CN101979666B - 快速检测单纯疱疹病毒ⅱ型的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测单纯疱疹病毒II型的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种引起人类多种疾病病原体基因检测技术，适用于单纯疱疹病毒II型定性定量检测。本发明由DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2、阴性质控标准品组成；荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒II型特异性引物对和荧光探针。本发明定量准确；检测速度快；特异性好，灵敏度高；可鉴定区别检测单纯疱疹病毒II型；使用步骤简单，可重复性高。本试剂盒可对单纯疱疹病毒II型进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。

Description

快速检测单纯疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种引起人类多种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种快速检测单纯疱疹病毒II型荧光定量PCR试剂盒，适用于单纯疱疹病毒II型的定性定量检测。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpse simplex virus，HSV)是一类严重危害人类健康、引起人类多种疾病的常见病原体。HSV有HSV2和HSV2两个亚型，两亚型的核苷酸同源性达50％，而感染方式和临床表现却不相同。

HSV2主要通过性接触而感染，常潜伏在骶神经根区，可引起生殖器疱疹和新生儿疱疹，并与女性外阴癌和***的发生有关；HSV2导致的生殖器疱疹容易复发，其复发比HSV1率高5-15倍，是引起人们性心理障碍的主要原因之一，可显著降低感染者的生活质量；HSV2是人类免疫缺陷病毒(HIV)性传播的重要协同辅助因素之一，其感染使HIV感染的危险性提高三倍；孕妇感染HSV2后可导致流产、早产、胎儿先天异常和新生儿疾病等，严重影响人类优生优育。因此准确及时地诊断和区分HSV2与HSV2对指导临床治疗、评估疾病的发展和预后具有重大意义。

近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Incetigation of HSV-1，HSV-2，CMV，HHV-6 and HHV-8 DNA BY real-time PCRin surgical resection materials of eplepsy patients with mesial temporallobe sclerosis[J].Journal of the Neurological Sciences.2008，264：151-156；Assessment of bluetongue viraemia in sheep by real-time PCRand correlation with viral infectivity.[J].Journal of the NeurologicalSciences，Available online 10 May 2010)和定量检测(Quantitativecharacterization of cell transduction by HSV-1 amplicons using flowcytometry and real-time PCR[J].Journal of the Neurological Sciences2009，159：160-166；Development of a novel TaqMan real-time PCR assayfordetecting rubella virus RNA.[J].Journal of the NeurologicalSciences2010，168：267-271)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法，国内目前已有关于丙肝、乙肝、支原体、衣原体、艾滋病、结核定量检测的试剂盒上市。

临床检测上传统的培养法和血清学方法具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点；常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题；因此亟待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速检测单纯疱疹病毒II型的荧光定量PCR试剂盒。

本发明采用以下技术方案：

一、PCR试剂盒

该试剂盒包括：DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2和阴性质控标准品；

1、DNA提取液

在pH7.4 Tris-EDTA缓冲液(pH7.610mM Tris.HCL，pH8.01mM EDTA)中，按照1∶100比例加入NP-40混匀后完成配制。将提取液II分装至5ml冻存管(有盖透明管)内。分装量5ml/管。

2、荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒II型特异性引物对和荧光探针

1)单纯疱疹病毒II型

正向引物为5′-GCTTCCTCATCGCGTACCAG-3′，

反向引物为5′-TCCTGCTCCCGCATGTACTC-3′。

2)荧光探针序列为5′-CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG-3′，

荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse，可以大大减少背景噪音的干扰。

3、HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2是含有单纯疱疹病毒II型高度保守基因-糖蛋白B基因的79个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。

HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2包含的GB基因的核苷酸序列为：

GCTTCCTCATCGCGTACCAGCCCCTCCTCAGCAACACGCTCGCCGAGCTGTACGTGCGGGAGTACATGCGGGAGCAGGA。

4、阴性质控标准品

该阴性质控标准品为无菌双蒸水，用于阴性对照。

二、PCR试剂盒的制备和检测方法

PCR试剂盒的制备和检测方法包括下列步骤：

①配制DNA提取液；

②配制荧光定量PCR反应液；

③配制HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2；

④配制阳性定量标准品；

⑤配制阴性质控标准品；

⑥判断未知样本的阴阳性；

应用DNA提取液提取未知检测样本得到DNA，后再取HSV2阳性定量标准品和阴性质控标准品分别加入装有荧光定量PCR反应液的PCR反应管中，然后置于PCR荧光定量仪中进行反应；其中，以阳性定量标准品反应曲线作为标准对照，阴性质控标准品反应曲线作为阴性对照，以阳性定量标准品反应曲线判断阳性样本的浓度。从而判断未知样本的阴阳性及浓度。

本试剂盒的工作原理：

在本发明提供的快速定量检测单纯疱疹病毒II型荧光定量PCR试剂盒中，有标记了荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5′→3′外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对单纯疱疹病毒II型的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

在本发明提供的检测单纯疱疹病毒II型荧光定量PCR试剂盒中，针对单纯疱疹病毒II型检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、Mg²⁺浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测***相结合，将其用于单纯疱疹病毒II型定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了检测单纯疱疹病毒II型荧光定量PCR方法，并研制出检测单纯疱疹病毒II型荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速诊断单纯疱疹病毒II型的要求。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、定量准确；

2、检测速度快，仅1.5小时，加上样品DNA的提取制备，共仅需2小时；

3、特异性好，灵敏度高；

4、可鉴定区别检测单纯疱疹病毒II型；

5、使用步骤简单，可重复性高。

本试剂盒可对单纯疱疹病毒II型进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。

应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

一、关于制备和检测方法的实施例

1、试剂盒组成与配制

①配制DNA提取液

DNA提取液组成：

提取液I：配制0.01M PBS(28.94g Na₂HPO₄·12H₂O，2.6g KH₂PO₄·2H₂O加入1000ml超净水混匀，调pH到7.4)。

提取液II：在pH7.4Tris-EDTA缓冲液(pH7.610mM Tris-HCL，pH8.01mMEDTA)中，按照1∶100比例加入NP-40混匀后完成配制。将提取液II分装至5ml冻存管(有盖透明管)内。分装量5ml/管。

②配制荧光定量PCR反应液

a、荧光PCR 10×Buffer组成：

500mM KCl、100mM Tris-HCl(PH9.025℃)、1.0％Triton X-100；

b、荧光定量PCR反应液：PCR 10×buffer 5.0μl，正向引物和反向引物各1.5μl(10μmol/L)，荧光探针1.0μl(5μmol/L)，MgCl₂5μl(25mmol/L)，dNTPs 1.0μl(10mmol/L)，Taq DNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，无菌双蒸水29.6μl。

③配制HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2：浓度为10⁹拷贝/ml标准阳性模板PMD18-T-HSV2。

④将阳性标准模板系列稀释为10⁸拷贝/ml、10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml。

⑤配制阴性质控标准品：

该阴性质控标准品为无菌双蒸水。

二、关于试剂盒的应用实施例

1、使用试剂盒快速检测单纯疱疹病毒II型

①在标本试管中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，转至1.5ml离心管中，10000g离心10min，再重复洗涤1次。沉淀直接加50μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10min，10000g离心2min，取上清液5μl做PCR反应。

②分别取荧光定量PCR反应液各45μl，取第①步所得HSV2DNA和第②步稀释的HSV2阳性标准模板各5μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变性300s；95℃10s，58℃40s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，所用荧光为FAM，其吸收波长494nm，发射波长522nm。

③通过比较待测样品和相应标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝数进行定量。

2、实验结果

荧光定量PCR反应结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为：HSV2标准阳性模板10⁸拷贝/ml、10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml的Ct值分别为17.92，21.64，24.83，28.248，31.09，34.82；阴性对照为40；

反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析P＞0.05，数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。

从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2个小时就能完成，而传统的细胞培养法约需1周左右才能完成，因此，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。

Claims (2)

1.一种快速检测单纯疱疹病毒II型的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括：

DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2和阴性质控标准品；

荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒II型特异性引物对和荧光探针；

正向引物为5′-GCTTCCTCATCGCGTACCAG-3′，

反向引物为5′-TCCTGCTCCCGCATGTACTC-3′；

荧光探针序列为5′-CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG-3′，

荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse，可以大大减少背景噪音的干扰，HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2是含有单纯疱疹病毒II型高度保守基因-糖蛋白B基因的79个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18-T载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖；

HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2包含的GB基因的核苷酸序列为：

GCTTCCTCATCGCGTACCAGCCCCTCCTCAGCAACACGCTCGCCGAGCTGTACGTGCGGGAGTACATGCGGGAGCAGGA。

2.按权利要求1所述的PCR试剂盒的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

①配制DNA提取液；

②配制荧光定量PCR反应液；

③配制HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2；

④配制阳性定量标准品；

⑤配制阴性质控标准品；

⑥判断未知样本的阴阳性。