CN110760615A - 一种ii型单纯疱疹病毒检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种II型单纯疱疹病毒检测试剂盒及检测方法。该试剂盒基于RPA‑LFD，包括RPA反应引物和RPA反应探针。此外，还公开了该试剂盒检测II型单纯疱疹病毒的方法。本发明的试剂盒具有灵敏度高，特异性强，操作简便，反应快速，仪器设备便携等特点，非常适合应用于II型HSV的床旁快速诊断。

Description

一种II型单纯疱疹病毒检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，公开了一种II型单纯疱疹病毒核酸检测试剂盒及检测方法。
背景技术
生殖器疱疹(Genital herpes,GH)是由单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)感染泌尿、生殖道及肛周部位皮肤黏膜引起的一种慢性、复发性、传染性疾病，发病占性传播疾病的30％左右。单纯疱疹病毒属于疱疹病毒科α亚科，是一种线性双链DNA病毒，根据血清型可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种，其中，Ⅰ型主要通过口面部感染，也通过性传播，Ⅱ型主要通过性传播。在发生GH感染患者中，85％以上为HSV-2感染，II型HSV主要引起生殖器疱疹，且反复发作，清除病毒十分困难，根源在于II型HSV具有嗜神经潜伏性，病毒可在人的骶尾神经节内建立终生潜伏。妊娠早期急性感染II型HSV可致流产、死胎和先天畸形。血清型抗II型HSV IgG阳性的孕妇传染新生儿风险增高。新生儿疱疹常常会导致长期的神经病学后遗症或死亡。感染II型HSV还会增大感染人类免疫缺陷病毒(HIV)的风险。II型HSV感染可能与某些癌症的发病相关。因此，早期的II型HSV检测对控制GH的传播具有至关重要的作用。传统的病毒分离法并不能快速检测HSV-2，并且灵敏度较低。常用的免疫方法包括检测II型HSV的IgG和IgM以及抗原检测。当IgM阳性表示正处于感染期，但由于IgM的产生存在一定的滞后性，影响早期诊断。IgG阳性对是否正处于感染期的诊断特异性不高，很多既往感染者IgG持续阳性。实时荧光PCR技术，是近年来应用于临床诊断病原体感染的新方法，具有高度敏感性和特异性等优点，在疾病的早期诊断，治疗监测，预后判断等方面具有广阔前景。但是实时荧光PCR方法需要昂贵的仪器，严格的实验室条件，仅在设备优良的大型综合医院及科研机构才会配备，限制了其应用，使其在疾病防控及社区检测中无法充分发挥作用。
RPA技术属于恒温扩增的一种，它的反应模式与PCR相似，不同的是RPA利用酶打开模板链，而不是通过高热变性，在25℃-43℃的温度范围，10-15min内实现对核酸的高效扩增。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
针对目前II型单纯疱疹病毒诊断技术存在的缺陷，本发明提供一种基于RPA-LFD的II型单纯疱疹病毒检测试剂盒及检测方法，基于RPA-LFD技术，具有特异、灵敏；快速、简便，高效的II型单纯疱疹病毒核酸检测试剂盒及检测方法。
本发明提供了一种基于RPA-LFD的II型单纯疱疹病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包括：RPA反应引物和RPA反应探针，其中，所述RPA反应引物为primer A和primer B，并且
Primer A的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
Primer B的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；
所述RPA反应探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
在本申请的一些实施方案中，所述基于RPA-LFD的II型单纯疱疹病毒的检测试剂盒还包括：RPA冻干颗粒、RPA反应缓冲液、和醋酸镁。
在本申请的一些实施方案中，所述基于RPA-LFD的II型单纯疱疹病毒的检测试剂盒还包括LFD试纸、LFD缓冲液、阴性对照和阳性对照。
在本申请的一些实施方案中，所述基于RPA-LFD的II型单纯疱疹病毒的检测试剂盒包括：RPA反应引物、RPA反应探针、RPA冻干颗粒、RPA反应缓冲液、醋酸镁、LFD试纸、LFD缓冲液、阴性对照和阳性对照，其中，所述RPA反应引物为primer A和primer B，并且
Primer A的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
Primer B的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；
所述RPA反应探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
在本申请的上述实施方案中，可选地，所述Primer B的5’端使用生物素Biotin标记，即Primer B为：
(Biotin)-atctccgtccagtcgtttatcttcactagc。
在本申请的上述实施方案中，可选地，所述探针的5’端使用羧基荧光素FAM标记。
在本申请的上述实施方案中，可选地，所述探针为：
5’FAM-acgcagccccgctggagctactatgacagct/THF/tagcgccgtcagcgag/C3-spacer/-3’。
在本申请的一些实施方案中，所述RPA反应缓冲液为Rehydration Buffer。
在本申请的一些实施方案中，所述RPA冻干颗粒包括噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、和dNTPs。
在本申请的一些实施方案中，所述阴性对照为双蒸水。
在本申请的一些实施方案中，所述阳性对照为II型单纯疱疹病毒基因组DNA。
在本申请一种优选的实施方案中，本申请提供一种II型单纯疱疹病毒的核酸检测试剂盒，该试剂盒含有：
1)RPA冻干颗粒；
所述RPA冻干颗粒包括噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、和dNTPs；
2)RPA反应缓冲液；
所述RPA反应缓冲液为Rehydration Buffer；
3)醋酸镁；
4)RPA反应引物：
Primer A：gttatggaatacaccgagtgcccctacaac；
Primer B：(Biotin)-atctccgtccagtcgtttatcttcactagc；
4)RPA反应探针：
5’FAM
-acgcagccccgctggagctactatgacagct(THF)tagcgccgtcagcgag/C3-spacer/-3’；
5)LFD试纸及LFD缓冲液；
6)阴性对照；
所述阴性对照为双蒸水；
7)阳性对照；
所述阳性对照为II型单纯疱疹病毒基因组DNA。
另一方面，本发明还提供一种利用基于RPA-LFD的II型单纯疱疹病毒的检测试剂盒检测II型单纯疱疹病毒核酸的方法，包括以下步骤：
(1)在RPA冻干颗粒中加入29.5μL Rehydration Buffer，2.1μL 10μM Primer A，2.1μL 10μM Primer B，0.6μL 10μM探针，10.7μL双蒸水，2.5μL模板，得到溶液；在反应管盖上加醋酸镁2.5μL，盖严管盖并离心使醋酸镁与所述溶液混合，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离心，放置于38℃水浴箱内进行扩增反应，15min后取出10μL扩增液与100μL LFD缓冲液混合，得到混合液；将侧流层析检测试纸条(LFD)样品浸入混合液中，室温放置5min后观测条带显色判定结果；
(2)结果判定：含有II型单纯疱疹病毒模板的试纸条检测线及质控线均出现条带，阴性对照仅有质控线出现条带；
这里，所述RPA冻干颗粒包括噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、dNTPs；
所述Primer A的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
Primer B的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；可选地，所述Primer B的5’端使用生物素Biotin标记，即Primer B为：
(Biotin)-atctccgtccagtcgtttatcttcactagc；
所述RPA反应探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，可选地，所述探针的5’端使用羧基荧光素FAM标记；可选地，所述探针为：
5’FAM
-acgcagccccgctggagctactatgacagct(THF)tagcgccgtcagcgag/C3-spacer/-3’。
本发明的试剂盒将RPA技术与LFD检测技术结合起来，首先利用带生物素标记的引物和带羧基荧光素(FAM)标记的探针对靶核酸进行扩增，使扩增产物同时携带FAM和生物素标记，然后将扩增产物加入到LFD试纸条样品端，LFD样品端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，当反应液进入试纸条时，带有FAM和生物素的扩增产物就会通过抗原抗体结合作用，在检测线上形成生物素抗体-核酸-金粒复合体并显色。整个试剂盒反应条件要求低，无需特殊检测仪器。
本发明将实时荧光RPA技术应用于II型单纯疱疹病毒检测，既克服了传统检测方法中灵敏度低、耗时过长的弊端，又解决了q-PCR设备昂贵、实验室要求高的问题。该检测试剂盒灵敏度、特异性与q-PCR比较无明显差异。并且可以在5-20min内判读结果。
综上所述，本试剂盒具有灵敏度高，特异性强，操作简便，反应快速，仪器设备便携，低污染等特点，非常适合应用于II型HSV的床旁快速诊断。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。
图1为本申请实施例3的II型单纯疱疹病毒检测试剂盒特异性分析结果；其中，1为阴性对照；2为I型单纯疱疹病毒；3为H5N1病毒；4为日本乙型脑炎病毒；5为II型单纯疱疹病毒；
图2为本申请实施例4的II型单纯疱疹病毒检测试剂盒灵敏度分析，其中，1为阴性对照；2为5copy/μL；3为10copy/μL；4为102copy/μL；5为103copy/μL。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
RPA试剂及缓冲液购自TwistDX公司，LFD试纸及其缓冲液购自Milenia Genline公司。
实施例1
(1)引物设计：从Genebank下载核酸序列，选择II型单纯疱疹病毒保守区段，设计合成RPA引物:
primerA：5’-gttatggaatacaccgagtgcccctacaac-3’(SEQ ID NO.1)；
primerB：5’-(biotin)-atctccgtccagtcgtttatcttcactagc-3’(SEQ ID NO.2)。
其中，biotin为生物素标记。
(2)探针设计：
5’FAM-acgcagccccgctggagctactatgacagct/THF/tagcgccgtcagcgag/C3-spacer/-3’(SEQ ID NO.3)。
FAM为羧基荧光素标记；THF为四氢呋喃；C3-spacer是聚合酶延伸阻断物。
引物及探针由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例2
反应体系和检测方法
(1)反应体系：在RPA冻干颗粒中【噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、dNTPs】加入29.5μL Rehydration Buffer，2.1μL 10μMPrimer A，2.1μL 10μM Primer B，0.6μL 10μM探针，10.7μL双蒸水，2.5μL模板，在反应管盖上加醋酸镁2.5μL，小心盖严管盖并离心使醋酸镁与溶液混合，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离心，放置于38℃水浴箱内进行扩增反应，15min后取出10μL扩增液与100μL LFD缓冲液混合，将侧流层析检测试纸条样品浸入混合液中，室温放置5min后观测条带显色判定结果。
(2)结果判定：含有II型单纯疱疹病毒模板的试纸条检测线及质控线均出现条带，阴性对照仅有质控线出现条带。
实施例3
基于RPA-LFD的II型单纯疱疹病毒检测体系特异性分析:
反应体系：在RPA冻干颗粒中【噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、dNTPs】加入29.5μL Rehydration Buffer，2.1μL 10μM PrimerA，2.1μL 10μM Primer B，0.6μL 10μM探针，10.7μL双蒸水，2.5μL模板(分别为阴性对照；I型单纯疱疹病毒；H5N1病毒；日本乙型脑炎病毒；II型单纯疱疹病毒)，在反应管盖上加醋酸镁2.5μL，小心盖严管盖并离心使醋酸镁与溶液混合，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离心，放置于38℃水浴箱内进行扩增反应，15min后取出10μL扩增液与100μL LFD缓冲液混合，将侧流层析检测试纸条样品浸入混合液中，室温放置5min后观测条带显色判定结果。
(2)结果判定：含有II型单纯疱疹病毒模板的试纸条检测线及质控线均出现条带，阴性对照及其他病原体仅有质控线出现条带。
实施例4
基于RPA-LFD的II型单纯疱疹病毒检测体系灵敏度分析:
反应体系：在RPA冻干颗粒中【噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、dNTPs】加入29.5μL Rehydration Buffer，2.1μL 10μM PrimerA，2.1μL 10μM Primer B，0.6μL 10μM探针，10.7μL双蒸水，2.5μL模板(分别为阴性对照；5copy/μL；10copy/μL；102copy/μL；103copy/μL II型单纯疱疹病毒)，在反应管盖上加醋酸镁2.5μL，小心盖严管盖并离心使醋酸镁与溶液混合，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离心，放置于38℃水浴箱内进行扩增反应，15min后取出10μL扩增液与100μL LFD缓冲液混合，将侧流层析检测试纸条样品浸入混合液中，室温放置5min后观测条带显色判定结果。
(2)结果判定：阴性对照仅有质控线出现条带，5copy/μL及其以上浓度的II型单纯疱疹病毒检测线及质控线均出现条带。
虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京卡帕索医疗技术有限公司
<120> 一种II型单纯疱疹病毒检测试剂盒及检测方法
<130> 011925945
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gttatggaat acaccgagtg cccctacaac 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atctccgtcc agtcgtttat cttcactagc 30
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acgcagcccc gctggagcta ctatgacagc ttagcgccgt cagcgag 47

Claims (10)

1.基于RPA-LFD的II型单纯疱疹病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包括：RPA反应引物和RPA反应探针，其中，所述RPA反应引物为primer A和primer B，并且
Primer A的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
Primer B的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；
所述RPA反应探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：RPA冻干颗粒、RPA反应缓冲液、和醋酸镁。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：LFD试纸、LFD缓冲液、阴性对照和阳性对照。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：RPA反应引物、RPA反应探针、RPA冻干颗粒、RPA反应缓冲液、醋酸镁、LFD试纸、LFD缓冲液、阴性对照和阳性对照。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其中，所述Primer B的5’端使用生物素Biotin标记，可选地，Primer B为：
(Biotin)-atctccgtccagtcgtttatcttcactagc。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其中，所述探针的5’端使用羧基荧光素FAM标记，可选地，所述探针为：
5’FAM-acgcagccccgctggagctactatgacagct/THF/tagcgccgtcagcgag/C3-spacer/-3’。
7.根据权利要求2或4所述的试剂盒，其中，所述RPA冻干颗粒包括噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、和dNTPs；
可选地，所述RPA反应缓冲液为Rehydration Buffer。
8.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其中，所述阴性对照为双蒸水；
所述阳性对照为II型单纯疱疹病毒基因组DNA。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒含有：
1)RPA冻干颗粒；
所述RPA冻干颗粒包括噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、和dNTPs；
2)RPA反应缓冲液；
所述RPA反应缓冲液为Rehydration Buffer；
3)醋酸镁；
4)RPA反应引物：
Primer A：gttatggaatacaccgagtgcccctacaac；
Primer B：(Biotin)-atctccgtccagtcgtttatcttcactagc；
4)RPA反应探针：
5’FAM
-acgcagccccgctggagctactatgacagct(THF)tagcgccgtcagcgag/C3-spacer/-3’；
5)LFD试纸及LFD缓冲液；
6)阴性对照；
所述阴性对照为双蒸水；
7)阳性对照；
所述阳性对照为II型单纯疱疹病毒基因组DNA。
10.一种利用基于RPA-LFD的II型单纯疱疹病毒的检测试剂盒检测II型单纯疱疹病毒核酸的方法，包括以下步骤：
(1)在RPA冻干颗粒中加入29.5μL Rehydration Buffer，2.1μL 10μM Primer A，2.1μL10μM Primer B，0.6μL 10μM探针，10.7μL双蒸水，2.5μL模板，得到溶液；在反应管盖上加醋酸镁2.5μL，盖严管盖并离心使醋酸镁与所述溶液混合，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离心，放置于38℃水浴箱内进行扩增反应，15min后取出10μL扩增液与100μL LFD缓冲液混合，得到混合液；将侧流层析检测试纸条(LFD)样品浸入混合液中，室温放置5min后观测条带显色判定结果；
(2)结果判定：含有II型单纯疱疹病毒模板的试纸条检测线及质控线均出现条带，阴性对照仅有质控线出现条带；
这里，所述RPA冻干颗粒包括噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、dNTPs；
所述Primer A的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
所述Primer B的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；可选地，所述Primer B的5’端使用生物素Biotin标记，即Primer B为：
(Biotin)-atctccgtccagtcgtttatcttcactagc；
所述RPA反应探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，可选地，所述探针的5’端使用羧基荧光素FAM标记；可选地，所述探针为：
5’FAM
-acgcagccccgctggagctactatgacagct(THF)tagcgccgtcagcgag/C3-spacer/-3’。
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