CN102071261A - 一种单纯疱疹病毒核酸检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明为一种利用荧光PCR鉴定单纯疱疹病毒(HSV)的方法与试剂盒，它采用基于HSV DNA聚合酶基因设计的引物探针和人工构建的内参照***，利用TaqMan探针双波长荧光PCR技术在单管中检测单纯疱疹病毒和内参DNA，以扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判断样品中HSV的存在。试剂盒组分包括核酸提取液、PCR缓冲液、Taq酶、内参照、阴性对照及阳性对照；其使用包括样本处理和扩增检测两个步骤。试剂盒操作简便快速，灵敏度高，不仅可避免自身PCR产物核酸污染产生的假阳性，而且能解决因样本中PCR抑制剂引起的假阴性问题，可广泛应用于临床中该病原体的快速检测。

Description

一种单纯疱疹病毒核酸检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于一种荧光PCR检测单纯疱疹病毒的方法和试剂盒。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Viruses，HSV)属疱疹病毒科，病毒颗粒直径约180nm，具双链DNA，根据其抗原性的差别和DNA序列限制内切酶切点不同，分HSV-1和HSV-2两型。临床上HSV可引起颜面和***部位的疱疹(颜面疱疹，如″口疮″)，或生殖器部位的疱疹(生殖器疱疹)等，生殖器官以外部位的HSV感染多由HSV-1型引起(占95％)，而生殖器官的HSV感染主要由HSV-2型引起(占78％)，但是两种类型的HSV均能感染这两个部位，也均能够感染新生儿。一般HSV可在分娩时通过产道感染给新生儿，引起新生儿疱疹，导致皮肤、眼或口腔感染，损害中枢神经***和其它内脏器官，导致智力缺陷，甚至死亡(死亡率高达50％，幸存者中多有智力发育障碍)。人体是HSV的唯一天然宿主，它可在人体内终生潜伏、在适当条件下被激活后能引起复发感染。近年来，在全球范围内HSV-II型的流行率持续上升，而生殖器疱疹虽然以HSV-2为主，但HSV-1也在日益增多。HSV检测既是临床妇女孕期优生优育五项(TORCH)检测的项目之一，又是性传播疾病控制预防中的一个令人关注的公共卫生问题。

目前HSV的实验室常规诊断采用酶联免疫(ELISA)方法，另外还有金标抗原、PCR等方法。ELISA通常检测病原的特异性抗体，具有灵敏度高、特异性强的特点，但对新感染未产生高抗体滴度或抗体基因突变者敏感性尚低，影响检出率。金标抗原检测试剂操作简单，适合基层单位使用，但检测灵敏度不及ELISA和PCR方法。PCR具有灵敏度极高的特点，可直接检测病原体基因，特别对于无症状及潜伏期感染的HSV患者，PCR方法检测具有较高的临床价值。近年来，随着分子生物学的进展，实时荧光PCR技术在病原体检测中得到广泛应用，和传统PCR电泳检测方法比较具有许多优点：(1)其采用的闭管检测消扩增产物污染问题，提高了检测准确度；(2)PCR体系中增加了荧光探针，提高了检测特异性和灵敏度；(3)操作迅速，无需传统PCR的后处理检测步骤，自动化程度高。如果在反应体系中引入内参照和双波长荧光探针，还能监测因样本中可能的PCR抑制剂引起的检测结果假阴性。目前尚未见到有利用单管双波长实时荧光PCR同时快速检测单纯疱疹病毒和内参照的试剂盒。

因此，本发明提供一种检测单纯疱疹病毒核酸的方法与试剂盒，其特征在于利用实时双波长荧光PCR技术和人工构建的内参照***，在单个反应管中检测单纯疱疹病毒和内参DNA。本发明可以用于监控PCR扩增中可能的抑制物，通过采取措施复检获得正确结果，从而避免检测结果出现假阴性，最终确定样本是否存在单纯疱疹病毒，试剂盒适合于临床HSV病原体的快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种单管双波长荧光PCR检测单纯疱疹病毒和内参DNA的方法和试剂盒，并能避免因PCR抑制物造成假阴性结果的，试剂盒包括所需的引物和探针，从而可以提高实时荧光PCR检测单纯疱疹病毒的准确性，适合在临床单纯疱疹病毒检测中推广使用。

1.实时荧光PCR引物探针的设计与合成

通过对GenBank中单纯疱疹病毒DNA聚合酶(Pol)基因序列查询，用分子生物学专业软件对各种来源的Pol基因序列进行比对后发现，其中一个区域序列(靶序列SEQ ID No.1)高度保守并具有很好的同源性，按照TaqMan荧光PCR设计的原则，根据靶序列SEQ ID No.1设计了一对单纯疱疹病毒特异性引物扩增其保守区域，并用5’端FAM标记的特异性TaqMan水解探针法实时检测。引物和探针碱基序列如下：

上游引物为5’-gAgAgggACATCCAggACTTTg-3’，如SEQ ID No.2所示；

下游引物为5’-TgAgCTTgTAATACACCgTCAgg-3’，如SEQ ID No.3所示；

HSV荧光探针为5’-TCACCgCCgAACTgAgCAgACACC-3’(5’标记FAM(6-羧基荧光素)，3’标记TAMRA(6-羧基-四甲基罗丹明)或BHQ(Black HoleQuencher))，同时检测HSV-1和HSV-2，如SEQ ID No.4所示。

HSV引物探针序列也可以是上述序列按照靶序列SEQ ID No.1向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上。

本发明的另一方面是采用了人工构建的内参照***，用于监测样品扩增反应中可能的PCR抑制物，避免检测结果假阴性，内参照***包括内参探针和内参DNA，其中内参探针采用SEQ ID No.5序列：

5’-TTCAgCgAgCgTgggACATCAgg-3’(5’端标记HEX(六氯-6-羧基荧光素)或JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素)、VIC荧光基团，3’标记TAMRA或BHQ)，内参探针也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列。

内参照***中的内参DNA为人工构建的DNA模板，它含有待检核酸(HSV DNA)扩增引物中的一条引物序列和另一条引物互补序列、以及内参探针序列或其互补序列，并且一条引物序列和另一条引物互补序列分别位于内参探针序列或互补序列的上下游。

通过上述设计，获得的一对引物和探针序列为单纯疱疹病毒所特异，而内参照***包括内参探针和内参DNA，上述引物探针及内参DNA由商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司等)合成后用无菌双蒸水溶解至浓度为25μM，-20℃保存。

2.试剂盒的制备

含有上述引物探针和内参DNA的单纯疱疹病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(32人份)，其主要成分如下：

(1)核酸提取液1.5ml，主要成分为10～50mM NaOH、5～10mM EDTA、1％～10％Triton X-100、1％～10％NP-40。

(2)PCR缓冲液0.7ml，主要成分有Tris-HCl(pH8.3)、KCl、明胶、dATP、dGTP、dCTP、dUTP、MgCl₂、引物。

(3)荧光探针0.1ml，含有HSV荧光探针。

(4)Taq酶70μl，含Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)。

(5)内参照16μl，含内参探针和内参DNA。

(6)阴性对照200μl，为Vero细胞培养物。

(7)阳性对照200μl，为HSV-1和HSV-2病毒培养物。

上述组装成的试剂盒在-20℃保存。

由(2)～(5)及模板配制的30μl反应体系各主要成分浓度如下：

Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2～0.4mM、MgCl₂2.5～5mM、引物各0.2～0.5μM、HSV荧光探针及内参探针各0.1～0.5μM、Taq DNA聚合酶1～5U、UNG酶0.1～1U。

在本发明另一优选例中，由(2)～(5)及模板配制的30μl反应体系各主要成分浓度如下：

Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.3mM、MgCl₂3.5mM、引物各0.35μM、HSV荧光探针0.2μM、内参探针0.15μM、Taq DNA聚合酶2U、UNG酶0.2U。

3.试剂盒使用方法

本发明试剂盒在样本单纯疱疹病毒检测过程中的使用步骤之一为：

(1)样本处理

使用棉拭子沾取皮肤、眼或口腔粘膜疱疹渗出液，或者用棉拭子采集尿道生殖道病变部位分泌物，然后将棉拭子置入1ml生理盐水，充分振荡摇匀后挤干棉拭子，取漂洗液在13,000rpm离心6分钟，用移液器小心吸弃上清(为防止吸走沉淀，可保留5μl残液)。在沉淀中加入50μl核酸提取液，旋涡振荡混匀后100℃保持10分钟，13,000rpm离心6分钟取上清进行荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样本液相同。

(2)扩增检测

试剂盒首次开封使用时，将内参照管低速离心数秒后全部加入到PCR缓冲液中，在旋涡振荡器上振荡混匀使用。按照待检测样本数n+2，取PCR缓冲液21×(n+2)、荧光探针3×(n+2)、Taq酶2×(n+2)组分，混匀后每个扩增管分装26μl，分别加入按照样本处理方法处理的试剂盒阴性对照、阳性对照以及上述处理好的n个样本模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl，将上述扩增管放到双通道实时荧光PCR仪器上按照50℃2min、94℃2min后94℃10sec、60℃45sec循环40次的程序运行。运行结束后结果按照下表判断。

注：若Ct值＝40时，某些荧光PCR仪器软件可能显示为＞40、无值或UNDET等。

4.有益效果

本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成单纯疱疹病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，其主要特点如下：

(1)试剂盒引入了内参照***，样品扩增中内参信号监控结果是否假阴性，可以避免由此造成的误诊；

(2)试剂盒使用了序列特异性且不同荧光标记的单纯疱疹病毒荧光探针和内参探针，两种信号之间不会相互干扰，保证了检测特异性；

(3)试剂盒闭管检测，操作简便快速；

(4)扩增体系中的dUTP-UNG酶***更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。

试剂盒的上述特点，均为采用引入的内参照***和荧光PCR技术组合应用而直接引起。从原理上说，本发明试剂盒在单纯疱疹病毒病原体临床样本检测中通过对实时荧光PCR扩增两个通道信号的分析，判断单纯疱疹病毒核酸特异性片段的存在，以及反应体系中是否存在由于抑制物造成的假阴性。作为一种单纯疱疹病毒核酸快速检测的手段，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于临床单纯疱疹病毒的快速鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明中所涉及的主要试剂说明：

Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)、dNTPs(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)均为上海宏谊公司生产，引物探针以及其它化学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

实施例1：单纯疱疹病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的制备

(1)引物探针合成

根据发明内容中SEQ ID No.1序列设计了引物探针，委托商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司)合成以下序列：

上游引物为5’-gAgAgggACATCCAggACTTTg-3’，如SEQ ID No.2所示；

下游引物为5’-TgAgCTTgTAATACACCgTCAgg-3’，如SEQ ID No.3所示；

单纯疱疹病毒荧光探针为5’-TCACCgCCgAACTgAgCAgACACC-3’(5’标记FAM，3’标记TAMRA)，如SEQ ID No.4所示。

内参探针为5’-TTCAgCgAgCgTgggACATCAgg-3’(5’标记HEX，3’标记TAMRA)，如SEQ ID No.5所示。

分别用无菌双蒸水溶解至浓度为25μM，-20℃保存。

(2)配制PCR缓冲液

在36ml无菌去离子水中依次加入17.2ml 5*PCR Buffer，dATP、dGTP、dCTP、dUTP(浓度均100mM)各258μl，上游和下游引物(25μM)各1.2ml，100mM MgCl₂3ml，振荡混匀，总体积用水定容到60ml。按照700μl/管分装。

(3)配制荧光探针

在9.2ml无菌去离子水中依次加入25μM HSV荧光探针0.8ml，振荡混匀，按照100μl/管分装。

(4)配制Taq酶

在5.6ml Taq酶稀释液中加入1.6ml Taq酶(5U/μl)和0.8ml UNG酶(1U/μl)，颠倒多次混匀。按照70μl/管分装。

(5)配制核酸提取液

在800ml水中加入2.0克NaOH、10ml Triton X-100、10ml NP-40、18.6克EDTA、10ml 1M Tris-HCl(pH8.0)，在磁力搅拌器上搅拌1小时保证溶解并充分混匀；用水定容至1L，高压灭菌。按照1.5ml/管分装。

(6)配制内参照

在8ml无菌去离子水中，含有9.5μM内参探针和10⁵copy/ml内参DNA。按照16μl/管分装。

(7)制备试剂盒阴性、阳性对照

用高糖DMEM(10％血清)培养基于37℃5％CO2培养箱内培养HEP-2/Vero细胞，待细胞铺满单层(约1-2天时间)，分别接种单纯疱疹病毒标准菌株HSV-1(F strain)和HSV-2(333strain)株，铺满瓶底后于分别在37℃5％CO2吸附2小时，然后吸出病毒液，加入新鲜的高糖DMEM(5％血清)培养基于培养箱培养，观察细胞病变(约3天出现细胞病变)，收集细胞，反复冻融3次得到病毒液。

采用蚀斑法测定培养液浓度，分别用培养基将HSV-1和HSV-2稀释至1×10⁴PFU/ml，等体积混匀后200μl/管分装作为阳性对照；阴性对照采用1×10⁴个/ml浓度的Vero细胞，每管200μl。

(8)将上述分装后的7种组分置于同一容器中，组装成试剂盒，封装。

制备工艺简述如下：

(1)合成的引物探针定量配制、浓度检测、抽样质检。

(2)将PCR缓冲液、Taq酶、核酸提取液、内参照无菌分装，抽样质检。

(3)将阴性、阳性对照进行浓度测定、分装，抽样质检。

(4)组装成品试剂盒，保存于-20℃。

实施例2：单纯疱疹病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的应用

(1)样本处理

使用棉拭子沾取患者皮肤、眼或口腔粘膜疱疹渗出液，然后将棉拭子置入1ml生理盐水，充分振荡摇匀后挤干棉拭子，取漂洗液在13,000rpm离心6分钟，用移液器小心吸弃上清(为防止吸走沉淀，可保留5μl残液)。在沉淀中加入50μl核酸提取液，旋涡振荡混匀后100℃保持10分钟，13,000rpm离心6分钟取上清进行荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样本液相同。

(2)扩增检测

按照发明内容中的方法，启封试剂盒将各组分冻融振荡混匀，随后将其中的内参照加入PCR缓冲液并振荡混匀。然后按照待检测样本数n+2，取PCR缓冲液21×(n+2)、荧光探针3×(n+2)、Taq酶2×(n+2)组分，混匀后每个扩增管分装26μl，分别加入上述处理好的试剂盒阴性对照、阳性对照及n个样本模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl，将上述扩增管放到ABI7500实时荧光PCR仪器(美国应用生物***公司)上按照50℃2min、94℃2min后94℃10sec、60℃45sec循环40次的程序运行。

仪器运行结束后，按照发明内容中的结果判断方法，阴性对照为阴性，阳性对照为阳性；样本扩增后如FAM通道Ct＜40则判断单纯疱疹病毒阳性，如HEX通道Ct＜40且FAM通道Ct＝40判断为单纯疱疹病毒阴性，如果FAM和HEX通道Ct均为40，则可以将样本提取物用无菌去离子水稀释，或重新采样去除样本中可能的PCR抑制物后复检。

实施例3：单纯疱疹病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的应用

(1)样本处理

使用棉拭子采集患者尿道生殖道病变部位分泌物，然后将棉拭子置入1ml生理盐水，充分振荡摇匀后挤干棉拭子，取漂洗液在13,000rpm离心6分钟，用移液器小心吸弃上清(为防止吸走沉淀，可保留5μl残液)。在沉淀中加入50μl核酸提取液，旋涡振荡混匀后100℃保持10分钟，13,000rpm离心6分钟取上清进行荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样本液相同。

(2)扩增检测

按照发明内容中的方法，启封试剂盒将各组分冻融振荡混匀，随后将其中的内参照加入PCR缓冲液并振荡混匀。然后按照待检测样本数n+2，取PCR缓冲液21×(n+2)、荧光探针3×(n+2)、Taq酶2×(n+2)组分，混匀后每个扩增管分装26μl，分别加入上述处理好的试剂盒阴性对照、阳性对照及n个样本模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl，将上述扩增管放到LC480实时荧光PCR仪器(Roche公司)上按照50℃2min、94℃2min后94℃10sec、60℃45sec循环40次的程序运行。

仪器运行结束后，按照发明内容中的结果判断方法，阴性对照为阴性，阳性对照为阳性；样本扩增后如FAM通道Ct＜40则判断单纯疱疹病毒阳性，如HEX通道Ct＜40且FAM通道Ct＝40判断为单纯疱疹病毒阴性，如果FAM和HEX通道Ct值均为40，则可以将样本提取物用无菌去离子水稀释，或重新采样去除样本中可能的PCR抑制物后复检。

核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110>上海复星医学科技发展有限公司

     上海复星医药(集团)股份有限公司

     吴大治，夏懿

<120>一种单纯疱疹病毒核酸检测方法及试剂盒

<130>HSV

<140>CN

<141>2009-11-22

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>949

<212>DNA

<213>Herpes simplex virus

<220>

<221>SEQ ID No.1

<222>(1)..(949)

<400>1

atcgccaaga aaaagtacat cggcgtcatc tgcgggggca agatgctcat caagggcgtg     60

gatctggtgc gcaaaaacaa ctgcgcgttt atcaaccgca cctccagggc cctggtcgac    120

ctgctgtttt acgacgatac cgtatccgga gcggccgccg cgttagccga gcgccccgca    180

gaggagtggc tggcgcgacc cctgcccgag ggactgcagg cgttcggggc cgtcctcgta    240

gacgcccatc ggcgcatcac cgacccggag agggacatcc aggactttgt cctcaccgcc    300

gaactgagca gacacccgcg cgcgtacacc aacaagcgcc tggcccacct gacggtgtat    360

tacaagctca tggcccgccg cgcgcaggtc ccgtccatca aggaccggat cccgtacgtg    420

atcgtggccc agacccgcga ggtagaggag acggtcgcgc ggctggccgc cctccgcgag    480

ctagacgccg ccgccccagg ggacgagccc gcccccccag cggccctgcc ctccccggcc    540

aagcgccccc gggagacgcc gtcgcatgcc gaccccccgg gaggcgcgtc caagccccgc    600

aagctgctgg tgtccgagct ggcggaggat cccgggtacg ccatcgcccg gggcgttccg    660

ctcaacacgg actattactt ctcgcacctg ctgggggcgg cctgcgtgac gttcaaggcc    720

ctgtttggaa ataacgccaa gatcaccgag agtctgttaa agaggtttat tcccgagacg    780

tggcaccccc cggacgacgt ggccgcgcgg ctcagggccg cggggttcgg gccggcgggg    840

gccggcgcta cggcggagga aactcgtcga atgttgcata gagcctttga tactctagca    900

tgagcccccc gtcgaagctg atgtcccgca tcttgcaata aatgtctgc                949

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>Herpes simplex virus

<220>

<221>SEQ ID No.2

<222>(1)..(22)

<400>2

gagagggaca tccaggactt tg                                             22

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>Herpes simplex virus

<220>

<221>SEQ ID No.3

<222>(1)..(23)

<400>3

tgagcttgta atacaccgtc agg                                            23

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>Herpes simplex virus

<220>

<221>SEQ ID No.4

<222>(1)..(24)

<400>4

tcaccgccga actgagcaga cacc                                           24

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>Internal-control

<220>

<221>SEQ ID NO.5

<222>(1)..(23)

<400>5

ttcagcgagc gtgggacatc agg                                            23

Claims (9)

1.本发明为一种单纯疱疹病毒(HSV)核酸检测的方法与试剂盒，其特征在于，采用基于HSV DNA聚合酶基因(Pol)设计的一对引物和一条荧光探针，利用TaqMan探针荧光PCR技术在单管中扩增检测单纯疱疹病毒。

2.如权利要求1所述，其特征在于，所用HSV核酸检测方法与试剂盒引物探针根据HSV Pol基因序列设计，一对引物扩增HSV-1和HSV-2型共有靶序列SEQ ID No.1上连续70～300个核苷酸序列，一条TaqMan荧光探针检测HSV(包括HSV-1和HSV-2)DNA，所述引物长度为15～35个核苷酸，探针长度20～50个核苷酸。

3.如权利要求2所述，其特征在于，试剂盒所用的引物序列可以为SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3的序列；HSV荧光探针可以为SEQ ID No.4序列，其5’端标记FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团TAMRA或BHQ。引物探针序列也可以是上述序列按照靶序列SEQ ID No.1向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上。

4.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的内参照***用于避免检测结果假阴性，内参照***包括内参探针和内参DNA。

5.如权利要求4所述，其特征在于，HSV核酸检测方法与试剂盒所用的内参探针采用SEQ ID No.5序列，探针5’端标记HEX或JOE、VIC荧光基团，3’端标记TAMR或BHQ淬灭基团；内参探针也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列。

6.如权利要求4所述，其特征在于，所用的内参DNA为人工构建的DNA模板，它含有待检核酸(HSV DNA)扩增引物中的一条引物序列和另一条引物互补序列、以及内参探针序列或其互补序列，并且一条引物序列和另一条引物互补序列分别位于内参探针序列或互补序列的上下游位置。

7.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，包括核酸提取液、PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、内参照、阴性及阳性对照。

8.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，其特征在于按照以下浓度配制成的反应体系进行扩增反应：Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2～0.4mM、MgCl₂2.5～5mM、引物各0.2～0.5μM、单纯疱疹病毒荧光探针和内参探针各0.1～0.5μM、Taq DNA聚合酶1～5U、UNG酶0.1～1U。

9.如权利要求1所述试剂盒在HSV快速鉴定中的应用，包括以下步骤：

(1)样本处理提取模板DNA，样本为疱疹感染病变部位渗出液或分泌物。

(2)模板DNA扩增检测，以荧光PCR仪上两个检测通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判断样品中HSV的存在。