CN102071262A - 一种单纯疱疹病毒基因分型检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明为一种单纯疱疹病毒(HSV)基因分型检测方法及试剂盒，它采用基于HSV DNA聚合酶基因设计的引物探针，利用TaqMan探针多波长荧光PCR技术在单管中同时检测HSV 1型和2型，以不同波长扩增模板的荧光信号和循环阈值判断样本中HSV的存在和型别。试剂盒还使用了人工构建的内参照***用于避免检测结果假阴性。试剂盒组分包括核酸提取液、PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、内参照、阴性及阳性对照；其使用包括样本处理和扩增检测两步骤。试剂盒操作简便，灵敏度高，不仅可避免自身PCR产物核酸污染产生的假阳性，而且能解决因样本中PCR抑制剂引起的假阴性问题，可广泛应用于临床中该病原体的基因分型快速检测。

Description

一种单纯疱疹病毒基因分型检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于一种利用荧光PCR技术对单纯疱疹病毒进行基因分型的方法与试剂盒。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Viruses，HSV)属疱疹病毒科，病毒颗粒直径约180nm，具双链DNA，根据其抗原性的差别和DNA序列限制内切酶切点不同，分HSV-1和HSV-2两型，并且已经完成HSV-1和HSV-2的基因组测序。临床上HSV可引起颜面和***部位的疱疹(颜面疱疹，如″口疮″)，或生殖器部位的疱疹(生殖器疱疹)等，生殖器官以外部位的HSV感染多由HSV-1型引起(占95％)，而生殖器官的HSV感染主要由HSV-2型引起(占78％)，但是两种类型的HSV均能感染这两个部位，也均能够感染新生儿。一般HSV可在分娩时通过产道感染给新生儿，引起新生儿疱疹，导致皮肤、眼或口腔感染，损害中枢神经***和其它内脏器官，导致智力缺陷，甚至死亡(死亡率高达50％，幸存者中多有智力发育障碍)。人体是HSV的唯一天然宿主，它可在人体内终生潜伏、在适当条件下被激活后能引起复发感染。近年来，在全球范围内HSV-2型的流行率持续上升，而生殖器疱疹虽然以HSV-2为主，但HSV-1也在日益增多。HSV检测既是临床妇女孕期优生优育五项(TORCH)检测的项目之一，又是性传播疾病控制预防中的一个令人关注的公共卫生问题。另外，HSV检测的同时如果能明确所感染的基因型，将在短期内为HSV感染疾病的治疗提供有益的信息帮助。

目前HSV的实验室常规诊断采用酶联免疫(ELISA)方法，另外还有金标抗原、聚合酶链反应(PCR)等方法。而HSV的基因分型方法通常采用分子生物学方法，例如链取代反应(SDA)和PCR技术，目前国外已有商业化的HSV基因分型检测试剂盒用于科研或临床诊断，包括美国BD公司、罗氏公司及德国QIAGEN的HSV-1/2基因分型检测试剂盒，其中BD公司产品采用了SDA技术，市场占有率不高；而罗氏和QIAGEN公司产品采用了基于FRET探针荧光PCR技术和熔解曲线分析方法，每个样品完成荧光PCR后还需要增加一个熔解曲线分析步骤，根据扩增产物Tm值对HSV进行基因分型，操作步骤较多和所需检测时间较长。此外，有文献(Anderson TP et al，J ClinMicrobiol，2003，41(5)：2135-2137)报告采用熔解曲线进行HSV基因分型存在熔解曲线特征不明显而导致结果无法判断的缺点。

鉴于临床上对HSV感染疾病的病原体基因分型的需求和现有基因分型试剂盒的技术局限性，有必要建立一种能快速检测HSV并进行基因分型的检测方法和试剂盒。

发明内容

本发明提供一种单纯疱疹病毒基因分型检测方法与试剂盒，其特征在于，采用基于HSV DNA聚合酶基因设计的引物探针，利用TaqMan探针多波长荧光PCR技术在单管中同时检测HSV 1型和2型，以不同波长扩增模板的荧光信号和循环阈值判断样本中HSV的存在和型别。试剂盒还使用了人工构建的内参照***用于避免检测结果假阴性。和国外HSV基因分型检测试剂盒比较，本发明的HSV基因分型检测试剂盒能在一个反应管中完成荧光PCR反应后，无需增加熔解曲线分析步骤，因而操作简便，检测灵敏度高；同时试剂盒还可避免自身PCR产物核酸污染产生的假阳性，引入的内参照***又能解决因样本中PCR抑制剂引起的假阴性问题，可广泛应用于临床中该病原体的基因分型快速检测。

1.实时荧光PCR引物探针的设计与合成

通过对GenBank中单纯疱疹病毒DNA聚合酶(Pol)基因序列查询，用分子生物学专业软件对各种来源的基因序列进行比对后发现，其中一个区域序列(靶序列SEQ ID No.1)对HSV-1和HSV-2两种基因型既有较好的序列同源性又有对两者相异的序列，按照TaqMan荧光PCR设计的原则，基于SEQ ID No.1靶序列设计了一对HSV特异性引物扩增SEQ ID No.1片段上连续70～300个核苷酸，并用5’端标记不同波长荧光基团的两种特异性TaqMan水解探针实时检测HSV-1和HSV-2。引物和探针碱基序列如下：

上游引物为5’-TCCATgCgCATCATCTACg-3’，如SEQ ID No.2所示；

下游引物为5’-TgTggCTCgCCATCTTgT-3’，如SEQ ID No.3所示；

HSV-1荧光探针为5’-ACTCCATATTTgTgCTgTgCCgC-3’(5’端标记FAM(6-羧基荧光素)，3’端标记BHQ(Black Hole Quencher))，如SEQ ID No.4所示。HSV-2荧光探针为5’-TggCCACCAgCgCTTCgC-3’(5’端标记HEX(6-羧基六氯荧光素)或JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素)、VIC荧光基团，3’端标记BHQ)，如SEQ ID No.5所示。

HSV基因分型引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列；其中引物序列也可以是按照靶序列SEQ ID No.1向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列。

本发明的另一方面是采用了人工构建的内参照***，用于监测样品扩增反应中可能的PCR抑制物，避免检测结果假阴性，内参照***包括内参探针和内参DNA，其中内参探针采用SEQ ID No.6序列：

5’-TTCAgCgAgCgTgggACATCAgg-3’(5’端标记Cy5或ROX(羧基-X-罗丹明)、TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)荧光基团，，3’端标记BHQ)，内参探针也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列。

内参照***中的内参DNA为人工构建的DNA模板，它含有待检核酸(HSV DNA)扩增引物中的一条引物序列和另一条引物互补序列、以及内参探针序列或其互补序列，并且一条引物序列和另一条引物互补序列分别位于内参探针序列或互补序列的上下游。

通过上述设计，获得的一对引物序列为两种单纯疱疹病毒基因型所特异，两条荧光探针分别为HSV-1和HSV-2所特异；而内参照***包括内参探针和内参DNA，上述引物探针由商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司等)合成后用无菌双蒸水溶解至浓度为25μM，-20℃保存。

2.试剂盒的制备

含有上述引物和探针的单纯疱疹病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(32人份)，其组分如下：

(1)核酸提取液1.5ml，主要成分为10～50mM NaOH、5～10mM EDTA、1％～10％Triton X-100、1％～10％NP-40。

(2)PCR缓冲液0.7ml，主要成分有Tris-HCl(pH8.3)、KCl、明胶、dATP、dGTP、dCTP、dUTP、MgCl₂、引物。

(3)荧光探针0.1ml，含有HSV-1、HSV-2荧光检测探针。

(4)Taq酶70μl，含Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)。

(5)内参照16μl，含内参探针和内参DNA。

(6)阴性对照200μl，为Vero细胞培养物。

(7)阳性对照200μl，为HSV-1和HSV-2病毒培养物。

上述组装成的试剂盒在-20℃保存。

由(2)～(5)及模板配制的30μl反应体系各主要成分浓度如下：

Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2～0.4mM、MgCl₂2.5～5mM、引物各0.2～0.5μM、HSV-1和HSV-2荧光探针及内参探针各0.1～0.5μM、Taq DNA聚合酶1～5U、UNG酶0.1～1U。

在本发明另一优选例中，由(2)～(5)及模板配制的30μl反应体系各主要成分浓度如下：

Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.3mM、MgCl₂3.5mM、引物各0.35μM、HSV-1荧光探针和HSV-2荧光探针各0.2μM、内参探针0.15μM、Taq DNA聚合酶2U、UNG酶0.2U。

3.试剂盒使用方法

本发明试剂盒在样本单纯疱疹病毒检测过程中的使用步骤之一为：

(1)样本处理

使用棉拭子沾取皮肤、眼或口腔粘膜疱疹渗出液，或者用棉拭子采集尿道生殖道病变部位分泌物，然后将棉拭子置入1ml生理盐水，充分振荡摇匀后挤干棉拭子，取漂洗液在13,000rpm离心6分钟，用移液器小心吸弃上清(为防止吸走沉淀，可保留5μl残液)。在沉淀中加入50μl核酸提取液，旋涡振荡混匀后100℃保持10分钟，13,000rpm离心6分钟取上清进行荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样本液相同。

(2)扩增检测

试剂盒首次开封使用时，将内参照管低速离心数秒后全部加入到PCR缓冲液中，在旋涡振荡器上振荡混匀使用。按照待检测样本数n+2，取PCR缓冲液21×(n+2)、荧光探针3×(n+2)、Taq酶2×(n+2)组分，混匀后每个扩增管分装26μl，分别加入按照样本处理方法处理的试剂盒阴性对照、阳性对照以及上述处理好的n个样本模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl，将上述扩增管放到多通道实时荧光PCR仪器上按照50℃2min、94℃2min后94℃10sec、60℃45sec循环40次的程序运行。运行结束后结果按照下表判断。

注：若Ct值＝40时，某些荧光PCR仪器软件可能显示为＞40、无值或UNDET等。

4.有益效果

本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成单纯疱疹病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，其主要特点如下：

(1)采用特异性靶序列并据此设计引物探针并通过荧光PCR扩增，以不同荧光标记的探针实时检测同一靶序列而检测HSV-1和HSV-2，从而对HSV进行基因分型，结果稳定可靠。

(2)引入的内参照***，检测的内参信号可以监控结果是否假阴性，可以避免由此造成的误诊；

(3)试剂盒使用了序列特异性且不同荧光标记的三种荧光探针，检测波长不同且荧光信号之间不会相互干扰，保证了检测特异性；

(4)试剂盒闭管检测，操作简便快速；

(5)扩增体系中的dUTP-UNG酶***更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。

试剂盒的上述特点，均为采用筛选的靶序列、引入的内参照***和TaqMan探针荧光PCR技术组合应用而直接引起。从原理上说，本发明试剂盒在临床样本检测中通过对实时荧光PCR扩增三个荧光检测通道信号的分析，判断单纯疱疹病毒特异性核酸片段的存在并进行基因分型，以及反应体系中是否存在由于抑制物造成的假阴性。和国外同类产品比较，本发明产品仅需单管荧光PCR反应，无需增加熔解曲线分析步骤就能完成HSV基因分型检测。作为一种单纯疱疹病毒基因分型快速检测的手段，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于临床单纯疱疹病毒的快速基因分型鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明中所涉及的主要试剂说明：

Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)、dNTPs(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)均为上海宏谊公司生产，引物探针以及其它化学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

实施例1：单纯疱疹病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的制备

(1)引物探针合成

根据发明内容中SEQ ID No.1序列设计了引物探针，委托商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司)合成以下序列：

上游引物为5’-TCCATgCgCATCATCTACg-3’，如SEQ ID No.2所示。

下游引物为5’-TgTggCTCgCCATCTTgT-3’，如SEQ ID No.3所示。

HSV-1荧光探针为5’-ACTCCATATTTgTgCTgTgCCgC-3’(5’端标记FAM，3’端标记BHQ-1)，如SEQ ID No.4所示。

HSV-2荧光探针为5’-TggCCACCAgCgCTTCgC-3’(5’端标记HEX，3’端标记BHQ-1)，如SEQ ID No.5所示。

内参探针为5’-TTCAgCgAgCgTgggACATCAgg-3’(5’标记Cy5，3’标记BHQ-3)，如SEQ ID No.6所示。

分别用无菌双蒸水溶解至浓度为25μM，-20℃保存。

(2)配制PCR缓冲液

在36m1无菌去离子水中依次加入17.2ml 5*PCR Buffer，dATP、dGTP、dCTP、dUTP(浓度均100mM)各258μl，上游和下游引物(25μM)各1.2ml，100mM MgCl₂3ml，振荡混匀，总体积用水定容到60ml。按照700μl/管分装。

(3)配制荧光探针

在8.4ml无菌去离子水中依次加入25μM HSV-1和HSV-2荧光探针各0.8ml，振荡混匀，按照100μl/管分装。

(4)配制Taq酶

在5.6ml Taq酶稀释液中加入1.6ml Taq酶(5U/μl)和0.8ml UNG酶(1U/μl)，颠倒多次混匀。按照70μl/管分装。

(5)配制核酸提取液

在800ml水中加入2.0克NaOH、10ml Triton X-100、10ml NP-40、18.6克EDTA、10ml 1M Tris-HCl(pH8.0)，在磁力搅拌器上搅拌1小时保证溶解并充分混匀；用水定容至1L，高压灭菌。按照1.5ml/管分装。

(6)配制内参照

在8ml无菌去离子水中，含有9.5μM内参探针和10⁵copy/ml内参DNA。按照16μl/管分装。

(7)制备试剂盒阴性、阳性对照

用高糖DMEM(10％血清)培养基于37℃5％CO2培养箱内培养HEP-2/Vero细胞，待细胞铺满单层(约1-2天时间)，分别接种单纯疱疹病毒标准菌株HSV-1(F strain)和HSV-2(333strain)株，铺满瓶底后于分别在37℃5％CO2吸附2小时，然后吸出病毒液，加入新鲜的高糖DMEM(5％血清)培养基于培养箱培养，观察细胞病变(约3天出现细胞病变)，收集细胞，反复冻融3次得到病毒液。

采用蚀斑法测定培养液浓度，分别用培养基将HSV-1和HSV-2稀释至1×10⁴PFU/ml，等体积混匀后200μl/管分装作为阳性对照；阴性对照采用1×10⁴个/ml浓度的Vero细胞，每管200μl。

(8)将上述分装后的7种组分置于同一容器中，组装成试剂盒，封装。

制备工艺简述如下：

(1)合成的引物探针定量配制、浓度检测、抽样质检。

(2)将PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、核酸提取液、内参照无菌分装，抽样质检。

(3)将阴性对照和阳性对照进行浓度测定、分装，抽样质检。

(4)组装成品试剂盒，保存于-20℃。

实施例2：单纯疱疹病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)在皮肤口腔疱疹HSV检测中的应用

(1)样本处理

使用棉拭子沾取患者皮肤、眼或口腔粘膜疱疹渗出液，然后将棉拭子置入1ml生理盐水，充分振荡摇匀后挤干棉拭子，取漂洗液在13,000rpm离心6分钟，用移液器小心吸弃上清(为防止吸走沉淀，可保留5μl残液)。在沉淀中加入50μl核酸提取液，旋涡振荡混匀后100℃保持10分钟，13,000rpm离心6分钟取上清进行荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样本液相同。

(2)扩增检测

按照发明内容中的方法，启封试剂盒将各组分冻融振荡混匀，随后将其中的内参照加入PCR缓冲液并振荡混匀。然后按照待检测样本数n+2，取PCR缓冲液21×(n+2)、荧光探针3×(n+2)、Taq酶2×(n+2)组分，混匀后每个扩增管分装26μl，分别加入上述处理好的试剂盒阴性对照、阳性对照及n个样本模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl，将上述扩增管放到ABI7500实时荧光PCR仪器(美国应用生物***公司)上按照50℃2min、94℃2min后94℃10sec、60℃45sec循环40次的程序运行。

运行结束后在荧光PCR仪器上分析结果，在FAM和HEX荧光波长检测通道阴性对照均为阴性、阳性对照均为阳性，而Cy5荧光波长阴性对照和阳性对照两者均为阳性；在FAM或HEX这两个荧光波长检测通道中样品扩增曲线呈明显的S形且其循环阈值(Ct值)＜40者为HSV-1或HSV-2阳性，当Cy5波长检测通道中样品扩增曲线呈明显的S形且其循环阈值(Ct值)＜40时FAM或HEX波长通道无Ct值或该值为40者为HSV-1或HSV-2阴性；如果样本扩增后三个荧光波长检测通道均无Ct值或该值为40，则需要去除样本中可能的PCR抑制物后复检。

实施例3：单纯疱疹病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)在生殖器疱疹HSV检测中的应用

(1)样本处理

使用棉拭子采集患者尿道生殖道病变部位分泌物，然后将棉拭子置入1ml生理盐水，充分振荡摇匀后挤干棉拭子，取漂洗液在13,000rpm离心6分钟，用移液器小心吸弃上清(为防止吸走沉淀，可保留5μl残液)。在沉淀中加入50μl核酸提取液，旋涡振荡混匀后100℃保持10分钟，13,000rpm离心6分钟取上清进行荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样本液相同。

(2)扩增检测

按照发明内容中的方法，启封试剂盒将各组分冻融振荡混匀，随后将其中的内参照加入PCR缓冲液并振荡混匀。然后按照待检测样本数n+2，取PCR缓冲液21×(n+2)、荧光探针3×(n+2)、Taq酶2×(n+2)组分，混匀后每个扩增管分装26μl，分别加入上述处理好的试剂盒阴性对照、阳性对照及n个样本模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl，将上述扩增管放到LC480实时荧光PCR仪器(Roche公司)上按照50℃2min、94℃2min后94℃10sec、60℃45sec循环40次的程序运行。

运行结束后在荧光PCR仪器上分析结果，在FAM和HEX荧光波长检测通道阴性对照均为阴性、阳性对照均为阳性，而Cy5荧光波长阴性对照和阳性对照两者均为阳性；在FAM或HEX这两个荧光波长检测通道中样品扩增曲线呈明显的S形且其循环阈值(Ct值)＜40者为HSV-1或HSV-2阳性，当Cy5波长检测通道中样品扩增曲线呈明显的S形且其循环阈值(Ct值)＜40时FAM或HEX波长通道无Ct值或该值为40者为HSV-1或HSV-2阴性；如果样本扩增后三个荧光波长检测通道均无Ct值或该值为40，则需要去除样本中可能的PCR抑制物后复检。

核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110>上海复星医学科技发展有限公司

     上海复星医药(集团)股份有限公司

     吴大治，夏懿

<120>一种单纯疱疹病毒基因分型检测方法及试剂盒

<130>HSV genotyping

<140>CN

<141>2009-11-22

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>490

<212>DNA

<213>herpes simplex virus

<220>

<221>SEQ ID No.1

<222>(1)..(490)

<400>1

caggccgcca tcaaggtcgt gtgtaactcg gtttacgggt tcacgggagt gcagcacgga     60

ctcctgccgt gcctgcacgt tgccgcgacg gtgacgacca tcggccgcga gatgctgctc    120

gcgacccgcg agtacgtcca cgcgcgctgg gcggccttcg aacagctcct ggccgatttc    180

ccggaggcgg ccgacatgcg cgcccccggg ccctattcca tgcgcatcat ctacggggac    240

acggactcca tatttgtgct gtgccgcggc ctcacggccg ccgggctgac ggccgtgggc    300

gacaagatgg cgagccacat ctcgcgcgcg ctgtttctgc cccccatcaa actcgagtgc    360

gaaaagacgt tcaccaagct gctgctgatc gccaagaaaa agtacatcgg cgtcatctac    420

gggggtaaga tgctcatcaa gggcgtggat ctggtgcgca aaaacaactg cgcgtttatc    480

aaccgcacct                                                           490

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>herpes simplex virus

<220>

<221>SEQ ID NO.2

<222>(1)..(19)

<400>2

tccatgcgca tcatctacg                                             19

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>herpes simplex virus

<220>

<221>SEQ ID No.3

<222>(1)..(18)

<400>3

tgtggctcgc catcttgt                                              18

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>herpes simplex virus

<220>

<221>SEQ ID No.4

<222>(1)..(23)

<400>4

actccatatt tgtgctgtgc cgc                                        23

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>herpes simplex virus

<220>

<221>SEQ ID No.5

<222>(1)..(18)

<400>5

tggccaccag cgcttcgc                                              18

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>Inter-control

<220>

<221>SEQ ID No.6

<222>(1)..(23)

<400>6

ttcagcgagc gtgggacatc agg                                        23

Claims (9)

1.本发明为一种单纯疱疹病毒(HSV)基因分型检测方法及试剂盒，其特征在于，采用基于HSV DNA聚合酶基因(Pol)设计的引物探针，利用TaqMan探针多波长荧光PCR技术在单管中同时扩增检测单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)，对HSV进行基因分型。

2.如权利要求1所述，其特征在于，所用HSV基因分型检测方法与试剂盒引物探针根据HSV Pol基因序列设计，一对引物扩增HSV-1和HSV-2型共有靶序列SEQ ID No.1上连续70～300个核苷酸序列，两条TaqMan荧光探针分别检测HSV-1和HSV-2DNA，所述引物长度为15～35个核苷酸，探针长度20～50个核苷酸。

3.如权利要求2所述，其特征在于，试剂盒所用的引物序列可以为SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3的序列；HSV-1荧光探针可以为SEQ ID No.4序列，其5’端标记FAM荧光基团；HSV-2荧光探针可以为SEQ ID No.5序列，其5’端标记HEX或JOE、VIC荧光基团；两条探针3’端标记的淬灭基团BHQ。引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列；其中引物序列也可以是按照靶序列SEQ ID No.1向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列。

4.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的内参照***用于避免检测结果假阴性，内参照***包括内参探针和内参DNA。

5.如权利要求4所述，其特征在于，HSV基因分型检测方法与试剂盒所用的内参探针采用SEQ ID No.5序列，探针5’端标记HEX或JOE、VIC荧光基团，3’端标记TAMRA或BHQ淬灭基团；内参探针也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列。

6.如权利要求4所述，所用的内参DNA为人工构建的DNA模板，它含有待检核酸(HSV-1和HSV-2DNA)扩增引物中的一条引物序列和另一条引物互补序列、以及内参探针序列或其互补序列，并且一条引物序列和另一条引物互补序列分别位于内参探针序列或互补序列的上下游位置。

7.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，包括核酸提取液、PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、内参照、阴性及阳性对照。

8.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，其特征在于按照以下浓度配制成的反应体系进行扩增反应：Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2～0.4mM、MgCl₂2.5～5mM、引物各0.2～0.5μM、HSV-1和HSV-2荧光探针及内参探针各0.1～0.5μM、Taq DNA聚合酶1～5U、UNG酶0.1～1U。

9.如权利要求1所述试剂盒在HSV基因分型检测中的应用，包括以下步骤：

(1)样本处理提取模板DNA，样本为疱疹感染病变部位渗出液或分泌物。

(2)模板DNA扩增检测，以荧光PCR仪上三个检测通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判断样品中HSV的存在和基因型别。