CN102605103B

CN102605103B - 一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法

Info

Publication number: CN102605103B
Application number: CN2012100681121A
Authority: CN
Inventors: 邱杨; 黄伟; 卢小雨; 刘建丽; 余以刚; 陈进会; 赵丽
Original assignee: Inspection & Quarantine Comprehensive Technology Center Dongguan Entry-Exit Inspection And Quarantine; Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection & Quarantine Comprehensive Technology Center Dongguan Entry-Exit Inspection And Quarantine; Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-03-15
Also published as: CN102605103A

Abstract

本发明公开了属于病毒检测技术领域的一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法。其引物和探针的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。本发明检测诺沃克病毒核苷酸的方法以样品RNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后，若出现诺沃克病毒特异性荧光扩增曲线则判定样品RNA中含有诺沃克病毒核苷酸。

Description

一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法。

背景技术

诺沃克病毒(Norwalk virus，NV)是一种直径27nm的小圆状结构病毒(SRSV)，又被称为诺瓦克样病毒(Norwalk-like Viruses，NLVs)，属于杯状病毒科诺沃克病毒属成员，是一种分布很广泛的肠道腹泻病毒。1968年在美国Norwalk镇发生了一起胃肠炎爆发流，该病毒是在这些患者的粪便中首次被发现，因此得名。NLV是在社区、学校、机关、军营和家庭中爆发流行的非细胞菌性胃肠炎的主要病原，感染对象主要是成人和学龄耳童，全年均有发生。诺沃克病毒的传播方式是通过粪-口途径传播，主要是通过污染的水源、食物和人-人密切接触传播；临床表现包括恶心、呕吐、腹痛、腹泻(水样便)，可伴有头痛、低热、乏力及食砍减退，病程一般2-3d，与轮状病毒等引起的其他病毒性腹泻相比，NLV引起的腹泻多伴有呕吐症状。因此，疾病预防控制机构以及医院急需特异性强，敏感性高，操作方便，可用于胃肠炎等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断的方法。

诺沃克病毒(Norwalk virus，NV)的基因组为正单链RNA，全长7.65Kb，编码3个开放读码框(open reading frarnes，ORFs)，分别编码非结构蛋白、外壳蛋白和一种功能还不清楚的蛋白：ORFs1编码具有RNA多聚酶活性的非结构蛋白前体，为非结构蛋白；ORFs2编码衣壳蛋白；ORFs3编码一种强碱性蛋白，与基因库中任何蛋白质的序列都无相似之处，其功能尚不清楚。诺沃克病毒成员庞杂，目前已对其100多个分离株进行基因测序。根据RNA聚合酶区域衣壳蛋白区核苷酸和氨基酸序列的同源性比较，将诺沃克病毒分为2个基因组：基因组I，代表株NV，包括SV等、Desert Shield virus(DSV)等；基因II组，代表株SMV，包括HV、Mexio virus(MX)等。

目前诺沃克病毒的常规检测方法主要是电镜法(EM)、放射性免疫试验(RIA)和酶联免疫法(ELISA)。诺沃克病毒被发现后很长一段时间内，电镜一直是检测的主要手段，具有直接、可靠的优点，但由于诺沃克病毒在电镜下缺乏显著的形态学特征，且敏感性低、价格昂贵、技术条件要求高，不适合检验检疫实际工作需求；用RIA法检测出急性期和恢复期之间抗体升高4倍以上，对流行病学调查更有意义，但RIA法实验时间需6d时间，同时还需要放射性同位素标记，对操作人员和环境造成不良影响；酶联免疫法(ELISA)特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，是目前可广泛应用的检测方法，但由于诺沃克病毒体外培养还未成功，可用试剂的病毒抗原数量受到限制。传统的RI-PCR也被用于诺沃克病毒，但检测时间需要6小时，在热循环后要用电泳对扩增产物进行检测分析，步骤繁琐，还会在实验操作过种中有可能发生污染；实时荧光RT-PCR(real-time fluorescent RT-PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、速度快、抗污染、高通量等优点逐渐取代了传统RT-PCR技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法。

一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示。

一种检测诺沃克病毒核苷酸的探针，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。

所述报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5，所述淬灭荧光染料为TAMRA、ROX、DABCY1、BHQ1或BHQ2。

一种检测诺沃克病毒核苷酸的方法，该方法以样品RNA为模板，利用如序列表SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示的引物以及序列表SEQ ID No.3所示的探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后，若出现诺沃克病毒特异性荧光扩增曲线则判定样品RNA中含有诺沃克病毒核苷酸。

所述实时荧光RT-PCR扩增的反应体系如下：2.5μL 10×One Step RNA PCRBuffer，终浓度为0.4mM的dNTP，终浓度为400μM的引物，终浓度为200μM的探针，终浓度为2.5U的Taq酶，终浓度为20U的RNase Inhibitor，终浓度为2.5U的AMV RTase XL，5μL样品RNA，10.5μL RNase Free dH₂O。

所述实时荧光RT-PCR扩增的反应条件如下：50℃反转录20min；95℃变性3min；以95℃5s，60℃40s扩增45个循环。

本发明根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记的探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对诺沃克病毒的检测。

本发明的有益效果：本发明根据诺沃克病毒基因组序列设计的引物特异性好，用于荧光PCR检测的灵敏度高。本发明的检测方法准确性高，灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有诺沃克病毒，为人腹泻、胃肠炎的病原学诊断及鉴别诊断提供了科学依据。

附图说明

图1为实时荧光RT-PCR检测诺沃克病毒核酸的特异性实验结果图。

图2是本发明检测方法的灵敏度实验的检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1引物与探针的设计及合成

通过分别对所有已知的诺沃克病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段(其序列见附录)，利用生物软件Primer Express3.0针对该区段设计引物和Taqman探针，并通这NCBI数据库进行了Blast同源性比对验证。引物序列为：

正向引物：5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’(SEQ ID No.1)；

反向引物：5’-CCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTC-3’(SEQ ID No.2)；

探针的序列为：5’-ATTGCGATCGCCCTCCCACGT-3’(SEQ ID No.3)；

该探针的5’端用VIC荧光基团标记，3’端用淬灭荧光染料BHQ2标记。

实施例2 Real-time RT-PCR

(1)RNA的提取

病毒样品RNA的抽提用Roche High Pure viral RNA kit试剂盒提取，取0.5克左右粪便标本，加TE 500μL制成10-20％的悬液，8000rpm离心5分钟；取200μL标本上清加400μL结合液，混合均匀，加入纯化过滤管中，1000rpm，15s；弃去过滤液，换一新的收集管，加入500μL inhibitor removal buffer，10000rpm离心1分钟；弃去过滤液，换一新的收集管，加入450μL洗液，10000rpm离心1分钟；重洗一次；最后离心，13000rpm，10s，弃去残余的洗液；去掉收集管，换一个干净的无RNA的1.5ml Eppendrof离心管，用50μL洗脱液加入过滤管中，10000rpm离心1分钟，将提取的RNA移到一个新的离心管中，于-80℃保存。

(2)扩增方法的建立

实时荧光RT-PCR反应体系(表1)：

表1荧光定量RT-PCR反应体系

组分	25μL体积	终浓度
			10×One step RNA PCR Buffer	2.5	1×
dNTPs(各2.5mM)	2	0.4mM
			正、反向引物(各10μM)	各1.5	0.6μM
探针(10μM)	0.5	0.2μM
			Taq酶	0.5	2.5U
RNase Inhi bitor(40U/μL)	0.5	20U
			AMV RTase XL(5U/μL)	0.5	2.5U
RNA	5
			RNase Free dH₂O	10.5

注：a.在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。

实时荧光RT-PCR反应条件：

将样品管放入ABI公司7500荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：50℃反转录20min；95℃变性3min；以95℃5s，60℃40s扩增45个循环(收集荧光)。反应结束后根据曲线判定结果。

(3)荧光RT-PCR

利用建立起的荧光RT-PCR反应体系对10株不同的人类病毒进行检测，检测结果如图1所示，3株NV病毒(编号为NV-SZ01，NV-SZ02，NV-SZ03)均出现相应的特异性荧光扩增曲线(参见图中A所指)，呈阳性反应。而其它7株人类病毒(包括3株灭活的脊髓灰质病毒Polio I、Polio II、PolioIII，3株轮状病毒、1株人星状病毒。)则均没有荧光信号产生(参见图中B所指)，判为阴性。结果表明，所设计的引物探针只对目的病毒(即，NV病毒)特异，与其它检测对象无交叉反应。

以诺沃克病毒的RNA为模板，通过实时荧光RT-PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而其它病毒的荧光强度没有变化。

实施例3 灵敏度实验

将NV病毒体外转录RNA用DEPC处理的水分别稀释，进行相对灵敏度检测，在25μL反应体系中，RNA分别被稀释成5.0×105、5.0×104、5.0×103、5.0×102、5.0×101拷贝数，检测结果如图2所示，结果证实诺沃克病毒检测的最低检测限均达到50个模板拷贝。

Claims

1.一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示。

2.一种配合权利要求1所述引物检测诺沃克病毒核苷酸的探针，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。

3.根据权利要求2所述检测诺沃克病毒核苷酸的探针，其特征在于，所述报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5，所述淬灭荧光染料为TAMRA、ROX、DABCY1、BHQ1或BHQ2。