；烟酸，200mg；泛酸，100mg；叶酸，6mg；生物素，1mg；氯化胆碱，2000mg；赖氨酸，0.4g；钙，65g；总磷，15g；食盐，30g。
⑷哺乳母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料的复配方法为：每千克生物发酵活性载体型复合预混合饲料含有：铜，200mg；铁，1200mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，50000IU；维生素D3，15000IU；维生素E，200IU；维生素K3，8mg；维生素B1，10mg；维生素B2，40mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.32mg；烟酸，200mg；泛酸，100mg；叶酸，60mg；生物素，1mg；氯化胆碱，2000mg。赖氨酸，1.6g；钙，68g；总磷，15g；食盐，30g。
任一所述方法制备而得的生物发酵活性载体型复合预混合饲料在生猪养殖上的应用。
生物发酵活性载体型复合预混合饲料占配制猪用全价饲料重量的10%。
本发明所用的嗜酸乳杆菌LA0912（Lactobacillus acidophilus LA0912）为申请人从猪肠道中分离的众多菌株中筛选获得，已于2013年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013577。该嗜酸乳杆菌能分泌抗生素类物质（包括嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素等），能拮抗肠道致病菌、抑制肠道不良微生物的增殖、调节肠道菌群平衡。其生物学特征如下：杆菌，两端圆。0.6-0.9×1.5-6μm，以单个、成双或短链出现；菌落粗糙、无边帽。在显微镜下观察，显示缠绕或微绒毛丝状物，从似暗影的菌堆的中心放射伸出。可同化麦芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、纤维二糖、甘露二糖、海藻糖、蜜二糖、苦杏仁苷，不能同化***糖、葡萄糖酸盐、甘露糖。15℃以下不生长，最适生长温度35-38℃，最适生长pH为5.5-6.0。
本发明所用的粪肠球菌EF1109（Enterococcus faecalis EF1109）为申请人从动物肠道中分离的众多菌株中筛选获得，已于2013年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013576。该菌是革兰氏阳性菌，在MRS琼脂平板上生长良好，菌落圆整、光滑、***、灰白色露滴样、直径0.5-1mm；显微镜下观察，该菌呈球形，不形成芽孢；生长温度范围10℃-50℃，pH范围4-10；对沙门氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用；可耐受pH2.5的人工胃液60min、最高耐受胆盐浓度为2.0%。
本发明所用的枯草芽孢杆菌BS0903（Bacillus subtilis BS0903）为申请人从健康动物肠道中分离的众多菌株中筛选获得，已于2012年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2012078。其生物学特征如下：菌落圆形、边缘呈锯齿状、表面粗糙、不透明、污白色，革兰氏阳性菌，芽孢形状为椭圆到柱状、位于菌体中央或稍偏，形成芽孢后的菌体不膨大。本发明的枯草芽孢杆菌能产生对沙门氏菌、致病性大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌有强烈杀灭作用的细菌素(主要是脂肽类物质)，还具有较强的产纤维素酶的能力，可以降解纤维素。同时，具有耐高温、耐酸及耐胆盐的特点：可以耐受80℃的制粒温度、1%pH2.0的胃蛋白酶的人工胃液以及0.3%的人工胆盐。
本发明的酿酒酵母SC1203（Saccharomyces cerevisiae SC1203）为申请人从健康动物肠道粪便中分离筛选获得，已于2013年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013578。其生物学特征如下：单细胞真菌，呈卵圆形、圆形或圆柱形，菌落较大较厚、呈乳白色、表面湿润、粘稠、易被挑起。本发明的酿酒酵母具有良好的抗逆性，能耐高温、耐酸、耐胆盐以及耐受常用抗生素类药物等，并且能产酸、产酶及抑制病原菌等功效。
有益效果：本发明巧妙综合了厌氧菌和好氧菌发酵的优点，选用的特定益生菌菌种组合能使乳酸菌迅速繁殖，占据数量优势，而本发明选用的嗜酸乳杆菌能分泌抗生素类物质（包括嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素等）；枯草芽孢杆菌能产生对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有强烈杀灭作用的细菌素(主要是脂肽类物质)，能有效抑制固态发酵培养基中的杂菌、有害菌，但是对本发明所选用的酵母菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌的生长代谢影响较小，可以实现固体培养基原料不需要消毒就可以直接用于接种培养；酿酒酵母的生长能够分解利用碳水化合物合成微生物蛋白，提高菌体蛋白的含量。通过液、固二次发酵所获得的生物发酵活性成分除了含有经反复筛选的具有优异特点的益生菌外，还含常规复合预混合饲料所不具备的多种益生菌发酵代谢产物，包括丰富的酶类、有机酸、维生素、抗菌肽类、未知生长因子等，不但可以提高动物免疫力，拮抗致病微生物，改善体内外生态环境，提高饲料消化吸收利用率，同时可以替代或部分替代常规预混合饲料配方中的抗生素、诱食剂、酸化剂、酶制剂、防霉剂等。本发明设计的占配制猪全价饲料10%的生物发酵活性载体型复合预混合饲料产品既保留了常规微生态制剂益生菌的功能，又避免了常规微生态制剂中具有重要功能的益生菌发酵代谢产物少的缺点，使得产品除了常规的营养性功能外，还大大提高了产品的免疫调节和保健功能；同时，本发明所设计的产品使用方便，仅需配以玉米、豆粕和麸皮等即可制成全价饲料，既保留全价发酵饲料的优异性能，又避免发酵全价料所带来的能量损失，易于各类养殖户、生产饲料企业使用；本发明设计的生物发酵活性载体型复合预混合饲料产品制备及最终产品无抗生素类产品的添加，绿色安全，适用于不同阶段猪群的使用。
具体实施方式
通过下列实施例将具体说明本发明，但所述的实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例1、液体发酵制备复合益生菌菌液
①嗜酸乳杆菌LA0912菌液的制备：将保藏的嗜酸乳杆菌LA0912菌种接种至装有20mLMRS培养基的厌氧管中，37℃恒温培养20h后即为嗜酸乳杆菌种子液，再将制备好的种子液按体积比1-10%的接种量进行二级培养，每级37℃静置恒温培养20h后获得供固体发酵用的嗜酸乳杆菌菌液；
所述的MRS培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；牛肉膏，8.0g/L；酵母膏，4.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；吐温80，1mL/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；三水乙酸钠，5.0g/L；柠檬酸三铵，2.0g/L；七水硫酸镁，0.2g/L；硫酸锰，0.05g/L；pH6.2±0.2；
②粪肠球菌EF1109菌液的制备：将保藏的粪肠球菌EF1109菌种接种至装有100mL的YPD液体培养基的锥形瓶中，37℃恒温静置培养10-20h后即为粪肠球菌种子液，再将制备好的种子液按体积比1-10%的接种量进行二级培养，每级37℃静置恒温培养10-20h后获得供固体发酵用的粪肠球菌菌液；
所述的YPD液体培养基配方如下：蛋白胨，20.0g/L；酵母浸粉，10.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；pH6.5±0.2；
③枯草芽孢杆菌BS0903菌液的制备：将保藏的枯草芽孢杆菌BS0903菌种接种至装有100mL的MNR培养基的锥形瓶中，30℃、摇床转速为225rpm、恒温培养16h后即为枯草芽胞杆菌种子液，再将制备好的种子液按体积比1-6%的接种量进行二级培养，每级30℃恒温培养20h，摇床转速为225rpm；培养结束后获得供固体发酵用的枯草芽孢杆菌菌液；
所述的MNB培养基配方如下：蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；葡萄糖，5.0g/L；七水硫酸镁，0.5g/L；硫酸锰，0.005g/L；pH7.0±0.2；
④酿酒酵母SC1203菌液的制备：将保藏的酿酒酵母SC1203菌种接种至装有100mL的YPD液体培养基的锥形瓶中，在转速为250rpm摇床中30℃恒温培养16h后即为酿酒酵母菌种子液，再将制备好的种子液按1-3%的接种量进行二级培养，摇床转速为250rpm、30℃恒温培养16h后获得供固体发酵用的酿酒酵母菌液；
所述的YPD液体培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；酵母浸粉，5.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；丙酸钠，2.5g/L；pH4.0±0.1；
⑤复合菌菌液的配制：四种菌中嗜酸乳杆菌浓度为4.12logCFU/mL，粪肠球菌浓度为4.12logCFU/mL，枯草芽孢杆菌浓度为5.45logCFU/mL，按照体积比为嗜酸乳杆菌:粪肠球菌:枯草芽孢杆菌:酿酒酵母＝1:1:1:1混匀制成复合菌菌液。
实施例2、固体发酵制备生物发酵活性载体
①固体发酵培养基的配制:按豆粕22%、玉米蛋白粉25%、米糠粕23%、麸皮25%、红糖5%配制混合。所述白分含量为重量百分比。
②固体发酵培养的条件：将实施例1制得的复合菌菌液在固体发酵培养基中的接种量为3-6%(mL/g)，蛋白酶的添加量为100-120U/g，水与固体发酵培养基的比例按1︰1-0.4︰1(mL/g)，复合菌菌液、蛋白酶及固体发酵培养基混匀后发酵，发酵温度35-40℃，发酵时间为72-120h。通过多因子正交试验获得最优发酵方案为：复合菌菌液在固体培养基中的接种量为4%（mL/g），蛋白酶的添加量为110U/g，水与固体培养基的比例按1︰0.6（mL/g），复合菌菌液、蛋白酶及培养基混匀后发酵，发酵温度37℃，发酵时间为84h。
③固体发酵产物的烘干粉碎：上述所获得的固体发酵培养物经低温烘干、粉碎后即为配制生物发酵活性载体型复合预混合饲料中的生物发酵活性载体。
实施例3、乳仔猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料的制备
以实施例2所获得的益生菌发酵生物活性载体与多种维生素、氨基酸、有机微量元素、矿物质、氯化胆碱、食盐复配、均匀混合，即得乳仔猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料。本发明的乳仔猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料每千克含：铜，360mg；铁，1200mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，60000IU；维生素D3，15000IU；维生素E，160IU；维生素K3，16mg；维生素B1，20mg；维生素B2，20mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.12mg；烟酸，200mg；叶酸，6mg；泛酸100mg；氯化胆碱，2000mg；赖氨酸，2.8g；钙，65g；总磷，15g；食盐，30g。
实施例4、生长育肥猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料的制备
以实施例2所获得的益生菌发酵生物活性载体与多种维生素、氨基酸、有机微量元素、矿物质、氯化胆碱、食盐复配、均匀混合，即得生长育肥猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料。本发明的生长育肥猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料每千克含：铜，240mg；铁，600mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，40000IU；维生素D3，10000IU；维生素E，120IU；维生素K3，8mg；维生素B1，20mg；维生素B2，20mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.08mg；烟酸，200mg；泛酸，100mg；叶酸，4mg；氯化胆碱，2000mg。赖氨酸，2.4g；钙，58g；总磷，15g；食盐，30g。
实施例5、妊娠母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料的制备
以实施例2所获得的益生菌发酵生物活性载体与多种维生素、氨基酸、有机微量元素、矿物质、氯化胆碱、食盐复配、均匀混合，即得妊娠母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料。本发明的妊娠母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料每千克含：铜，200mg；铁，1200mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，50000IU；维生素D3，15000IU；维生素E，200IU；维生素K3，8mg；维生素B1，10mg；维生素B2，40mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.32mg；烟酸，200mg；泛酸，100mg；叶酸，6mg；生物素，1mg；氯化胆碱，2000mg；赖氨酸，0.4g；钙，65g；总磷，15g；食盐，30g。
实施例6、哺乳母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料的制备
以实施例2所获得的益生菌发酵生物活性载体与多种维生素、氨基酸、有机微量元素、矿物质、氯化胆碱等复配、均匀混合，即得哺乳母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料。本发明的哺乳妊娠母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料每千克含：铜，200mg；铁，1200mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，50000IU；维生素D3，15000IU；维生素E，200IU；维生素K3，8mg；维生素B1，10mg；维生素B2，40mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.32mg；烟酸，200mg；泛酸，100mg；叶酸，60mg；生物素，1mg；氯化胆碱，2000mg。赖氨酸，1.6g；钙，68g；总磷，15g；食盐，30g。
实施例7、验证本发明的乳仔猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料对乳仔猪的饲用效果
⑴试验方法:选择35日龄左右、健康无病、品种一致、体重相近、个体均匀的仔猪150头，随机分成3组，分别为试验组、对照组1和对照组2。试验期5周。试验各组栏舍条件一致，试验期间各组猪只均自由采食、自动饮水，试验猪免疫、消毒等按猪场常规进行。试验组饲料是在玉米-豆粕日粮中按10%的含量添加本发明实施例3的乳仔猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料。对照组1饲料是在玉米-豆粕日粮中添加常规配方自配的10%仔猪复合预混合饲料（载体为脱脂米糠）。对照组2饲料是在玉米-豆粕日粮中添加常规市售的10%仔猪前期复合预混合饲料。
⑵测定指标：
初重、末重、日均采食量、日均增重、料重比、腹泻率。
⑶试验结果：
⑷结果分析：由上表可见，试验组相对于对照组1和对照组2日均采食量差异显著(P＜0.05)，表明本发明的乳仔猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料能显著提高饲料的适口性。试验组增重比对照组1和对照组2分别提高了23.95%和20.30%，差异显著(P＜0.05)。试验组相对于对照组1和对照组2料重比分别低12.20%和10.37%，差异显著(P＜0.05)。表明本发明的乳仔猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料能显著提高饲料利用率。同时，由于仔猪免疫力的增强，仔猪的腹泻率也明显下降，仔猪的身体健康状况大大改善，从而又大幅提高了仔猪的生产性能。
实施例8、验证本发明的生长育肥猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料对生长育肥猪的饲用效果
⑴试验方法:选择健康无病、体重相近（约65Kg）的长白育肥猪120头，随机分成3组，分别为试验组、对照组组1和对照组组2。试验期8周。试验组栏舍条件一致，试验期间各组猪只均自由采食、自动饮水，试验猪免疫、消毒等按猪场常规进行。试验组饲料是在玉米-豆粕日粮中按10%的含量添加本发明实施例4的生长育肥猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料。对照组1饲料是在玉米-豆粕日粮中添加常规配方自配的10%生长育肥复合预混合饲料（载体为脱脂米糠）。对照组2饲料是在玉米-豆粕日粮中添加常规市售的10%育肥前期复合预混合饲料。
⑵测定指标：
日均采食量、日均增重、料重比。
⑶试验结果：
| 组别 | 试验头数 | 日均采食量（g） | 日均增重（g） | 料重比 | 成活率（%） |
| 试验组 | 40 | 3505 | 1120 | 3.13 | 100 |
| 对照组1 | 40 | 3431 | 1066 | 3.22 | 100 |
| 对照组2 | 40 | 3457 | 1077 | 3.21 | 100 |
⑷结果分析：由上表可见，试验组相对于对照组1和对照组2日均采食量分别提高了2.16%和1.39%，差异显著(P＜0.05)。试验组相对于对照组1和对照组2料重比分别低2.88%和2.56%，差异显著(P＜0.05)。表明本发明的生长育肥猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料具有显著提高生长育肥猪生长性能的作用。
实施例9、验证本发明的妊娠母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料对怀孕母猪的饲用效果
⑴试验方法:选择健康无病、胎次相近的60头母猪，随机分成2组，分别为试验组、对照组。母猪怀孕期两组栏舍条件一致，每圈3头。试验从前一胎产仔断奶后配种至预产期前20天喂怀孕母猪料，一天喂两次，每次1Kg，自由饮水。预产期前20天开始三组改为相同的哺乳期饲料直至分娩。试验猪免疫、消毒等按猪场常规进行。试验组饲料是在玉米-豆粕-麸皮日粮中按10%的含量添加本发明实施例5的妊娠母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料。对照组饲料是在玉米-豆粕-麸皮日粮中添加常规配方自配的10%妊娠母猪复合预混合饲料（载体为脱脂米糠）。
⑵测定指标：
分娩率、窝均产仔数、窝均产活仔数、平均初生重、母猪便秘头数。
⑶试验结果：
⑷结果分析：由上表可见，试验组比对照组分娩率提高了11.53%，差异显著(P＜0.05)，窝均产活仔数提高了12.61%，差异显著(P＜0.05)，平均初生重提高了7.25%，差异显著(P＜0.05)。试验组母猪便秘数为零。表明本发明的妊娠母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料能明显提高怀孕母猪的生产性能及健康水平。
实施例10、验证本发明的哺乳母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料对哺乳母猪的饲用效果
⑴试验方法:选择品种相同、健康、胎次及预产期相近的60头怀孕母猪，随机分成3组，分别为试验组、对照组1和对照组2。试验从预产期前20天至产后21天。试验猪饲养、免疫、消毒等按猪场常规进行。试验组饲料是在玉米-豆粕-麸皮日粮中按10%的含量添加本发明实施例6的哺乳母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料。对照组1饲料是在玉米-豆粕-麸皮日粮中添加常规配方自配的10%哺乳母猪复合预混合饲料（载体为脱脂米糠）。对照组2饲料是在玉米-豆粕日粮中添加常规市售的10%哺乳母猪复合预混合饲料。
⑵测定指标：
21日龄乳猪窝均活个体数、乳猪个体重、乳猪成活率、母猪子宫炎发病数。
⑶试验结果：
⑷结果分析：由上表可见，试验组比对照组1和对照组2的21日龄的乳猪个体均重、21日龄乳猪成活率以及乳猪日增重显著提高，差异显著(P＜0.05)。试验组母猪子宫炎发病头数为零。表明本发明的妊娠母猪生物发酵活性载体型复合预混合饲料能更好地满足哺乳母猪的营养需要、提高母猪健康水平，并促进乳猪生长发育、提高乳猪成活率。
以上为对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细的描述，通过对本发明实施例的上述说明，仅适用于帮助本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对本领域的专业技术人员，依据本发明实施例，在本文所公开的原理和新颖特点相一致的情况下，对这些实施例均会有多种修改，并在其它实施例中实现。综上所述，本发明实施内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种生物发酵活性载体型复合预混合饲料，其特征在于由以下步骤制备而得：
（1）益生菌生物发酵活性载体的制备：由嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）LA0912、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）EF1109、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS0903、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC1203分别液体发酵培养，所获得的发酵培养液按体积比1:1:1:1混合后进行固体发酵培养，所获得的固体发酵培养物经低温烘干、粉碎后作为生物发酵活性载体型复合预混合饲料的母料，简称生物发酵活性载体；
（2）以生物发酵活性载体复配维生素、氨基酸、矿物质、有机微量元素、氯化胆碱及食盐即获得适用于不同阶段猪群的生物发酵活性载体型复合预混合饲料。
2.一种生物发酵活性载体型复合预混合饲料的制备方法，其特征在于其生产工艺步骤为：
（1）益生菌生物发酵活性载体的制备：由嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）LA0912、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）EF1109、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS0903、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC1203分别液体发酵培养，所获得的发酵培养液按体积比1:1:1:1混合后进行固体发酵培养，所获得的固体发酵培养物经低温烘干、粉碎后作为生物发酵活性载体型复合预混合饲料的母料，简称生物发酵活性载体；
（2）以生物发酵活性载体复配维生素、氨基酸、矿物质、有机微量元素、氯化胆碱及食盐即获得适用于不同阶段猪群的生物发酵活性载体型复合预混合饲料。
3.根据权利要求2所述生物发酵活性载体型复合预混合饲料的制备方法，其特征在于所述生物发酵活性载体的具体制备步骤为：
⑴液体发酵
①嗜酸乳杆菌LA0912菌液的制备：将保藏的嗜酸乳杆菌LA0912菌种接种至装有20mLMRS培养基的厌氧管中，37℃恒温培养20h后即为嗜酸乳杆菌种子液，再将制备好的种子液按体积比1%-10%的接种量进行二级培养，每级37℃恒温培养20h后获得供固体发酵用的嗜酸乳杆菌菌液；
所述的MRS培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；酵母膏，4.0g/L；牛肉膏，8.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；吐温80，1mL/L；三水乙酸钠，5.0g/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；柠檬酸三铵，2.0g/L；七水硫酸镁，0.2g/L；硫酸锰，0.05g/L；pH6.2±0.2；
②粪肠球菌EF1109菌液的制备：将保藏的粪肠球菌EF1109菌种接种至装有100mL的YPD液体培养基的锥形瓶中，37℃恒温静置培养20h即为粪肠球菌种子液，再将制备好的种子液按体积比1%-10%的接种量进行二级培养，每级37℃静置恒温培养10-20h后获得供固体发酵用的粪肠球菌菌液；
所述的YPD液体培养基配方如下：蛋白胨，20.0g/L；酵母浸粉，10.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；pH6.5±0.2；
③枯草芽孢杆菌BS0903菌液的制备：将保藏的枯草芽孢杆菌BS0903菌种接种至装有100mL的MNR培养基的锥形瓶中，30℃、摇床转速为225rpm、恒温培养16h后即为枯草芽胞杆菌种子液，再将制备好的种子液按体积比1%-6%的接种量进行二级培养，每级37℃静置恒温培养10-20h后获得供固体发酵用的枯草芽孢杆菌菌液；
所述的MNB培养基配方如下：蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；葡萄糖，5.0g/L；七水硫酸镁，0.5g/L；硫酸锰，0.005g/L；pH7.0±0.2；
④酿酒酵母SC1203菌液的制备：将保藏的酿酒酵母SC1203菌种接种至装有100mL的YPD液体培养基的锥形瓶中，在转速为250rpm摇床中30℃恒温培养16h后即为酿酒酵母菌种子液，再将制备好的种子液按体积比1%-3%的接种量进行二级培养，摇床转速为250rpm、30℃恒温培养16h后获得供固体发酵用的酿酒酵母菌液；
所述的YPD液体培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；酵母浸粉，5.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；丙酸钠，2.5g/L；pH4.0±0.1；
⑤复合菌菌液的配制：按体积比1:1:1:1配比量取嗜酸乳杆菌LA0912菌液、粪肠球菌EF1109菌液、枯草芽孢杆菌BS0903菌液及酿酒酵母SC1203菌液，混匀获得复合菌菌液；
⑵固体发酵
①固体发酵培养基的配制：按质量比豆粕22%、玉米蛋白粉25%、米糠粕23%、麸皮25%、红糖5%配制混合；
②固体发酵培养的条件：复合菌菌液在固体发酵培养基中的接种量按体积质量比为3-6%(mL/g)，蛋白酶的添加量为100-120U/g，水与固体发酵培养基的比例按体积质量比1:1-0.4:1(mL/g)，复合菌菌液、蛋白酶及固体发酵培养基混匀后发酵，发酵温度35-40℃，发酵时间为72-120h；
③固体发酵产物的烘干粉碎：上述所获得的固体发酵培养物经40-60℃低温烘干、粉碎后即为配制生物发酵活性载体型复合预混合饲料所需的生物发酵活性载体。
4.根据权利要求2所述生物发酵活性载体型复合预混合饲料的制备方法，其特征在于复配方法为：每千克生物发酵活性载体型复合预混合饲料含有：铜，200-360mg；铁，600-1200mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，40000-60000IU；维生素D3，10000-15000IU；维生素E，120-200IU；维生素K3，8-16mg；维生素B1，10-20mg；维生素B2，20-40mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.12-0.32mg；烟酸，200mg；叶酸，4-6mg；泛酸100mg；生物素，0-1mg；氯化胆碱，2000mg；赖氨酸，0.4-2.8g；钙，40-80g；总磷，15g；食盐，30-60g。
5.根据权利要求2所述生物发酵活性载体型复合预混合饲料的制备方法，其特征在于复配方法为：每千克生物发酵活性载体型复合预混合饲料含有：铜，360mg；铁，1200mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，60000IU；维生素D3，15000IU；维生素E，160IU；维生素K3，16mg；维生素B1，20mg；维生素B2，20mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.12mg；烟酸，200mg；叶酸，6mg；泛酸100mg；氯化胆碱，2000mg；赖氨酸，2.8g；钙，65g；总磷，15g；食盐，30g。
6.根据权利要求2所述生物发酵活性载体型复合预混合饲料的制备方法，其特征在于复配方法为：每千克生物发酵活性载体型复合预混合饲料含有：铜，240mg；铁，600mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，40000IU；维生素D3，10000IU；维生素E，120IU；维生素K3，8mg；维生素B1，20mg；维生素B2，20mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.08mg；烟酸，200mg；泛酸，100mg；叶酸，4mg；氯化胆碱，2000mg。赖氨酸，2.4g；钙，58g；总磷，15g；食盐，30g。
7.根据权利要求2所述生物发酵活性载体型复合预混合饲料的制备方法，其特征在于复配方法为：每千克生物发酵活性载体型复合预混合饲料含有：铜，200mg；铁，1200mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，50000IU；维生素D3，15000IU；维生素E，200IU；维生素K3，8mg；维生素B1，10mg；维生素B2，40mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.32mg；烟酸，200mg；泛酸，100mg；叶酸，6mg；生物素，1mg；氯化胆碱，2000mg；赖氨酸，0.4g；钙，65g；总磷，15g；食盐，30g。
8.根据权利要求2所述生物发酵活性载体型复合预混合饲料的制备方法，其特征在于复配方法为：每千克生物发酵活性载体型复合预混合饲料含有：铜，200mg；铁，1200mg；锌，800mg；锰，120mg；碘，1.4mg；硒，1mg；维生素A，50000IU；维生素D3，15000IU；维生素E，200IU；维生素K3，8mg；维生素B1，10mg；维生素B2，40mg；维生素B6，12mg；维生素B12，0.32mg；烟酸，200mg；泛酸，100mg；叶酸，60mg；生物素，1mg；氯化胆碱，2000mg。赖氨酸，1.6g；钙，68g；总磷，15g；食盐，30g。
9.权利要求2～9任一所述方法制备而得的生物发酵活性载体型复合预混合饲料在生猪养殖上的应用。
10.根据权利要求9所述生物发酵活性载体型复合预混合饲料在生猪养殖上的应用，其特征在于：生物发酵活性载体型复合预混合饲料占配制猪用全价饲料重量的10%。
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