CN102094074A - 定量检测白血病融合基因tel-aml1荧光rt-pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于定量检测白血病TEL-AML1融合基因的荧光RT-PCR试剂盒，属于体外核酸诊断领域。该试剂盒包括定量参考品、阴性参考品、阳性对照品、RT-PCR酶、PCREnhancer、DEPC水、荧光PCR反应液I，荧光PCR反应液II以及RNA提取液。本发明包括一个以荧光PCR技术为基础的RT-PCR体系，包含针对AML1和TEL-AML1的正、反向引物和荧光探针，在相同PCR条件下可以同时检测AML1和TEL-AML1的RNA；可以简便快速地在临床样本中检测是否发生TEL-AML1基因融合，为白血病诊断、分型、临床治疗和预后判断提供重要依据，为临床的治疗提供新的思路。

Description

定量检测白血病融合基因TEL-AML1荧光RT-PCR试剂盒

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中检测白血病患者TEL-AML1基因融合的荧光RT-PCR(聚合酶链式反应)试剂盒。 

背景技术

白血病是造血***的恶性疾病，俗称“血癌”，是国内十大高发恶性肿瘤之一。我国白血病患者约为3～4人/10万人口，小儿的恶性肿瘤中以白血病的发病率最高，每年至少以3万到4万的速度增加。据调查，我国＜10岁小儿白血病的发病率为2.28/10万，任何年龄均可发病，男性的发病率高于女性。癌基因的激活及异常表达与白血病的发生有关，染色体的断裂与移位可使癌基因的位置发生移动并被激活。染色体易位导致基因融合，这些融合基因及其相关基因的异常表达，导致无节制的细胞生长和恶性转化，是白血病发病的重要机理。 

急性淋巴细胞白血病(ALL)在儿童白血病中约占75％，TEL-AML1t(12；21)是儿童ALL中最常见的染色体结构异常，由12号染色体上的TEL基因与21号染色体上的AML1基因融合而成，在TEL-AML1融合基因形成的同时往往伴随另一个等位基因的缺失，易位和缺失使TEL/AML致白血病的机制复杂化。TEL和AML1的融合使AML1编码的CBRa失去与DNA结合能力或不能正常转录而发挥激活靶基因的作用，即AML1从转录激活因子转变成转录抑制因子。此外，12p缺失在引起TEL基因缺失的同时还累及其下游的CD-KNIB基因，由于该基因能编码周期素依赖激酶抑制蛋白P27，具有阻止细胞从G1期进入s期，抑制细胞增殖的作用，故其受累加速了白血病细胞的过度生长。SHURTLE等于1995年发现近30的前B急性淋巴细胞白血病儿童存在TEL-AML1融合基因并与预后相关。 

TEL-AML1融合基因阳性ALL多发生在1～10岁，1～5岁者占76.2％，所有的t(12；21)病人都表达B族细胞免疫表型，以CD9、CD10阳性最为多见，***对TEL-AML1阳性白血病的治疗效果较好。现有对白血病融合蛋白的检测方法主要是染色体核型分析，但由于12p和21q末端在常规显带时很相似，因此常规细胞遗传学方法检出率仅0.05％，需应用FISH或RT-PCR方法提高检测阳性率。FISH方法操作复杂，耗时长，还需荧光显微镜等大型仪器设备和病理医生的诊断意见，对检测机构的要求较严格，不利于临床样本的快速检出；RT-PCR结果不能实时监测，产物需要凝胶电泳检测，容易造成假阳性和假阴性结果。 

荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。 

荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针等，本方法涉及的是Taqman探针技术。其工作原理是：它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’→3’酶切活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’ 端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM(6-羧基荧光素)，TET(四氯-6-羧基荧光素)，JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)，HEX(六氯-6-甲基荧光素)或VIC等，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)或DABCYL(4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。 

目前市场上还没有利用荧光定量RT-PCR技术进行白血病融合蛋白基因TEL-AML1检测的产品。 

发明内容

为克服传统方法对白血病融合蛋白TEL-AML1检测的缺点，本发明提供一种特异性高、成本低并且能够作定量检测的检测产品。 

本发明提供了一种定量检测白血病融合基因TEL-AML1的荧光RT-PCR试剂盒，包括定量参考品、阴性参考品、阳性对照品、荧光PCR反应液I，荧光PCR反应液II；所述的荧光PCR反应液I包括AML1基因引物、AML1特异性荧光探针；所述的荧光PCR反应液II包括TEL-AML1融合基因引物、TEL-AML1特异性荧光探针。 

所述的定量参考品、阳性对照品为含有***AML1基因和TEL-AML1融合基因特异序列的PMD18-T载体质粒，所述的***序列分别如下： 

AML1基因***序列为 

TCGGAGCGAAAACCAAGACAGGTCACTGTTTCAGCCTCACCCCTCTAGCCCTACATCTCTCTTTCTTCTCCCCTCTGCTGGATACCTCTGGGACTC                           96bp； 

TEL-AML1融合基因***序列为 

GCACGCCATGCCCATTGGGAGAATAGCAGAATGCATACTTGGAATGAATCCTTCTAGAGACGTCCACGATGCCAGCACGAGCCGCCGCTTCACGCCGCCTTCCACCG                107bp。 

所述的定量参考品为存放浓度为1.0×10¹⁰-5.0×10¹⁰拷贝/毫升的重组质粒。使用时可按梯度稀释，用于做定量判断的参考。 

所述的阳性对照品重组质粒浓度为1.0×10⁶-5.0×10⁶拷贝/毫升。 

所述的阴性参考品为正常无TEL-AML1融合表达的阴性血清。 

所述的AML1基因引物序列如下： 

扩增检测AML1基因的正向引物                TCGGAGCGAAAACCAAGACAG     21； 

扩增检测AML1基因反向引物                  GAGTCCCAGAGGTATCCAGCAG    22。 

所述的AML特异性荧光探针序列如下： 

检测AML1基因的探针TCAGCCTCACCCCTCTAGCCCTAC    24。 

所述的TEL-AML1融合基因引物序列如下： 

扩增检测TEL-AML1融合基因的正向引物        GCACGCCATGCCCATTGGGA      20； 

扩增检测TEL-AML1融合基因的反向引物        CGGTGGAAGGCGGCGTGAAG      20。 

所述的TEL-AML1特异性荧光探针序列如下： 

检测TEL-AML1融合基因的探针        AGCAGAATGCATACTTGGAATGAATCCT    28。 

所述的AML1和TEL-AML1特异性荧光探针均为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，可以是FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5；3’端的为一种荧光淬灭基团，可以是TAMRA、DABCYL、NFQ。在本发明的反应体系中，可以使用一个或者多个荧光探针，所标记的荧光报告基团可以为一种或者两种。 

所述的试剂盒还包括RT-PCR酶、PCR Enhancer、DEPC水、以及RNA提取液。 

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果： 

①定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险； 

②灵敏度和特异性高。由于采取特异性和引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到是否发生基因融合； 

③检测速度快，加上样本提取总共仅需2-3个小时； 

④步骤简单，结果用拷贝数表示，定量结果准确可靠，不仅缩短了检测时间，减少了污染的发生，而且提高了分析数据的可靠性； 

⑤可同时进行高通量的样本检测。 

总之荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间可控制在两个半小时以内，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取代传统细胞遗传学检测或者普通RT-PCR检测进行TEL-AML1基因融合导致白血病的诊断。检测结果不仅可以为白血病诊断、分型、临床治疗和预后判断提供重要依据，同时也是白血病微小残留病检测的基础。有助于深人了解相关白血病的发病机制，并为临床的治疗提供新的思路。 

附图说明：

图1为定量参考品的荧光PCR扩增曲线：曲线从左到右分别为(5.0×10⁷，5.0×10⁶，5.0×10⁵，5.0×10⁴拷贝/毫升)； 

图2为定量参考品的标准曲线，相关系数＝0.999729，说明线性关系非常好，可用于RNA拷贝数的定量分析； 

图3为阴性参考品、阳性对照品的荧光PCR扩增曲线。 

图4为临床阳性样本的AML1和TEL-AML1荧光RT-PCR扩增曲线。所测得阳性样本AML1扩增曲线Ct值在24～30之间，所测得阳性样本AML1扩增曲线Ct值在30～38之间，均在定量参考品线性范围之内。 

具体实施方式：

应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。 

实施例1：试剂盒的制备 

1.引物和探针设计与合成 

使用Primer Express 2.0，分别在AML1基因非融合区域及TEL和AML1基因融合区域，设计筛选处于保守区的探针，在选择好的探针基础上设计AML1基因和TEL-AML1融合基因的上下游引物。引物与探针均委托专业公司(生工)合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化，探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA荧光基团。 

扩增序列如表1： 

表1.特异性探针与引物序列 

序列名称	寡核苷酸序列(5’-3’)	碱基长度(bp)
			AML1探针	TCAGCCTCACCCCTCTAGCCCTAC	24
TEL-AML1探针	AGCAGAATGCATACTTGGAATGAATCCT	28
			AML1正向引物	TCGGAGCGAAAACCAAGACAG	21
AML1反向引物	GAGTCCCAGAGGTATCCAGCAG	22
			TEL-AML1正向引物	GCACGCCATGCCCATTGGGA	20
TEL-AML1反向引物	CGGTGGAAGGCGGCGTGAAG	20

2.AML1质粒阳性模板定量参考品的制备 

本实施例中AML1质粒作为阳性模板用于制备定量参考品。 

使用步骤1中合成的扩增AML1特异性引物扩增AML1非融合区域序列，将经过纯化的PCR产物连接到PMD18-T载体上；然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；通过蓝白斑筛选，构建AML1重组质粒DNA作为灵敏度参考品。构建的AML1重组质粒经双向DNA测序鉴定。提取质粒，紫外分光光度计定量，稀释到5.0×10¹⁰拷贝/毫升于-20℃保存。 

3.TEL-AML1融合基因阳性对照品的制备 

本实施例中TEL-AML1质粒作为阳性模板用于制备阳性对照品。 

使用步骤1中合成的扩增TEL-AML1特异性引物扩增TEL-AML1融合基因特异序列，将经过纯化的PCR产物连接到PMD18-T载体上；然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；通过蓝白斑筛选，构建TEL-AML1重组质粒DNA作为阳性对照品。构建的TEL-AML1重组质粒经双向DNA测序鉴定。提取质粒，紫外分光光度计定量，稀释到5.0×10¹⁰拷贝/毫升于-20℃保存。 

4.对照品选择 

使用正常人血清为阴性对照；TEL-AML1重组质粒(5×10⁶拷贝/毫升)为阳性对照。 

5.荧光PCR反应液I组成 

表2.荧光PCR反应液I组成 

原料名称	终浓度
		PCR Buffer	(0.8-2)×
MgCl2	2-5mM
		dNTP	0.1-0.5mM
AML1引物	0.1-0.50μM
		AML1探针	0.1-0.50μM
PCR Enhancer	0.4-2U
		RT-PCR酶	0.5-3U
H2O	适量
		DNA模版	15μL
总体积	50μL

6.荧光PCR反应液II组成 

表3.荧光PCR反应液II组成 

原料名称	终浓度
		PCR Buffer	(0.8-2)×
MgCl2	2-5mM
		dNTP	0.1-0.5mM
TEL-AML1引物	0.1-0.50μM
		TEL-AML1探针	0.1-0.50μM
PCR Enhancer	0.4-2U
		RT-PCR酶	0.5-3U
H2O	适量
		DNA模版	15μL
总体积	50μL

实施例2：试剂盒的使用 

1.样本提取 

使用RNA提取液抽提待测样品血液的总RNA 

操作步骤： 

1)取0.5ml离心管，加入150μLRNA提取液，然后加入100μL待测样本(EDTA抗凝血)，充分混匀。 

2)加入50μL氯仿，4℃，13000rpm，离心15min。 

3)将离心后的上层至新的离心管中，加入100μL异丙醇，室温放置10min。 

4)4℃，13000rpm，离心15min。 

5)轻轻倒去上清，置于吸水纸上，加入300μL，冰预冷75％乙醇，4℃，13000rpm，离心10min。 

6)轻轻倒去上清，置于吸水纸上，简短离心，用枪头小心的吸弃上清，室温干燥1-5min。 

7)加入30μL DEPC水，自然溶解，置于冰上备用(2h内)。 

2.定量参考品准备 

将AML1质粒阳性模板定量参考品用DEPC水进行梯度稀释，浓度分别为5.0×10⁷，5.0×10⁶，5.0×10⁵，5.0×10⁴拷贝/毫升。 

3.阳性对照品准备 

将TEL-AML1融合基因阳性对照品用DEPC水进行梯度稀释，将其稀释到终浓度5.0×10⁶拷贝/毫升。 

4.样本检测 

分别取步骤1中提取的核酸，步骤2中获得的梯度稀释的定量参考品，作为RNA模板，加入RT-PCR酶、PCR Enhancer、及含有特异性PCR引物和特异性荧光探针的荧光定量反应液I中，组成PCR反应体系I。分别取步骤1中提取的核酸、步骤3中获得的阳性对照品和阴性对照，作为RNA模板，加入RT-PCR酶、PCR Enhancer、及含有特异性PCR引物和特异性荧光探针的荧光定量反应液II中，组成PCR反应体系II。在PCR反应体系I中分别加入已经稀释混匀好的AML1质粒标准品(5.0×10⁷，5.0×10⁶，5.0×10⁵，5.0×10⁴拷贝/毫升)，作为样本定量判定的标准。 

体系各主要成分如下： 

5.反应程序 

设置收集FAM荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入荧光PCR仪(ABI7500)开始扩增，反应程序如下： 

表4.PCR反应程序 

6.结果判断 

基线范围的Ct值(循环数)为6-15或由软件自动选择，设定阈值使之超过无规则扩增曲线的最高值。荧光PCR仪不同，所得基线范围的Ct值会有所不同。 

7.质控标准 

(1)各类对照质控品判断结果如下表： 

表5.质控品标准检测结果 

	质控品	标准检验结果
			1	阴性对照	无扩增
3	阳性对照	22＜Ct值≤25

图3为阴性对照和阳性对照的荧光PCR扩增曲线，其中阴性对照无扩增，阳性对照Ct＝23。 

(2)定量参考品质控判断方法：梯度稀释的AML1质粒阳性模板定量参考品质粒，经扩增做出标准曲线，当相关系数＞0.99时可用于AML1和TEL-AML1RNA拷贝数的定量分析；否则要重新实验。图1为定量参考品扩增后得到的扩增曲线，根据该曲线得到的标准曲线为图2。 

7.结果报告： 

图4为临床样本的AML1和TEL-AML1荧光RT-PCR扩增曲线。所测得阳性样本Ct值在20～38之间，在定量参考品线性范围之内，且样本AML1扩增曲线Ct值小于TEL-AML1扩增曲线Ct值。 

样本结果的判断标准如下： 

表6.报告样本检测结果 

序列表 

<110>上海裕隆临床检验中心有限公司 

<120>定量检测白血病融合基因TEL-AML1荧光RT-PCR试剂盒 

<160>8 

<210>1 

<211>96 

<212>DNA 

<213>人属(HOMO) 

<400>1 

tcggagcgaa aaccaagaca ggtcactgtt tcagcctcac ccctctagcc ctacatctct    60 

ctttcttctc ccctctgctg gatacctctg ggactc                              96 

<210>2 

<211>107 

<212>DNA 

<213>人属(HOMO) 

<400>2 

gcacgccatg cccattggga gaatagcaga atgcatactt ggaatgaatc cttctagaga    60 

cgtccacgat gccagcacga gccgccgctt cacgccgcct tccaccg                 107 

<210>3 

<211>21 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作定量检测白血病融合基因TEL-AML1荧光RT-PCR试剂盒中扩增检测AML1基因的正向引物。 

<400>3 

tcggagcgaa aaccaagaca g                                              21 

<210>4 

<211>22 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用定量检测白血病融合基因TEL-AML1荧光RT-PCR试剂盒中扩增检测AML1基因反向引物。 

<400>4 

gagtcccaga ggtatccagc ag                                    22 

<210>5 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作定量检测白血病融合基因TEL-AML1荧光RT-PCR试剂盒中扩增检测TEL-AML1融合基因的正向引物。 

<400>5 

gcacgccatg cccattggga                                       20 

<210>6 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作定量检测白血病融合基因TEL-AML1荧光RT-PCR试剂盒中扩增检测TEL-AML1融合基因的反向引物。 

<400>6 

cggtggaagg cggcgtgaag                                       20 

<210>7 

<211>24 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作定量检测白血病融合基因TEL-AML1荧光RT-PCR试剂盒中检测AML1基因的探针。 

<400>7 

tcagcctcac ccctctagcc ctac                                  24 

<210>8 

<211>28 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作定量检测白血病融合基因TEL-AML1荧光RT-PCR试剂盒中检测TEL-AML1融合基因的探针。 

<400>8 

agcagaatgc atacttggaa tgaatcct                            28 

Claims (10)

1.一种定量检测白血病融合基因TEL-AML1的荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括定量参考品、阴性参考品、阳性对照品、荧光PCR反应液I，荧光PCR反应液II；所述的荧光PCR反应液I包括AML1基因引物、AML1特异性荧光探针；所述的荧光PCR反应液II包括TEL-AML1融合基因引物、TEL-AML1特异性荧光探针。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的定量参考品、阳性对照品分别为含有***AML1基因和TEL-AML1融合基因特异序列的PMD18-T载体质粒，所述的***序列分别如下：AML1基因***序列为

TCGGAGCGAAAACCAAGACAGGTCACTGTTTCAGCCTCACCCCTCTAGCCCTACATCTCTCTTT

CTTCTCCCCTCTGCTGGATACCTCTGGGACTC                           96bp；

TEL-AML1融合基因***序列为

GCACGCCATGCCCATTGGGAGAATAGCAGAATGCATACTTGGAATGAATCCTTCTAGAGACGTC

CACGATGCCAGCACGAGCCGCCGCTTCACGCCGCCTTCCACCG               107bp。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的定量参考品为存放浓度为1.0×10¹⁰-5.0×10¹⁰拷贝/毫升的重组质粒。

4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品重组质粒浓度为1.0×10⁶-5.0×10⁶拷贝/毫升。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的阴性参考品为正常人无TEL-AML1融合表达的阴性血清。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的AML1基因引物序列如下：

扩增检测AML1基因的正向引物TCGGAGCGAAAACCAAGACAG     21；

扩增检测AML1基因的反向引物GAGTCCCAGAGGTATCCAGCAG    22。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的TEL-AML1融合基因引物序列如下：

扩增检测TEL-AML1融合基因的正向引物GCACGCCATGCCCATTGGGA  20；

扩增检测TEL-AML1融合基因的反向引物CGGTGGAAGGCGGCGTGAAG  20。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性荧光探针序列如下：

检测AML1基因的探针TCAGCCTCACCCCTCTAGCCCTAC              24；

检测TEL-AML1融合基因的探针AGCAGAATGCATACTTGGAATGAATCCT  28。

9.如权利要求1或8所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，可以是FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5；3’端的为一种荧光淬灭基团，可以是TAMRA、DABCYL、NFQ。

10.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括RT-PCR酶、PCR Enhancer、DEPC水、以及RNA提取液。

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