CN101019609A - 利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法 - Google Patents
利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法。方法的步骤为：1)将斜面保存或甘油冻存的纳豆芽孢杆菌菌种用KMB培养基摇瓶培养得一级菌种；2)将豆粕粉、玉米淀粉、玉米浆、NaCl溶于水，调节pH值，灭菌，接入一级菌种摇瓶培养得二级菌种；3)用水浸泡豆粕，再添加NaCl，碳源葡萄糖、蔗糖或玉米淀粉，氮源明胶、(NH4)2SO4或脲，灭菌得固态培养基；接种二级菌种，经保温保湿发酵，得发酵豆粕；4)在发酵豆粕中加入灭菌玉米粉，干燥，粉碎，得到纳豆芽孢杆菌饲料添加剂。添加剂具有促进仔猪生长，降低料重比，促进益生菌乳酸杆菌生长，抑制有害菌大肠杆菌生长的功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法。
背景技术
由于人口的迅速增加和生活水平的不断提高，肉禽蛋奶的需求量逐年增加。饲料是畜禽的食物，如何提高饲料的利用率、保护环境和保障农牧业的持续、健康、稳定发展已成为人类迫切需要解决的重要问题。利用益生菌微生物发酵生产的无毒无害、无污染残留的绿色饲料添加剂，具有提高饲料原料利用率，降解饲料中抗营养因子，消除其抗营养作用，促进营养物质的消化吸收，减少动物体内矿物质的***量，从而减少对环境的污染等功能。目前国内在畜禽的养殖过程中，常用含抗生素的饲料喂养，这不但可能会使畜禽会产生抗药性，增加用药量，而且抗生素使用不当，将会在畜禽肉、奶、蛋中产生残留，还可能导致人类产生耐药性、致癌、致畸等不良后果，因此，发达国家早已限制部分抗生素在畜禽饲料中的应用，并提倡“绿色饲料”、“绿色食品”。发展绿色无公害饲料添加剂是21世纪饲料工业的重要研究方向，饲用微生态制剂是实现这一目的的主要途径，具有促生长、提高饲料利用率、无毒副作用、无残留、不产生抗药性、不污染环境等抗生素之类药物所不具备的优点而受到重视。虽然目前关于微生态制剂应用在动物饲料中的报道很多，但是由于其生产成本很高，大大限制了它们在饲料中的添加量，因而实际使用效果往往并不太理想。
芽孢杆菌制剂是近年来国内外饲料工业和畜禽生产中应用较多的一类益生菌。有关报道(饶正华，李丽蓓，高生.细菌素在饲料中的应用.中国饲料.2001，第24期；Osawa O，Matsumato K.Digestion of staphylococcal enterotoxin by Bacillusnatto.Antonic-Van-Leeu wenhoek.1997年第4期)表明芽孢杆菌作为益生素，具有提高动物生产性能，提高动物对疾病的抵抗和免疫机能，改善肠道微生态，饲料中营养物质的消化等多种功能。其中纳豆芽孢杆菌作为一种人类食用历史悠久、对人体保健功效明确和食用安全的菌种，近年来在饲料业中的应用特别受到人们的关注。
纳豆是日本的传统发酵食品，它是以大豆为原料，经纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)发酵而成。纳豆具有独特的风味和粘性，与我国的传统食品豆豉相似，但纳豆是由纯菌种发酵而成，时间较短，便于控制，具有多种保健功能，如溶血栓、降低血脂、降低胆固醇、预防大肠癌、软化血管、预防高血压和动脉硬化、抗菌等作用，还可预防骨质疏松、提高蛋白质的消化率、抗氧化等功能(陈丽花，陈有容，齐凤兰.芽孢杆菌的功能及其应用.食品工业.2001年，第4期)纳豆多年来研究表明纳豆具有以下特点：
①提高大豆的营养性能，提高肠道对营养物质的吸收率。纳豆芽孢杆菌可分泌很多酶，如淀粉酶，蛋白酶，可分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质，使发酵产品富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种易被人体吸收的成分。利用纳豆芽孢杆菌发酵大豆可使大豆具有几乎不含胆固醇，必需氨基酸含量高，营养平衡好的优点，使大豆的消化率从原来的50％增加到90％以上。大豆蛋白质将有50-60％转化为肽和氨基酸，其中10％是氨基酸，特别是谷氨酸较多，同时还会产生独特的风味物质，如丁酸，丙酸和丁二酸等。经高压灭菌的大豆用纳豆芽孢杆菌发酵48小时，可溶性物质和可透析物质的数量分别从22％和6％上升到65％和40％；体外可消化性物质从29％提高到33-43％。用纳豆芽孢杆菌对大豆进行发酵，在最初的18小时发酵中，研究发现大量蛋白质和碳水化合物发生降解反应，释放出高水平的寡肽和寡糖。这表明纳豆芽孢杆菌能降解大豆中的高分子物质，大幅度的提水溶性小分子物质的数量(陆兆新.纳豆的保健功能.中国食物与营养，2000年第二期)。
②拮抗病原微生物作用。日本学者小泽恭辅研究发现，纳豆菌的芽孢对致病菌如病原性大肠杆菌(如0-111，0-144)及沙门氏菌具有抗菌作用，还能杀死肠道出血性大肠杆菌O-157(陆兆新.值得开发的保健食品—纳豆.中国食品报，2000年11月1日)。
③调整肠道功能。纳豆菌食用后在肠中生长，作为营养体能在肠内生活几周，分泌各种酶和维生素，从而可促进小肠粘膜细胞的增殖，同时纳豆菌进入肠内，可以抑制肠内异常发酵菌和痢疾菌等的繁殖，促进乳酸菌等益生菌的增殖，调节肠内微生态平衡，保证肠功能的正常运作，改善动物免疫机能和饲料中营业物质的消化吸收(陆兆新.纳豆的保健功能.中国食物与营养，2000年第二期)。藤田昭二等证实，仔猪和母猪的饲料中添加纳豆菌制剂，对于防制仔猪腹泻的发生和改善腹泻临床症状有明显的作用(藤田昭二等，纳豆菌BN株对防制仔猪腹泻的效果-和对母猪粪便中乳酸菌的影响.国外兽医-畜禽传染病，1989年第三期)。
④生产性能好。纳豆芽孢杆菌能形成芽孢。与营养细胞相比，芽孢具有耐酸，耐碱，耐高温，抗辐射的，对抗生素和化学药品的抗性也高。芽孢在制粒过程及酸性胃环境中均能保持高度的稳定性的特性，在肠道中不增殖，在肠道上段能迅速发育转变成具有新陈代谢作用的营养型细胞(秦玉昌，潘宝海，于荣，张建东，谯仕彦.芽孢杆菌对畜禽生产性能的影响。中国饲料，2004年第16期)。
1999年纳豆菌被我国农业部列入12种可直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂(杨振海，蔡辉益.饲料添加剂安全使用规范.中国农业出版社2003年出版)。迄今，国内外已开展了纳豆芽孢杆菌应用于仔鸡、猪和牛饲料的研究(陈兵，缪志伟，朱风香等.仔猪日粮中添加纳豆芽孢杆菌的效果试验.浙江畜牧兽医，2003年第四期；藤田昭二，沈志强.纳豆菌BN株对防制仔猪腹泻的效果和对母猪便中乳酸菌的影响.国外兽医学：畜禽传染病，1989年第九期；陈兵，缪志伟，朱凤香等.纳豆芽孢杆菌对AA鸡生产性能和十二指肠消化酶的影响.浙江农业学报，2003年第五期；杨晓斌，谢拥葵，韦燕鹏等.益生菌纳豆芽孢杆菌的筛选.广州食品工业科技，2003年增刊)。
以往以开发生产食品、功能食品、保健食品为目的纳豆食品发明专利，通常采用以大豆为原料传统食品生产方法，如专利200410043690.5(2004年)中描述了利用原大豆固体发酵生产多聚谷氨酸。专利02121352.6(2002年)中虽描述了利用大豆粉、大豆饼粕粉为原料培养基生产具有血栓溶解性的保健食品，但未涉及饲料添加剂领域。
以往涉及利用纳豆菌开发微生态饲料添加剂的专利，大多采用多菌种复合生产，如专利03139006.4(2003年)中采用红假单孢菌、纳豆菌芽孢杆菌在豆汁液体中发酵生产含硒复合微生物饲料添加剂。
在饲料业中采用大豆作为原料显然成本偏高，而利用饲料级豆粕作为替代原料则可以大大降低生产成本。日本人堀淳曾在我国曾申请了“以发酵的大豆糟粕作为主要原料的鱼类和甲壳类养殖用饵料”的专利87106774(1987年)，该申请虽然采用大豆糟粕作为主要原料进行固体发酵的方法，但它主要以开发容易消化、原料供应稳定、价格比鱼粉便宜，可替代鱼粉的植物蛋白性淡水鱼饵料为目的，并未涉及以活菌数为主要质量指标的益生菌添加剂，用途也未涉畜禽养殖业。特别是其方法工艺描述过于简单，未涉及科学研究基础上的发酵用菌种培养液和固体培养基配方，以及各种工艺参数描述，难以实施工业化生产。该申请迄今在我国未获授权。目前国内已有的一些纳豆芽孢杆菌制剂的应用报道通常采用液体发酵产品，尚未见利用豆粕生产，成本符合畜禽养猪业的固态发酵纯种纳豆菌饲料添加剂的成熟工艺和产品报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法。
利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法的步骤为：
1)将纳豆芽孢杆菌斜面保存或甘油冻存的菌种，用KMB培养基，37℃、250rpm摇瓶培养16h，得到一级菌种液；
2)将粒度为80目重量百分比为1-5％的豆粕粉、1-3％的玉米淀粉、1-2％的玉米浆、0.2-0.8％的NaCl溶于水溶液，经双层纱布过滤，调节pH值至6.5-7.0，补水，121℃高压灭菌15min，接入2-6％的上述一级菌种液，37℃培养12-18h，得到二级菌种液；
3)用pH值为5.5-8.5的水浸泡豆粕1-2h，泡胀豆粕含水量为55-70％，再添加重量百分比为0.3-1.2％的NaCl，3-5％的碳源葡萄糖、蔗糖或玉米淀粉，3-5％的氮源明胶或(NH4)2SO4、脲或明胶，混匀，经过蒸煮灭菌，冷却，得到固态培养基；
4)固态培养基中接种5-10％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，30-37℃保温保湿发酵10-18h，得到发酵豆粕；
5)在上述发酵豆粕中，加入重量百分比为50-200％的灭菌玉米粉，充分拌匀，经45-80℃热风烘14-18h至干燥，得到干燥发酵豆粕；
6)将上述干燥发酵豆粕用饲料粉碎机粉碎，过40-60目筛，得到纳豆芽孢杆菌饲料添加剂。
所述的步骤2)将粒度为80目重量百分比为5％的豆粕粉、1％的玉米淀粉、1.5％的玉米浆、0.2％的NaCl溶于水溶液，经双层纱布过滤，调节pH值至7.0，补水，121℃高压灭菌15min，接入4％的上述一级菌种液，37℃培养24h，得到二级菌种液。
步骤3)用pH值为7的水浸泡豆粕1h，泡胀豆粕含水量为60％，添加重量百分比为0.9％的NaCl，5％的碳源葡萄糖，5％的氮源明胶，混匀，经过蒸煮灭菌，冷却，得到固态培养基。
步骤4)固态培养基中接种5％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，37℃保温保湿发酵16h，得到发酵豆粕。
步骤5)在上述发酵豆粕中，加入重量百分比为200％的灭菌玉米粉，充分拌匀，经55℃热风烘16h至干燥，得到干燥发酵豆粕。
豆粕经过发酵，使原有抗营养因子得到降解，部分大分子蛋白质被降解分子量小于1000的小肽，维生素K2、B2、吡啶二羧酸等营养和功能成分比发酵前增加数倍。
由于产品所含纳豆菌具有耐热、耐酸碱、好氧、繁殖快、能形成芽孢的特点，活菌质量稳定，每克含活菌总数为7.0-10.0×108cfu/g，符合农业部规定的纳豆芽孢杆菌饲料添加剂活菌总数1×108cfu/g的标准。
本发明为一种不含抗生素的益生菌饲料添加剂，在断奶仔猪常规饲料中添加2％-4％，具有促进仔猪的生长，提高日增重，提高采食量，降低料重比，促进益生菌乳酸杆菌的生长，抑制有害菌大肠杆菌生长的功能。
附图说明
图1是纳豆芽孢杆菌液体发酵生长曲线；
图2是纳豆芽孢杆菌固体发酵生长曲线；
图3是利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法流程图。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述，但不限于本实施例。
实施例1
1)将纳豆芽孢杆菌斜面保存或甘油冻存的菌种，用KMB培养基(KMB培养基配方：NaCl8.0g，Na2HPO4·12H2O2.9g，K2HPO40.2g，调节pH值至7.0-7.5，加H2O至1000ml，140℃高压灭菌2-30min)，37℃、250rpm摇瓶培养13h，得到一级菌种液；
2)将粒度为80目、重量百分比为3％的豆粕粉，1％的玉米淀粉，1％的玉米浆，0.2％的NaCl溶于水溶液。经双层纱布过滤，调节pH值至6.5，补水，121℃高压灭菌15min，接入2％的上述一级菌种液，37℃培养12h，得到二级菌种液；
3)用pH值为5.5的水浸泡豆粕1h，泡胀豆粕含水量为55％，再添加重量百分比为0.3％的NaCl，3％的碳源葡萄糖，3％的氮源明胶，混匀，经过蒸煮灭菌，冷却，得到固态培养基；
4)固态培养基中接种5％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，30℃保温保湿发酵10h，得到发酵豆粕；
5)在上述发酵豆粕中，加入重量百分比为50％的灭菌玉米粉，充分拌匀，经45℃热风烘14h至干燥，得到干燥发酵豆粕；
6)将上述干燥发酵豆粕用饲料粉碎机粉碎，过40目筛，得到纳豆芽孢杆菌饲料添加剂。
实施例2
1)将纳豆芽孢杆菌斜面保存或甘油冻存的菌种，用KMB培养基摇瓶培养，37℃、250rpm摇瓶培养12h，得到一级菌种液；
2)将粒度为80目重量百分比为5％的豆粕粉、2％的玉米淀粉、1.5％的玉米浆、0.5％的NaCl溶于水溶液，经双层纱布过滤，调节pH值至7.0，补水，121℃高压灭菌15min，接入4％的上述一级菌种液，37℃培养14h，得到二级菌种液；
3)用pH值为8.5的水浸泡豆粕2h，泡胀豆粕含水量为70％，再添加重量百分比为1.2％的NaCl，5％的碳源蔗糖，5％的氮源(NH4)2SO4，混匀，经过蒸煮灭菌，冷却，得到固态培养基；
4)固态培养基中接种7.5％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，37℃保温保湿发酵18h，得到发酵豆粕；
5)在上述发酵豆粕中，加入重量百分比为200％的灭菌玉米粉，充分拌匀，经60℃热风烘15h至干燥，得到干燥发酵豆粕；
6)将上述干燥发酵豆粕用饲料粉碎机粉碎，过60目筛，得到纳豆芽孢杆菌饲料添加剂。
实施例3
1)将纳豆芽孢杆菌斜面保存或甘油冻存的菌种，用KMB培养基摇瓶培养，37℃、250rpm摇瓶培养14h，得到一级菌种液；
2)将粒度为80目重量百分比为7％的豆粕粉、3％的玉米淀粉、2％的玉米浆、0.8％的NaCl溶于水溶液，经双层纱布过滤，调节pH值至7.0，补水，121℃高压灭菌15min，接入6％的上述一级菌种液，37℃培养16h，得到二级菌种液；
3)用pH值为7.0的水浸泡豆粕1h，泡胀豆粕含水量为60％，再添加重量百分比为0.9％的NaCl，5％的玉米淀粉，5％的明胶，混匀，经过蒸煮灭菌，冷却，得到固态培养基；
4)固态培养基中接种10％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，37℃保温保湿发酵16h，得到发酵豆粕；
5)在上述发酵豆粕中，加入重量百分比为100％的灭菌玉米粉，充分拌匀，经55℃热风烘16h至干燥，得到干燥发酵豆粕；
6)将上述干燥发酵豆粕用饲料粉碎机粉碎，过40目筛，得到纳豆芽孢杆菌饲料添加剂。
实施例4
(1)活化纳豆芽孢杆菌菌种：取用含30％甘油的KMB液体培养基(每1000mLKMB培养基配方为：NaCl8.0g，Na2HPO4·12H2O2.9g，K2HPO40.2g，溶于水，调节pH值至7.0-7.5，加H2O至1000ml，140℃高压灭菌2-30min)存放在冻存管中，在-80℃冰箱中的冻存的菌株，解冻后吸取100μl移入加有装有100mLKMB液体培养基的摇瓶中，37℃、250rpm摇瓶培养12h，即为一级菌种液。或用接种环从试管中KMB斜面保存的菌株中取2环，接种于装有5mL KMB液体培养基的试管中37℃、250rpm摇瓶培养12h，再取100μl移入装有100mL KMB液体培养基的摇瓶中继续培养12h，作为一级菌种液。
(2)纳豆芽孢杆菌二级液体扩大培养：配制二级种子液体培养基，配比为：豆粕粉(80目)1-5％，最佳5％；玉米淀粉1-3％，最佳1.0％；玉米浆1-2％，最佳1.5％；NaCl0.2-0.8％，最佳0.2％。将所有配料混合，溶于水，经双层纱布过滤，调节pH值至6.5-7.0，然后补水至足量，121℃高压灭菌15min。接入4-6％的一级菌种液，最佳4％。37℃、250 rpm摇瓶培养12-18h，最佳14h。
最佳培养时间：培养过程中每隔2h取样进行活菌数检测，建立生长曲线如图1：由图1可见，在0～4h，菌体处于生长的延滞期；在4～8h，菌体处于对数生长期；在8～20h，菌体处于生长的稳定期；从20h开始，纳豆芽孢杆菌开始进入生长的衰亡期。在生长稳定期菌体产生大量活菌数达到最大值，且基本保持稳定，同时培养物的生化稳定性也较好，因此确定最佳培养时间为14h，最长不超过24h。
(3)固态发酵：豆粕用pH值为5.5-8.5，最佳6.5-7.5的水，浸泡1h；培养基用豆粕含水量为55-70％，最佳60％；添加营养配料：NaCl0.3-1.2％，最佳0.9％，碳源葡萄糖或蔗糖、玉米淀粉，最佳为葡萄糖5％；氮源明胶或(NH4)2SO4、脲，最佳为明胶5％。将营养配料与泡胀的豆粕混匀，经过蒸煮灭菌，冷却，即为固态培养基。固态培养基中加入接种量为5％的二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，30-37℃保温保湿发酵10-18h，最佳14-16h。
最佳培养时间：培养过程中每隔2h取样进行活菌数检测，建立生长曲线如图2。由图2可见，在0-4h，菌体处于生长的延滞期；在4-10h，菌体处于对数生长期；在10-16h，菌体处于生长的稳定期；从16h开始，纳豆芽孢杆菌开始进入生长的衰亡期。在菌体生长稳定期活菌数达到最大且保持稳定，确定最佳收获时间是14-16h，最长不超过18h。
豆粕培养基最佳含水量：加适量水使原料豆粕含水量分别达55％、60％、65％、70％，浸泡1h，灭菌。每份取20g分装于培养皿中，每个处理重复三次，经37℃恒温培养16h，最后分别取样作活菌数检测。结果显示(表1)显示，含水量60％的豆粕中细菌总数高于其它三种含水量的培养基，差异达到极显著水平；而含水量为55％、60％、65％的培养基间细菌总数无显著差异。因此确定豆粕培养基的最佳含水量为60％。
表1 豆粕培养基中含水量对纳豆菌生长的影响(n＝3)
| 含水量(％) | 菌数(108cfu/g) | 5％显著水平 | 1％极显著水平 |
| 55 | 2.10±0.14 | b | B |
| 60 | 4.55±0.25 | a | A |
| 65 | 1.07±0.11 | b | B |
| 70 | 1.36±0.04 | b | B |
注：同列中大写字母不同表示差异高度显著(p<0.01>，小写字母不同表示差异显著(p<0.05>，以下其它表同样。
豆粕培养基的最佳pH值：采用四种不同pH值，即调节豆粕培养基的pH值，使之分别为5.5、6.5、7.5和8.5，接种纳豆菌培养16h后，分别测定细菌总数。结果(表2)显示，pH为6.5培养基细菌总数最高，pH为7.5的培养基其次，二者无显著差异，但均极显著地高于pH值为5.5和8.5的培养基，后二种培养基间的细菌总数无差异，因此确定豆粕培养基的最佳酸碱度为6.5-7.5。
表2 浸泡水酸碱度对纳豆菌生长的影响(n＝3)
| 浸泡水pH值 | 菌数(108cfu/g) | 5％显著水平 | 1％极显著水平 |
| 5.5 | 4.25±0.21 | b | B |
| 6.5 | 7.00±0.33 | a | A |
| 7.5 | 6.35±0.23 | a | A |
| 8.5 | 1.25±0.21 | c | B |
豆粕培养基中无机盐NaCl的最佳添加量：采用四种不同NaCl添加量，即豆粕培养基中NaCl添加量为0.3％、0.6％、0.9％、1.2％，，以及对照豆粕培养基，接种纳豆菌培养16h后，分别测定细菌总数。结果(表3)显示，当NaCl添加量0.90％时活菌数最高，极显著地高其它四个添加量和对照的培养基。因此确定豆粕培养基的最佳NaCl添加量为0.90％。
表3 NaCl对纳豆菌生长的影响(n＝3)
| NaCl浓度(％) | 活菌数(108cfu/g) | 5％显著水平 | 1％极显著水平 |
| 0.3 | 8.5±0.18 | b | B |
| 0.6 | 8.0±0.24 | b | B |
| 0.9 | 9.8±0.24 | a | A |
| 1.2 | 7.0±0.30 | c | C |
| 对照 | 4.1±0.14 | d | D |
豆粕培养基最佳碳源：采用三种不同碳源，即豆粕培养基中分别添加5％的葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉，以及对照豆粕培养基，接种纳豆菌培养16h后，分别测定细菌总数。结果(表4)显示，添加葡萄糖的培养基活菌数最高，随后依次为蔗糖、玉米淀粉。与对照相比，添加葡萄糖、蔗糖细菌总数极显著增加，玉米淀粉有显著增加。因此确定豆粕培养基的最佳碳源为葡萄糖。
表4 碳源对纳豆菌生长的影响(n＝3)
| C源 | 活菌数(108cfu/g) | 5％显著水平 | 1％极显著水平 |
| 葡萄糖 | 59.50±4.99 | a | A |
| 蔗糖 | 37.50±2.91 | b | B |
| 玉米淀粉 | 16.00±3.52 | c | C |
| 对照 | 3.95±0.05 | d | C |
豆粕培养基最佳氮源：采用三种不同碳源，即豆粕培养基中分别添加5％的明胶、(NH4)2SO4、脲，以及对照豆粕培养基，接种纳豆菌培养16h后，分别测定细菌总数，结果(表5)显示，添加明胶的培养基活菌数最高，随后依次为(NH4)2SO4、对照、脲。与对照相比，添加明胶细菌总数极显著增加。因此，补充合适的氮源有利于纳豆菌生长，最佳碳源为明胶。
表5 氮源对纳豆菌生长的影响(n＝3)
| N源 | 活菌数(108cfu/g) | 5％显著水平 | 1％极显著水平 |
| 明胶 | 17.0±0.30 | a | A |
| (NH4)2SO4 | 1.05±1.95 | b | B |
| 脲 | 0.25±1.82 | c | C |
| 对照 | 1.00±2.59 | b | B |
(3)干燥：取发酵后的豆粕，加入经灭菌的载体玉米粉，加量为发酵豆粕量的0.5-2倍，最佳为2倍，充分拌匀。经45-80℃，最佳低于45-65℃，热风烘14-18h至干燥。
最佳载体加量：取发酵湿豆粕，按豆粕∶玉米粉分别1∶0.5、1∶1、1∶2的比例，加入经辐照灭菌的玉米粉，混匀，在80℃下烘至恒重，记录烘干所需时间，同时取样作活菌数检测。结果(表6)显示，当玉米粉∶发酵豆粕为1∶1时烘干需要的时间较短，活菌数最多。因此确定载体玉米粉的最佳加量为玉米粉∶发酵豆粕为1∶1。
表6 玉米粉添加量对产品中纳豆菌的影响
| 玉米粉/发酵豆粕的比率 | 0.50 | 1.00 | 2.00 |
| 烘干时间(h) | 2.50 | 2.00 | 1.50 |
| 活菌数(106cfu/g) | 0.55 | 1.21 | 0.77 |
最佳烘干温度与时间：取发酵豆粕加入等量玉米粉，置电热干燥箱中，分别在45℃、55℃、65℃、75℃条件下进行常规加温处理，每级温度分别设30min和60min二个加热时间，并设对照，最后取样作活菌数检测。同时分别在60℃、80℃、100℃和120℃条件下进行加温处理，观察高温条件下产品中纳豆菌的耐热性。由表7结果可见，温度对产品中纳豆菌的影响大于加热时间。与对照相比，干燥60min后，产品中活菌数有一定下降。在干燥温度为75℃时，产品中活菌数比对照和45-65℃各组温度处理均极显著下降。经45℃、55℃和65℃三个温度处理的活菌数与对照均无显著差异，各处理间，无论30min和60min也均无显著差异。45-65℃处理一般活菌数在7.0-10.0×108cfu/g，由此确定最佳烘干温度在65℃以下。
表7 常规加温处理温度与时间对产品中活菌数的综合影响(n＝3)
| 温度(℃) | 处理时间(min) | 活菌数(108cfu/g) | 5％显著水平 | 1％极显著水平 |
| 45 | 30 | 7.6±0.99 | a | A |
| 60 | 7.5±2.40 | a | A | |
| 55 | 30 | 10.00±0.56 | a | A |
| 60 | 7.0±1.13 | a | A | |
| 65 | 30 | 8.75±3.04 | a | A |
| 60 | 8.25±1.34 | a | A | |
| 75 | 30 | 0.62±0.28 | b | B |
| 60 | 0.67±0.19 | b | B |
由于益生菌饲料在制粒过程中经常遇到80℃以上的瞬时高温膨化，为此进一步观察了80-120℃温度处理对纳豆菌的影响。结果(表8)表明，经80℃、100℃和120℃三个温度处理后纳豆活菌数极显著低于65℃，这表明80℃以上的高温容易导致纳豆菌营养细胞的大量死亡。但80℃、100℃和120℃三个温度间的活菌数差异不大，原因可能是80℃以上高温条件下存活的纳豆菌菌体主要是芽孢。但比较而言，短时间加温对纳豆菌存活率的影响相对小一些。因此，纳豆菌饲料产品在加工和保存中，应避免80℃以上长时间高温。
表8 高温处理温度与持续时间对产品中活菌数的影响
| 温度(℃) | 处理时间(min) | 活菌数(106cfu/g) | 5％显著水平 | 1％极显著水平 |
| 80 | 15 | 12.0±4.24 | a | A |
| 30 | 0.36±0.02 | b | B | |
| 60 | 0.30±0.24 | b | B | |
| 100 | 15 | 0.36±0.23 | b | B |
| 30 | 0.93±0.04 | b | B | |
| 60 | 0.24±0.24 | b | B | |
| 120 | 15 | 0.83±0.01 | b | B |
| 30 | 0.77±0.48 | b | B | |
| 60 | 0.50±0.40 | b | B |
(4)粉碎包装：用饲料粉碎机粉碎，过40目筛，包装密封，即为成品。
实施例5
产品生产中试
综合各试验优化条件，进行固态发酵中试：豆粕加pH6.6-7.5的水浸泡1h，使含水量达到60％；添加营养配料NaCl0.90％、葡萄糖5％、明胶5％混匀，经过蒸煮灭菌，冷却，加入接种量为5％的二级菌种液混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，30-37℃保温发酵16h，即为发酵豆粕。然后按发酵豆粕重量百分比的200％，加入经辐照灭菌的载体玉米粉，拌匀，55℃烘16h至干燥。用饲料粉碎机粉碎，过40目筛，包装，即为成品。
对中试产品和对照(玉米粉与干豆粕混合物)分别进行质量分析，结果表明(表9)：中试产品中肽(分子量小于1000)、VB2、吡啶二羧酸均高于对照。中试产品中活菌含量为7.5×108cfu/g，超过农业部纳豆菌饲料添加剂推荐标准1×108cfu/g，达到益生菌饲料质量要求。其中VB2、吡啶二羧酸可能主要来自于纳豆菌发酵过程的代谢产物，肽主要来自于纳豆菌发酵过程对蛋白质降解。
表9 中试产品成分分析
| 成分 | 纳豆菌产品 | 对照 |
| 水分含量(％) | 9.10±0.01 | 10.33±0.01 |
| 蛋白质含量(以干基计，％) | 33.85±0.01 | 37.82±0.01 |
| 肽含量(分子量＜1000，以干基计，％) | 1.95±0.01 | 0.53±0.01 |
| VB2含量(干基计，mg/1000g) | 1.96±0.01 | 0.22±0.01 |
| 吡啶二羧酸含量(干基计，mg/g) | 2.06±0.01 | 0.22±0.01 |
| 纳豆菌活菌数(108cfu/g) | 7.50±2.12 |
注：对照由豆粕粉和玉米粉组成，其干基含量
实施例6
产品在生猪饲养生产中的应用
在30日龄的断奶的杜大长仔猪日粮中添加纳豆菌芽孢杆菌产品，与常规饲料进行对比试验：其过程如下：
试验前随机选择90头30日龄的断奶仔猪，分成2组：①对照组：饲料不添加药物，②纳豆菌组1：每吨日粮添加纳豆菌产品2kg，③纳豆菌组2：每吨日粮添加产品4kg。每组设3个重复栏，每栏9-11头。喂养1周后，分别取样各组仔猪的粪便，分别检测粪便中的大肠杆菌和乳酸杆菌活菌数。在试验前和喂养20日后，各组分别按栏进行称重，记录每饲料的消耗量，统计日增重和料重比。
肠道菌群检测结果(表10)表明，添加纳豆菌的两组仔猪粪便的大肠杆菌数比对照组明显减少，显示纳豆芽孢杆菌对大肠杆菌有一定抑制作用。添加纳豆菌的两组仔猪乳酸杆菌数均比对照组有提高，显示添加纳豆菌可促进断奶仔猪肠道益生菌的生长。
表10 添加纳豆菌产品对断奶仔猪肠道菌群的影响(n＝3)
| 处理 | 大肠杆菌 | 乳酸于菌 | ||
| 菌数(108cfu/g) | 增减率(％) | 活菌数(109cfu/g) | 增减率(％) | |
| 对照 | 8.02±0.04 | - | 8.81±0.04 | - |
| 添加纳豆菌0.2％ | 7.57±0.04 | -7.80 | 9.65±0.05 | +9.53 |
| 添加纳豆菌0.4％ | 7.39±0.07 | -10.99 | 10.08±0.06 | +14.41 |
日增重、料重比考察结果(表11)表明，添加纳豆芽孢杆菌饲料组仔猪日增重明显高于对照组，同时添加纳豆芽孢杆菌组仔猪的采食量也高于对照组，说明添加纳豆芽孢杆菌的饲料有更好的适口性。添加纳豆芽孢杆菌饲料组仔猪的料重比明显低于对照组，说明添加纳豆芽孢杆菌可提高仔猪对食物的吸收利用率。
表11 添加纳豆菌产品对仔猪日增重、料重比的影响
| 处理 | 头数(头) | 初体重(kg) | 结束体重(kg) | 增重(kg) | 采食量(kg/头.日) | 料重比 |
| 对照 | 30 | 8.26±0.65 | 13.62±1.92 | 4.63±1.27 | 0.55±0.06 | 2.453±0.014 |
| 添加纳豆菌0.2％ | 29 | 8.23±0.43 | 15.32±0.28 | 7.11±0.17 | 0.63±0.02 | 1.939±0.002 |
| 添加纳豆菌0.4％ | 31 | 8.26±0.77 | 14.43±0.63 | 6.07±0.48 | 0.50±0.13 | 2.116±0.028 |
Claims (5)
1.一种利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法，其特征在于，方法的步骤为：
1)将纳豆芽孢杆菌斜面保存或甘油冻存的菌种，用KMB培养基，37℃、250rpm摇瓶培养12-16h，得到一级菌种液；
2)将粒度为80目重量百分比为1-5％的豆粕粉、1-3％的玉米淀粉、1-2％的玉米浆、0.2-0.8％NaCl溶于水溶液，经双层纱布过滤，调节pH值至6.5-7.0，补水，121℃高压灭菌15min，接入2-6％的上述一级菌种液，37℃摇瓶培养12-18h，得到二级菌种液；
3)用pH值为5.5-8.5的水浸泡豆粕1-2h，泡胀豆粕含水量为55-70％，再添加重量百分比为0.3-1.2％的NaCl，3-5％的碳源葡萄糖、蔗糖或玉米淀粉，3-5％的氮源明胶、(NH4)2SO4或脲，混匀，经过蒸煮灭菌，冷却，得到固态培养基；
4)在固态培养基中接种5-10％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，30-37℃保温保湿发酵10-18h，得到发酵豆粕；
5)在上述发酵豆粕中加入重量百分比为50-200％的灭菌玉米粉，充分拌匀，经45-80℃热风烘14-18h至干燥，得到干燥发酵豆粕；
6)将上述干燥发酵豆粕用饲料粉碎机粉碎，过40-60目筛，得到纳豆芽孢杆菌饲料添加剂。
2.根据权利要求1所述的一种利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法，其特征在于，所述的步骤2)将粒度为80目重量百分比为5％的豆粕粉、1％的玉米淀粉、1.5％的玉米浆、0.2％的NaCl溶于水溶液，经双层纱布过滤，调节pH值至7.0，补水，121℃高压灭菌15min，接入4％的上述一级菌种液，37℃培养14h，得到二级菌种液。
3.根据权利要求1所述的一种利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法，其特征在于，所述的步骤3)用pH值为7的水浸泡豆粕1h，泡胀豆粕含水量为60％，添加重量百分比为0.9％的NaCl、5％的碳源葡萄糖、5％的氮源明胶，混匀，经过灭菌，冷却，得到固态培养基。
4.根据权利要求1所述的一种利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法，其特征在于，所述的步骤4)固态培养基中接种5％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，37℃保温保湿发酵16h，得到发酵豆粕。
5.根据权利要求1所述的一种利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法，其特征在于，所述的步骤5)在上述发酵豆粕中，加入重量百分比为200％的灭菌玉米粉，充分拌匀，经55℃热风烘16h至干燥，得到干燥发酵豆粕。
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