CN106916907A - 一种特异性检测单纯疱疹病毒ⅰ、ⅱ型核酸的荧光pcr方法及试剂盒 - Google Patents

一种特异性检测单纯疱疹病毒ⅰ、ⅱ型核酸的荧光pcr方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR方法及试剂盒，该试剂盒包含的特异性引物对和荧光探针如下：单纯疱疹病毒Ⅰ型：正向引物：5’‑CCCCGCTGGAACTACTATGACA‑3’；反向引物：5’‑TCCGTCCAGTCGTTTATCTTCA‑3’；荧光探针：5’‑ACGCCCCCGCGTTTGAGACC‑3’；单纯疱疹病毒Ⅱ型：正向引物：5’‑AAGCTCCCGCTAAGGACATG‑3’；反向引物：5’‑GGTGCTGATGATAAAGAGGATATCTAGA‑3’；荧光探针：5’‑AACACATCCCCCTGTTCTGGTTCCTAACG‑3’。本发明试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高效率的特点，可以实现对单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型的定性检测，能够成为有效的辅助检测工具。

Description

一种特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR方法及 试剂盒
技术领域
本发明属于微生物体外核酸检测领域，具体涉及一种特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR方法及试剂盒，能够对单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型的DNA进行定性检测，可以作为有效的检测工具。
背景技术
单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Viruses，HSV)属疱疹病毒科，病毒颗粒直径约180纳米，人类是单纯疱疹病毒唯一的自然宿主。同时，单纯疱疹病毒主要分两型，即单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV1)和单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV2)。HSV1主要引起生殖道以外的口腔、皮肤、粘膜或其他器官感染，而HSV2主要引起生殖道感染。
孕妇在孕程的早中晚期的首次感染对胎儿均有严重影响，可导致流产，发育迟缓，先天性畸形，智力障碍，视网膜脉络膜炎等。大多数新生儿感染是因为***分娩受染，虽然出生时外表可正常，但产后3周内逐渐出现症状：一是在皮肤、口腔、眼结合膜处等出现疱疹；二是中枢神经***异常，颅内压增高，抽搐等；三是全身性弥散型，表现为黄疸，肝炎，肺炎等。未经及时治疗的新生儿单纯疱疹病毒感染，有很大概率导致死亡或有神经***后遗症。
目前，临床实验室检测多采用血清学试验，如ELISA、RIA和IFA等，检测特异性抗体。血清单纯疱疹病毒-IgM阳性证明近期感染己持续2～4个月。血清单纯疱疹病毒-IgG阳性则提示既往感染。由于单纯疱疹病毒抗原来源困难，血清学试验尚难普及，而且某些人群感染病毒后抗体反应很弱或不产生抗体，因此仅以抗体检测结果不能准确判定单纯疱疹病毒感染情况，需辅以抗原或核酸检测结果作为诊断和治疗的依据。目前比较成熟的核酸检测方法是用荧光PCR方法，该方法克服了常规PCR法特异性差、易污染、结果分析操作步骤多等缺点，采用TaqMan方法或称双标探针法(荧光淬灭探针或称FQ探针)，即在其5’端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个淬灭基团。靶序列的特异性探针和特异性的PCR引物同时使用，设计的该探针在上下游PCR引物的范围内退火，由三个寡核苷酸共同结合于目的基因片段，使其特异性大大增强。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性将荧光报告基团从探针上切割下来。随着PCR循环数的增加，游离报告基团的数量不断的增加，实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号，从而对靶序列进行定性分析。该PCR反应在封闭***内进行，分析结果也无需开封，因此，避免了PCR产物污染的发生。
目前，也有荧光PCR方法用于检测单纯疱疹病毒的报道，但是开发更多有效、快速、准确、灵敏度高、特异性强的荧光PCR方法用的引物和探针，并将此引物和探针用于检测试剂盒也是本领域追求的目标。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，该试剂盒具有灵敏、特异和高效率的特点，从而实现检测样本中单纯疱疹病毒的核酸，实现定性的目的。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，包括单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性引物对和荧光探针、单纯疱疹病毒Ⅱ型特异性引物对和荧光探针，
所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性引物对和荧光探针如下：
正向引物：5’-CCCCGCTGGAACTACTATGACA-3’
反向引物：5’-TCCGTCCAGTCGTTTATCTTCA-3’
荧光探针：5’-ACGCCCCCGCGTTTGAGACC-3’；
所述的单纯疱疹病毒Ⅱ型特异性引物对和荧光探针如下：
正向引物：5’-AAGCTCCCGCTAAGGACATG-3’
反向引物：5’-GGTGCTGATGATAAAGAGGATATCTAGA-3’
荧光探针：5’-AACACATCCCCCTGTTCTGGTTCCTAACG-3’。
所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型荧光探针、单纯疱疹病毒Ⅱ型荧光探针的两端分别标记报告荧光素或荧光染料、淬灭基团。标记的报告荧光素或荧光染料为FAM或其它任何可以作为探针标记的荧光素或荧光染料，例如HEX、TET、JOE、Yakima Yellow、Cy3、Cy3.5、Cy5、NED、VIC、PET、ROX、LIZ、RED、Texas Red；淬灭基团为TAMRA或其它任何可以作为淬灭基团的化学物质，例如Dabcyl、BHQ1、BHQ2。
进一步地，所述的试剂盒还包括PCR反应液、单纯疱疹病毒Ⅰ型阳性质控品、单纯疱疹病毒Ⅱ型阳性质控品和阴性质控品。
优选地，所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型阳性质控品含人工合成序列，所述人工合成序列为人工合成含所述单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性引物对扩增产物片段的序列。该人工合成序列内容为：
CGCGGCAAATATGCCTTGGTGGATGCCTCTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCCGGCGCGTGTACCACATCCAGGCGGGCCTACCGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCCTCCCGATCACGGTTTACTACGCCGTGTTGGAGCGCGCCTGCCGCAGCGTGCTCCTAAACGCACCGTCGGAGGCCCCCCAGATTGTCCGCGGGGCCTCCGAAGACGTCCGGAAACAACCCTACAACCTGACCATCGCTTGGTTTCGGATGGGAGGCAACTGTGCTATCCCCATCACGGTCATGGAGTACACCGAATGCTCCTACAACAAGTCTCTGGGGGCCTGTCCCATCCGAACGCAGCCCCGCTGGAACTACTATGACAGCTTCAGCGCCGTCAGCGAGGATAACCTGGGGTTCCTGATGCACGCCCCCGCGTTTGAGACCGCCGGCACGTACCTGCGGCTCGTGAAGATAAACGACTGGACGGAGATTACACAGTTTATCCTGGAGCACCGAGCCAAGGGCTCCTGTAAGTACGCCCTCCCGCTGCGCATCCCCCCGTCAGCCTGCCTCTCCCCCCAGGCCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCATCCCCGAGAACCAGCGCACCGTCGCCGTATACAGCTTGAAGATCG。
优选地，所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型阳性质控品是通过在pUC57质粒载体中***所述人工合成含所述单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性引物对扩增产物片段的序列重组制得。
根据本发明的一个具体方面，所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型阳性质控品所含的重组pUC57载体质粒浓度为1ng/μL。
优选地，所述的单纯疱疹病毒Ⅱ型阳性质控品含人工合成序列，所述人工合成序列为人工合成含所述单纯疱疹病毒Ⅱ型特异性引物对扩增产物片段的序列。该人工合成序列内容为：
CCACGACTCCGGGGCCCCAAACAACCCCTCCCGGACCCGCAACCCCGGGTCCGGTGGGCGCCTCCGCCGCGCCCACGGCCGATTCCCCCCTCACCGCCTCGCCCCCCGCTACCGCGCCGGGGCCCTCGGCCGCCAACGTTTCGGTCGCCGCGACCACCGCCACGCCCGGAACCCGGGGCACCGCCCGTACCCCCCCAACGGACCCAAAGACGCACCCACACGGACCCGCGGACGCTCCCCCCGGCTCGCCAGCCCCCCCACCCCCCGAACATCGCGGCGGACCCGAGGAGTTTGAGGGCGCCGGGGACGGCGAACCCCCCGAGGACGACGACAGCGCCACCGGCCTCGCCTTCCGAACTCCGAACCCCAACAAACCACCCCCCGCGCGCCCCGGGCCCATCCGCCCCACGCTCCCGCCAGGAATTCTTGGGCCGCTCGCCCCCAACACGCCTCGCCCCCCCGCCCAAGCTCCCGCTAAGGACATGCCCTCGGGCCCCACACCCCAACACATCCCCCTGTTCTGGTTCCTAACGGCCTCCCCTGCTCTAGATATCCTCTTTATCATCAGCACCACCATCCACACGGCGGCGTTCGTTTGTCTGGTCGCCTTGGCAGCACAACTTTGGCGCGGCCGGGCGGGGCGCAGGCGATACGCGCACCCGAGCGTGCGTTACGTATGTCTGCCACCCGAGCGGGATTAGGGGGTGGGGGTGGGGGGCGAGAAACGATGAAGGACGGGAAAGGGAACAGCGACCAAATGTCACGATAAGAACAATAAA。
优选地，所述的单纯疱疹病毒Ⅱ型阳性质控品是通过在pUC57质粒载体中***所述人工合成含所述单纯疱疹病毒Ⅱ型特异性引物对扩增产物片段的序列重组制得。
根据本发明的一个具体方面，所述的单纯疱疹病毒Ⅱ型阳性质控品所含的重组pUC57载体质粒浓度为1ng/μL。
优选地，所述的阴性质控品含人工合成人类管家基因GAPDH部分片段的序列。
用于扩增所述的人工合成人类管家基因GAPDH部分片段的引物对如下：
正向引物：5’-CCGGGAAGGAAATGAATG-3’
反向引物：5’-CTTCTCTAAGTCCCTCCTAC-3’。
更优选地，所述的人工合成的人类管家基因GAPDH部分片段的序列为：
TTCTTTCCTTTCGCGCTCTGCGGGGTCACGTGTCGCAGAGGAGCCCCTCCCCCACGGCCTCCGGCACCGCAGGCCCCGGGATGCTAGTGCGCAGCGGGTGCATCCCTGTCCGGATGCTGCGCCTGCGGTAGAGCGGCCGCCATGTTGCAACCGGGAAGGAAATGAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCCTGCCGGTGACTAACCCTGCGCTCCTGCCTCGATGGGTGGAGTCGCGTGTGGCGGGGAAGTCAGGTGGAGCGAGGCTAGCTGGCCCGATTTCTCCTCCGGGTGATGCTTTTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCAAAGAAGTGGGTTTATGGAGGTCCTCTTGTGTCCCCTCCCCGCAGAGGTGTGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAGCCGGGAGAAGCTGAGTCATGGGTAGTTGGAAAAGGACATTTCCACCGCAAAATGGCCCCTCTGGTGGTGGCCCCTTCCTGCAGCGCCGGCTCACCTCACGGCCCCGCCCTTCCCCTGCCAGCCTAGCGTTGACCCGACCCCAAAGGCCAGGCTGTAAATGTCACCGGGAGGATTGGGTGTCTGGGCGCCTCGGGGAACCTGCCCTTCTCCCCATTCCGTCTTCCGGAAACCAGATCTCCCACCGCACCCTGGTCTGAGGTTAAATATAGCTGCTGACCTTTCTGTAGCTGGGGGCCTGGGCTGGGGCTCTCTCCCATCCCTTCTCCCCACACACATGCACTTACCTGTGCTCCCACTCCTGATTTCTGGAAAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGCAAATC。
更优选地，所述阴性质控品是通过在pTG19-T质粒载体中***所述人工合成人类管家基因GAPDH部分片段的序列重组制得。
优选地，所述PCR反应液包括Taq酶、dNTP、缓冲液等成分。
根据本发明，所述的试剂盒的反应体系包括检测单纯疱疹病毒Ⅰ型的反应体系和检测单纯疱疹病毒Ⅱ型的反应体系。
根据本发明，所述检测单纯疱疹病毒Ⅰ型的反应体系为20μL-50μL，当所述检测单纯疱疹病毒Ⅰ型的反应体系为20μL体系，则包括：PCR反应液(2x)10μL，HSV1正向引物0.5μL(10μMol/mL)，HSV1反向引物0.5μL(10μMol/mL)，HSV1荧光探针0.5μL(10μMol/mL)，被检测物细胞、组织、体液(分泌物、痰液、尿液等等)的DNA提取物4μL，灭菌超纯水加至20μL；当所述检测单纯疱疹病毒Ⅰ型的反应体系为50μL体系，则包括：PCR反应液(2x)25μL，HSV1正向引物1.25μL(10μMol/mL)，HSV1反向引物1.25μL(10μMol/mL)，HSV1荧光探针1.25μL(10μMol/mL)，被检测物细胞、组织、体液(分泌物、痰液、尿液等等)的DNA提取物4-10μL，灭菌超纯水加至50μL。
根据本发明，所述检测单纯疱疹病毒Ⅱ型的反应体系为20μL-50μL，当所述检测单纯疱疹病毒Ⅱ型的反应体系为20μL体系，则包括：PCR反应液(2x)10μL，HSV2正向引物0.5μL(10μMol/mL)，HSV2反向引物0.5μL(10μMol/mL)，HSV2荧光探针0.5μL(10μMol/mL)，被检测物细胞、组织、体液(分泌物、痰液、尿液等等)的DNA提取物4μL，灭菌超纯水加至20μL；当所述检测单纯疱疹病毒Ⅱ型的反应体系为50μL体系，则包括：PCR反应液(2x)25μL，HSV2正向引物1.25μL(10μMol/mL)，HSV2反向引物1.25μL(10μMol/mL)，HSV2荧光探针1.25μL(10μMol/mL)，被检测物细胞、组织、体液(分泌物、痰液、尿液等等)的DNA提取物4-10μL，灭菌超纯水加至50μL。
根据本发明，所述的试剂盒的荧光PCR扩增的反应时间和温度为：50℃，2min 1个循环(如果PCR反应液不含UNG酶则省略)；95℃，2-10min(依据不同来源的PCR反应液而定)1个循环；95℃，15s，60℃，1min，40个循环并收集荧光信号。
本发明采用的另一种技术方案是：一种特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR方法，采用上述试剂盒进行检测。
由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明试剂盒通过对大量临床样本进行检测，能够有效检测出单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型，大量临床样本的检测对试剂盒的有效性、大规模使用性提供了保障。
本发明试剂盒，单纯疱疹病毒Ⅰ型荧光PCR检测的反应效率高达89.8％，单纯疱疹病毒Ⅱ型荧光PCR检测的反应效率高达85.1％，具有较高的反应效率。
附图说明
图1为单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型荧光PCR引物对的质检电泳图；
图中，1：HSV1荧光PCR反应正向引物；2：HSV1荧光PCR反应反向引物；3：HSV2荧光PCR反应正向引物；4：HSV2荧光PCR反应反向引物；M：电泳Marker，长度由上到下依次为17，24，34(单位：碱基)。
图2为HSV1荧光PCR反应探针的质检HPLC图。
图3为HSV2荧光PCR反应探针的质检HPLC图。
图4为单纯疱疹病毒Ⅰ型的pUC57重组质粒构成示意图。
图5为单纯疱疹病毒Ⅱ型的pUC57重组质粒构成示意图。
图6为pTG19-T质粒载体构成示意图。
图7为单纯疱疹病毒Ⅰ型阳性质控品荧光PCR的扩增反应图；
图中从左至右的曲线分别对应单纯疱疹病毒Ⅰ型阳性质控品的浓度从高到低。
图8为图7对应的标准曲线图。
图9为单纯疱疹病毒Ⅱ型阳性质控品荧光PCR的扩增反应图；
图中从左至右的曲线分别对应单纯疱疹病毒Ⅱ型阳性质控品的浓度从高到低。
图10为图9对应的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，应当说明一点，实施例仅用于具体说明本发明而不用于限制本发明。
实施例1：试剂盒的制备
1、引物和探针的设计和合成
使用Primer Express 3.0软件，对单纯疱疹病毒Ⅰ型的gpD基因、Ⅱ型的gpG基因的DNA序列分别设计了特异性引物对和其特异性的探针，引物和探针均由上海捷瑞生物有限公司合成，在合成的探针上进行了双荧光和淬灭基团标记。其中，引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。设计出的引物对和探针分别为：
单纯疱疹病毒Ⅰ型：正向引物：5’-CCCCGCTGGAACTACTATGACA-3’(SEQ ID NO.1)
反向引物：5’-TCCGTCCAGTCGTTTATCTTCA-3’(SEQ ID NO.2)
荧光探针：5’-ACGCCCCCGCGTTTGAGACC-3’(SEQ ID NO.3)
单纯疱疹病毒Ⅱ型：正向引物：5’-AAGCTCCCGCTAAGGACATG-3’(SEQ ID NO.4)
反向引物：5’-GGTGCTGATGATAAAGAGGATATCTAGA-3’(SEQ ID NO.5)
荧光探针：5’-AACACATCCCCCTGTTCTGGTTCCTAACG-3’(SEQ ID NO.6)。
引物和探针合成后均制备成冻干粉状，然后用1×TE buffer稀释至100μM的浓度作为母液，-20℃保存。工作液为母液通过无菌水稀释10倍制得，用于常规使用。
对特异性引物对和荧光探针进行质检分析，结果如图1、2和3所示。
2、阳性质控品和阴性质控品的制备
1)单纯疱疹毒Ⅰ型阳性质控品的制备：含单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性引物对扩增产物的特异性片段由南京金斯瑞生物有限公司合成，然后用重组DNA基因工程方法人工装入pUC57质粒载体中，再通过转化大肠杆菌、质粒扩增和质粒提取等步骤获得重组质粒DNA，此质粒DNA就是本发明试剂盒中所使用的单纯疱疹毒Ⅰ型阳性质控品，该单纯疱疹毒Ⅰ型阳性质控品所含的人工合成序列如SEQ ID NO.7所示。单纯疱疹病毒Ⅰ型的pUC57重组质粒构成示意图如图4所示。
2)单纯疱疹毒Ⅱ型阳性质控品的制备：含单纯疱疹病毒Ⅱ型特异性引物对扩增产物的特异性片段由南京金斯瑞生物有限公司合成，然后用重组DNA基因工程方法人工装入pUC57质粒载体中，再通过转化大肠杆菌、质粒扩增和质粒提取等步骤获得重组质粒DNA，此质粒DNA就是本发明试剂盒中所使用的单纯疱疹毒Ⅱ型阳性质控品，该单纯疱疹毒Ⅰ型阳性质控品所含的人工合成序列如SEQ ID NO.8所示。单纯疱疹病毒Ⅱ型的pUC57重组质粒构成示意图如图5所示。
3)阴性质控品的制备：以人类管家基因GAPDH基因为模板，设计常规PCR引物，引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，从人类组织细胞提取的基因组DNA中进行PCR扩增，获得扩增产物，然后用重组DNA基因工程的方法将扩增产物人工装配到pTG19-T质粒载体中，再通过转化大肠杆菌、质粒扩增和质粒提取等步骤获得重组质粒DNA，此质粒DNA就是本发明试剂盒中所使用的阴性质控品，该阴性质控品所含的人工合成的人类管家基因GAPDH部分片段的序列如SEQ ID NO.11所示。pTG19-T质粒载体构成示意图如图6所示。
3、PCR反应液
PCR反应液包括Taq酶、dNTP、缓冲液等成分，可以使用购自ABI公司的荧光PCR反应混合液，名称是Universal Master Mix II,with UNG。
实施例2：样本核酸的提取
使用天根生化科技(北京)有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)，按照该试剂盒说明书的步骤，提取样本核酸。提取完成后，产物放-20℃保存。
实施例3：标准曲线的制作
1)单纯疱疹病毒Ⅰ型
选取单纯疱疹病毒Ⅰ型阳性质控品作为标准物，稀释浓度至1μg/mL，然后继续以10倍梯度稀释五个浓度，一共是6个浓度梯度，即1μg/mL、10-1μg/mL、10-2μg/mL、10-3μg/mL、10-4μg/mL、10-5μg/mL。然后进行荧光PCR扩增反应，用与ABI7500仪器配套的软件生成标准曲线，结果如图7和图8所示，且仪器的***显示，反应效率达89.8％。
2)单纯疱疹病毒Ⅱ型
选取单纯疱疹病毒Ⅱ型阳性质控品作为标准物，稀释浓度至1μg/mL，然后继续以10倍梯度稀释五个浓度，一共是6个浓度梯度，即1μg/mL、10-1μg/mL、10-2μg/mL、10-3μg/mL、10-4μg/mL、10-5μg/mL。然后进行荧光PCR扩增反应，用与ABI7500仪器配套的软件生成标准曲线，结果如图9和图10所示，且仪器的***显示，反应效率达85.1％。
实施例4：荧光PCR扩增以及结果分析
1、采用的反应体系如表1和2所示。在荧光PCR专用八联管中配置好每个体系后，放入ABI7500荧光PCR仪器中(或其它类型的开放式荧光定量PCR仪器)，准备进行反应。每次实验都需要配置1个阳性质控品的反应管作为阳性对照和一个阴性质控品的反应管作为阴性对照。
表1
HSV1体系内容 体积(μL)
PCR反应液 10
HSV1正向引物 0.5
HSV1反向引物 0.5
HSV1荧光探针 0.5
无菌水 4.5
待测样本 4
总计 20
表2
HSV2体系内容 体积(μL)
PCR反应液 10
HSV2正向引物 0.5
HSV2反向引物 0.5
HSV2荧光探针 0.5
无菌水 4.5
待测样本 4
总计 20
表1和2中的待测样本为通过实施例2的方式制备得到的待测样本。
2、反应条件设置如表3所示：
表3
3、结果分析
1)反应结束后，首先，基线的选取设置为“自动”。阈值(threshold)设定的原则是阈值线刚好超过阴性质控品的扩增曲线的最高点，使其Ct值＝40或“Undetermined”。
2)设置好阈值后，观察阳性质控品的扩增曲线是否为正常的S型对数增长曲线，且Ct值≤37。满足上述条件则说明本次实验反应正常，否则，需要重做。
3)结果判定：Ct值≤37，表示该样本结果为阳性，Ct值>37或“Undetermined”，表示该样本结果为阴性。
应用实施例
使用本发明试剂盒对收集到的124例组织样本进行了检测。124例样本为临床收集的胎儿组织，分两组：正常引产组(对照组)42例，自发性流产组(患病组)82例。按照上述实施例2：样本核酸的提取。随后按照上述实施例4：荧光PCR扩增以及结果分析，使用本发明试剂盒在ABI7500荧光PCR仪进行荧光PCR检测，结果如下表4所示。
表4
从表中的结果可以得出，本试剂盒能够成功检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型，并且从正常组和患病组的阳性率结果来看，本试剂盒可以很好地区分正常对照组和患病组。单纯疱疹病毒Ⅰ型检测结果，对照组无阳性结果，而患病组为4.76％；单纯疱疹病毒Ⅱ型检测结果，对照组与患病组阳性率的比率是1比2.55,也就是说患病组单纯疱疹病毒Ⅱ型的感染率是正常对照组的2.55倍,结果显示本试剂盒具有很好的灵敏度和特异性，能够作为检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型的有效工具。大量临床样本的检测对试剂盒的有效性、大规模使用性提供了保障。
本发明试剂盒，单纯疱疹病毒Ⅰ型的反应效率高达89.8％，单纯疱疹病毒Ⅱ型的反应效率高达85.1％，具有较高的反应效率。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 张家港蓝苏生物工程有限公司
<120> 一种特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR方法及试剂盒
<130>
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>检测单纯疱疹病毒Ⅰ型的正向引物
<400> 1
ccccgctgga actactatga ca 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>检测单纯疱疹病毒Ⅰ型的反向引物
<400> 2
tccgtccagt cgtttatctt ca 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>检测单纯疱疹病毒Ⅰ型的荧光探针
<400> 3
acgcccccgc gtttgagacc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>检测单纯疱疹病毒II型的正向引物
<400> 4
aagctcccgc taaggacatg 20
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>检测单纯疱疹病毒II型的反向引物
<400> 5
ggtgctgatg ataaagagga tatctaga 28
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>检测单纯疱疹病毒II型的荧光探针
<400> 6
aacacatccc cctgttctgg ttcctaacg 29
<210> 7
<211> 721
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>试剂盒单纯疱疹毒Ⅰ型阳性质控品所含的人工合成序列
<400> 7
cgcggcaaat atgccttggt ggatgcctct ctcaagatgg ccgaccccaa tcgctttcgc 60
ggcaaagacc ttccggtcct ggaccagctg accgaccctc cgggggtccg gcgcgtgtac 120
cacatccagg cgggcctacc ggacccgttc cagcccccca gcctcccgat cacggtttac 180
tacgccgtgt tggagcgcgc ctgccgcagc gtgctcctaa acgcaccgtc ggaggccccc 240
cagattgtcc gcggggcctc cgaagacgtc cggaaacaac cctacaacct gaccatcgct 300
tggtttcgga tgggaggcaa ctgtgctatc cccatcacgg tcatggagta caccgaatgc 360
tcctacaaca agtctctggg ggcctgtccc atccgaacgc agccccgctg gaactactat 420
gacagcttca gcgccgtcag cgaggataac ctggggttcc tgatgcacgc ccccgcgttt 480
gagaccgccg gcacgtacct gcggctcgtg aagataaacg actggacgga gattacacag 540
tttatcctgg agcaccgagc caagggctcc tgtaagtacg ccctcccgct gcgcatcccc 600
ccgtcagcct gcctctcccc ccaggcctac cagcaggggg tgacggtgga cagcatcggg 660
atgctgcccc gcttcatccc cgagaaccag cgcaccgtcg ccgtatacag cttgaagatc 720
g 721
<210> 8
<211> 779
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>试剂盒单纯疱疹毒Ⅱ型阳性质控品所含的人工合成序列
<400> 8
ccacgactcc ggggccccaa acaacccctc ccggacccgc aaccccgggt ccggtgggcg 60
cctccgccgc gcccacggcc gattcccccc tcaccgcctc gccccccgct accgcgccgg 120
ggccctcggc cgccaacgtt tcggtcgccg cgaccaccgc cacgcccgga acccggggca 180
ccgcccgtac ccccccaacg gacccaaaga cgcacccaca cggacccgcg gacgctcccc 240
ccggctcgcc agccccccca ccccccgaac atcgcggcgg acccgaggag tttgagggcg 300
ccggggacgg cgaacccccc gaggacgacg acagcgccac cggcctcgcc ttccgaactc 360
cgaaccccaa caaaccaccc cccgcgcgcc ccgggcccat ccgccccacg ctcccgccag 420
gaattcttgg gccgctcgcc cccaacacgc ctcgcccccc cgcccaagct cccgctaagg 480
acatgccctc gggccccaca ccccaacaca tccccctgtt ctggttccta acggcctccc 540
ctgctctaga tatcctcttt atcatcagca ccaccatcca cacggcggcg ttcgtttgtc 600
tggtcgcctt ggcagcacaa ctttggcgcg gccgggcggg gcgcaggcga tacgcgcacc 660
cgagcgtgcg ttacgtatgt ctgccacccg agcgggatta gggggtgggg gtggggggcg 720
agaaacgatg aaggacggga aagggaacag cgaccaaatg tcacgataag aacaataaa 779
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>扩增阴性质控品人工合成片段的正向引物
<400> 9
ccgggaagga aatgaatg 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>扩增阴性质控品人工合成片段的反向引物
<400> 10
cttctctaag tccctcctac 20
<210> 11
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>试剂盒阴性质控品所含的人工合成序列
<400> 11
ttctttcctt tcgcgctctg cggggtcacg tgtcgcagag gagcccctcc cccacggcct 60
ccggcaccgc aggccccggg atgctagtgc gcagcgggtg catccctgtc cggatgctgc 120
gcctgcggta gagcggccgc catgttgcaa ccgggaagga aatgaatggg cagccgttag 180
gaaagcctgc cggtgactaa ccctgcgctc ctgcctcgat gggtggagtc gcgtgtggcg 240
gggaagtcag gtggagcgag gctagctggc ccgatttctc ctccgggtga tgcttttcct 300
agattattct ctggtaaatc aaagaagtgg gtttatggag gtcctcttgt gtcccctccc 360
cgcagaggtg tggtggctgt ggcatggtgc caagccggga gaagctgagt catgggtagt 420
tggaaaagga catttccacc gcaaaatggc ccctctggtg gtggcccctt cctgcagcgc 480
cggctcacct cacggccccg cccttcccct gccagcctag cgttgacccg accccaaagg 540
ccaggctgta aatgtcaccg ggaggattgg gtgtctgggc gcctcgggga acctgccctt 600
ctccccattc cgtcttccgg aaaccagatc tcccaccgca ccctggtctg aggttaaata 660
tagctgctga cctttctgta gctgggggcc tgggctgggg ctctctccca tcccttctcc 720
ccacacacat gcacttacct gtgctcccac tcctgatttc tggaaaagag ctaggaagga 780
caggcaactt ggcaaatc 798

Claims (11)

1.一种特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，包括单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性引物对和荧光探针、单纯疱疹病毒Ⅱ型特异性引物对和荧光探针，其特征在于：
所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性引物对和荧光探针如下：
正向引物：5’-CCCCGCTGGAACTACTATGACA-3’
反向引物：5’-TCCGTCCAGTCGTTTATCTTCA-3’
荧光探针：5’-ACGCCCCCGCGTTTGAGACC-3’；
所述的单纯疱疹病毒Ⅱ型特异性引物对和荧光探针如下：
正向引物：5’-AAGCTCCCGCTAAGGACATG-3’
反向引物：5’-GGTGCTGATGATAAAGAGGATATCTAGA-3’
荧光探针：5’-AACACATCCCCCTGTTCTGGTTCCTAACG-3’。
2.根据权利要求1所述的特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型荧光探针、单纯疱疹病毒Ⅱ型荧光探针的两端分别标记报告荧光素或荧光染料、淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的报告荧光素或荧光染料为包括FAM或其它任何可以作为探针标记的荧光素或荧光染料；所述的淬灭基团为包括TAMRA或其它任何可以作为淬灭基团的化学物质。
4.根据权利要求1所述的特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括PCR反应液、单纯疱疹病毒Ⅰ型阳性质控品、单纯疱疹病毒Ⅱ型阳性质控品和阴性质控品。
5.根据权利要求4所述的特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型阳性质控品含人工合成序列，所述的人工合成序列为人工合成含所述单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性引物对扩增产物片段的序列。
6.根据权利要求5所述的特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型阳性质控品所含的人工合成序列为：
CGCGGCAAATATGCCTTGGTGGATGCCTCTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGC
GGCAAAGACCTTCCGGTCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCCGGCGCGTGTAC
CACATCCAGGCGGGCCTACCGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCCTCCCGATCACGGTTTAC
TACGCCGTGTTGGAGCGCGCCTGCCGCAGCGTGCTCCTAAACGCACCGTCGGAGGCCCCC
CAGATTGTCCGCGGGGCCTCCGAAGACGTCCGGAAACAACCCTACAACCTGACCATCGCT
TGGTTTCGGATGGGAGGCAACTGTGCTATCCCCATCACGGTCATGGAGTACACCGAATGC
TCCTACAACAAGTCTCTGGGGGCCTGTCCCATCCGAACGCAGCCCCGCTGGAACTACTAT
GACAGCTTCAGCGCCGTCAGCGAGGATAACCTGGGGTTCCTGATGCACGCCCCCGCGTTT
GAGACCGCCGGCACGTACCTGCGGCTCGTGAAGATAAACGACTGGACGGAGATTACACAG
TTTATCCTGGAGCACCGAGCCAAGGGCTCCTGTAAGTACGCCCTCCCGCTGCGCATCCCC
CCGTCAGCCTGCCTCTCCCCCCAGGCCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGG
ATGCTGCCCCGCTTCATCCCCGAGAACCAGCGCACCGTCGCCGTATACAGCTTGAAGATC
G。
7.根据权利要求4所述的特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的单纯疱疹病毒Ⅱ型阳性质控品含人工合成序列，所述人工合成序列为人工合成含所述单纯疱疹病毒Ⅱ型特异性引物对扩增产物片段的序列。
8.根据权利要求7所述的所述的特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的单纯疱疹病毒Ⅱ型阳性质控品所含的人工合成序列为：
CCACGACTCCGGGGCCCCAAACAACCCCTCCCGGACCCGCAACCCCGGGTCCGGTGGGCG
CCTCCGCCGCGCCCACGGCCGATTCCCCCCTCACCGCCTCGCCCCCCGCTACCGCGCCGG
GGCCCTCGGCCGCCAACGTTTCGGTCGCCGCGACCACCGCCACGCCCGGAACCCGGGGCA
CCGCCCGTACCCCCCCAACGGACCCAAAGACGCACCCACACGGACCCGCGGACGCTCCCC
CCGGCTCGCCAGCCCCCCCACCCCCCGAACATCGCGGCGGACCCGAGGAGTTTGAGGGCG
CCGGGGACGGCGAACCCCCCGAGGACGACGACAGCGCCACCGGCCTCGCCTTCCGAACTC
CGAACCCCAACAAACCACCCCCCGCGCGCCCCGGGCCCATCCGCCCCACGCTCCCGCCAG
GAATTCTTGGGCCGCTCGCCCCCAACACGCCTCGCCCCCCCGCCCAAGCTCCCGCTAAGG
ACATGCCCTCGGGCCCCACACCCCAACACATCCCCCTGTTCTGGTTCCTAACGGCCTCCC
CTGCTCTAGATATCCTCTTTATCATCAGCACCACCATCCACACGGCGGCGTTCGTTTGTC
TGGTCGCCTTGGCAGCACAACTTTGGCGCGGCCGGGCGGGGCGCAGGCGATACGCGCACC
CGAGCGTGCGTTACGTATGTCTGCCACCCGAGCGGGATTAGGGGGTGGGGGTGGGGGGCG
AGAAACGATGAAGGACGGGAAAGGGAACAGCGACCAAATGTCACGATAAGAACAATAAA。
9.根据权利要求4所述的特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的阴性质控品含人工合成人类管家基因GAPDH部分片段的序列，用于扩增所述的人工合成人类管家基因GAPDH部分片段的引物对如下：
正向引物：5’-CCGGGAAGGAAATGAATG-3’
反向引物：5’-CTTCTCTAAGTCCCTCCTAC-3’。
10.根据权利要求9所述的特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的人工合成的人类管家基因GAPDH部分片段的序列为：
TTCTTTCCTTTCGCGCTCTGCGGGGTCACGTGTCGCAGAGGAGCCCCTCC
CCCACGGCCTCCGGCACCGCAGGCCCCGGGATGCTAGTGCGCAGCGGGTG
CATCCCTGTCCGGATGCTGCGCCTGCGGTAGAGCGGCCGCCATGTTGCAA
CCGGGAAGGAAATGAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCCTGCCGGTGACTAA
CCCTGCGCTCCTGCCTCGATGGGTGGAGTCGCGTGTGGCGGGGAAGTCAG
GTGGAGCGAGGCTAGCTGGCCCGATTTCTCCTCCGGGTGATGCTTTTCCT
AGATTATTCTCTGGTAAATCAAAGAAGTGGGTTTATGGAGGTCCTCTTGT
GTCCCCTCCCCGCAGAGGTGTGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAGCCGGGA
GAAGCTGAGTCATGGGTAGTTGGAAAAGGACATTTCCACCGCAAAATGGC
CCCTCTGGTGGTGGCCCCTTCCTGCAGCGCCGGCTCACCTCACGGCCCCG
CCCTTCCCCTGCCAGCCTAGCGTTGACCCGACCCCAAAGGCCAGGCTGTA
AATGTCACCGGGAGGATTGGGTGTCTGGGCGCCTCGGGGAACCTGCCCTT
CTCCCCATTCCGTCTTCCGGAAACCAGATCTCCCACCGCACCCTGGTCTG
AGGTTAAATATAGCTGCTGACCTTTCTGTAGCTGGGGGCCTGGGCTGGGG
CTCTCTCCCATCCCTTCTCCCCACACACATGCACTTACCTGTGCTCCCAC
TCCTGATTTCTGGAAAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGCAAATC。
11.一种特异性检测单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的荧光PCR方法，采用权利要求1～10中任一项权利要求所述的试剂盒进行检测。
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