CN102102131A

CN102102131A - 检测单纯疱疹病毒ⅱ型荧光pcr试剂盒

Info

Publication number: CN102102131A
Application number: CN2009102012905A
Authority: CN
Inventors: 穆海东; 汪宁梅; 穆宇豪; 黎飒
Original assignee: SHANGHAI YULONG CLINICAL TESTING CENTER CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI YULONG CLINICAL TESTING CENTER CO Ltd
Priority date: 2009-12-17
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2011-06-22

Abstract

本发明公开了一种用于检测单纯疱疹病毒II型感染的荧光PCR试剂盒，属于体外核酸诊断试剂盒领域。该试剂盒包括阳性参考品、阴性参考品、荧光聚合酶链式反应液、PCR引物和特异性荧光探针、PEG沉淀液、裂解液。本发明包括以荧光PCR技术为基础的PCR体系，包含针对单纯疱疹病毒II型基因序列的正、反向引物和荧光探针，在适合的PCR条件下可以检测单纯疱疹病毒II型基因的核酸序列；可以简便快速地在临床样本中检测HSV II感染，特异性高。

Description

检测单纯疱疹病毒Ⅱ型荧光PCR试剂盒

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中检测单纯疱疹病毒II型(HSV-II)感染的荧光PCR(聚合酶链式反应)试剂盒。

背景技术

单纯疱疹是单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)所引起的一种急性疱疹性皮肤病，人是单纯疤疹病毒唯一的自然宿主，此病毒存在于病人、恢复者或者是健康带菌者的水疱疤液、唾液及粪便中，传播方式主要是直接接触传染，亦可通过被唾液污染的餐具而间接传染。人类单纯疱疹病毒分为两型，即单纯疱疹病毒I型(HSV-I)和单纯疱疹病毒II型(HSV-II)。I型主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染。II型主要引起生殖器部位皮肤粘膜感染。病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破损皮肤进入体内，潜居于人体正常粘膜、血液、唾液及感觉神经节细胞内。当机体抵抗力下降时，如发热、胃肠功能紊乱、月经、妊娠、病灶感染和情绪改变时，体内潜伏的HSV被激活而发病。单纯疱疹病毒，引起的感染症与CD4T淋巴细胞数有关，在***、***、肛周处形成溃疡病变、疱疹性瘭疽(广泛皮肤糜烂)等难治病变，疼痛明显，也可以见到疱疹性肺炎，消化道及疱疹性脑炎。HSV亦可引起生殖器疱疹，属性传播疾病。

单纯疱疹病毒主要侵犯起源于外胚层的组织，如皮肤、粘膜、眼和神经***。人体的特异性细胞免疫对于HSV感染的限局和中止有重要作用，因此免疫功能正常者的原发感染常为局部感染，免疫未成熟的新生儿、免疫功能低下和高度营养不良者则可形成全身播散性感染。原发性局部感染的患者中也有一部分伴有病毒血症。原发性感染后的体液免疫可清除体内大部病毒，而小部分病毒常潜伏在局部感觉神经节内，如三叉神经节、颈上神经节、迷走神经节、骶神经节等。在某些因素，如发热、日晒、创伤、月经、情绪激动、手术等刺激下，病毒可在神经节内被激活，沿轴突向其支配的周围组织扩散而引起复发，故复发总是在相同部位反复发生，而且在疱疹发生前常有局部皮肤的感觉异常。这种复发多不伴有病毒血症。

因此，如果孕妇罹患原发性疱疹病毒感染，病毒就有可能在病毒血症期间通过胎盘感染胎儿而形成先天感染。如果孕妇产道中疱疹病毒(原发感染或复发均可)，则病毒可于分娩过程中感染新生儿而引起新生儿感染。无论是先天感染或新生儿感染，预后都较差，如有人统计了298例这种患儿，其中178例死亡，57例有后遗症，仅66例健存。因此对于这种疾患的防治非常重要。目前临床上对HSV的检测方法主要有病毒培养、细胞学检查、血清HSV-IgM型抗体检测和多聚合酶链反应(PCR)等。虽然病毒培养鉴定是确诊HSV感染的金标准，但此法需分离单纯疱疹病毒并将其接种去组织培养基中，24～48小时才可出现病变现象，耗时长、而且技术要求严格，不利于HSV感染的的普查和快速诊断；皮肤处刮片作细胞学检查是显微镜下观察是否有多核巨细胞和核内嗜酸性包涵体等，此法是在表现出临床症状后进行筛查，不利于HSV感染的早期诊断；血清HSV-IgM型抗体检测，易检测假阴性和假阳性结果，仅适用于流行病学调查，对临床诊断价值不大。

荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。

荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针等，本方法涉及的是Taqman探针技术。其工作原理是：它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’→3’酶切活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM(6-羧基荧光素)，TET(四氯-6-羧基荧光素)，JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)，HEX(六氯-6-甲基荧光素)或VIC等，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)或DABCYL(4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。

发明内容

为克服传统方法(如电泳法等)对HSV II检测的缺点，本发明提供一种特异性高、成本低并且能够作定性检测的检测产品。

本发明提供了一种检测单纯疱疹病毒II型的荧光PCR试剂盒，包括阴性参考品、阳性参考品、UNG酶、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR引物、特异性荧光探针。

所述的阳性参考品为含有***HSV II特异序列的PMD18-T载体质粒，所述***的特异序列如下：

gcgagccacatctcgcgcgcgctgttcctccccccgatcaagctcgagtgcgaaaaaacgttcaccaagctgctgctcat

cgccaagaaaaagtacatcggcgtcatctgcgggggcaagatgctcatcaagggcgtggatctggtgcgcaaaaacaact

gcgcgtttatcaaccgcacctccagggccctggtc 195bp。

所述的阳性参考品为存放浓度为1.0×10⁶-1.0×10⁷拷贝/微升的重组质粒。

所述的阴性参考品为PMD18-T空载体稀释液。

所述的PCR引物序列如下：

扩增检测单纯疱疹病毒II型的正向引物 ACGTTCACCAAGCTGCTGC 19；

扩增检测单纯疱疹病毒II型的反向引物 CCTGGAGGTGCGGTTGAT 18。

所述的特异性荧光探针序列如下：

检测单纯疱疹病毒II型的探针 TGCTCATCAAGGGCGTGGATCTGGTGC 27。

所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，可以是FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5；3’端的为一种荧光淬灭基团，可以是TAMRA、DABCYL、BHQ0、BHQ1、BHQ2。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

①定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能实时监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；

②灵敏度和特异性高。由于采取特异性和引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到病毒的感染；

③检测速度快，加上样本提取总共仅需2-3个小时；

④步骤简单；

⑤可同时进行高通量的样本检测。

总之荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间可控制在两个半小时以内，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取代传统细胞检测或者普通PCR检测进行HSV II的早期诊断。

附图说明：

图1为HSV II阳性参考品的荧光PCR扩增曲线：曲线为阳性参考品曲线，阴性参考品曲线；

图2为HSV II临床样本的荧光PCR扩增曲线：所测得的阳性参考品Ct值在20～28之间，阴性参考品Ct值为Undet，阳性样本Ct值在20～38之间。

具体实施方式：

应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1：试剂盒的制备

1.引物和探针设计与合成

使用Primer Express 3.0，针对HSV II完整基因，筛选处于保守区的引物，在选择好的引物基础上设计HSV II的探针。引物与探针均委托专业公司(生工)合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化，探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA荧光基团。

扩增序列如表1：

表1.特异性探针与引物序列

序列名称	寡核苷酸序列(5’-3’)	碱基长度(bp)
			HSV II探针	tgctcatcaagggcgtggatctggtgc	27
HSV II正向引物	acgttcaccaagctgctgc	19
			HSV II反向引物	atcaaccgcacctccagg	18

2.HSV II质粒阳性模板定性参考品的制备

本实施例中HSV II质粒作为阳性模板用于制备定量参考品。

使用步骤1中合成的扩增HSV II特异性引物扩增HSV II基因区靶序列，将经过纯化的PCR产物连接到PMD18-T载体(购自TAKARA)上；然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自TAKARA)中；通过蓝白斑筛选，构建HSV II重组质粒DNA作为阳性参考品。构建的HSV II重组质粒经双向DNA测序鉴定。提取质粒，紫外分光光度计定量，并保存于-20℃。

3.参考品选择

使用无单纯疱疹病毒II型***片段的空载体质粒作为阴性参考品；含有单纯疱疹病毒II型的重组质粒(1.0×10⁶-1.0×10⁷拷贝/微升)为阳性参考品。

4.荧光PCR反应液组成

表2.PCR反应液组成

原料名称	终浓度
		PCR Buffer	1×
MgCl₂	2-5mM
		dNTP	0.1-0.5mM
HSV II引物	0.1-0.50μM
		HSV II探针	0.1-0.50μM
UNG酶	0.05-1U
		Taq酶	0.5-5U
H₂O	适量
		DNA模版	2μL
总体积	50μL

实施例2：试剂盒的使用

1.样本提取

使用DNA提取液提取待测样品中的HSV II核酸

1)样本前处理：拭净宫颈口过多的分泌物，用生理盐水浸润的棉拭子紧贴宫颈口粘膜稍用力转动2周以取得分泌物和脱落细胞，将取样后的棉拭子放入备有1ml无菌生理盐水的EP管中充分漂洗，贴壁挤干。使用PEG沉淀，碱裂解法提取HSV II基因。

PEG沉淀液配方：30％PEG8000。

裂解液配方：60mmol/L TrisHCl，pH 8.0；0.5％SDS；200mmol/L NaCl；1M/L NaOH。

2)操作步骤：取500μl分泌物与等体积PEG沉淀液震荡混匀于13000rpm离心10min，弃上清；加50μl裂解液，100℃保温20min，13000rpm离心10min，取上清2μl 做PCR反应。

2.样本检测

分别取步骤1中提取的核酸，试剂盒中获得的阳性参考品，阴性参考品，作为DNA模板，加入UNG酶、Taq聚合酶、及含有特异性PCR引物和特异性荧光探针的荧光定量反应液中，组成PCR反应体系。作为样本定性判定的标准。

该体系各主要成分如下：

3.反应程序

设置收集FAM荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入荧光PCR仪(ABI7500)开始扩增，反应程序如下：

表3.PCR反应程序

4.结果判断

基线范围的Ct值(循环数)为3-15或由软件自动选择，设定阈值使之超过无规则扩增曲线的最高值。荧光PCR仪不同，所得基线范围的Ct值会有所不同。

5.参考品标准

(1)各类对照参考品品判断结果如下表：

表4.参考品标准检测结果

	质控品	标准检验结果
			1	阴性参考品	Ct值≥40
2	阳性参考品	20≤Ct值≤28

图1为HSV II的阳性参考品及阴性参考品荧光PCR扩增曲线图。所测得的阳性参考品Ct值在20～28之间，阴性参考品Ct值为Undet.(undetect，未检出)或者Ct值为40。

6.结果报告：

图2为临床样本的HSV II荧光PCR扩增曲线。所测得的阳性参考品Ct值在20～28之间，所测得阳性样本Ct值在20～38之间。

样本结果的判断标准如下：

表4.报告样本检测结果

序列表

<110>上海裕隆临床检验中心有限公司

<120>检测单纯疱疹病毒II型荧光PCR试剂盒

<160>4

<210>1

<211>195

<212>DNA

<213>单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)

<400>1

gcgagccaca tctcgcgcgc gctgttcctc cccccgatca agctcgagtg cgaaaaaacg 60

ttcaccaagc tgctgctcat cgccaagaaa aagtacatcg gcgtcatctg cgggggcaag 120

atgctcatca agggcgtgga tctggtgcgc aaaaacaact gcgcgtttat caaccgcacc 180

tccagggccc tggtc 195

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测单纯疱疹病毒II型荧光PCR试剂盒扩增检测HSV II的正向引物。

<400>2

acgttcacca agctgctgc 19

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测单纯疱疹病毒II型荧光PCR试剂盒扩增检测HSV II的反向引物。

<400>3

cctggaggtg cggttgat 18

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测单纯疱疹病毒II型荧光PCR试剂盒中检测HSV II的探针。

<400>4

tg ctcatcaa gggcgtggat ctggtgc 27

Claims

1.一种检测单纯疱疹病毒II型的荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括阴性参考品、阳性参考品、UNG酶、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR引物、特异性荧光探针。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性参考品为含有***HSV II特异序列的PMD18-T载体质粒，所述***的特异序列如下：

gcgcgtttatcaaccgcacctccagggccctggtc 195bp。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的阳性参考品为存放浓度为1.0×10⁶-1.0×10⁷拷贝/微升的重组质粒。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的阴性参考品为PMD18-T空载体稀释液。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR引物序列如下：

扩增检测单纯疱疹病毒II型的正向引物 ACGTTCACCAAGCTGCTGC 19；

扩增检测单纯疱疹病毒II型的反向引物 CCTGGAGGTGCGGTTGAT 18。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性荧光探针序列如下：

检测单纯疱疹病毒II型的探针 TGCTCATCAAGGGCGTGGATCTGGTGC 27。

7.如权利要求1或7所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，可以是FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5；3’端的为一种荧光淬灭基团，可以是TAMRA、DABCYL、BHQ0、BHQ1、BHQ2。