CN109852728A - 一种检测单纯疱疹病毒-2(hsv-2)的rca方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测单纯疱疹病毒‑2(HSV‑2)的RCA方法，按照如下步骤完成：（1）标本DNA的提取；（2）捕获探针的杂交，（3）锁式探针的环化连接与酶切，（4）RCA扩增，再用琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果。本发明锁式探针结合RCA技术是一种检测单纯疱疹病毒‑2(HSV‑2),的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因序列，RCA扩增放大检测信号。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病毒检测方面具有独特优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种检测单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的RCA方法。
背景技术
单纯疱疹是一种由单纯疱疹病毒所致的病毒性皮肤病，中医称为热疮。能引起人类多种疾病，如龈口炎、角膜结膜炎、脑炎以及生殖***感染和新生儿的感染。在感染宿主后，常在神经细胞中建立潜伏感染，激活后又会出现无症状的排毒，在人群中维持传播链，周而复始的循环。单纯疱疹属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米。根据抗原性的差别目前把该病毒分为1型和2型。两型病毒核苷酸序列有50％同源性，型间有共同抗原，也有特异性抗原。HSV-2的原发感染主要引起生殖器疱疹，男性表现为***的水泡性溃疡损伤，女性为宫颈、外阴、***的水泡性溃疡损伤，并发症包括生殖器外损伤和无菌性脑膜炎。HSV-2病毒是生殖器疱疹的主要病原，一旦感染，患者将终身携带这种病毒并周期性地出现生殖器疱疹性损伤，HSV-2感染还会增加HIV-1传播的风险，且目前没有针对HSV-2的有效疫苗问世。由于HSV-2的高阳性率及与HIV-1共同的传播途径，针对HSV-2的相关研究越来越受到重视。
针对单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的检查方法有很多，包括病毒分离培养、补体结合试验、中和试验、免疫荧光及酶联免疫吸附试验和DNA检测等，但是目前针对单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的检测方法主要还是血清学检测和PCR检测，分别针对血清中存在抗体和病原核酸进行检测。血清学检测的特异性和灵敏性不高，常常造成假阳性结果；PCR方法灵敏度高、特异性强，但反应条件要求高，并且也存在一定的假阳性反应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的RCA方法，该检测方法操作简单、检测时间周期短、高特异性和灵敏性，通过滚环复制法，能够检测出单纯疱疹病毒-2(HSV-2)。
本发明的技术方案如下：一种检测单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的RCA方法，按照如下步骤完成：
(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒步骤处理，获得含疱疹病毒-2(HSV-2)的基因组DNA样品；
(2)捕获探针的杂交：在反应管中依次加入含疱疹病毒-2(HSV-2)的基因组DNA样品、锁式探针、捕获探针，充分混匀，55±1℃水浴杂交0.5-1.5h，缓慢冷却至室温，加入溶于2×结合缓冲液中的链霉亲和素包被的磁珠(2×:2倍工作浓度的结合缓冲液，链霉亲和素包被的磁珠购自上海生物工程有限公司，下同)，混匀，室温放置20-25min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次(1×:1倍工作浓度的结合缓冲液，下同)，弃去洗液。(杂交意义：将待检测的病毒靶基因从病毒基因组中分离出来，提高检测效率和准确度)
(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coli Buffer，轻轻混匀95±1℃下反应3-5min，45±1℃孵育35-40min后，加入10×BSA缓冲液和E.coli DNA连接酶，混匀，37±1℃进行环化连接反应35-40min；再加入10×ExonucleaseⅠBuffer和ExonucleaseⅠ核酸外切酶，混匀，37±1℃下反应0.5-1.5h，最后在95±1℃条件下灭活ExonucleaseⅠ核酸外切酶3-5min(反应体系中所用到的10×E.coliBuffer、10×BSA缓冲液、E.coli DNA连接酶、10×ExonucleaseⅠBuffer和ExonucleaseⅠ核酸外切酶购自上海生物工程有限公司)，即可得到探针环化连接产物；(环化连接意义：E.coli DNA连接酶将靶序列DNA连接成单链环状的DNA，为下一步RCA扩增提供环状的DNA模板；酶切意义：ExonucleaseⅠ核酸外切酶将线性的靶DNA或者连接错误的DNA进行切割，防止非环状DNA扩增对RCA扩增产生干扰)
(4)RCA扩增：取步骤(3)中制得的探针环化连接产物、引物和10×phi29Buffer，轻轻混匀，95±1℃下反应3-5min后进行冰浴1-2min；加入phi29DNA聚合酶、dNTPs液，混匀后37±1℃进行RCA反应1.5-2.5h(反应体系中所用到的phi29DNA聚合酶、dNTPs和phi29buffer购自上海生物工程有限公司)，得到扩增产物；
(5)取步骤(4)制得的扩增产物用质量浓度为1.0-2.0％的琼脂糖凝胶电泳，即可完成对单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的检测。通过凝胶成像仪观察电泳结果，如图2所示，有肉眼可见条带扩增出来及为单纯疱疹病毒-2(HSV-2)阳性，反之为单纯疱疹病毒-2(HSV-2)阴性。
所述步骤(2)(4)中所设计用于RCA反应的探针、引物是：
引物(特异性结合目标DNA，使扩增反应产物能成线性增长，提高检测灵敏度)
5’-ATTATTCACTTATTACATCGTATCCTGCTATTATCTACAG-3’SEQ NO1；
探针是：
锁式探针(由于探针5’端与3’端的连接需要探针的两段识别序列与靶序列完全互补，将DNA探针特异性的锁定在目标DNA上，因此使RCA反应具有高特异性，同时可以区分单一位点的突变)
5’-TCTAGAGGTAGTGCCTTTCAATGCAGATCAGAAGCCGCAATTACCACAATTCTC CTTAGGAACCCCTTAGATAGGACAACGAGGTAGACGAACAAACTTTCC-3’探针的5’端进行磷酸化修饰，SEQ NO2；
捕获探针(一段特殊标记的探针，可以特异性的结合目标DNA上的靶序列，然后被亲和磁珠特异性的吸附，有利于增强后续扩增特异性和灵敏度)
Biotin-ATTATTCACTTATTACATCCATAAGAATCCACTAAACTTAGCCAACATGTTCTTATSEQNO3。
采用上述技术方案，本发明通过锁式探针特异识别靶基因序列，RCA扩增放大检测信号，是一种检测单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的新方法。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病毒检测方面具有独特优势。
有益效果：本发明锁式探针结合RCA技术是一种检测单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因序列，RCA扩增放大检测信号。锁式探针由5’端模板结合区、中间连接序列区和3’端模板结合区组成。当5’端和3’端与靶序列完全互补时，探针两段在DNA连接酶的作用下形成磷酸二酯键被连接成环，为RCA扩增提供环形模板，环化后的探针就可通过引物进行滚环复制和支链扩增。反之，若靶序列上存在变异或没有所要检测的目的基因，探针无法被连接成环状，复制也就无法进行。
本发明相对于现有的检测技术同时具有突出意义：(1)多元性。RCA中的通用引物可以等效率的扩增多条相异的锁式探针，克服了PCR等扩增方法中的很多问题，如反应物和扩增产物相互反应和干扰的现象；(2)高特异性。利用锁式探针检测目标序列时，由于探针5’端与3’端的连接需要探针的两段识别序列与靶序列完全互补，因此RCA的反应具有高特异性，可以区分单一位点的突变；(3)高灵敏度。线性RCA的扩增效率可以达到105倍，而指数RCA的扩增效率可达到109倍；(4)高通量。PCR等传统的核酸扩增技术因为其扩增产物扩散进液相而不能产生持续积累的扩增信号，因此不适宜在芯片上进行核酸扩增，但是RCA则可以解决这个问题，因为其在靶目标上会形成闭合的环状序列，从而确保了RCA产生的信号能够集中到一点，以此实现原位扩增和载片扩增。
该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在低病毒载量检测方面具有独特优势。
附图说明
图1为实施例1RCA检测不同浓度的模板电泳结果(泳道1,2,3,4分别代表终浓度为5nM，500pM，50pM，5pM模板组RCA产物电泳结果)。
图2为实施例2不同标本进行RCA检测的电泳结果(泳道为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12为第1至12号标本RCA产物组电泳结果)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明：
实施例1
RCA扩增反应的最低检测浓度的检测，按照如下步骤完成：
(1)将已知单纯疱疹病毒-2(HSV-2)阳性标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒操作说明书上的步骤处理，获得样本的DNA(病毒基因组DNA)，用超微量分光光度计测DNA浓度(NanoDrop 2000C)，并将其稀释至检测终浓度分别为5pM、50pM、500pM和5nM的模板；
(2)捕获探针的杂交：在杂交反应管中分别依次加入步骤(1)中稀释不同浓度的6μl DNA样品、1μmol/L锁式探针1μl、1μmol/L捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μl溶于2×结合缓冲液中链霉亲和素包被的磁珠(2×:2倍工作浓度，磁珠购自上海生物工程有限公司)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次(1×:1倍工作浓度)，弃去洗液。
(3)锁式探针的环化连接与酶切：每管分别加入去离子水16ul、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coli Buffer2μl，轻轻混匀，95℃下反应5min，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.4μl E.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×Exonuclease Ⅰ Buffer2μl和Exonuclease Ⅰ核酸外切酶1.8μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease Ⅰ核酸外切酶5min(反应体系中所用到的酶、BSA缓冲液和buffer购自上海生物工程有限公司)，得到探针环化连接产物；
(4)RCA扩增：取步骤(3)中制得的探针环化连接产物42μl、分别加入100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer1μl，轻轻混匀，95℃下反应5min，再进行冰浴1-2min；加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTPs液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h(反应体系中所用到的酶、dNTPs和buffer购自上海生物工程有限公司)；
(5)取步骤(4)制得的扩增产物用质量浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳，即可完成对单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的最低检测浓度的检测。通过凝胶成像仪观察电泳结果，如图1所示。
所述步骤(2)(4)中所设计用于RCA反应的引物、探针是：
引物5’-ATTATTCACTTATTACATCGTATCCTGCTATTATCTACAG-3’SEQ NO1；
探针是：
锁式探针
5’-TCTAGAGGTAGTGCCTTTCAATGCAGATCAGAAGCCGCAATTACCACAATTCTC CTTAGGAAC
CCCTTAGATAGGACAACGAGGTAGACGAACAAACTTTCC-3’探针的5’端进行磷酸化修
饰，SEQ NO2。
捕获探针
Biotin-ATTATTCACTTATTACATCCATAAGAATCCACTAAACTTAGCCAACATGTTCT
TAT SEQ NO3。
通过实施例1的检查方法对单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的最低检测浓度标本进行检测，得出：
用本发明的方法检测终浓度分别为5pM、50pM、500pM和5nM的模板，RCA扩增产物电泳结果如图1所示。结果显示，RCA在模板终浓度5pmol/L以下均未见扩增产物，模板终浓度50pmol/L以上均可见明亮条带，表明RCA的最低检测浓度为50pmol/L。结果提示，滚环扩增RCA法能较好满足低病毒载量标本的检测。
实施例2
一种检测单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的RCA方法的特异性检测，按照如下步骤完成：
(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒操作说明书上的步骤处理，获得样本的DNA(病毒基因组DNA)；
(2)捕获探针的杂交：在杂交反应管中依次加入6μl DNA样品、1μmol/L锁式探针1μl、1μmol/L捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μl溶于2×结合缓冲液中链霉亲和素包被的磁珠(2×:2倍工作浓度，磁珠购自上海生物工程有限公司)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次(1×:1倍工作浓度)，弃去洗液。
(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16ul、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coli Buffer2μl，轻轻混匀，95℃下反应5min，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μl E.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×ExonucleaseⅠ Buffer2μl和ExonucleaseⅠ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活ExonucleaseⅠ核酸外切酶5min(反应体系中所用到的酶、BSA缓冲液和buffer购自上海生物工程有限公司)，得到探针环化连接产物；
(4)RCA扩增：取步骤(3)中制得的探针环化连接产物42μl、加入100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer1μl，轻轻混匀，95℃下反应5min，再进行冰浴1-2min；加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTPs液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h(反应体系中所用到的酶、dNTPs和buffer购自上海生物工程有限公司)；
(5)取步骤(4)制得的扩增产物用质量浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳，即可完成对单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的检测。通过凝胶成像仪观察电泳结果，如图2所示，有肉眼可见条带扩增出来及为单纯疱疹病毒-2(HSV-2)阳性，反之为单纯疱疹病毒-2(HSV-2)阴性。
所述步骤(2)(4)中所设计用于RCA反应的引物、探针是：
引物5’-ATTATTCACTTATTACATCGTATCCTGCTATTATCTACAG-3’SEQ NO1；
探针是：
锁式探针
5’-TCTAGAGGTAGTGCCTTTCAATGCAGATCAGAAGCCGCAATTACCACAATTCTC CTTAGGAAC
CCCTTAGATAGGACAACGAGGTAGACGAACAAACTTTCC-3’探针的5’端进行磷酸化修
饰，SEQ NO2。
捕获探针
Biotin-ATTATTCACTTATTACATCCATAAGAATCCACTAAACTTAGCCAACATGTTCT
TAT SEQ NO3。
通过实施例2的检测方法对12例临床上已经检测过单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的不同病人标本进行RCA检测，得出：
通过实施例2的检查方法对12例标本提取DNA，然后将DNA进行RCA检测，结果显示10例为阳性，2例为阴性。
单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的阳性检测结果与临床检测结果完全一致，说明检测的结果是满意的。
序列表
<110> 湖北朗德医疗科技有限公司
<120> 一种检测单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的RCA方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
5’-ATTATTCACTTATTACATCGTATCCTGCTATTATCTACAG-3’
<210> 2
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
5’-TCTAGAGGTAGTGCCTTTCAATGCAGATCAGAAGCCGCAATTACCACAATTCTCCTTAGGAACCCCTTAGATAGGACAACGAGGTAGACGAACAAACTTTCC-3’
<210> 3
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
Biotin-ATTATTCACTTATTACATCCATAAGAATCCACTAAACTTAGCCAACATGTTCTTAT
Claims (4)
1.一种检测单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的RCA方法，其特征在于，按照如下步骤完成：
(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒步骤处理，获得含疱疹病毒-2(HSV-2)的基因组DNA样品；
(2)捕获探针的杂交：在反应管中依次加入含疱疹病毒-2(HSV-2)的基因组DNA样品、锁式探针、捕获探针，充分混匀，55±1℃水浴杂交，杂交完成后自然冷却至室温，加入溶于2×结合缓冲液的链霉亲和素包被的磁珠，混匀，室温放置，磁性分离，用1×结合缓冲液清洗磁珠数次，弃去洗液，得到杂交产物；
(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coliBuffer，轻轻混匀，在95±1℃下反应3-5min，然后再在45±1℃下孵育后，加入10×BSA缓冲液和E.coli DNA连接酶，混匀，在37±1℃进行环化连接反应；反应完成后加入10×Exonuclease Ⅰ Buffer和Exonuclease Ⅰ核酸外切酶，混匀，在37±1℃反应，反应完成后在95±1℃下条件下灭活Exonuclease Ⅰ核酸外切酶，得到探针环化连接产物；
(4)RCA扩增：取步骤(3)中制得的探针环化连接产物、加入引物和10×phi29 Buffer，混匀后在95±1℃下反应3-5min，然后进行冰浴；再加入phi29 DNA聚合酶、dNTPs液，混匀后在37±1℃进行RCA反应，得到扩增产物；
(5)取步骤(4)制得的扩增产物用的琼脂糖凝胶电泳，有肉眼可见条带扩增出来的为单纯疱疹病毒-2(HSV-2)阳性，反之为单纯疱疹病毒-2(HSV-2)阴性，即可完成对单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的检测；
所述步骤(4)中所设计用于RCA反应的引物是：
5’-ATTATTCACTTATTACATCGTATCCTGCTATTATCTACAG-3’SEQ NO1；
所述步骤(2)中的锁式探针为：
5’-TCTAGAGGTAGTGCCTTTCAATGCAGATCAGAAGCCGCAATTACCACAATTCTC CTTAGGAACCCCTTAGATAGGACAACGAGGTAGACGAACAAACTTTCC-3’探针的5’端进行磷酸化修饰SEQ NO2；
所述步骤(2)中的捕获探针为：
Biotin-ATTATTCACTTATTACATCCATAAGAATCCACTAAACTTAGCCAACATGTTCTTAT SEQ NO3。
2.根据权利要求1所述的检测单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的RCA方法，其特征在于，步骤(2)中锁式探针、捕获探针的浓度均为0.5-1.5μmol/L，且锁式探针、捕获探针相对于DNA样品体积的10-20％。
3.根据权利要求1所述的检测单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的RCA方法，其特征在于，步骤(3)中10×E.coli Buffer相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％；10×BSA缓冲液相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％；E.coli DNA连接酶相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的1.5-2.5％；10×Exonuclease I Buffer相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％；Exonuclease I相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％。
4.根据权利要求1所述的检测单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的RCA方法，其特征在于，步骤(4)中引物的添加量为探针环化连接产物的1.8-3％；10×phi29 Buffer的添加量为探针环化连接产物的9.5-15％；phi29 DNA聚合酶的添加量为探针环化连接产物的1.8-3％。
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