CN104593352A - 促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂，其由以下质量百分数的组分组成：5-25%经培养、浓缩及固化后的菌株FA08、10-25%经扩培、浓缩与固定后的菌株DS31、余量为载体；载体为硅藻土或沸石粉或麦饭石粉，且硅藻土、沸石粉、麦饭石粉的粉碎细度均为120-250目；同时揭露了该复合微生物菌剂的制备方法。本发明复合微生物菌剂对水产常见的病原菌溶藻弧菌、嗜水气单胞菌都有抑制作用；且该复合微生物菌剂利用两菌株的协同作用，能够降低水产养殖动物的饵料系数，更为有效的促进水产动物肠道的健康与对饲料的利用率，从而能提高水产动物成活率。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
近几年来食品安全备受关注，水产品的健康养殖势在必行，目前在水产养殖过程中，多数使用光合细菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌等微生物制剂改善养殖环境，降低疾病的发生，取得了较好的效果，然而水产养殖动物的疾病发生还与水产动物机体本身有关，因此这几年来针对水产动物肠道健康的研究较多，其中也有一部分利用微生物促进水产动物的肠道健康。如罗源、江海英等申请的中国专利（专利号：201210029204.9）公开了一种短小芽孢杆菌、益生菌制剂及其制备方法和应用。发明的有益效果是：利用短小芽孢杆菌具有强的胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对弧菌具有广泛的抑制性，起到抑制对虾肠道病原弧菌生长、减少对虾弧菌病的发生，同时促进对虾生长、降低饵料系数；但其缺陷在于：对病原菌的抑制性较为单一，只提及对弧菌类病原菌有广泛的抑制作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂，并同时揭露了该复合微生物菌剂的制备方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一种促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂，其由以下质量百分数的组分组成：
经培养、浓缩及固化后的菌株FA08 5-25%；
经扩培、浓缩与固定后的菌株DS31 10-25%；
余量为载体；
其中：载体为硅藻土或沸石粉或麦饭石粉，且硅藻土、沸石粉、麦饭石粉的粉碎细度均为120-250目；
所述菌株FA08为地衣芽孢杆菌菌株FA08（Bacillus licheniformis），于2014年08月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No:9544；
所述菌株DS31为干酪乳杆菌菌株DS31（Lactobacillus casei），于2014年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No:10073。
同时揭露了上述促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂的制备方法，其具体步骤为：
（1）地衣芽孢杆菌菌株FA08的培养：取所述的地衣芽孢杆菌菌株FA08（Bacillus licheniformis）并将其接种至LB培养基中，且于28-40℃、150-200rpm下活化培养5-10h；活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至LB培养基，并于28-40℃、150-200rpm条件下培养12-24h；
（2）地衣芽孢杆菌菌株FA08的浓缩与固化：将经步骤（1）培养所得的菌液置于8000-10000rpm离心5-10min，弃上清得湿菌液；于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸石粉50g/L-2000g/L， 之后30-40℃条件下进行干燥，得固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08，备用；
（3）干酪乳杆菌菌株DS31的扩培：取所述的干酪乳杆菌菌株DS31（Lactobacillus casei）并将其接种至MRS培养基中，且于30-45℃、摇床150-200rpm下活化培养5-10h；活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于30-45℃、摇床150-200rpm条件下培养12-24h；
（4）菌株吸附：于步骤（3）扩培后的菌液中添加粉碎细度120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸石粉50g/L-2000g/L，并于100-150rpm下吸附1-5h；
（5）浓缩与固定：步骤（4）吸附后的菌液于8000-10000rpm下离心5-10min，弃上清得湿菌液，并加入0.1-1.0ml/L的保护剂，30-40℃搅拌干燥，得固定后的干酪乳杆菌菌株DS31，备用；
（6）复配：先按照下列质量百分数称取组分：5-25% 步骤（2）所得的固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08、10-25% 步骤（5）所得的固定后的干酪乳杆菌菌株DS31、余量为粉碎细度120-250目的硅藻土或沸石粉或麦饭石；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，之后进行分装包装即得所述的复合微生物菌剂。
进一步地，所述LB培养基的组分均为：蛋白胨10g， 酵母粉 5g，NaCl 10g，H20 1000 mL。
进一步地，所述保护剂为甘油、海藻酸钠、糊精中的任一种。
进一步地，所述MRS培养基的组分均为：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、Tween-80 1.0 mL、NaAc 5.0 g、K2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.25 g、H2O 1000 mL、pH 6.2-6.6。
本发明的有益效果在于：通过利用地衣芽孢杆菌菌株FA08（Bacillus licheniformis）与干酪乳杆菌菌株DS31（Lactobacillus casei）所制得的复合微生物菌剂，其对水产常见的病原菌溶藻弧菌、嗜水气单胞菌都有抑制作用；且该复合微生物菌剂利用二者的协同作用，能够降低水产养殖动物的饵料系数，更为有效的促进水产动物肠道的健康与对饲料的利用率，从而能提高水产动物成活率。
具体实施方式
本发明中涉及两菌株即地衣芽孢杆菌菌株FA08及干酪乳杆菌菌株DS31，其中，地衣芽孢杆菌菌株FA08是从采自福建省宁德市养殖池底泥样品中分离并筛选得到能够改善水产养殖动物肠道的菌株，通过对该菌株进行生理生化特性测定和16s rDNA鉴定，最终确认其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的一个菌株；干酪乳杆菌菌株DS31是从采自福建省宁德市网箱养殖的健康大黄鱼的鱼肠中分离并筛选得到对水产养殖动物肠道的改良具有促进作用的功能菌株，通过对该菌株进行生理生化特性测定和16s rDNA鉴定，最终确认其为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）的一个菌株。
一、 第一个菌株的分离与鉴定：
1、初筛：
称取10g采自福建省宁德市养殖池底泥样品，加入100mL 0.85%NaCl中，搅拌后取上层浊液置于LB培养基，之后于37℃、180rpm条件下富集培养30h，富集培养所得菌液置于75℃水浴20min，水浴后的菌液进行梯度稀释及LB平板涂布法分离操作，然后挑取LB平板上长起的形态不一的菌落，保存备用。
2、复筛：
取初筛得到的各菌落并分别置于LB试管中，于37℃、180rpm下活化6h；活化好的菌液按10%接种量接种至CMC-Na产酶培养基中，37℃，180rpm发酵48h；所得发酵液经10000rpm离心6min，得各菌落的上清液，备用；
配制CMC-Na平板，打孔后，分别在各孔内添加50uL所得的上清液，之后置于37℃过夜反应；反应后的平板用刚果红染色1h，接着用0.85% NaCl脱色，观察比较各孔中上清液水解圈的大小，进而筛选出产酶能力较强的菌株，将该菌株标记为菌株FA08。
其中，CMC-Na产酶培养基的组分为：蛋白胨10.0g，酵母膏9.0g，CMC-Na 5.0g，pH8.0；CMC-Na平板的组分为：CMC-Na 15.0g、硫酸铵 1.0g、酵母膏 1.0g、硫酸镁 1.0g、磷酸二氢钾 1.0g、H2O 1000mL、Agar 20.0g。
3、鉴定：
将筛选所得菌株FA08接种至LB固体培养基中，37℃下培养，并观察菌落形态，并做部分生理生化特性的测定，结果如下：菌落白色微黄，中间凸起，表面光滑，边缘不规则，革兰氏阳性，产芽孢，葡萄糖发酵阳性，水解淀粉阳性。同时对该菌株进行16S rDNA鉴定，得其16s rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
将测得的16s rDNA序列输入NCBI进行同源性搜索，发现其相似度最高的为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）；则结合生理生化鉴定结果及16s rDNA序列数据库比对结果，确定该菌株FA08为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的一个菌株。
二、 第二个菌株的分离与鉴定：
1、初筛：
将新鲜大黄鱼于冰盘上进行解剖，刮取鱼肠内壁粘膜置于0.85%NaCl中，搅拌均匀后经梯度稀释并涂布于BCP培养基，于37℃生化培养箱中培养24-48h直至菌落长出，挑取周围变黄的菌落，保存到MRS斜面备用。
本发明中，BCP培养基的组分：酵母膏25g、蛋白胨5.0g、葡萄糖5.0g、溴甲酚紫0.004g、琼脂15g、水1000ml，pH7.0；MRS培养基的组分为： 蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、Tween-80 1.0 mL、NaAc 5.0 g、K2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.25 g、H2O 1000 mL、琼脂15g，pH 6.2-6.6；
2、复筛：
挑取初筛保存的菌落并接种至MRS试管中活化6h，活化好的菌液按5%接种量接种至MRS培养基中，于37℃、180rpm、摇床培养24h，摇床培养期间每隔2h取样测pH，进而筛选出产酸能力最强的菌株，将该菌株标记为菌株DS31。
3、鉴定：
将筛选所得菌株DS31接种至MRS固体培养基中，37℃下培养，观察菌落形态，并做部分生理生化特性的测定，结果如下：菌落乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，革兰氏阳性，无芽孢，葡萄糖发酵阳性，乳糖发酵阳性。同时对该菌株进行16S rDNA鉴定，得其16s rDNA序列如SEQ ID NO：2所示。
将测得的16s rDNA序列输入NCBI进行同源性搜索，发现其相似度最高的为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）；则结合生理生化鉴定结果及16s rDNA序列数据库比对结果，确定该菌株DS31为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）的一个菌株。
三、复合微生物菌剂及其制备方法
一种促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂，其由以下质量百分数的组分组成：
经培养、浓缩及固化后的菌株FA08 5-25%；
经扩培、浓缩与固定后的菌株DS31 10-25%；
余量为载体；
其中：载体为硅藻土或沸石粉或麦饭石粉，且硅藻土、沸石粉、麦饭石粉的粉碎细度均为120-250目。
且该复合微生物菌剂的制备方法的具体操作步骤如下：
（1）地衣芽孢杆菌菌株FA08的培养：取所述的地衣芽孢杆菌菌株FA08（Bacillus licheniformis）并将其接种至LB培养基中，且于28-40℃、150-200rpm下活化培养5-10h；活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至LB培养基，并于28-40℃、150-200rpm条件下培养12-24h；
（2）地衣芽孢杆菌菌株FA08的浓缩与固化：将经步骤（1）培养所得的菌液置于8000-10000rpm离心5-10min，弃上清得湿菌液；于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸石粉50g/L-2000g/L， 之后30-40℃条件下进行干燥，得固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08，备用；
（3）干酪乳杆菌菌株DS31的扩培：取所述的干酪乳杆菌菌株DS31（Lactobacillus casei）并将其接种至MRS培养基中，且于30-45℃、摇床150-200rpm下活化培养5-10h；活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于30-45℃、摇床150-200rpm条件下培养12-24h；
（4）菌株吸附：于步骤（3）扩培后的菌液中添加粉碎细度120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸石粉50g/L-2000g/L，并于100-150rpm下吸附1-5h；
（5）浓缩与固定：步骤（4）吸附后的菌液于8000-10000rpm离心5-10min，弃上清得湿菌液，并加入0.1-1.0ml/L的保护剂，30-40℃搅拌干燥，得固定后的干酪乳杆菌菌株DS31，备用；
（6）复配：先按照下列质量百分数称取组分：5-25% 步骤（2）所得的固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08、10-25% 步骤（5）所得的固定后的干酪乳杆菌菌株DS31、余量为粉碎细度120-250目的硅藻土或沸石粉或麦饭石；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，之后进行分装包装即得所述的复合微生物菌剂。
本发明中，保护剂选自甘油、海藻酸钠、糊精中的任一种； LB培养基、LB试管的组分均为：蛋白胨10g， 酵母粉 5g，NaCl 10g，H20 1000 mL；LB固体培养基、LB平板的组分均为：蛋白胨10g， 酵母粉 5g，NaCl 10g，琼脂20g，H20 1000 mL ；MRS培养基的组分均为：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、Tween-80 1.0 mL、NaAc 5.0 g、K2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.25 g、H2O 1000 mL、pH 6.2-6.6。
为了更好的对本发明中复合微生物菌剂进行进一步阐述说明，申请人例举了如下实施例。
实施例1
菌株FA08的培养：取菌株FA08并将其接种至LB培养基中，且于35℃、170rpm下活化培养5h；活化好即得种子液，接着按8%接种量将种子液接种至LB培养基，并于28℃、200rpm条件下培养24h，得菌株FA08菌液；
菌株FA08的浓缩与固化：将菌株FA08菌液置于10000rpm离心8min，弃上清得湿菌液；于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的硅藻土1000g/L（即每升湿菌液中加入1000g硅藻土），之后40℃条件下进行干燥，得固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08，备用；
菌株DS31的扩培：取菌株DS31（Lactobacillus casei）并将其接种至MRS培养基中，且于45℃、摇床180rpm下活化培养10h；活化好即得种子液，接着按8%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于45℃、摇床180rpm条件下培养24h，得菌株DS31菌液；
菌株DS31的吸附：扩培后的菌株 DS31 菌液中添加粉碎细度120-250目的麦饭石粉1000g/L，并于100rpm下吸附3h；
菌株DS31的浓缩与固定：菌株DS31吸附后的菌液于8000rpm离心6 min，弃上清得湿菌液，并加入0.5 ml/L的甘油，35℃搅拌干燥，得固定后的干酪乳杆菌菌株DS31，备用；
复配：先按照下列质量百分数称取组分：25%固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08、25%固定后的干酪乳杆菌菌株DS31、25%粉碎细度120-250目的硅藻土；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，之后进行分装包装即得所述的复合微生物菌剂。
实施例2
菌株FA08的培养：取菌株FA08并将其接种至LB培养基中，且于28℃、200rpm下活化培养10h；活化好即得种子液，接着按1%接种量将种子液接种至LB培养基，并于40℃、150rpm条件下培养12h，得菌株FA08菌液；
菌株FA08的浓缩与固化：将菌株FA08菌液置于8000rpm离心10min，弃上清得湿菌液；于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的麦石饭粉500g/L（即每升湿菌液中加入500g麦石饭粉），之后30℃条件下进行干燥，得固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08，备用；
菌株DS31的扩培：取菌株DS31（Lactobacillus casei）并将其接种至MRS培养基中，且于37℃、摇床150rpm下活化培养5h；活化好即得种子液，接着按1%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于37℃、摇床150rpm条件下培养12h，得菌株DS31菌液；
菌株DS31的吸附：扩培后的菌株 DS31 菌液中添加粉碎细度120-250目的沸石粉1000g/L，并于120rpm下吸附4 h；
菌株DS31的浓缩与固定：菌株DS31吸附后的菌液于9000rpm离心8 min，弃上清得湿菌液，并加入0.1 ml/L的海藻酸钠，30℃搅拌干燥，固定后的干酪乳杆菌菌株DS31，备用；
复配：先按照下列质量百分数称取组分：15%固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08、20%固定后的干酪乳杆菌菌株DS31、65%粉碎细度120-250目的麦石饭粉；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，之后进行分装包装即得所述的复合微生物菌剂。
实施例3
菌株FA08的培养：取菌株FA08并将其接种至LB培养基中，且于40℃、150rpm下活化培养5h；活化好即得种子液，接着按7%接种量将种子液接种至LB培养基，并于28℃、150rpm条件下培养18h，得菌株FA08菌液；
菌株FA08的浓缩与固化：将菌株FA08菌液置于10000rpm离心5min，弃上清得湿菌液；于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的沸石粉2000g/L，之后37℃条件下进行干燥，得固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08，备用；
菌株DS31的扩培：取菌株DS31（Lactobacillus casei）并将其接种至MRS培养基中，且于45℃、摇床200rpm下活化培养8h；活化好即得种子液，接着按10%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于45℃、摇床200rpm条件下培养17h，得菌株DS31菌液；
菌株DS31的吸附：扩培后的菌株 DS31 菌液中添加粉碎细度120-250目的硅藻土900g/L，并于150rpm下吸附5 h；
菌株DS31的浓缩与固定：菌株DS31吸附后的菌液于10000rpm离心10 min，弃上清得湿菌液，并加入1.0 ml/L的糊精，37℃搅拌干燥，固定后的干酪乳杆菌菌株DS31，备用；
复配：先按照下列质量百分数称取组分：10%固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08、25%固定后的干酪乳杆菌菌株DS31、65%粉碎细度120-250目的沸石粉；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，之后进行分装包装即得所述的复合微生物菌剂。
四、复合微生物菌剂的效果试验
试验1
取0.5g实施例1制得的复合微生物菌剂，并加10ml蒸馏水摇匀溶解，之后按5%接种量接种于MRS培养基，于37℃、180rpm下培养24h；取培养好的菌液于10000rpm下离心6min，弃去沉淀，得发酵上清液；制作抑菌板，打孔后，孔内添加50uL发酵上清液后置于37℃培养过夜；且该抑菌板：45℃ 熔融SLB添加1%活化好的病原菌（溶藻弧菌、嗜水气单胞菌）；观察并记录抑菌板上抑菌圈径；
试验结果：
| 指示菌 | 抑菌效果抑菌圈（mm） |
| 溶藻弧菌 | 18.54±0.74 |
| 嗜水气单胞菌 | 17.78±0.30 |
试验2
取实施例2制得的复合微生物菌剂并将其用在养殖甲鱼池塘中：设计一对照组与一实验组；实验组中在甲鱼饲料中按2g/kg的拌饵量添加实施例2制得的复合微生物菌剂，每天拌饵一次进行饲喂；对照组为空白对照，即喂饲相同饵料但不添加实施例2制得的复合微生物菌剂；试验5个月后，计算甲鱼池中甲鱼的饵料系数及成活率。
通过计算得试验结果为：没有使用本发明益生菌制剂的对照组饵料系数1.56，成活率80.1%；而实验组饵料系数1.34，成活率90.7%。
试验3
取实施例3制得的复合微生物菌剂并将其用在养殖甲鱼池塘中：设计一对照组与一实验组；实验组中在甲鱼饲料中按4g/kg的拌饵量添加实施例3制得的复合微生物菌剂，每天拌饵一次进行饲喂；对照组为空白对照，即喂饲相同饵料但不添加实施例3制得的复合微生物菌剂；试验5个月后，计算甲鱼池中甲鱼的饵料系数及成活率。
通过计算得试验结果为：没有使用本发明益生菌制剂的对照组饵料系数1.56，成活率80.1%；而实验组饵料系数1.31，成活率91.9%。
综上，本发明复合微生物菌剂对水产常见的病原菌溶藻弧菌、嗜水气单胞菌都有抑制作用；通过菌株FA08与干菌株DS31的复配，利用二者的协同作用，能够降低水产养殖动物的饵料系数，更为有效的促进水产动物肠道的健康与对饲料的利用率，从而能提高水产动物成活率。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家***第三海洋研究所
<120> 促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂及其制备方法
<130> 100000
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1407
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）
<400> 1
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cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1320
cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttggagccag ccgccgaagg 1380
tgggacagat gattggggga agtcgat 1407
<210> 2
<211> 1453
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）
<400> 2
gccgcctatg atggagtcgt acgagttctg tgcggtgaag ggtgcttgca ccgtgattca 60
acttaaaacg agtggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgccctt aagtggggga 120
taacatttgg aaacagatgc taataccgca taaatccaag aaccgcatgg ttcttggctg 180
aaagatggcg taagctatcg cttttggatg gacccgcggc gtattagcta gttggtgagg 240
taacggctca ccaaggcgat gatacgtagc cgaactgaga ggttgatcgg ccacattggg 300
actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg 360
caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt 420
gttggagaag aatggtcggc agagtaactg ttgtcggcgt gacggtatcc aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggat 540
ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccctcggctt 600
aaccgaggaa gcgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc 660
atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg 780
tagtccatgc cgtaaacgat gaatgctagg tgttggaggg tttccgccct tcagtgccgc 840
agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatct tttgatcacc tgagagatca ggtttcccct tcgggggcaa 1020
aatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttatg actagttgcc agcattcagt tgggcactct agtaagactg 1140
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200
ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg agaccgcgag gtcaagctaa 1260
tctcttaaag ccattctcag ttcggactgt aggctgcaac tcgcctacac gaagtcggaa 1320
tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc cgaagccggt ggcgtaaccc tttaggagcg 1440
agccgtttaa agg 1453
Claims (5)
1.一种促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂，其特征在于：由以下质量百分数的组分组成：
经培养、浓缩及固化后的菌株FA08 5-25%；
经扩培、浓缩与固定后的菌株DS31 10-25%；
余量为载体；
其中：载体为硅藻土或沸石粉或麦饭石粉，且硅藻土、沸石粉、麦饭石粉的粉碎细度均为120-250目；
所述菌株FA08为地衣芽孢杆菌菌株FA08（Bacillus licheniformis），于2014年08月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:9544；
所述菌株DS31为干酪乳杆菌菌株DS31（Lactobacillus casei），于2014年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:10073。
2.一种权利要求1所述促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
（1）地衣芽孢杆菌菌株FA08的培养：取权利要求1中所述的地衣芽孢杆菌菌株FA08（Bacillus licheniformis）并将其接种至LB培养基中，且于28-40℃、150-200rpm下活化培养5-10h；活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至LB培养基，并于28-40℃、150-200rpm条件下培养12-24h；
（2）地衣芽孢杆菌菌株FA08的浓缩与固化：将经步骤（1）培养所得的菌液置于8000-10000rpm离心5-10min，弃上清得湿菌液；于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸石粉50g/L-2000g/L， 之后30-40℃条件下进行干燥，得固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08，备用；
（3）干酪乳杆菌菌株DS31的扩培：取权利要求1所述的干酪乳杆菌菌株DS31（Lactobacillus casei）并将其接种至MRS培养基中，且于30-45℃、摇床150-200rpm下活化培养5-10h；活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于30-45℃、摇床150-200rpm条件下培养12-24h；
（4）菌株吸附：于步骤（3）扩培后的菌液中添加粉碎细度120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸石粉50g/L-2000g/L，并于100-150rpm下吸附1-5h；
（5）浓缩与固定：步骤（4）吸附后的菌液于8000-10000rpm下离心5-10min，弃上清得湿菌液，并加入0.1-1.0ml/L的保护剂，30-40℃搅拌干燥，得固化后的干酪乳杆菌菌株DS31，备用；
（6）复配：先按照下列质量百分数称取组分：5-25% 步骤（2）所得的固化后的地衣芽孢杆菌菌株FA08、10-25% 步骤（5）所得的固定后的干酪乳杆菌菌株DS31、余量为粉碎细度120-250目的硅藻土或沸石粉或麦饭石；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，之后进行分装包装即得所述的复合微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述LB培养基的组分均为：蛋白胨10g， 酵母粉 5g，NaCl 10g，H20 1000 mL。
4.根据权利要求2所述促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述保护剂为甘油、海藻酸钠、糊精中的任一种。
5.根据权利要求2所述促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述MRS培养基的组分均为：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、Tween-80 1.0 mL、NaAc 5.0 g、K2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.25 g、H2O 1000 mL、pH 6.2-6.6。
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