CN102373304B - 单纯疱疹病毒1型和2型同时检测鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒1型和2型同时检测鉴定方法。包括采用如下引物及Taqman探针进行实时荧光定量PCR，所述引物包括上游引物HSV-F为5’-GTCAGCGAGGATAACCTG-3’，下游引物HSV-R为5’-GTCCAGTCGTTTATCTTCAC-3’，为公用引物；1型单纯疱疹病毒特异性探针HSV-1P序列为5’-TTGAGACCGCCGGCACGTAC-3’；2型单纯疱疹病毒探针HSV-2P序列为5’-CTTCGAGACCGCGGGTACGTAC-3’。实现了在同一反应管中同时检测单纯疱疹病毒1型和2型，并通过不同的荧光通道加以鉴别，扩增的同时可以直接在软件上判读结果，而不用跑电泳，避免了气溶胶污染。

Description

单纯疱疹病毒1型和2型同时检测鉴定方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒1型和2型同时检测鉴定方法。 

技术背景

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)能引起人类多种疾病，如龈口炎(gingivostomatitis)、角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)、脑炎(encephalitis)以及生殖***感染和新生儿的感染。在感染宿主后，常在神经细胞中建立潜伏感染，激活后又会出现无症状的排毒，在人群中维持传播链，周而复始的循环。 

单纯疱疹病毒感染在我国非常普遍，发病率高，可通过胎盘及产道感染新生儿，导致流产及新生儿死亡，与***的发生也有关，危害较大，因属病毒感染，又无特效疗法，所以给人带来很大痛苦。HSV分为1型(HSV-1)和2型(HSV-2)，两者基因组的相似度大约在50％，1型疱疹病毒主要通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，主要感染腰以上部位的粘膜组织和器官。如引起***黏膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹，口和口周围发生的疱疹，99％是由1型疱疹病毒引起的。2型疱疹病毒主要存在于女性宫颈、***、外阴皮肤及男性的***、尿道等处，是引起生殖器发炎和疱疹的罪魁祸首，据有关资料表明，生殖器的病原体90％为2型疱疹病毒，仅10％为1型疱疹病毒。在治疗方面，HSV-1引起的症状较轻，用药后较易治疗，所以有效的区分两种病毒感染对临床用药有一定的指导意义。 

目前，临床上对单纯疱疹病毒的检测方法：分离培养是检测HSV的金标准，但该方法操作十分繁琐，且有一定的危险性，时间耗费长。临床上常用ELISA和间接免疫荧光来检测HSV的特异性抗体，但在疾病早期(即窗口期)无法检测到病毒抗体，而且病毒抗体存在时间较长，治疗成功后仍有抗体存在，在诊断方面会有一定的困扰，所以选择核酸检测是检测病原体的最佳方法。研究证实，在生殖器溃疡愈合过程中，荧光探针定量PCR检测无症状排毒更为灵敏。因此，对于疱疹已结痂者，或无痂状排毒的患者，用实时荧光定量PCR技术检测单纯疱疹病毒可作为首选。 

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术(HIGUCHIR，FOCKLERC，DOLLINGER G，et al.Kinetic PCR analysis：real-time monitoring of DNA amplification reactions[J].Biotechnology，1993，11：1026；韩俊英，曾瑞萍.荧光定量PCR技术及其应用[J].国外医学遗传学分册，2000，23(3)：177.，在此全文引用作为参考，如同全文叙述一样)。 

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对***、沙眼衣原体、解脲支原体、人类***瘤病毒、单纯疱疹病毒、肝炎类病毒、人结核分枝杆菌、细小病毒B19、EB病毒和人巨细胞病毒等多种病原体进行测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。 

本发明利用HSV-1和HSV-2的基因组差异，设计1对上游引物和下游引物，根据扩增的靶片段分别设计Taqman探针，并对两条探针进行不同的荧光标记，实现了在同一反应管中同时检测HSV-1和HSV-2，并通过不同的荧光通道加以鉴别，扩增的同时可以直接在软件上判读结果，而不用跑电泳，避免了气溶胶污染，在临床上有更大的应用前景。 

发明内容

针对鉴定和检测单纯疱疹病毒需时间长和分型需要，及普通PCR容易造成气溶胶污染的缺点，本发明提供了一种单纯疱疹病毒1型和2型同时检测或鉴定方法。 

具体的，一种同时鉴定或检测单纯疱疹病毒1型和2型的方法，包括采用如下引物及Taqman探针进行实时荧光定量PCR，所述引物包括上游引物HSV-F为5’-GTCAGCGAGGATAACCTG-3’，下游引物HSV-R为5’-GTCCAGTCGTTTATCTTCAC-3’，为公用引物；1型单纯疱疹病毒特异性探针HSV-1P序列为5’-TTGAGACCGCCGGCACGTAC-3’；2型单纯疱疹病毒探针HSV-2P序列为5’-CTTCGAGACCGCGGGTACGTAC-3’。 

优选的，1型单纯疱疹病毒的探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ；2型单纯疱疹病毒的探针5’端标记JOE，3’端标记BHQ。 

本发明进一步提供鉴定或检测单纯疱疹病毒1型和2型的试剂盒，包含：引物HSV-F5’-GTCAGCGAGGATAACCTG-3’，引物HSV-R  5’-GTCCAGTCGTTTATCTTCAC-3’；探针HSV-1P5’-TTGAGACCGCCGGCACGTAC-3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ；探针HSV-2P5’-CTTCGAGACCGCGGGTACGTAC-3’，5’端标记JOE，3’端标记BHQ。 

上述方法或试剂盒既可用于病毒纯培养物的鉴定与检测，用于科学研究等非疾病诊断的目的，也可用于临床样本的直接检测。 

本发明利用单纯疱疹病毒1型和2型之间的基因组差异，设计一对上游引物和下游引物，上下游引物均为公用引物。设计两条Taqman探针分别针对1型和2型单纯疱疹病毒，1型单纯疱疹病毒的探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ，2型单纯疱疹病毒的探针5’端标记JOE，3’端 标记BHQ。当样品中只存1型单纯疱疹病毒DNA时，反应体系中的1型单纯疱疹病毒检测体系体系会进行扩增，在FAM通道有荧光信号出现，并有实时扩增曲线；当样品中只存在2型单纯疱疹病毒DNA时，反应体系中2型单纯疱疹病毒检测体系会进行扩增，在JOE通道有荧光信号出现，并有实时扩增曲线；当同时存在两种病毒的DNA时，两个体系会同时工作，在两个通道都会出现实时扩增曲线，实现了在同一反应管中同时检测单纯疱疹病毒1型和2型，并通过不同的荧光通道加以鉴别，扩增的同时可以直接在软件上判读结果，而不用跑电泳，避免了气溶胶污染。 

附图说明

图1 HSV-1和HSV-2及HSV-F、HSV-R引物序列比对图 

图2 Taqman探针技术工作原理 

图3 实时定量PCR扩增曲线 

图4 针对HSV-1 DNA模板的扩增曲线 

图5 针对HSV-2 DNA的扩增曲线 

图6 针对HSV-1 DNA和HSV-2 DNA混合模板的扩增曲线 

图7 针对两种系列稀释模板的扩增曲线 

具体实施方式

一种快速同时鉴别和检测1型和2型单纯疱疹病毒的方法。根据1型和2型单纯疱疹病毒基因组DNA序列的差异，设计一对上游引物和下游引物，上下游引物均为公用引物。设计两条Taqman探针分别针对1型和2型单纯疱疹病毒，1型单纯疱疹病毒的探针5’端标记FAM(6-羧基荧光素)荧光基团，3’端标记BHQ(Black hole quenchers)淬灭基团，2型单纯疱疹病毒的探针5’端标记JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)荧光基团，3’端标记BHQ。当样品中只存1型单纯疱疹病毒DNA时，反应体系中的1型单纯疱疹病毒检测体系会进行扩增，在FAM通道有荧光信号出现，并有实时扩增曲线；当样品中只存在2型单纯疱疹病毒DNA时，反应体系中2型单纯疱疹病毒检测体系会进行扩增，在JOE通道有荧光信号出现，并有实时扩增曲线；当同时存在两种病毒的DNA时，两个体系会同时工作，在两个通道都会出现实时扩增曲线，从而实现对两者的鉴别。 

本发明所提供的引物序列如下：上游引物HSV-F为5’-GTCAGCGAGGATAACCTG-3’(SEQ ID NO：1)，下游引物HSV-R为5’-GTCCAGTCGTTTATCTTCAC-3’(SEQ ID NO：2)，均为公用引物。1型单纯疱疹病毒特异性Taqman探针HSV-1P序列为5’-TTGAGACCGCCGGCACGTAC-3’(SEQ ID NO：3)；2型单纯疱疹病毒Taqman探针HSV-2P序列为5’-CTTCGAGACCGCGGGTACGTAC-3’(SEQ ID NO：4)。 

反应体系为：模板5ul，10×Taq酶buffer 5ul，2.5mM dNTP 4ul，浓度为10uM HSV-F引物2ul，浓度为10uM HSV-R引物2ul，浓度为10uM HSV-1P探针1ul，浓度为10uM HSV-2P探针1ul，Taq酶2.5U，ddH2O补至50ul。 

PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃40s，共40个循环；在荧光定量PCR仪上进行扩增，对FAM和JOE通道进行信号收集。 

如果是单通道实时荧光PCR仪可分管操作，两个探针5’端均标记FAM荧光基团。 

下述实例中所用方法如无特殊说明均为常规方法，所合成的引物探针工作均由生工生物工程(上海)有限公司合成。 

引物探针的设计与合成： 

根据Pub-Med中基因库中所提供的1型和2型单纯疱疹病毒的基因组序列进行比对，发现两者基因组在核苷酸水平上可以达到50％以上的相似度，但二者同时也存在这差异，最终找到了一段比较理想的区域，位于HSV-1和HSV-2的glycoprotein D gene，两者可以共用一对引物，但在探针上有所区别，根据探针的特异性可以将HSV-1和HSV-2区分开来。 

如图1所示，深色区域为引物HSV-F和HSV-R与1型和2型单纯疱疹病毒基因组序列对比图，从图中可以看出，这一对引物所在的区域HSV-1和HSV-2都是比较保守的，可以针对单纯疱疹病毒进行通用扩增，但图中框内的区域两者之间存在四个差异，这也是设计探针来区分两者的依据。 

TaqMan荧光探针的工作原理为：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’～3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离(如图2)，从而荧光监测***可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，形成扩增曲线(如图3)。基于以上所述，荧光定量PCR可以避免气溶胶污染，进行多重反应。 

HSV-1和HSV-2的区分依赖于各自特异性探针上标记的荧光集团不同，可以采用不同的通道对荧光信号进行收集。当模板中只存在HSV-1DNA时，只有FAM通道可以收到荧光信号，形成扩增曲线；相反，当模板中只存在HSV-2 DNA时，只有JOE通道可以收集到荧光信号，形成扩增曲线；当两种模板都存在时，两个通道都会收到荧光信号，形成扩增曲线。通过在不同通道的荧光信号观察到的荧光曲线来判断模板中是HSV-1或/和HSV-2。 

实施例 

实验材料：HSV-1(临床株-测序验证)，HSV-2(临床株-测序验证)，Taq酶套装(Takara)， 

引物，探针 

实验仪器：ABI7500(荧光PCR仪) 

实验方法： 

1、体系构建 

整个反应体系如下表： 

序号

组份

初浓度

数量

序号

组份

初浓度

数量

1

超纯水

/

29.4μl

8

ROX(校准荧光)

100×

0.1μl

2

10×buffer

/

5μl

9

dNTP

25mM

4μl

3

PrimerHSV-F

10uM

2μl

10

模板

5μl

4

primer HSV-R

10uM

2μl

11

Total

50μl

5

ProbeHSV-1P

10uM

1μl

12

6

ProbeHSV-2P

10uM

1μl

13

7

Taq酶

5U/L

0.5μl

14

模板A为HSV-1临床样本提取的核酸(经测序验证为HSV-1)；模板B为HSV-2临床样本提取的核酸(经测序验证为HSV-2)；模板C为两者混合物。 

按照上述体系进行配置，在ABI7500上进行扩增，PCR的反应条件如下：94℃5min；94℃30s，60℃40s，共40个循环；对FAM和JOE通道进行信号收集(如单通道仪器可分管操作，两个探针均标记FAM)。 

图4、5、6，分别是针对模板A、B、C的扩增曲线。 

从图4中可以看出，在模板中只含有HSV-1基因组DNA时，只在对应HSV-1的通道有扩增曲线，而针对HSV-2的通道没有扩增曲线出现。 

从图5中可以看出，在模板中只含有HSV-2基因组DNA时，只在对应HSV-2的通道有扩增曲线，而针对HSV-1的通道没有扩增曲线出现。 

从图6中可以看出，在模板中同时含有HSV-1和HSV-2基因组DNA时，在两个通道都可以检测到荧光信号。 

从图4-6中可以看出，两种体系在同一反应管中可以很好的进行工作，没有交叉反应，特异性很好。 

将提取的HSV-1和HSV-2的核酸进行系列稀释，在体系中分别进行检测，结果如图7，A图为稀释的HSV-1 DNA作为模板进行的检测；B图为稀释的HSV-2 DNA作为模板进行的检测。 结果表明可以检出低浓度的样品。 

Claims (1)

1.鉴定或检测单纯疱疹病毒1型和2型的试剂盒，其包含：引物HSV-F5’-GTCAGCGAGGATAACCTG-3’，引物HSV-R5’-GTCCAGTCGTTTATCTTCAC-3’；探针HSV-1P5’-TTGAGACCGCCGGCACGTAC-3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ；探针HSV-2P5’-CTTCGAGACCGCGGGTACGTAC-3’，5’端标记JOE，3’端标记BHQ。

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