CN115747379A - 单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 - Google Patents
单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115747379A CN115747379A CN202211554925.1A CN202211554925A CN115747379A CN 115747379 A CN115747379 A CN 115747379A CN 202211554925 A CN202211554925 A CN 202211554925A CN 115747379 A CN115747379 A CN 115747379A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hsv
- detection
- seq
- primer
- nucleotide sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物医学检测技术领域。本发明提供的试剂盒包括针对HSV‑1和HSV‑2的核酸提取液、检测液a、检测液b和SAT酶液，通过优化设计更适合于HSV‑1和HSV‑2检测的引物和探针，并在检测过程中分步添加各组分进行分步反应可以实现对HSV‑1和HSV‑2的实时、快速、准确检测，并且灵敏度高、特异性好，扩增产物RNA易降解不会引起环境污染，且在检测过程中不会引起样本交叉污染。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，特别是涉及使用特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification andTest，SAT)结合的单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。
背景技术
单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是一类严重危害人类健康、引起皮肤病和性病的病毒性病原体，是引起生殖器疱疹最常见的原因，人是其唯一的自然宿主，人群感染高达80-90％，10％无症状。根据抗原性不同，可将HSV分为HSV-1型和HSV-2型。HSV-1主要引起腰以上部位(如眼、口、唇的皮肤黏膜)以及中枢神经***的感染，一般通过口腔及污染的手及飞沫感染，感染多见于儿童，常引起口腔齿龈和口腔炎，多为隐性感染，并不表现出症状。HSV-2主要引起生殖器部位的皮肤黏膜及新生儿感染，引起生殖器疱疹，发作时生殖器周围出现疼痛性皮肤疱疹损害，并容易复发。由于许多HSV感染者缺乏典型的临床表现(比如出现自限性、复发性、疼痛性的水疱或溃疡性皮疹)，且HSV感染者的预后取决于所感染的HSV类型(HSV-1或HSV-2)，因此对HSV的分型诊断具有重要的临床和流行病学意义。
目前，对HSV进行检测的方法主要包括实时荧光PCR技术，例如专利文献CN101979667A(以下称文献1)公开一种同步检测单纯疱疹病毒I型和II型的荧光定量PCR试剂盒，其包括分别用于检测HSV-1和HSV-2的引物和探针，能够同步高特异性和高灵敏度(10copies/50μL)检出体系中的HSV-1和HSV-2。又如专利文献CN112063749A(以下称文献2)公开一种用于鉴定单纯疱疹病毒的引物探针组合以及荧光定量PCR试剂盒，其包括分别用于检测HSV-1和HSV-2的引物和探针，能够高灵敏度(最低拷贝数为100copies/μL)、高特异性和高效率检出体系中的HSV-1和HSV-2。然而，上述文献1和文献2公开的方法均基于荧光PCR的基本原理，其在PCR反应过程中需要温度的升降和循环，因此所需检测时间较长(一般需要2-3小时)，效率较低；另外，PCR的反应产物为DNA，不易降解，容易导致样本交叉污染和实验环境的污染。
虽然本领域已存在基于核酸恒温扩增检测技术的单纯疱疹病毒的检测方法，例如专利文献CN105624329A(以下称文献3)公开一种单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其基于荧光核酸恒温扩增检测原理可实现对单纯疱疹病毒1型的高特异性和高灵敏度检测。又如专利文献CN110923362A(以下称文献4)公开一种用于同时检测单纯疱疹病毒I型/II型胶体金层析试剂盒，其联合RNA恒温扩增技术和金探针层析技术实现对单纯疱疹病毒I型/II型核酸的高特异性和高灵敏度(对HSVI的最低检测限为8.0TCID50/mL，对HSVII的最低检测限为6.4TCID50/mL)检测。然而，上述文献3公开的方法只能检测HSV-1，而不能同时检测HSV-2并分型；上述文献4公开的方法存在以下缺陷：(1)在RNA恒温扩增之后和层析检测之前，需要将RNA恒温扩增产物取出与包含探针的检测液预杂交混合，这一过程极易造成不同检测样本之间的交叉污染；(2)RNA恒温扩增之后的操作均需要人工操作，更容易造成人为操作失误，且效率较低；(3)该文献4公开的检测方法为终点检测法，只能定性获得RNA恒温扩增完成之后的检测结果，而不能实时反映RNA恒温扩增的状态。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其包括：
(1)核酸提取液：其包含含有捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针用于捕获检测序列，包括用于捕获HSV-1的检测序列的TCO-11和用于捕获HSV-2的检测序列的TCO-21，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合，包括用于与HSV-1的靶标序列特异性结合的HSV-1-F1和用于与HSV-2的靶标序列特异性结合的HSV-2-F1；
(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列，其中所述第二引物包括与所述HSV-1-F1配合的HSV-1-R1和与所述HSV-2-F1配合的HSV-2-R1；
(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合，其中所述靶标检测探针包括针对HSV-1的HSV-1-P1和针对HSV-2的HSV-2-P1，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团；
(4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
其中：
所述TCO-11包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，所述TCO-21包含如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
所述HSV-1-F1包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述HSV-2-F1包含SEQ IDNO:9所示的核苷酸序列；
所述HSV-1-R1包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述HSV-2-R1包含SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列；
所述HSV-1-P1包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述HSV-2-P1包含SEQ IDNO:11所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述固相支持物为磁性颗粒。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：
(5)洗涤液：其含有NaCl和SDS；和/或
(6)矿物油；和/或
(7)阳性对照：含有单纯疱疹病毒1型和2型核酸的体系；和/或
(8)阴性对照：不含有单纯疱疹病毒1型和2型核酸的体系。
在一些实施方式中，所述核酸提取液的组分包括：250-800mM HEPES、4-10％十二烷基硫酸锂、1-50μΜ的TCO-11、1-50μΜ的TCO-21、50-500mg/L磁珠、25-150pmol/mL的HSV-1-F1、25-150pmol/mL的HSV-2-F1。
在一些实施方式中，所述检测液a的组分包括：10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mMMgCl2、1-20mM NTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％PVP40、250-750pmol/mL的HSV-1-R1、250-750pmol/mL的HSV-2-R1。
在一些实施方式中，所述检测液b的组分包括：10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mMMgCl2、1-20mM NTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％PVP40、143-857pmol/mL的HSV-1-F1、143-857pmol/mL的HSV-2-F1、143-857pmol/mL的HSV-1-P1、143-857pmol/mL的HSV-2-P1。
在一些实施方式中，所述SAT酶液的组分包括：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
在一些实施方式中，所述洗涤液的组分包括：5-50mM HEPES、50-500mM NaCl、0.5-1.5％SDS、1-10mM EDTA。
在一些实施方式中，所述阳性对照为体外转录的单纯疱疹病毒1型和2型US4基因mRNA的稀释物。
本发明另一方面提供一种单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测的引物和探针组合，其包括：
(i)核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15所示的捕获探针TCO-11、和核苷酸序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的捕获探针TCO-21；
(ii)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一引物HSV-1-F1、和核苷酸序列如SEQIDNO:9所示的第一引物HSV-2-F1；
(iii)核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二引物HSV-1-R1、和核苷酸序列如SEQIDNO:10所示的第二引物HSV-2-R1；和
(iv)核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的靶标检测探针HSV-1-P1、和核苷酸序列如SEQID NO:11所示的靶标检测探针HSV-2-P1。
本发明再一方面提供一种同时检测单纯疱疹病毒1型和2型核酸的非疾病诊断方法，其使用上述的试剂盒，包括以下步骤：
1)向试样中加入核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；
2)向所述分析检测样品中加入检测液a进行第一步反应，获得第一步反应液；
3)向所述第一步反应液中加入SAT酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；
4)向所述第二步反应液中加入检测液b进行第三步反应，并进行实时荧光检测获得实时荧光检测的dt值；
5)根据步骤4)获得的实时荧光检测的dt值进行结果判定：
若针对HSV-1的dt≤35，则试样中含有HSV-1；
若针对HSV-2的dt≤35，则试样中含有HSV-2。
在一些实施方式中，步骤2)中所述第一步反应的条件为40℃-45℃保温3-15min。
在一些实施方式中，步骤3)中所述SAT酶液使用前事先预热，预热温度为40-45℃。
在一些实施方式中，步骤3)中所述第二步反应的条件为40℃-45℃反应3-15min。
在一些实施方式中，步骤4)中所述第三步反应的条件为40℃-45℃反应30-60min。
在一些实施方式中，所述试样包括医学样本和来源包括物体表面附着物、饮用水、食品、血液制品、乳制品、唾液的非医学样本。
基于以上技术方案提供的单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中包括针对HSV-1和HSV-2的核酸提取液、检测液a、检测液b和SAT酶液等，其中在核酸提取液中可包含用于结合HSV-1和HSV-2的检测序列的捕获探针和用于与HSV-1和HSV-2的靶标序列特异性结合的第一引物，在检测液a中可含有第二引物，在检测液b中可含有第一引物、靶标检测探针等，SAT酶液则含有反应过程中所需要的RNA聚合酶和反转录酶等。本发明根据单纯疱疹病毒1型和2型的US4基因优化设计获得更适合于单纯疱疹病毒1型和2型检测的引物和探针，并在使用过程中通过分步添加上述反应液分步反应，可以避免不同引物、探针之间的相互干扰，体系反应较为简单，并保留实时荧光核酸恒温扩增检测技术的高特异性优点，还可以实现对HSV-1和HSV-2的高灵敏度检测。本发明除用于医学研究对HSV-1和HSV-2进行同时检测与分型，还可以用于对非医学样本，例如物体表面附着物、唾液等环境样本，以及血液制品、乳制品、饮用水、食品等样本中的HSV-1和HSV-2进行同时检测，适合大范围推广使用。
与现有的检测方法相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明试剂盒中引物和探针组根据单纯疱疹病毒1型和2型的US4基因进行优化设计获得，在检测过程中通过分步添加不同的组分进而实现更高的灵敏度检测。实施例结果表明，本发明提供的试剂盒和方法对HSV-1和HSV-2检测的浓度最低限均至少可达100copies/mL，明显高于上述文献1(10copies/50μL，即200copies/mL)和文献2(最低拷贝数为100copies/μL(即100000copies/mL))中检测HSV-1和HSV-2的灵敏度，也明显高于上述文献4中对HSV-2的检测灵敏度(最低检测限为6.4TCID50/mL，相当于约1000copies/mL)，因此本发明提供的试剂盒和方法能够满足更高灵敏度的要求。
(2)本发明采用实时荧光核酸恒温扩增检测技术对HSV-1和HSV-2进行检测，其实验步骤和反应体系更加简单，相对于上述文献4公开的方法易于实现自动化，且减少了人员操作的带来的失误，以及减少了操作人员感染的风险。
(3)本发明方法在RNA恒温扩增过程中以及RNA恒温扩增完成后无开盖操作，因此区别上述文献4而不会导致样本之间的交叉污染，且本发明方法可实时监控RNA恒温扩增的过程，相对于上述文献4公开的终点检测法，检测结果更加直观、可靠，并能够定量反映检测样本中的靶标核酸。
(4)本发明将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有温度的升降及循环，因而相对于上述文献1和文献2公开的方法检测所需时间大大缩短，同时降低了对所用PCR仪的设计和生产成本。
(5)本发明扩增产物为RNA，RNA在自然界中极易降解，相对上述文献1和文献2中PCR扩增DNA而言，污染易控，交叉影响小，不会引起环境污染。
附图说明
图1为实施例1中HSV-1-1单独检测HSV-1的系列稀释的阳性标准品的扩增曲线(A)和HSV-2-1单独检测HSV-2的系列稀释的阳性标准品的扩增曲线(B)。
图2为实施例1中组1-4的引物和探针分别对含有系列稀释的HSV-1和HSV-2阳性标准品的双重检测体系进行实时荧光核酸恒温扩增检测的曲线，其中A-B幅表示组1的引物和探针分别对HSV-1和HSV-2的扩增曲线，C-D幅表示组2的引物和探针分别对HSV-1和HSV-2的扩增曲线，E-F幅表示组3的引物和探针分别对HSV-1和HSV-2的扩增曲线，G-H幅表示组4的引物和探针分别对HSV-1和HSV-2的扩增曲线。
图3为实施例1中组5-8的引物和探针分别对含有系列稀释的HSV-1和HSV-2阳性标准品的双重检测体系进行实时荧光核酸恒温扩增检测的曲线，其中A-B幅表示组5的引物和探针分别对HSV-1和HSV-2的扩增曲线，C-D幅表示组6的引物和探针分别对HSV-1和HSV-2的扩增曲线，E-F幅表示组7的引物和探针分别对HSV-1和HSV-2的扩增曲线，G-H幅表示组8的引物和探针分别对HSV-1和HSV-2的扩增曲线。
图4为组1的引物探针组合对10份待测样本进行检测的扩增曲线，其中A幅表示HSV-2阳性样本的扩增曲线，B幅表示HSV-1阳性样本的扩增曲线。
图5为本发明方法的特异性检测曲线，其中A幅表示特异性检测HSV-1的扩增曲线，B幅表示特异性检测HSV-2的扩增曲线。
具体实施方式
针对现有技术中存在的单纯疱疹病毒检测方法的缺陷，本发明利用核酸恒温同步放大检测的方法同时检测单纯疱疹病毒1型和2型并能进行分型，还提供了用于单纯疱疹病毒检测的核酸恒温同步放大检测试剂盒及其专用引物和探针以及检测方法。
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明提及的所有引物、捕获探针、荧光探针和体外转录RNA产物用已有技术合成。
实施例1：用于实时荧光核酸恒温扩增检测单纯疱疹病毒1型和2型的专用引物和探针的设计
本发明人根据Genbank数据库已公开的单纯疱疹病毒核酸序列，从单纯疱疹病毒(1型和2型)US4基因(其中：HSV-1US4基因genbank序列号为3239065，HSV-2US4基因genbank序列号为1487356)上一段高度保守且与其他相似病原体有较大差异的序列入手确定检测序列，按照引物和探针设计原则进行有针对性的引物和探针设计，以使其能在同时对单纯疱疹病毒1型和2型进行实时荧光核酸恒温扩增检测中有效应用。
1.1、单独检测单纯疱疹病毒1型和2型的引物和探针的设计和筛选
分别针对单纯疱疹病毒1型和2型均设计了多组引物和探针，并利用这些引物和探针组分别对单纯疱疹病毒1型和2型的系列稀释的阳性标准品(浓度分别为106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL，以下详述)和阴性对照(不含单纯疱疹病毒1型和2型核酸的体系，例如去离子水)进行实时荧光核酸恒温扩增检测(具体检测方法可参见以下实施例2)，从中筛选出分别针对单纯疱疹病毒1型和2型检测的灵敏度较高的引物和探针组合，下表1示出了分别针对单纯疱疹病毒1型和2型检测的各两组引物和探针作为示例，下表2则示出了表1所示的引物和探针组合分别检测单纯疱疹病毒1型和2型的系列稀释的阳性标准品的结果(以开始出现“S”型扩增曲线的循环数表示)。
该实施例中阳性标准品的制备方式包括以下步骤：
(1)用化学合成法合成一段单纯疱疹病毒(HSV-1或HSV-2)US4 mRNA基因片段，构建到含有T7启动子序列的常用质粒载体上；
(2)用商品化T7启动子体外转录试剂盒转录出RNA片段，纯化后，通过紫外计算RNA拷贝数，作为阳性对照，对该阳性对照进行10倍倍比稀释，得到系列稀释的阳性标准品。
表1：分别针对单纯疱疹病毒1型和2型检测的各两组引物和探针信息
表2：表1所示的引物和探针组合分别检测单纯疱疹病毒1型和2型的结果(dt值)
由上表2所示的各组引物探针分别对单纯疱疹病毒1型和2型进行单独检测的灵敏度结果可知，HSV-1-1和HSV-1-2单独检测单纯疱疹病毒1型时均至少能检测至浓度为102copies/mL的阳性标准品，且两者开始出现“S”型扩增曲线的循环数基本一致，如图1中A幅所示，示例性示出了HSV-1-1单独检测单纯疱疹病毒1型的系列稀释的阳性标准品的扩增曲线。HSV-2-1和HSV-2-2单独检测单纯疱疹病毒2型时也均至少能检测至浓度为102copies/mL的阳性标准品，且两者开始出现“S”型扩增曲线的循环数也基本一致，如图1中B幅所示，示例性示出了HSV-2-1单独检测单纯疱疹病毒2型的系列稀释的阳性标准品的扩增曲线。因此，HSV-1-1和HSV-1-2均能单独用于高灵敏度检测HSV-1，HSV-2-1和HSV-2-2均能单独用于高灵敏度检测HSV-2。
1.2、单纯疱疹病毒1型和2型的双重实时荧光核酸恒温扩增检测的引物和探针组合的确定
将上述步骤1.1中确定的能单独用于高灵敏度检测单纯疱疹病毒1型的引物探针组合(HSV-1-1和HSV-1-2)与能单独用于高灵敏度检测单纯疱疹病毒2型的引物探针组合(HSV-2-1和HSV-2-2)进行双重组合(如下表3所示，共4个双重组合：组1-4)，利用这些引物探针的双重组合分别对含有系列稀释的HSV-1和HSV-2阳性标准品(浓度为别为：106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL)的双重检测体系进行实时荧光核酸恒温扩增检测(具体检测方法参见以下实施例2)，以从中确定能够用于高灵敏度检测单纯疱疹病毒1型和2型的最优组合，结果如图2中A-H幅所示，其中为了清楚考虑，将双重检测体系中的单纯疱疹病毒1型和2型的扩增曲线分开示出，A幅表示组1的引物探针检测HSV-1的扩增曲线，B幅表示组1的引物探针检测HSV-2的扩增曲线，C幅表示组2的引物探针检测HSV-1的扩增曲线，D幅表示组2的引物探针检测HSV-2的扩增曲线，E幅表示组3的引物探针检测HSV-1的扩增曲线，F幅表示组3的引物探针检测HSV-2的扩增曲线，G幅表示组4的引物探针检测HSV-1的扩增曲线，H幅表示组4的引物探针检测HSV-2的扩增曲线。由图2可见，组1的引物探针双重检测HSV-1和HSV-2时，均可检测至102copies/mL；组2的引物探针双重检测HSV-1和HSV-2时，仅可检测至103copies/mL；组3的引物探针双重检测HSV-1和HSV-2时，仅可检测至103copies/mL；组4的引物探针双重检测HSV-1和HSV-2时，针对HSV-1可检测至102copies/mL，针对HSV-2仅可检测至103copies/mL。由此可证明即便HSV-1-1和HSV-1-2均能单独用于高灵敏度检测HSV-1，以及HSV-2-1和HSV-2-2均能单独用于高灵敏度检测HSV-2，但是在检测同时含有HSV-1和HSV-2的双重体系时，这些引物探针的组合不一定仍具有较高的检测灵敏度。因此，相对于组2-4中的引物和探针，组1中的引物和探针更适合用于高灵敏度双重检测HSV-1和HSV-2，对两者的最低检测限均至少可达102copies/mL，可确定组1中的引物和探针的组合为对HSV-1和HSV-2进行双重实时荧光核酸恒温扩增检测的最优组合。
表3：单纯疱疹病毒1型和2型的双重实时荧光核酸恒温扩增检测引物探针组合
| 双重组合编号 | 引物探针的双重组合方式 |
| 组1 | HSV-1-1+HSV-2-1 |
| 组2 | HSV-1-2+HSV-2-1 |
| 组3 | HSV-1-2+HSV-2-2 |
| 组4 | HSV-1-1+HSV-2-2 |
1.3、单纯疱疹病毒1型和2型的双重实时荧光核酸恒温扩增检测的捕获探针的确定
为了确定特异性的寡核苷酸捕获探针(target capture oligo，TCO)是否会影响单纯疱疹病毒1型和2型的双重实时荧光核酸恒温扩增检测的灵敏度，该实施例中还分别针对HSV-1和HSV-2设计了多条捕获探针，如下表4中所示，针对HSV-1和HSV-2，各列出了其中的2条捕获探针。将这些捕获探针分别与用于检测单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测引物和靶标检测探针组合(如下表5所示，共4个组合：组5-8)，利用这些组合(组5-8)分别对含有系列稀释的阳性标准品(浓度为别为：106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL)的单纯疱疹病毒1型和2型的双重检测体系进行实时荧光核酸恒温扩增检测(具体检测方法参见以下实施例2)，以从中确定能够用于高灵敏度检测单纯疱疹病毒1型和2型的最优组合，结果如图3中A-H幅所示，其中为了清楚考虑，将双重检测体系中的单纯疱疹病毒1型和2型的扩增曲线分开示出，A幅表示组5的引物探针检测HSV-1的扩增曲线，B幅表示组5的引物探针检测HSV-2的扩增曲线，C幅表示组6的引物探针检测HSV-1的扩增曲线，D幅表示组6的引物探针检测HSV-2的扩增曲线，E幅表示组7的引物探针检测HSV-1的扩增曲线，F幅表示组7的引物探针检测HSV-2的扩增曲线，G幅表示组8的引物探针检测HSV-1的扩增曲线，H幅表示组8的引物探针检测HSV-2的扩增曲线。由图3可见，组5的引物探针双重检测HSV-1和HSV-2时，均可检测至102copies/mL，且在该浓度下开始出现“S”型扩增曲线时的循环数最大仅约为18(图3中B幅)；组6的引物探针双重检测HSV-1和HSV-2时，也均可检测至102copies/mL，但在该浓度下开始出现“S”型扩增曲线时的循环数最小约为22.5(图3中C幅)；组7的引物探针双重检测HSV-1和HSV-2时，也均可检测至102copies/mL但在该浓度下开始出现“S”型扩增曲线时的循环数最小约为24.5(图3中E幅)；组8的引物探针双重检测HSV-1和HSV-2时，也均可检测至102copies/mL，但在该浓度下开始出现“S”型扩增曲线时的循环数最小约为21.0(图3中H幅)。由此可见特异性的寡核苷酸捕获探针也会影响单纯疱疹病毒1型和2型的双重实时荧光核酸恒温扩增检测的灵敏度，虽然组5-8中的捕获探针均可以用于高灵敏度双重检测HSV-1和HSV-2，但相对于组6-8中的捕获探针，可确定组5中的捕获探针更适合用于高灵敏度双重检测HSV-1和HSV-2。
表4：单纯疱疹病毒1型和2型的双重实时荧光核酸恒温扩增检测的捕获探针信息
表5：双重检测HSV-1和HSV-2的捕获探针与引物和靶标检测探针的组合
综上1.1-1.3的结果，可确定组1的引物探针组合(与组5的引物探针组合相同)作为本发明对单纯疱疹病毒1型和2型进行双重实时荧光核酸恒温扩增检测的最优引物和探针组合，该组合对HSV-1和HSV-2进行双重实时荧光核酸恒温扩增检测时，对两者的最低检测限均至少可达102copies/mL。以下实施例中均使用组1的引物探针组合。
实施例2：实时荧光核酸恒温扩增检测单纯疱疹病毒1型和2型的方法
该实施例方法基于RNA恒温同步放大检测原理检测单纯疱疹病毒1型和2型的mRNA，可对从受试者获取的生殖道拭子样本中是否含有单纯疱疹病毒核酸进行检测，具体操作步骤如下所述。
2.1、生殖道拭子样本采集与处理要求
1)适用样本类型：男性泌尿道、女性生殖道分泌物样本。
2)样本采集：要求受试者在采样前2个小时不能排尿、采样前24小时禁止性生活。
男性泌尿道：用无菌拭子深入尿道2-3cm，旋转3-5秒后取出，放回管中密闭送检。
女性生殖道：先用无菌生理盐水擦去***内过多的分泌物，再将无菌拭子放于生殖道低位1/3处轻轻旋转取得粘膜分泌物标本，放回管中密闭送检。
3)样本处理：
方案1、使用无菌生理盐水充分洗涤采样后的拭子，制备细菌悬液；取不少于300μL的所得细菌悬液于1.5mL离心管或样本管中，混入等体积样本保存液1(沪浦械备20150012)，充分混匀后即为待测样本。
方案2、使用不少于600μL的样本保存液2(沪浦械备20210018)充分洗涤采样后的拭子，洗涤所得即为待测样本。
4)样本保存：
上述步骤2)中采集的拭子样本，可在2-8℃保存3天，-20℃保存4个月，-70℃保存12个月。
上述步骤3)处理后的待测样本，若为生理盐水的细菌悬液，可在2-8℃保存3天，-20℃保存4个月，-70℃保存12个月，冻融不超过三次。若为已经加入样本保存液1或直接洗涤于样本保存液2的样本可在2-8℃保存3天，未能在24h检测的样本可以置于-20℃保存不超过6个月，冻融不超过三次。冷冻/冷藏样本检测前应将温度平衡至室温(18-30℃)。
2.2、样品准备
取250μL含有单纯疱疹病毒1型和2型阳性对照(实施例1中制备)的体系(体系中HSV-1和HSV-2阳性对照的浓度均为105copies/mL)、250μL阴性对照和250μL待测样本1-10(上述步骤2.1中方案1或方案2获得)分别置于样品处理管中备用；
2.3、核酸提取
(1)在各样品处理管中分别加入100μL-800μL核酸提取液(HEPES 500mM、LLS 8％、捕获探针TCO-11 15μΜ、捕获探针TCO-21 15μΜ、磁珠150mg/L、HSV-1-F1浓度为100pmol/mL、HSV-2-F1浓度为100pmol/mL)，混匀，60℃保温10分钟，室温放置5-10分钟；
(2)将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置2-5分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液(HEPES 25mM、NaCl150mM、1％SDS、EDTA2.5mM)振荡均匀后静置2-5分钟，弃液体，保留磁珠，然后加入800μL洗涤液和150μL矿物油，振荡均匀后静置2-5分钟，弃液体，保留磁珠；
(3)将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用。
2.4、SAT扩增检测
(1)向样品处理管中各加入40μL检测液a(Tris 15mM、MgCl2 15mM、dNTP 2.5mM、NTP 3mM、PVP40 1％、KCl 10mM、HSV-1-R1浓度为500pmol/mL、HSV-2-R1浓度为500pmol/mL)振荡重悬磁珠；
(2)取振荡混匀的上述40μL反应检测液a加至洁净微量反应管，向每个反应管中加入50μL矿物油，42℃5-10min。向微量反应管中加入25μL SAT酶液(事先42℃条件下预热，含有M-MLV反转录酶60000U/mL、T7 RNA聚合酶40000U/mL、10mM HEPES pH7.5、15mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mM zinc acetate(乙酸锌)、20mMtrehalose(海藻糖)、100mM Tris-HCl pH 8.0、80mM KCl、0.25mM EDTA、0.5％(v/v)TritonX-100和30％(v/v)glycerol(丙三醇))，42℃5-10min；
(3)向微量反应管中加入35μL的检测液b(Tris 15mM、MgCl2 15mM、dNTP 2.5mM、NTP 3mM、PVP40 1％、KCl 10mM、HSV-1-F1浓度为429pmol/mL、HSV-2-F1浓度为429pmol/mL、HSV-1-P1浓度为429pmol/mL、HSV-2-P1浓度为429pmol/mL)，将反应管快速转至恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次(即相当于40个循环)；荧光素通道选择FAM、CY5通道。
2.5、结果判定
根据SAT扩增结果得到的曲线，设定阀值线(以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点)，由软件自动读取dt值(表示待测样本曲线与阈值线交点对应的横坐标读数(循环数))，判定结果。
结果判定标准为：
CY5通道dt≤35，则待测样本为HSV-1阳性，即待测样本中含有HSV-1；
CY5通道dt>35，则待测样本为HSV-1阴性，即待测样本中不含有HSV-1；
FAM通道dt≤35，则待测样本为HSV-2阳性，即待测样本中含有HSV-2；
FAM通道dt>35，则待测样本为HSV-2阴性，即待测样本中不含有HSV-2。
利用上述方法分别对10份单纯疱疹病毒1/2型生殖道拭子样本(样本保存液基质，下表6中所示的样本1-10，其中样本4和6采自临床确认感染HSV-1的受试者，其他样本采自临床确认感染HSV-2的受试者)进行实时荧光核酸恒温扩增检测的结果如图4和下表6所示，其中图4中A幅表示阳性结果为含有HSV-2的样本的扩增曲线，B幅表示阳性结果为含有HSV-1的扩增曲线。
由图4和表6所示的结果可知，在10份单纯疱疹病毒1/2型生殖道拭子样本中，样本4和6中含有HSV-1，即所对应的受试者感染HSV-1；样本1-3、5、7-10中含有HSV-2，即所对应的受试者感染HSV-2。检测结果与样本的实际情况相吻合，且阴阳性对照检测结果正常，证明本方法有效。
表6：10份单纯疱疹病毒拭子样本实时荧光核酸恒温扩增检测结果
| 拭子样本编号 | HSV-1 | HSV-2 |
| 样本1 | 阴性 | 阳性 |
| 样本2 | 阴性 | 阳性 |
| 样本3 | 阴性 | 阳性 |
| 样本4 | 阳性 | 阴性 |
| 样本5 | 阴性 | 阳性 |
| 样本6 | 阳性 | 阴性 |
| 样本7 | 阴性 | 阳性 |
| 样本8 | 阴性 | 阳性 |
| 样本9 | 阴性 | 阳性 |
| 样本10 | 阴性 | 阳性 |
| 阳性对照 | 阳性 | 阳性 |
| 阴性对照 | 阴性 | 阴性 |
从该实施例结果可以看出：
(1)该检测将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有温度的升降及循环，在RNA恒温扩增过程中以及RNA恒温扩增完成后无开盖操作，因此不会导致样本之间的交叉污染。
(2)检测中分步添加反应液(特别是检测液a、检测液b和SAT酶液)实现分步反应，避免了不同引物、探针之间的相互干扰使体系反应较为单纯，一次检测过程能实现对HSV-1和HSV-2的同时检测，并能依据检测结果(两病毒为阴性或阳性)对样本感染的病毒进行分型。
(3)检测灵敏度高：结合实施例1的结果可知，该检测对HSV-1和HSV-2检测的浓度最低限均至少可达100copies/mL，明显低于文献1的10copies/50μL(即200copies/mL)和文献2的最低拷贝数100copies/μL(即100000copies/mL)，也明显低于文献4中对HSV-2的最低检测限6.4TCID50/mL(相当于约1000copies/mL)。
参照本实施例，用同样方法(特别是步骤2.2-2.5)可以对其他医学样本(如疱疹液等)进行检测，还可以对非医学样本，例如河水、海水、污水、物体表面附着物(检测前先制成水样)、气溶胶等环境样本，以及饮用水、食品(检测前先制成水样)等样本中的单纯疱疹病毒1型和2型进行检测。
实施例3：实时荧光核酸恒温扩增检测单纯疱疹病毒1型和2型方法的特异性
为了进一步验证本发明方法的检测特异性，以与单纯疱疹病毒相似的病原体如带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、HHV-6、HHV-7和HHV-8等作为待测样本，与实施例2中含有单纯疱疹病毒1型和2型阳性对照的体系(体系中HSV-1和HSV-2阳性对照的浓度均为105copies/mL)一起按照上述实施例2的方法进行实时荧光核酸恒温扩增检测，检测结果如图5所示，其中A幅表示含有阳性对照的体系中HSV-1的扩增曲线，B幅表示含有阳性对照的体系中HSV-2的扩增曲线。
由图5所示的结果，可见本发明的方法仅能检出HSV-1和HSV-2的mRNA，而其他病原体均未检出，可见本发明方法不受其他病原体的影响，具有良好的检测特异性。
实施例4：单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
该实施例提供的用于单纯疱疹病毒1型和2型检测的试剂盒是基于RNA核酸恒温同步放大检测原理检测单纯疱疹病毒的试剂盒，具体包括以下组分：
(1)核酸提取液：用于提取和纯化样本中的单纯疱疹病毒1型和/或2型核酸，其包含250-800mM HEPES、4-10％十二烷基硫酸锂(LLS)、1-50μΜ的捕获探针TCO-11、1-50μΜ的捕获探针TCO-21、50-500mg/L磁珠、25-150pmol/mL的HSV-1-F1、25-150pmol/mL的HSV-2-F1；
(2)检测液a：其包含10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mM MgCl2、1-20mM NTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％PVP40、250-750pmol/mL的HSV-1-R1、250-750pmol/mL的HSV-2-R1；
(3)检测液b：其包含10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mM MgCl2、1-20mM NTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％PVP40、143-857pmol/mL的HSV-1-F1、143-857pmol/mL的HSV-2-F1、143-857pmol/mL的HSV-1-P1、143-857pmol/mL的HSV-2-P1；
(4)SAT酶液：其主要含16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶和8000-80000U/mL的RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)，具体含16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰基-L-半胱氨酸)、0.04-0.4mM zinc acetate(乙酸锌)、10-100mM trehalose(海藻糖)、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol(甘油)。
为了方便检测，该实施例提供的试剂盒还包含以下组分：
(5)洗涤液：用于磁珠水相清洗，其配方为HEPES 5-50mM、NaCl 50-500mM、1％SDS、EDTA 1-10mM；
(6)矿物油：用于磁珠有机相清洗的矿物油；
(7)阳性对照；可以为体外转录单纯疱疹病毒1型和2型US4基因mRNA的稀释物(实施例1中制备(浓度均可以为106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL等))；
(8)阴性对照：不含单纯疱疹病毒核酸的体系，例如去离子水或样本保存液(其含有高浓度去垢剂和生理盐水)。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何等同替换、改进等，均应属于本发明公开的内容。
Claims (10)
1.一种单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括：
(1)核酸提取液：其包含含有捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针用于捕获检测序列，包括用于捕获HSV-1的检测序列的TCO-11和用于捕获HSV-2的检测序列的TCO-21，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合，包括用于与HSV-1的靶标序列特异性结合的HSV-1-F1和用于与HSV-2的靶标序列特异性结合的HSV-2-F1；
(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列，其中所述第二引物包括与所述HSV-1-F1配合的HSV-1-R1和与所述HSV-2-F1配合的HSV-2-R1；
(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合，其中所述靶标检测探针包括针对HSV-1的HSV-1-P1和针对HSV-2的HSV-2-P1，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团；
(4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
其中：
所述TCO-11包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，所述TCO-21包含如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
所述HSV-1-F1包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述HSV-2-F1包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
所述HSV-1-R1包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述HSV-2-R1包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
所述HSV-1-P1包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述HSV-2-P1包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相支持物为磁性颗粒。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
(5)洗涤液：其含有NaCl和SDS；和/或
(6)矿物油；和/或
(7)阳性对照：含有单纯疱疹病毒1型和2型核酸的体系；和/或
(8)阴性对照：不含有单纯疱疹病毒1型和2型核酸的体系。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，
所述核酸提取液的组分包括：250-800mM HEPES、4-10％十二烷基硫酸锂、1-50μΜ的TCO-11、1-50μΜ的TCO-21、50-500mg/L磁珠、25-150pmol/mL的HSV-1-F1、25-150pmol/mL的HSV-2-F1；
所述检测液a的组分包括：10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mM MgCl2、1-20mM NTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％PVP40、250-750pmol/mL的HSV-1-R1、250-750pmol/mL的HSV-2-R1；
所述检测液b的组分包括：10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mM MgCl2、1-20mMNTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％PVP40、143-857pmol/mL的HSV-1-F1、143-857pmol/mL的HSV-2-F1、143-857pmol/mL的HSV-1-P1、143-857pmol/mL的HSV-2-P1；
所述SAT酶液的组分包括：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，
所述洗涤液的组分包括：5-50mM HEPES、50-500mM NaCl、0.5-1.5％SDS、1-10mMEDTA；和/或
所述阳性对照为体外转录的单纯疱疹病毒1型和2型US4基因mRNA的稀释物。
6.一种单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测的引物和探针组合，其包括：
(i)核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15所示的捕获探针TCO-11、和核苷酸序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的捕获探针TCO-21；
(ii)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一引物HSV-1-F1、和核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示的第一引物HSV-2-F1；
(iii)核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二引物HSV-1-R1、和核苷酸序列如SEQIDNO:10所示的第二引物HSV-2-R1；和
(iv)核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的靶标检测探针HSV-1-P1、和核苷酸序列如SEQIDNO:11所示的靶标检测探针HSV-2-P1。
7.一种同时检测单纯疱疹病毒1型和2型核酸的非疾病诊断方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：
1)向试样中加入核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；
2)向所述分析检测样品中加入检测液a进行第一步反应，获得第一步反应液；
3)向所述第一步反应液中加入SAT酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；
4)向所述第二步反应液中加入检测液b进行第三步反应，并进行实时荧光检测获得实时荧光检测的dt值；
5)根据步骤4)获得的实时荧光检测的dt值进行结果判定：
若针对HSV-1的dt≤35，则试样中含有HSV-1；
若针对HSV-2的dt≤35，则试样中含有HSV-2。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述第一步反应的条件为40℃-45℃保温3-15min；和/或
步骤3)中所述SAT酶液使用前事先预热，预热温度为40-45℃；和/或
步骤3)中所述第二步反应的条件为40℃-45℃反应3-15min。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述第三步反应的条件为40℃-45℃反应30-60min。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述试样包括医学样本和来源包括物体表面附着物、饮用水、食品、血液制品、乳制品、唾液的非医学样本。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211554925.1A CN115747379A (zh) | 2022-12-06 | 2022-12-06 | 单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211554925.1A CN115747379A (zh) | 2022-12-06 | 2022-12-06 | 单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115747379A true CN115747379A (zh) | 2023-03-07 |
Family
ID=85343552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211554925.1A Pending CN115747379A (zh) | 2022-12-06 | 2022-12-06 | 单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115747379A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117305521A (zh) * | 2023-11-28 | 2023-12-29 | 首都医科大学附属北京妇产医院 | 一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒及其用途 |
-
2022
- 2022-12-06 CN CN202211554925.1A patent/CN115747379A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117305521A (zh) * | 2023-11-28 | 2023-12-29 | 首都医科大学附属北京妇产医院 | 一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒及其用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104313180B (zh) | 同时检测和鉴别眼睛和中枢神经***的细菌、真菌、寄生虫和病毒感染的新方法 | |
| CN109487013B (zh) | 单纯疱疹病毒i型和ii型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法 | |
| CN105734176B (zh) | 一种联合检测多种性病病原体dna的方法 | |
| CN102191321B (zh) | 一种利用rna恒温扩增的***核酸检测试剂盒 | |
| CN113088579B (zh) | 一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法 | |
| CN112941189A (zh) | ***早筛分子标志物znf671基因甲基化检测的引物探针组合物及试剂盒和使用方法 | |
| CN113774157A (zh) | 一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法 | |
| CN115747379A (zh) | 单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 | |
| CN102329888A (zh) | 一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量PCR检测方法及其试剂盒 | |
| Sfanos et al. | An evaluation of PCR primer sets used for detection of Propionibacterium acnes in prostate tissue samples | |
| CN112680541B (zh) | 一种LNA-Taqman-多重荧光PCR技术及其在念珠菌快速检测中的应用 | |
| CN103820574B (zh) | 人疱疹病毒6型实时荧光定量pcr分型检测试剂盒 | |
| CN113502341B (zh) | ***16s RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 | |
| CN103290141A (zh) | 16种高危型和5种低危型hpv检测试剂盒 | |
| CN116121413A (zh) | B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 | |
| CN103131797B (zh) | 一种博卡病毒实时荧光pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN113512598B (zh) | 百日咳杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 | |
| CN104745722A (zh) | 一种用于检测水痘带状疱疹病毒的引物、探针和试剂盒 | |
| CN106929601B (zh) | 一种高灵敏人***瘤病毒6,11型核酸检测试剂盒 | |
| CN109913589B (zh) | 一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法 | |
| CN1814788A (zh) | 水体中常见食源性致病菌多重pcr快速检测试剂盒及检测方法 | |
| CN113151570B (zh) | 一种基于lna修饰的环介导等温扩增lamp技术及其在念珠菌快速检测中的应用 | |
| KR102421844B1 (ko) | 신규한 사스 코로나 바이러스 2 감염 진단 마커 및 이의 용도 | |
| CN113249508B (zh) | 用于检测b族链球菌的特异性引物、探针和应用 | |
| CN106929605B (zh) | 一种能同时检测和鉴别***和水泡性口炎的检测试剂盒及引物和探针 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |