FI119028B - Menetelmä alkalofiilisten Bacillus-kantojen transformoimiseksi - Google Patents

Description

119028

Menetelmä alkalofiilisten Bacillus-kantojen transformoimiseksi - Förfarande för att transformera alkalofila Bacillus-stammar (Jakamalla erotettu ph:sta 884904) Tämän keksinnön aiheena on serliniproteaasin tehostunut tuotanto Baclllus-kannolssa rekombinaatiomenettelytapoja käyttäen.

Bacillus-laj ej a on käytetty laajalti teollisesti tärkeiden entsyymien kuten alfa-amylaasin, neutraalin proteaasin ja alkalisten proteaasien tai seriiniproteaasien tuotannossa. Yleisesti ottaen bakteeriperäisiä seriiniproteaaseja voidaan saada monista prokaryoottlsista organismeista mukaanlukien gram-negatiiviset organismit kuten Serratla- tai Pseudomonas-lajit ja gram-positiiviset bakteerit kuten Micrococcus- ja Bacillus-lajit. Teollisesti tärkeiden seriiniproteaasien erityisen kiinnostava ryhmä ovat korkean aktiivisuuden emäksisessä ympäristössä omaavat proteaasit. Eri Bacillus-laj ien, mukaanlukien B^ subtllls, B. licheni-formls, B. amylollguefaciens, B. alcalophllus ja muut Bacillus-lajit, tuottaessa teollisia seriiniproteaaseja, korkea-alkalisia (high alkaline) proteaaseja tuottavat yleensä Bacillus-laj it, jotka kykenevät kasvamaan » · : emäksisessä pHrssa. Esimerkki tällaisesta Bacillus-lajista on Bacillus novo -laji PB92.

Proteolyyttisten entsyymien, erityisesti korkea-alkalisten • · proteaasien, tuottamiseen siten, että saanto on korkea, kykenevien Bacillus-kantojen kehittämistä kohtaan tunnetaan huomattavaa kiinnostusta.

• · • · • · · *'**: Useita solunulkoisten Baclllus-entsyymien geenejä on kloo- . nattu menestyksekkäästi, kuten alfa-amylaasigeenit orga- f · · **.*./ nismeista, B. amylollguef aciens (Palva et ai., Gene 15 '·;** (1981) 43-51), B. llchenlformls (Ortlepp, Gene 23_ (1983) • · ;,· · 267), B. stearothermophllus (Mlelenz et ai., Proc. Natl.

« • · 2 119028

Acad. Sei. USA 80 (1983) 5975-5979; EPA-0057976 ja B. sub-tilis Yang et al., Nucleic Acids Res. 3Λ (1983) 237); Te-vaanisukraasigeeni B. subtills (Gay et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 1424); neutraalia proteaasia koodaavat geenit B. stearothermophilus (Fuji et al., J. Bacteriol. 156 (1983) 831), B. amyloliquefaclens (Honjo et al., J. Biotech. 1^ (1984) 165) ja B, subtllis (Yang et al. , J. Bacteriol. 160 (1984) 115; seriiniproteaasia tai emäksistä proteaasia koodaavat geenit B. subtilis (Wong et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 1184), B. lichenifor-mls (Jacobs et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8913) ja B. amyloliquefaclens (Wells et al., Nucleic Acids Res. 11. (1983) 7911).

Teollisten seriiniproteaasien tuottamista eri Baclllus-lajeissa kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa n:ot 3,674,643; 3,723,250; ja 4,480,043. Emäksisessä pH:ssa kasvamaan kykenevien Bacillus-kantojen korkea-alkalisen proteolyyttisen entsyymin tuotantoa kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa n:ot 3,723,250; Re. 30,602 ja 4,480,037. Yleiskatsauksen osalta koskien Bacillus-lajien käyttöä teollisesti tärkeiden entsyymien tuottamiseksi : katso esimerkiksi Debabov, 'The Industrial Use of Bacilli' 000 · ·:··· kirjassa The Molecular Biology of Bacilli (Academic Press, ....: New York, 1982).

• · • ·

Menetelmän B. subtiliksen protoplastitransformaation suo- • a *** rittamiseksi ovat kuvanneet Chang ja Cohen (Mol. Gen.

, Genet. 168 (1979) 111-115). Samankaltaisia menetelmiä on • 0 0 '•j·* kuvattu transformoinnin suorittamiseksi menestyksekkäästi, # 0 *·.♦* kun kyseessä ovat B. meqaterium-protoplastit (Vorobjeva et ·♦♦·: al., FEMS Microbiol. Letters 7 (1980) 261-263), B. amylo- liquefaciens-protoplastit (Smith et al., Appi. and Env.

Microbiol. 51 (1986) 6 34), B. thuringiensis-protoplastit • · · ~" \ (Fisher et al., Arch. Microbiol. 139 (1981) 213-217), B.

0 0· ' ' *· sphaericus-protoplastit (McDonald, J. Gen. Microbiol. 130 3 119028 (1984) 203), ja B. larvae-protoplastit (Bakhiet et ai.,

Appi. and Env. Microbiol. £9 (1985) 577). Bakhiet et ai., supra, ilmoittivat kuitenkin epäonnistumisesta B. popil-laen kohdalla. Mann et ai., Current Microbiol. 12 (1986) 131-135, ilmoittivat lajien B. polymyxa, B. licheniformis, B. macerans ja B. laterosporus menestyksekkäästä transfor-moinnista. Menetelmä ei kuitenkaan ollut tuloksekas lajien B.coaqulans, B. cereus ja B. pumilus kohdalla, vaikka todettiin hyvää protoplastimuodostusta. Muihin menetelmiin DNA:n viemiseksi protoplasteihin kuuluu fuusioiminen DNA:ta sisältäviin liposomeihin, Holubova, Folia Microbiol. 30 (1985) 97.

Keksinnön kohteena ovat uudet alkalofiiliset Bacillus-isäntäsölut sekä menetelmä tällaisten solujen trans-fOrmoimiseksi. Isäntäsolu, joka omaa edullisesti positiivisen taustan, transformoidaan käyttäen DNA-rakennetta, joka käsittää korkea-alkalista proteolyyttistä entsyymiä koodaavan geenin. Voidaan käyttää protoplastitransformointia DNA-rakenteen avulla polyetyleeniglykolin läsnäollessa emäksisessä pH:ssa. DNA-sekvenssiä voidaan ylläpitää kromo- • · · *· sominulkoisesti tai se voidaan integroida isäntäsolu- • · • · · M t genomiin.

» · • · ··· • · * * -_s ti* II» * ·

Lyhyt kuvaus piirroksista: • · · *”;* Kuviossa l esitetään tulokset histidiini/MOPS-geeli- • · *”* elektroforeesiajosta, joka suoritettiin pUB110:n tai vas- *:1: taavasti pM58 sisältävien B. subtills DB104 - viljelmien ·;··· supernatanteilla, verrattuna useihin subtilisiineihin.

··· * · · *;*! vyöhyke l: Carlsberg-subtil isiini • * * *: vyöhyke 2: Bacillus PB92 -proteaasi 4 119028 vyöhyke 3: Bacillus subtills -subtllisiini vyöhyke 4: Bacillus subtilis DB104 (pM58) vyöhyke 5: Bacillus subtills DB104 (pUBHO)

Kuviossa 2 esitetään plasmidin pM58 restriktiokartta. Kuvion yläosassa esitetään edelleen sekvenssolmlsstrategia. Nuolilla varustetut kiinteät viivat edustavat faagi Ml 3 -vektoreihin mplO, mpll ja mpl8 kloonattuja fragmentteja. Kuvion alaosassa esitetään sekvenssolmlsstrategia, jossa käytetään proteaasigeenissä tasaisin välein sijaitsevia 10 oligonukleotidiä.

Kuviossa 3 esitetään koodaavan juosteen nukleotidisekvens-si korreloituna Bacillus PB92 -seriiniproteaasin aminohapposekvenssiin. Promoottorit (P-^ P2), ribosomisitoutumis-keskukset (rbs) ja lopetusalueet (term) on niinikään esitetty. Numeroidut kiinteät viivat edustavat sekvensoinnissa käytettyjen 10 oligonukleotidin sijaintikohtia.

Kuviossa 4A esitetään plasmidin pE194-neo rakentaminen.

• · ♦ *· “ Kuviossa 4B esitetään plasmidin pMAX-4 rakentaminen.

• · « * « « « · • · · · ’"‘ί Tämän keksinnön mukaan tarjotaan uusia Bacillus - *ί**ϊ kantoja proteolyyttisten entsyymien tuottamiseksi siten, että saanto on korkea, sekä menetelmiä niiden vai- • ♦ · :***; mistamiseksi. Isäntäsolut transformoidaan yhdistämällä • · ·

Bacillus-lsäntäkannasta valmistetut protoplastit fuusioi- . misolosuhteissa plasmidirakenteeseen, joka käsittää jotain ♦ · · proteolyyttistä entsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin.

♦ · ···

Korkea-alkaliset proteaasit ovat seriiniproteaaseja tai subtilisiineja, jotka ovat erittäin aktiivisia emäksisessä ympäristössä. Tarkemmin ottaen korkea-alkalisten proteaa- • · · ,·. . sien optimiaktiivisuus ilmenee yli noin 9:n ylittävillä • ·· pH-arvoilla ja ne säilyttävät tästä optimiaktiivisuudesta 5 119028 ainakin 80 % pH;ssa noin 11 tai jopa yli. Korkea-alkalisia proteaaseja tuottavat yleensä emäksisessä pH:ssa kasvamaan kykenevät Bacillus-kannat.

Proteaasigeenin eristyksessä käytetyt menetelmät ovat alalla tunnettuja ja niitä ovat synteesi, eristys genomi-DNArsta, valmistaminen cDNA:sta tai näiden yhdistelmät. Korkea-alkalistaproteaasia koodaavien geenien eristys ja ilmentäminen on julkistettu tämän patenttihakemuksen pohjana olevassa etuoikeusasiakirjassa, EP-hakemusjulkaisussa n:o EP-A-87200358.7, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteenä. Eri menetelmät geenien manipuloimiseksi ovat tunnettuja ja niihin lukeutuvat restriktio, pilkkominen, uudelleenpilkkominen (resection), ligatointi, in vitro-mutatointi, alukkeen avulla korjailu (primer repair), liittäjien ja siltasekvenssien käyttö ja muut samankaltaiset menetelmät. Katso Maniatis et ai.. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.

Yleisesti ottaen menetelmä käsittää genomikirjaston vai- • · · *· " mistamisen korkea-alkalista proteaasia ilmentävästä orga- • · : nismista. Luovuttajamikro-organismin genomi eristetään ja *·1" pilkotaan soveltuvalla restriktioentsyymillä. Saadut luo- *:**: vuttaj akannan DNA-fragment it ligatoidaan sitten kloonaus- vektoriin, joka on pilkottu yhteensopivalla restriktioen- ··« ·***. donukleaasilla.

• · «·· , insertoidun DNA-fragmentin sisältävät kloonit voidaan tun- • · 1 nistaa resistenssimerkin avulla tai käyttämällä jotain • 1 “ suoraa tai positiivista valikoimismenettelyä kuten B. sub- tilikselle (Gryczan ja Dubnow, Gene 20 (1982) 459-469) ke- *:·1: hitetty menettely. Lisäksi korkea-alkalista proteaasia il- .··. mentävät kloonit voidaan tunnistaa käyttämällä ilmentymis- • · « . tuotteen vastaisia vasta-aineita tai toteamalla kyseisen ’ proteolyyttisen entsyymin substraatin hävikki tai tuot- 119028 e teenmuodostus. Esimerkiksi merkkigeeniä, kuten antibioot-tiresistenssigeeniä, ilmentäviä pesäkkeitä voidaan seuloa proteaasituotannon suhteen, jolloin viimemainittu määritetään kaseiinikehäsaostuman kasvun perusteella kaseiinia sisältäville maljoille maljattujen pesäkkeiden ympärillä.

Kun täydellinen geeni on tunnistettu, joko cDNA:na tai kromosomi-DNA:na, sitä voidaan manipuloida lukuisilla tavoilla ilmaisun aikaansaamiseksi. Voidaan käyttää Bacil-lus-lsäntiä, jotka ovat esimerkiksi alkalofiilisiä bakteereita, mukaanlukien ne alkalofiiliset Bacillus-lajit, jotka jo tuottavat korkea-alkalisia proteaaseja. Edullinen isäntäorganismi on Bacillus novo -laji PB92. Sen vuoksi on käytännöllistä ylläpitää villityyppisekvenssiä, joka omaa säätösignaaleja ja erittyviä johtosekvenssejä, jne., vaikka muistakin Bacillus-lajeista saatuja, kyseisessä Bacll-lus-isäntäkannassa funktionaalisia kontrollialueita voidaan niinikään käyttää. Jonkin Bacillus-solun transformoitiin soveltuva vektori sisältää täten korkea-alkalista proteaasia koodaavan rakennegeenin, joka voidaan saada jostain alkalofiilisesta Baclllus-lajista, esim. säätö-alueita, kuten esim. promoottorisekvenssin, ribosomisitou- ·. “· tumiskeskuksen muodostavan sekvenssin ja emäksistä prote- * · : aasia koodaavan geenin transkription ja translaation lope- * tusta sääteleviä sekvenssejä, jotka ovat alkalofiilisessä *:**: Baclllus-lsäntäsolussa funktionaalisia.

• · · • * • · • * * .***· Vektori voi sisältää lisäksi merkkigeenin, esimerkiksi ··· tuottamaan resistenssin jollekin antibiootille, jolle ky- ,···. seinen isäntäkanta on herkkä, sekä jonkin toisiintumisal- • * kukohdan, joka kykenee toisiintumaan itsenäisesti isäntä- **.* solussa. Toisiintumisalkukohta voi käsittää mutaation, jo- • * ·.· · ka tekee sen toiminnasta isäntäsolussa lämpötilaherkän, :***: jolloin mahdollistuu kromosomi-integraation esiinseulonta . *·. Ehrlichin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 1433, ku- ♦ * · I vaarnan mukaan.

• « 7 119028

Aminohapposekvenssiä voidaan käyttää sellaisen koettimen suunnittelemiseksi ja rakentamiseksi, jolla seulotaan korkea-alkalista proteaasia koodaavan geenin luovuttajaso-luina kiinnostavista soluista peräisin olevasta mRNA:sta tai DNA:sta valmistettua genomikirjastoa. Käyttämällä korkea-alkalista proteaasia koodaavaa cDNArta tai sen fragmenttia hybridisaatiokoettimena voidaan helposti kloonata muista organismeista tavattuja rakenteellisia suku-laisgeenejä. Erityisen kiinnostavaa on geenien eristys korkea-alkalisia seriiniproteaaseja ilmentävistä organismeista käyttämällä oligonukleotidikoettimia, jotka perustuvat alkalofHiisistä Bacillus-kannoista, mukaanlukien Bacillus novo -lajista PB92, saatavissa olevien korkea-alkalisia seriiniproteaaseja koodaaviin nukleotidisekvens-seihin. Tällaiset koettimet voivat olla huomattavasti lyhyempiä kuin sekvenssi kokonaisuudessaan, mutta niiden pituuden tulisi olla vähintään 10, edullisesti vähintään 15 ja edullisemmin 20 nukleotidia. Pidemmätkin oligonuk-leotidit ovat hyödyllisiä aina geenin täyteen mittaan asti, jolloin pituus ei edullisesti ylitä 1200 nukleotidia. Voidaan käyttää sekä RNA- että DNA-koettimia.

• · • · · • «« • * Käytännössä koettimet leimataan tyypillisesti jollain to- ·}··· dettavalla tavalla (esim. 32P:llä, 3H:lla, biotiinilla tai avidiinilla), minkä jälkeen niitä inkuboidaan organismis- .···. ta, josta geeniä etsitään, peräisin olevan yksisäikeisen • · ,!··. DNA:n tai RNA:n kanssa. Hybridisoitumlnen todetaan leiman • f avulla, sen jälkeen kun yksisäikeinen ja kaksisäikeinen . (hybridisoitunut) DNA (tai DNA/RNA) on erotettu toisistaan • · · ’;j;* (tyypillisesti nitroselluloosapaperia käyttäen). Alan am- • » *···* mattilaiset ovat hyvin perillä oligonukleotidien yhteydes- ·;··· sä käytettäviksi soveltuvista hybridisoimismenettelyistä.

• «•M • ·

Vaikka koettimia käytetään normaalisti helpon tunnistuksen • · · '** *t mahdollistavan todettavan leiman kanssa, myös leimaamatto- • · t *· *· mat oligonukleotidit ovat hyödyllisiä sekä leimattujen ko- β 119028 ettimien prekursoreina että käytettäviksi menetelmissä, jotka mahdollistavat kaksisäikeisen DNA:n (tai DNA/RNA:n) suoran toteamisen. Tämän mukaisesti ilmaisu oligonukleoti-dikoetin viittaa sekä leimattuihin että vailla leimaa oleviin muotoihin. Ligatointiseoksella transformoidaan sitten transformoitumiskelpoisia B. subtilis-soluja. Merkkigeeniä valikointikeinona käyttäen voidaan sitten eristää rekömbi-nanttiplasmideja, joita voidaan karakterisoida restriktio-analyysin ja sekvenssoinnin avulla.

Tämä keksintö koskee menetelmää alkalofiilisten Bacillus-solujen transformoimiseksi, ja sille ovat tunnusomaisia patenttivaatimuksessa 1 esitetyt menetelmävaiheet. Lisäksi edellytetään, ettei menetelmässä käytetty DNA-rakenne, eikä myöskään keksinnön mukaisen.alkalofiilisen Bacillus-isäntäsolun sisältämä ilmentämisrakenne sisällä DNA-sek-venssiä, joka koodaa sellaista korkea-alkalista seriini-proteaasia, jolla on ainakin 70 %:n.homologia aminohappo-sekvenssiin • · H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N~R-G-L-T-G-S-G~V-K-V-A- • * * v-l-d-t-g-i-s-t-h-p-d-l-n-i-r-g-g-a-s-f-v-p-g-e-p-s-t-q-d-g-n- *:**: g-h-g-t-h-v-a-g-t-i-a-a-l-n-n-s-i-g-v-l-g-v-a-p~n-a-e-l-y-a-v- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S*-I“A“Q-G-L“E-W-A-G-N-N-G~M-H-V-A-N-L- .···. S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- • * I" S-G-A“G~S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G“A-T-D-Q-N-N~N-R-A-S-F-S- • · *···' Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L.-N-G-T-S- M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q -1 -R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH, ··· • · • · ··« *.:.Σ nähden, eikä se sisällä endogeenista mielenkiinnon kohtee- ··· na olevaa entsyymiä koodaavaa DNA-sekvenssiä.

• · • · • ··

Toivottavaa on, että ilmentymistuote erittyy. Koska emäksinen proteaasi erittyy, voidaan käyttää villityypin i 119028 9 johto- ja prosessoimissignaaleja. Lisäksi voidaan valmistaa fuusioitu geeni varustamalla rakennegeeni 5'-sekvenssillä, joka koodaa erittyvää johto- ja prosessoimissignaa-lia. Edustavia heterologisia erittyviä johtosekvenssejä ovat Bacillus-amyjaasi- ja Bacillus-proteaasigeenien erittyvät johtosekvenssit. Fuusioimalla tarkoituksenmukaisella lukualueella erittyvä johtosekvenssi kiinnostavaan raken-negeeniin kasvualustaan saadaan erittymään kypsä alkalo-fiilinen proteaasi.

Ilmentämiskasetti voi olla täysin tai osittain peräisin luontaisista lähteistä ja olla täysin tai osittain peräisin isäntäsoluun nähden homologisista lähteistä, tai isän-täsoluun nähden heterologisista lähteistä. Keksinnön mukaiset eri DNA-rakenteet (DNA-sekvenssit, vektorit, plas-midit, ilmentämiskasetit) eristetään ja/tai puhdistetaan, tai syntetisoidaan, jolloin ne eivät ole "luontaisesti esiintyviä".

Riippuen siitä, halutaanko rakennegeenin integroituvan isäntäkannan kromosomiin vai kromosominulkoisen yksikön tulevan ylläpidetyksi, voidaan mukaan sisällyttää toi- ·. : siintumisjärlestelmä Bacillus-laj ia varten tai olla sitä .* .* sisällyttämättä, integrointia silmälläpitäen plasmidira- • * · *** t kenteen homologisia jaksoja Baclllus-qenomiin nähden voi- | daan käyttää rekombinoitumistodennäköisyyden kasvattami- * * seksi. Lisäksi lämpötilaherkän toisiintumisalkukohdan si- • · :...* säilyttäminen plasmidirakenteeseen mahdollistaa valikoin- • ·· nin kromosomi-integraation suhteen. Katso esimerkiksi Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 1433.

»«* • ♦ • · ··« ·“*: Isäntäsoluun voidaan insertoida rakennegeenistä useampi • · · . *. kuin yksi kopio rakennegeenin ilmentymisen vahvistamisek- * · · :;j.: si. Rakennegeenin stabiili vahvistuminen voidaan saada in- • * ’···* tegroimalla isäntäsolugenomiin rakennegeenistä vähintään : yksi ylimääräinen kopio ja valikoimalla transformanttien φ • · 10 119028 suhteen, joissa rakennegeenin kopioita erottavat endogee-niset kromosomaaliset sekvenssit. DNA-rakenteita ja menetelmiä prokaryoottisille järjestelmille kuvataan EP-hake-musjulkaisussa n:o EP-A-87200356.1, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteenä.

ToisiintumisjärjestelmSn ohella plasmidirakenteeseen sisältyy tavallisesti vähintään yksi merkkigeeni. Merkkigee-nillä tarkoitetaan jossain isännässä ilmentymään kykenevää rakennegeeniä, joka tuottaa biosidi- tai virusresistens-sin, tai resistenssin raskasmetalleille, immuniteetin tai muuta vastaavaa. Biosidiresistenssin kyseessä ollessa tämä saattaa käsittää resistenssin antibiooteille, esimerkiksi neomysiinille, kanamysiinille, tetrasykliinille jne. Merkkigeeni valitaan mahdollistamaan valikointi alhaisten kopiolukujen ja sellaisen antibioottipitoisuuden kyseessä ollessa, joka ei vakavasti häiritse rekombinanttisolujen kasvua. Erityisen kiinnostava on neomysiiniresistenssi.

Eri DNA-sekvenssit voivat olla peräisin vaihtelevista • . lähteistä ja ne voidaan liittää toisiinsa vektorin saarni- • ·* .* seksi, joka sisältää yhden tai useamman kätevän, edulli- • · t **· | sesti yksittäisen restriktiokeskuksen, jolloin on mahdol- | lista insertoida tai korvata rakennegeenit näihin keskuk- * * siin plasmidirakenteen saamiseksi.

• I· • · • « ··· «··

Kun plasmidirakenne on valmistettu, sillä voidaan transformoida soveliaita isäntäsoluja. Bacillus-isäntä voi olla : mikä tahansa Bacillus-kanta, loskin soveliasta kantaa va- ·♦♦ ...........

*“*. littaessa otetaan huomioon tekijät, jotka mahdollisesti te- ··· *. hostavat korkea-alkalisten proteaasien tuotantoa. Tuotan- ] toa voidaan tehostaa lukuisilla tavoilla, mukaanlukien ’ isännän käyttäminen, jossa halutun tuotteen hajoaminen on :*·*: alentunut, säätösignaalit tulevat tunnistetuiksi, eritys :*·_? sujuu vaikeuksitta, jne. Täten vaikka edullinen Bacillus- isäntä tuottaa jotain korkea-alkalista proteaasia, ja on 11 119028 joko villityypin Bacillus tai mutantti-Baclllus, Baclllus-isäntä voi niinikään olla jonkin korkea-alkalisen proteaa-sin tuottavan Bacilluksen mutantti, joka ei tuota korkea-alkalista proteaasia.

Korkea-alkalisia proteaaseja tuottavat Baclllus-laj it eivät ole taksonomisesti hyvin luokiteltuja ja niihin viitataan yleensä alkalofiilisinä Baclllus-kantoina. Esimerkkejä emäksisessä pH:ssa kasvamaan kykenevistä Bacillus-kannoista kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa n:ot 3,723,250; Re. 30,602 ja 4,480,037. Eräs esimerkki edullisesta alkalofiilisesta Bacillus-isäntäkannasta on kanta Bacillus novo -laji PB92, joka on julkaistu mm. US-patenttijulkaisussa n:o Re. 30,602.

Isäntäsoluina voidaan käyttää myös teollisia alkalofiili-siä Bacillus-kantoja Teolliset Bacillus-kannat ovat peräisin organismeista, jotka ovat eristettävissä maaperästä tai ovat saatavissa talletuslaitoksista tai muista lähteistä, ja ne saadaan tällaisia Bacillus-kantoj a geneettisesti modifioimalla. Teollisille Bacillus-kannoille on \**i tunnusomaista vastustuskyky geenivaihtoa kohtaan, kuten faa- : gitartutusta tai transformointia kohtaan. Kyseiset kannat 9 ***** ovat stabiileja ja ne saattavat valinnaisesti kyetä itiön- *!··: muodostukseen. Ne ovat yleensä prototrofisia ja niitä on :***: yleensä modifioitu tuottamaan endogeenisten proteiinituot- ··· ····. teiden, kuten entsyymien alfa-amylaasi ja eri proteaasit, suuria saantoja. Teollisessa tuotantoprosessissa saadun . .·. endogeenisen proteiinituotteen saanto saattaa olla ainakin • * · #I*^ 5 g/1 (0,5 % w/v). Teolliset kannat erittävät myös DNA- • · *" aaseja, mistä seurauksena DNA hajoaa kasvualustassa, mikä ***** puolestaan tuottaa suojan geenivaihtoa vastaan.

Alkalof Ulisten Bacillus-kantoj en transformointiin liittyy • · · * -* . edullisesti sanotuista kannoista peräisin olevien proto- • ·· plastien käyttö. Kuitenkaan cohenin et ai., supra, kuvaa- ! 119028 12 man mukainen tavanomainen protoplastitransformoimisjärjes-tely ei toimi alkalofiilisten Bacillus-kantoj en kyseessä ollessa. Tämän vuoksi on kehitetty lisäjärjestelyjä.

Alkalofiilisten Baclllus-laj ien kyseessä ollessa proto-plastien muodostuminen ja regeneraatio voivat tapahtua korkeassa pHrssa, edullisesti pHrssa noin 8. Protoplasteja voidaan valmistaa uudelleensuspendoimalla solut emäksiseen ylläpitoalustaan (Alkaline Holding Medium, AHM), pH 7,8 -8,5, minkä jälkeen soluja inkuboidaan 30-80 minuutin ajan 37eC:ssa. Esimerkin yhdestä AHM:stä osalta katso esimerkki 5. Saadut protoplastit pestään sitten lysotsyymin poistamiseksi, minkä jälkeen ne uudelleensuspendoidaan AHM:ään. Sitten plasmidirakenne ja alkalofiilinen Bacillus-lsäntä-protoplasti yhdistetään sopivan fusogeenin läsnäollessa. Vaikka voidaan käyttää mitä tahansa halutun tehokkuuden tuottavaa fusogeenia, useimmissa tapauksissa polyetylee-niglykolin (mp. 1000 - 8000) on todettu tuottavan erittäin tehokas fuusio, johon yhdistyy hyvin kätevä käyttö. Vastaanottavasta Baclllus-kannasta valmistettuja protoplasteja ja plasmidirakennetta sekoitetaan keskenään ei 5 minuuttia ylittävän ajan, edullisesti ei pitempää kuin 2 mi-·. : nuuttia, polyetyleenigykolin läsnäollessa. Sitten fusogee-

• M

.* niseos korvataan tavanomaisella ravinnekasvualustalla, *** *. jossa soluja inkuboidaan korkeintaan 5 tunnin ajan, edul lisesti 2-3 tuntia, ennen kuin ne siirretään regeneroimis-| * maljoihin. Regeneroimismaljat sisältävät jotain antibioot- :...: tia kuten neomysiiniä transformanttien valikoimiseksi.

• · · • · • · • ♦ ·

Kloonit, joissa DNA-rakenteen ylläpito on episomaalinen, voidaan tunnistaa toteamalla korkea-alkalisen seriinipro-··· * ·"*: teaasin ilmentyminen. Niiden kloonien tunnistamiseksi, *·· .*. jotka sisältävät ilmentämisrakenteen kromosominsa inte- • · · graalisena osana, kehittyvät kloonit seulotaan eristämällä • · *···' kokonaissolu-DNA ja valikoimalla ne kloonit, joissa ei ole : todettavissa vapaata plasmidi-DNA:ta, mutta joissa plasmi- • · 119028 13 din merkkigeeni ilmentyy. Kloonit voidaan sitten seuloa sopivilla tavoilla erittäin emäksisen proteaasin ilmentymisen toteamiseksi.

Eri toteamismenettelyltä ovat spesifisten vasta-aineiden käyttö, DNA- tai RNA-hybridisaatio, entsyymituotteen muodostuminen tai entsyymin substraatin häviäminen, ja niitä voidaan käyttää kloonien seulomiseksi ilmentämisrakenteen ja kiinnostavan rakennegeenin ilmentymisen, eli proteaasi-tuotannon, läsnäolon toteamiseksi. Syntynyttä proteaasia voidaan karakterisoida biokemiallisesti esimerkiksi määrittämällä proteaasin molekyylipaino SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesiajon, histidiini/MOPS-geelielektro-foreesin avulla ja määrittämällä kineettiset parametrit Km ja vmax, jolloin määritys suoritetaan synteettisen substraatin sukkinyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-prolyyli-L-fe-nyylialanyyli-p-nitroanilidin avulla.

Ilmentämisrakenteen episomaalisesti tai kromosomin integroituneena sisältävänä Bacillus-isäntää viljellään sitten ravinnekasvualustassa entsyymin syntetisoitumista suosivissa olosuhteissa. Ravinnekasvualusta sisältää tavalli- *.; sesti jonkin keinon plasmidin ylläpitämiseksi, jollainen « · · .1 / on esimerkki jonkin antibiootin läsnäolo, jolle ei-trans- *** formoitu isäntä on herkkä. Käyttämistä voidaan jatkaa, kunnes kasvatusliemi on tullut loppuunkäytetyksi. Jos tuo- * te on erittynyt, tuote voidaan eristää kasvatusliemestä • · · tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi uuttamalla, kro- « 2 matografisesti, elektroforeettisesti tai muulla vastaavalla tavalla. Jos tuote on jäänyt sytoplasmaan, solut ote-taan talteen sentrifugoimalla, suodattamalla jne., tuote- ··· ·***: taan niihin lyysi mekaanisesti rikkomalla, detergentin tai • · · , ·. lysotsyymin avulla, tai muilla menetelmillä, ja eristetään • t · *· tuote kuten aiemmin on kuvattu. Ei-transformoidun isäntä- * 1 1 1 *·;·1 solun ollessa korkea-alkalisen proteaasin tuottaja kyseis- • · ·’: tä menetelmää käyttämällä voidaan päästä korkea-alkalisen 2 »·· ♦ 14 119028 proteaasin runsaasti kasvaneisiin saantoihin, jotka ovat tavallisesti vähintään noin 120 % ei-transformoidun isän-täsolun saannosta, vain yhden kromosominulkoisen geeniko-pion avulla.

Seuraavat esimerkit tarjotaan havainnollistamistarkoituk-sessa eikä rajaavassa mielessä.

ESIMERKKI 1

Genoml-DNA-kirjaston valmistus alkaloflilisestä Bacillus novo -lajista PB92 ja serllnlproteaasiqeenin eristys

Kromosomi-DNA:ta eristettiin Bacillus novo -lajista PB92 (talletettu numerolla OR-06 talletuslaitokseen Laborato-rium voor Microbiologie, Technical University of Delft, Hollanti; katso US-patenttijulkaisu n:o Re. 30,602) Saito-Miuvan, Biochim. Biophys. Acta. 72 (1963) 619-632, kuvaaman menetelmän mukaan, minkä jälkeen se pilkottiin osittain restriktioentsyymillä Sau3A ja pilkkomistuotteet li-gatoitiin plasmidin pUBHO (Gryczan et ai., J. Bacteriol. 134 (1978) 318-329) BamHI-keskukseen♦ Plasmidin pUBHO

*, ; plasmidi-DNA valmistettiin kuten Birnboim ja Doly (Nucl.

• · · .* Acids. Res. 7 (1979) 1513-1523) ovat kuvanneet.

• · · — ' * · • · · ··· * • ] Ligatointiseoksella transformoitiin B. subtilis-lA40:ää ‘ ‘ (Bacillus Genetic Stock Centre) Spizizenin et ai., J. Bac- teriol. 81 (1961) 741-746, menetelmän mukaan käyttäen 0,6 * ·· ·...· - 1 /ug DNA:ta millilitraa transformoitumiskelpoisia solu ja kohden. Transformoimisseoksen soluja maljattiin mini-maalimaljoille, joissa kasvualusta sisälsi: 2,8 % • ·· ·***: K2HP04:ää, 1,2 % KH2P04:ää, 0,4 % (NH4)2S04 :ää, 0,2 % tri- .\ Na-sitraatti.2H20:ta, 0,04 % MgS04.7H20:ta, 0,00005 %

MnS04.4H20:ta, 0,4 % L-glutamiinihappoa, 0,5 % glukoosia, *·”* 0,02 % kasaminohappoja, 50 /ug/ml tryptofaania, 20 /ug/ml metioniinia, 20 /ug/ml lysiiniä, 20 /ug/ml neomysiiniä, • · t* · • · 119028 15 0,4 % kaseiinia ja 1,5 % agaria. Maljojen yön yli kestäneen inkuboinnin 37eC:ssa jälkeen yksi 50 000:stä neomy-siiniresistentistä pesäkkeestä osoitti kasvanutta proteaa-situotantoa, mikä määritettiin kaseiinipilkkoutumistuot-teiden muodostaman saostumakehän kasvusta pesäkkeen ympärillä agar-maljassa. Tästä pesäkkeestä eristettiin plas-midi-DNA Birnboimin ja Dolyn, Nucleic Acids Res. τ_ (1979) 1513-1523, kuvaaman menetelmän mukaan ja se nimettiin pM58:ksi.

ESIMERKKI 2 PB92-seriinlproteaasiqeenin ilmentyminen pM58:n sisältävää Bacillus subtills lA40:ää viljeltiin mi-nimaalikasvualustassa (Splzlzen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 44 (1958) 1072-1078), johon oli lisätty 0,02 % kasaminohappoja, 50 ^ug/ml tryptofaania, 20 /ug/ml metio-niinia, 20 /ug/ml lysiiniä ja 20 /ug/ml neomysiiniä. Kun oli kulunut 24 tuntia, viljelmä sentrifugoitiin ja super-natantista määritettiin proteaasiaktiivisuus käyttäen di-metyylikaseiinia substraattina (Lin et ai., J. Biol. Chem. ‘ S 244 (1969) 789-793). Plasmidin pUBHO sisältävää B. sub- tllls-vlljelmä, jota käytettiin kontrollina, osoitti alle • · · *** | 1/60-osan pM58:lla transformoidun viljelmän osoittamasta | proteaasiaktiivisuudesta. Proteaasiaktiivisuus inhiboitui täysin käsiteltäessä 1 mM fenyylisulfonyylifluoridiliuok- :...: sella (PMSF), mutta ei käsiteltäessä 20 mM EDTA-liuoksel- • · · la.

Näytteitä edelläkuvatuista supernatanteista analysoitiin ·**": proteiinigeelissä Laemmlin, Nature 227 (1970) 680, mene- ·»· . *. telmän mukaan. Näissä geeleissä analysoitaviksi aiotut * « * näytteet valmistettiin käsittelemällä supernatantteja *·;·* 5-%:isella trikloorietikkahapolla (TCA). Näytteen sentri- j :’: fugoinnin jälkeen saostuneen proteiinin muodostama pellet- • · 16 119028 ti pestiin kahdesti asetonilla, minkä jälkeen se liuotettiin 40 /ul:aan näytepuskuria (0,5M Tris/HCl, pH 7,5, 10 % v/v 2-merkaptoetanolia, 50 % v/v glyserolia ja 0,05 % bro-mifenolisinistä) keittämällä 10 minuutin ajan. Elektrofo-reesiajon jälkeen geelit värjättiin valmisteella Coomassie Brilliant Blue. Sitten viljelmäsupernatanttinäytteet analysoitiin elektroforeettisesti. Käytettiin kolmea eri B. subtilis lA40-kantaa: kantaa, joka sisälsi pUB110:n; tai pM58:n; tai joka ei sisältänyt plasmidia; sekä Bacillus PB92-proteaasia kontrollina. Elektroforeesiajon jälkeen geelit värjättiin käyttäen valmistetta Coomassie Brilliant Blue ja poistettiin väri. Plasmidin pM58 sisältävästä B. subtills-kannasta 1A40 peräisin oleva näyte sisälsi 31 kD:tä proteiinia, joka migroitui kuten Bacillus PB92-pro-teaasi. Tätä proteiinia ei ollut todettavissa pUB110:n sisältävästä B. subtills-kannasta 1A40 saadussa kontrolli-vyöhykkeessä.

Kaikilla seriiniproteaaseilla on samankaltainen molekyyli-paino. Tämän vuoksi Bacillus PB92:n kloonattu seriinipro-teaasi erotettiin tunnetuista seriiniproteaaseista (B. subtilis-subtilisilnl, Carlsberq-subtllislini) transformoi moimalla pM58 ja pUBHO proteaasinegatiiviseen B. sub- tilis-kantaan DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) • · · 1 442-444) ja analysoimalla syntyneet solunulkoiset proteaa-. sit. Saatuja transformantteja kasvatettiin minimaalikasvu- alustassa (Spizizen et ai., supra), joka sisälsi 0,02 % '···' kasaminohappoja, 50 ^ug/ml histidiiniä ja 20 /ug/ml neomy- siiniä. Kun oli kulunut 24 tuntia, otettiin näytteitä, jotka sentrifugoitiin ja analysoitiin ilman esikäsittelyä ί,,.ί histidiini/MOPS-geeleissä, jotka sisälsivät 75 mM kalium- ·***: hydroksidia, 40 mM histidiiniä, 100 mM MOPS:ää (3-(N-mor- . ‘o folinojpropaanisulfonihappo), pH 7,5, ja 5 % polyakryyli- *".* amidia. Elektroforeesipuskuri sisälsi 40 mM histidiiniä, '*:** 100 mM MOPS:ää, pH 6,6. Näytteet ajettiin katodiin päin.

O· | Proteaasinauhat todettiin Agfa Pan 100 Professional- » · 119028 n filmien avulla (Zuidweg et ai,, Biotechnol. and Bioengin. 14 (1972) 685-714). Nämä tulokset on esitetty kuviossa 1. Kuten esitetty pM58 käsittää Bacillus PB92-proteaasia koo-daavan geenin.

ESIMERKKI 3

Bacillus PB92-serilniproteaasigeenin sekvenssolntl pM58:n erään Ball-Hpal-fragmentin sekvenssi kokonaisuudessaan määritettiin Sangerin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 6463, menetelmän mukaan. pM58-restriktiofragment-teja (katso kuvio 2) kloonattiin faagi M13-vektoreihin mplO, mpll ja mpl8 (Messing et ai., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309-321). pM58-fragmentti-insertioiden suhteen seulottiin plakki-hybridisaation avulla. Sekvenssoinnin jälkeen valmistettiin kymmenen geenissä tasaisin välein sijaitsevaa oligonukleotidiä ja toistettiin sekvenssointi, jolloin varmistui kuviossa 3 esitetty sekvenssi.

ESIMERKKI 4 /.J Seriinlproteaasin sisältävän plasmidin pMAX-4 rakentaminen • · • • « · • * i

Plasmidin puCN7lO (kuvio 4A) rakentamiseksi pUB110:aa pii- • * . kottiin Taql:llä ja PvuII:lla. Neomysiiniresistenssin ]„* tuottavan geenin sisältävää fragmenttia puhdistettiin ai- • · *··;' haisen sulamispisteen omaavassa agaroosissa ja fragmentis- :·..* ta tehtiin tylppäpäinen Klenow-polymeraasin ja NTP-mole- kyylien avulla (Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory :".ί Manual", Cold Spring Harbor, 1982). Plasmidi pUC7 (Vieira ·"]: et al., Gene 1£ (1982) 259-268) linearisoitiin Sallrllä ja . \t siitä tehtiin tylppäpäinen kuten edellä on kuvattu. Frag- *".* mentit ligatoitiin toisiinsa T4-ligaasin avulla (Maniatis) * · **:*' ja ligatointituotteella transformoitiin E. coll JM103. Va- ·,! · likointi suoritettiin 2xTY-maljoissa (1,6 % w/v Bacto- • * 18 119028 tryptonia, l % w/v hiivauutetta, 0,5 % natriumkloridia), jossa kasvualusta sisälsi (lisäksi) 50 /ug/ml ampisillii-niä ja 10 /ug/ml neomysiiniä. Saatua, pUCN710:ksi nimettyä plasmidia pilkottiin BamHl:llä. Plasmidia pE194 (Jordan-escu, Plasmid 1 (1978) 468-479) pilkottiin Bell:llä. Pilkkomisista saadut fragmentit ligatoitiin toisiinsa T4-li-gaasin avulla ja ligatointiseoksella transformoitiin B. subtllls-kanta 1A40. valikointi suoritettiin minimaalimal-joissa, joissa kasvualusta sisälsi 20 /ug/ml neomysiiniä (katso esimerkki 1). Saatu plasmidi, pEl94-neo (kuvio 4A), sisältää neomysiinigeenin.

Proteaasigeenin alakloonaus integroimisvektoriin pE194-neo suoritettiin seuraavasti: pM58:aa (katso esimerkki 1) pilkottiin Hpal:llä ja Ball:llä ja BqlH :11a. Plasmidia pE194-neo pilkottiin Hpal:llä. Saadut fragmentit ligatoitiin toisiinsa T4-ligaasilla ja ligatointiseoksella transformoitiin B. subtilis-kantaa 1A40. Transformantit valikoitiin neomysiiniresistenssin sekä kasvaneen proteaasi-tuotannon suhteen, jolloin viimemainittu pääteltiin kaseiinin pilkkoutumistuotesaostumasta (kehämuodostus, katso esimerkki 1). Saatiin plasmidi pMAX-4, jonka rakenteesta ·.: varmistuttiin restriktioentsyymianalyysin avulla (katso kuvio 4B).

• i ··· · 119028 19 sälsi 0,5M sakkaroosia, 0,02M magnesiumkloridia jaj 0,02M Tris/maleaattia, pH 8,0, steriilissä vedessä ja johon oli lisätty 0,4 mg/ml lysotsyymiä. Protoplastit pelletoitiin (10 minuuttia, 4500 kierr./min), uudelleensuspendoitiin 5 ml:aan AHM+-puskuria, pH 8,0 (AHM-puskuri, johon oli lisätty 3,5 % w/v valmistetta Bacto Penassay Broth ja 0,04 % w/v valmistetta Albumine Merieux), sekoitettin ja uudel-leenpelletoitiin kuten edellä. Pelletti uudelleensuspendoitiin 5,0 ml:aan AHMiää, minkä jälkeen 0,5 ml tätä pro-toplastisuspensiota sekoitettiin 5 /ug:aan demineralisoi-tua vettä, joka sisälsi 1 /ug:n plasmidi-DNA:ta, ja inku-boitiin 2 minuutin ajan 30~%:isen w/v polyetyleeniglyköli 8000 -liuokseen, pH 8,0, läsnäollessa. Laimennettiin suhteessa 1:3 AHM+-kasvualustaan, pH 8,0, ja sentrifugoitiin, minkä jälkeen pelletti uudelleensuspendoitiin pieneen tilavuuteen (1 ml) AHM+-kasvualustaa ja inkuboitiin 2-3 tunnin ajan. Sadan mikrolitran näyte-eriä maljattiin vasta-valmistettuihin regeneroimismaljoihin, joissa kasvualusta sisälsi 0,5M Na-sukkinaatti/HCl:ää, pH 8,0, 1,5 % w/v aga-ria, 0,5 % w/v kasaminohappoja, 0,5 % w/v hilvauutetta, 0,03IM fosfaattipuskuria, pH 8,0, 0,5 % w/v glukoosia, 0,02M magnesiumkloridia ja 0,02 % w/v Albumine Merieux ·. : -valmistetta. Nämä maljat sisälsivät niinikään 1000 /ug/ml .‘t>\ neomysiiniä valikointia silmälläpitäen. Maljoja inkuboi- tiin 37eC:ssa vähintään 72 tunnin ajan, minkä jälkeen pe-\ säkkeet kopiomaljattiin Heart infusion -valmiste-agar- maljoille, jotka sisälsivät 20 /ug/ml neomysiiniä.

* · • * ··« • ·· ESIMERKKI 6 :***: pMAX-4:n integrointi Bacillus-kannan PB92 kromosomiin ··· *» 1«·· ** i I. ι··ιιιι I .1-..-.11- ··· • * .*. pMAX-4:n sisältävä Bacillus-kantaa PB92 viljeltiin 20 • · · - /ug/ml neomysiiniä sisältävässä Heart Infusion -valmiste-*·;·* maljassa ja eräs pesäke siitä siirrostettiin 100 ml:aan ! valmistetta Tryptone Soya Broth (TSB), joka sisälsi l • · 20 119028 /ug/ml neomysiiniä, ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 37°C:ssa. Kahden millilitran erä viljelmää (noin 109 so-lua/ml) laimennettiin 100 mitään samaa kasvualustaa, joka sisälsi l /ug/ml neomysiiniä, ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 50*C:ssa. 24 tunnin kuluttua 5 mltn erä viljelmää (noin 109 solua/ml) laimennettiin toistamiseen kuten edellä on kuvattu, ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 50eC:ssa l /ug/ml neomysiiniä läsnäollessa. Viimemainittu menettely toistettiin edelleen kerran. Sitten solususpensio laimennettiin satakertaisesti, minkä jälkeen se maljattiin Heart Infusion - (HI) - valmiste-agar- (Difco) maljoille, joissa kasvualusta sisälsi 1 /ug/ml neomysiiniä. Maljoja inkuboitiin 16 tunnin ajan 50eC:ssa. Neomysiiniresistentit pesäkkeet eristettiin ja niitä viljeltiin 10 ml:ssa TSB-kasvu-alustaa, joka sisälsi 1 /ug/ml neomysiiniä, 16 tunnin ajan 37°C:ssa. Näistä viljelmistä eristettiin kokonais-DNA (Holmes et ai., Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197) ja plasmidin puuttumisesta varmistuttiin ajamalla DNA:n elektroforeesi agaroosigeelissä. Plasmidin puuttuminen näytteistä, joista plasmidi-DNA ei ollut todettavissa, varmistettiin transformoimalla kokonais-DNA:11a B. subtl-lis-kantaa 1A40. Näytteet, jotka eivät kyenneet transfor-,*·,· moimaan B. subtilis-kantaa 1A40, katsottiin plasmidia si- ϊ sältämättömiksi. Saatiin neomysiiniresistentti, plasmidia vailla oleva Bacillus-kanta, joka nimettiin PBT109:ksi, a "tmS Tämä kanta sisälsi kopion plasmidista pMAX-4 kromosomiinsa a ♦ ... integroituneena.

a · a · • aa «•a a a *···* Integroituminen kantaan PBT109 tapahtui niinkutsutun

Campbell-tyyppisen mekanismin välityksellä homologisena aaa rekombinaationa, jonka tuloksena kaksi peräkkäin järjes-**|φί täytynyttä proteaasigeeniä sijaitsi kromosomissa plasmidi- • )·, sekvenssien erottamina. Tämä kannan PBT109 geneettinen • a a "1/ järjestely vahvistettiin kuten on esitetty vireillä ole- *" vassa, tämän kanssa samanaikaisesti jätetyssä EPA-hakemus- : julkaisussa (Epä-Ο 000 000), joka julkaisu sisällytetään •f: tähän viitteenä.

21 119028 ESIMERKKI 7

Transformoitujen kantojen proteaasliuotanto

Transformoitujen kantojen proteaasituotantoa testattiin lisäämällä 0,2 ml noin 109 solua/ml sisältävää TSB-vil-jelmää 500 ml:n ravistelupulloihin, jotka sisälsivät 100 ml US-patenttijulkaisussa n:o Re. 30,602 kuvattua tuotan-toviljelmää. Testattaessa B. subtllis-kantoj a pH säädettiin kuitenkin 7,0:aan. Kun kyseessä olivat kannat DB104 (pUBHO), DB104 (pMAX-4), PB92 (pMAX-4), neomysiiniä lisättiin 20 /ug/ml ja PBT109:n kysessä ollessa 1 /ug/ml. Näiden solulinjojen suhteellinen proteaasituotanto on esitetty taulukossa 1.

Taulukko l

Proteaasituotanto transformoidussa Bacillus-lajeissa kanta suhteellinen pro- neomysiini- _teaasltuotanto** lisäys_ ·. : Bacillus PB92 100,0 % • ·· "

Bacillus PB92 (pMAX-4) 120,0 % + \ Bacillus PBT109 120,0 % + B. subtills DB104 (pUBHO) 1 2 3 1,5 % + B. subtills DB104 (pMAX-4) 10,0 % + • · • · * 1 · • · · ......... __ 1 • · Φ · «·· * Proteaasituotannon mittaamiseksi vain pMAX-4:n proteaa- sigeenistä tämä plasmidi transformoitiin (Spizizen et ·1": ai., (1961) supra) myös eksoproteaasinegatiiviseen B.

♦ ·· 11 ”” . 1. subtilis-kantaan DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) » t f — — I I— 1 442-444) kuvattu esimerkissä 2.

• · • · « ·· · • 1 1 2 • » 3 · ♦ • » 22 1 1 9028 ** Proteaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen dimetyylika-seiinia substraattina kuten kuvanneet Lin et ai., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793.

Suuremman mittakaavan (10 litraa) fermentaatioissa Bacillus PB92 (pMAX-4) osoitti PBT109:ään verrattuna epästabiilisuutta ja alentunutta tuotantoa, ellei käymisalustaan lisätty neomysiiniä.

Edellä saatujen tuloksien nojalla on selvää, että keksintö koskee yksinkertaista ja tehokasta menettelytapaa serii-niproteaasin tuottamiseksi, jossa homologinen tai hetero-loginen seriiniproteaasia koodaava geeni viedään stabii-listi teollisten Bacillus-kantojen kromosomiin. Keksintö koskee myös seriiniproteaasin tehostunutta tuotantoa ja jotain seriiniproteaasia tuottavassa Bacillus-isännässä. Kun plasmidirakenteet integroituvat isäntäsolukromosomei-hin, päästään stabiilimpaan tilanteeseen tuotantofermen-taatioita ja suuresti tehostunutta proteaasituotantoa silmälläpitäen, kuin jos läsnä on kromosominulkoisia plasmi-dirakenteita.

·. : Kaikki tässä patenttijulkaisussa mainitut julkaisut ja pa- ·*.·] tenttihakemusjulkalsut osoittavat viitteellisesti tämän 4 · · keksinnön koskeman alan ammattilaisten teknisen taidon ta- • m , son. Kaikki julkaisut ja patenttihakemusjulkaisut sisälly- tetään tähän viitteinä samassa määrin, kuin jos kukin yk- • · *···* sittäinen julkaisu tai patenttihakemusjulkaisu olisi ni- ·...* menomaisesti ja itsenäisesti osoitettu sisällytettäväksi viitteeksi.

• · • · • · · ·*’*: Kuvattuamme keksinnön nyt kokonaisuudessaan alan keskimaa- ··· . räiselle taitajalle lienee ilmeistä, että siihen voidaan • · · *".* tehdä useita muutoksia ja modifikaatioita poikkeamatta • · ’;·* oheisten patenttivaatimuksien hengestä tai piiristä.

• · i · » I f · ·«· · • ·

Claims (5)

23 119028

1. Menetelmä alkalofiilisten Bacillus-solujen transfor-moimiseksi, tunnettu siitä, että esikäsitellään mainittuja Bacillus-soluja lysotsyymillä emäksisessä ympäristössä noin 20 - noin 37 °C:ssa proto-plastien muodostamiseksi; erotetaan mainitut protoplastit lysotsyymistä; yhdistetään nämä protoplastit johonkin DNA-rakenteeseen jonkin fusogeenin läsnäollessa noin 20 - noin 37 °C:ssa; laimennetaan mainittua fusogeenia ja regeneroidaan mainitut Bacillus-solut; ja viljellään mainittuja regeneroituja Bacillus-soluja valikoivissa olosuhteissa, edellyttäen että DNA-rakenne ei ole (i) ilmentämiskasetti, joka sisältää toiminnallisesti yh-;*·.· distettyinä komponentteina (a) transkription säätelyalueen ♦ m : .*. ja translaation aloitusalueen, jotka ovat funktionaalisia • · 9 ··* · ....: Bacillus-isäntäsolussa, (b) DNA-sekvenssin, joka koodaa • · sellaista korkea-alkalista seriiniproteaasia, jolla on • · ... ainakin 70 %:n homologia aminohapposekvenssiin • » • · ·· *··* h2n-a-q-s-v-p-w-g-i-s-r-v-q-a-p-a-a-h~n-r-g-lt-g-s-g-v-k-v-a- V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- :*·.. G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- ’·* S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- ♦ * S-G-A-G-S -1 - S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S*· Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S- · · ./ M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-I.-K-M- ' ** T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH, • · · · · • · 24 119028 nähden, (c) translaation ja transkription lopetuksen säätelyalueet, jotka ovat funktionaalisia mainitussa isäntäsolussa, jolloin mainitun DNA-sekvenssin ilmentäminen on mainittujen aloitus- ja lopetusalueiden säätelevän kontrollin alaisena; ja (d) vähintään yhden merkkigeenin ja lämpötilaherkän replikaation aloituskohdan jostain bakteeriplasmidista, jolloin korkea-alkalisella seriini-proteaasilla on optimiaktiivisuus yli 9 olevassa pH-arvossa, ja joka säilyttää ainakin 80 % optimaalisesta aktiivisuudestaan pH:ssa 11 tai sen yli olevassa pH:ssa, ja joka on saatavissa alkalofiilisesta Bacillus-kannasta; tai (ii) plasmidirakenne, joka sisältää endogeenista mielenkiinnon kohteena olevaa entsyymiä koodaavan DNA-sekvens-sin, mainitussa isäntäsolussa toiminnallisen replikaatio-järjestelmän ja valintamerkkigeenin.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att nämnda DNA-konstruktion i transkriptionsriktning innehäller en transkriptions- och translationsinitierande reglerregion; en DNA-sekvens, som kodar för en polypeptid ·*·.· av intresse; samt en translations- och transkriptions- • * Ϊ terminerande reglerregion, varvid nämnda reglerregioner är • · · · funktionella i nämnda värdcell.

· • · ... 3. Alkalofil Bacillus-värdcell, som innehäller en uttryck- • · "* ningskonstruktion episomalt eller kromosomalt integrerad, • · *···* väri nämnda uttryckningskonstruktion innehäller en trans kriptions- och translationsinitierande reglerregion; en • * ϊ *·· DNA-sekvens, som kodar för en polypeptid av intresse; samt • * · en translations- och transkriptionsterminerande regler- . .·. region, varvid nämnda reglerregioner är funktionella i « · · t···' nämnda värdcell, förutsatt att polypeptiden av intresse är • · *!* nägot annat an en polypeptid, vars sekvens har ätminstone ·· : *· 70 %:s homologi med aminosyrasekvensen f t • · * • ·* • · 28 119028 h2n-a-q-s-v-p-w-g-i-s-r-v-q-a-p-a-a-h-n-r-g-l-t-g-s-g-v-k-v-a-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I -A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K“V-L-G-A“S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L·-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-s-g-a-g-s-i-s-y-p-a-r-y-a-n-a-m-a-v-g-a-t-d-q-n-n-n-r-a-s-f-s- Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH,

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu DNA-rakenne sisältää transkription suunnassa transkription ja translaation aloituksen säätely- :**.· alueen; kiinnostavaa polypeptidiä koodaavan DNA-sekvens- • · j .*. sin; sekä transkription ja translaation lopetuksen sääte- • · · · lyalueen, jolloin mainitut säätelyalueet ovat toiminnalli- • m ...,· siä mainitussa isäntäsolussa. • · • · · • · • · ”* 3. Alkalofiilinen Bacillus-isäntäsolu, joka sisältää il- • · *···* mentämisrakenteen episomaalisesti tai kromosomaalisesti integroituna, jossa mainittu ilmentämisrakenne sisältää • t : ’·· transkription ja translaation aloituksen säätelyalueen; • * · :,,,· kiinnostavaa polypeptidiä koodaavan DNA-sekvenssin; sekä Φ . .·. transkription ja translaation lopetuksen säätelyalueen, • · · ,··*. jolloin mainitut säätelyalueet ovat toiminnallisia maini- m "* tussa isäntäsolussa, edellyttäen, että kiinnostuksen koh- • · ; *** teenä oleva polypeptidi on muu kuin polypeptidi, jonka • · sekvenssillä on ainakin 70 %:n homologia aminohappo 25 119028 sekvenssiin H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G“V-K-V-A- V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S- Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y“P“G-S-T“Y-A-S-L-N-G-T-S- M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N- T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH, nähden.

4. Alkalofil Bacillus-v'ardcell enligt patentkravet 3, kännetecknad därav, att nämnda uttryckningskonstruktion innehäller en sekretionsledande sekvens och en pro-cessignal fusionerad till 5'-terminalen av en DNA-sekvens, som kodar för en polypeptid av intresse.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen alkalofiilinen Bacillus- isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu ilmentämis-rakenne sisältää erittymisen johtosekvenssin ja proses-sointisignaalin fuusioituneena mielenkiinnon kohteena olevaa polypeptidiä koodaavan DNA-sekvenssin 5'-päähän.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen alkalofiilinen Bacillus-isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu ilmen- . . tämisrakenne sisältää merkkigeenin, joka antaa biosidi- · · ,1 ,1 tai virusresistenssin. * · · • · • M • · • · • · · · • · • •I ··· • 1 • · • · · • · • · • ·· • · 1 • · • · ·2 • · · • · 1 · · • · · • · • · • · · • f • · • · · · • · • ·· 2 • 1 26 119028

11 Förfarande för att transformera alkalofila Bacillus-celler, kännetecknat därav, att man förbehandlar nämnda Bacillus-ceHer med lysozym i alkalisk miljö vid ca. 20 - ca. 37 °C för att bilda protoplaster; avskiljer nämnda protoplaster frän lysozymet; kombinerar dessa protoplaster med en DNA-konstruktion i närvaro av ett fusogen vid ca. 20 - ca. 37 °C; utspäder nämnda fusogen och regenererar nämnda Bacillus-celler; och odlar nämnda regenererade Bacillus-ceHer under selektiva förhällanden, förutsatt att DNA-konstruktionen inte är (i) en uttryckningskassett, som innehäller som funktio- nelit förenade komponenter (a) en transkriptionsregler- ;2.· region och en translationsinitieringsregion, vilka är • · : funktionella i en Bacillus-värdcell, (b) en DNA-sekvens, • · · • •ft · som kodar för ett högalkaliskt serinproteas med ätminstone • · 70 %:s homologi till aminosyrasekvensen • · ··· • · 'ill h2n-a-q-s-v-p-w-g-i-s-r-v-q-a-p-a-a-h-n-r-g-l-t-g-s-g-v-k-v-a- V-L'D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-M-A-B-L-Y-A-V- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- * .1·2. S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- • · *" S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S- ft Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S- :3: M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N- ·· T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH, • · ft · • ft • · ft 2 • ftft 3 • ft 27 119028 (c) translations- och transkriptionsterminerande reglerregioner, vilka är funktionella i nämnda värdcell, varvid uttryckning av nämnda DNA-sekvens är under reg-lerande kontroll av nämnda initierande och terminerande regioner; och d) minst en markörgen och ett temperatur-känsligt replikationsinitieringsställe frän nägon bakteriell plasmid, varvid det högalkaliska serinproteaset har optimal aktivitet vid ett pH-värde över 9, och som upprätthäller ätminstone 80 % av sin optimala aktivitet vid pH 11 eller ett pH över detta, och som erhälls frän en alkalofil Bacillus-stam; eller (ii) en plasmidkonstruktion, som innehäller en DNA-sekvens, som kodar för ett endogent enzym av intresse, ett i nämnda värdcell funktionellt replikationssystem och en selektionsmarkörgen.

5. Alkalofil Bacillus-vardcell enligt patentkravet 3 eller 4, kännetecknad därav, att nämnda uttryckningskonstruktion innehäller en markörgen, som ger biocid- eller virusresis-tens. • · * · 1 2 3 • ·· * · e 1 • « · • · ♦ ··» · • · e · ·»· • · • · ·· «·· · • · ··« *· 9 · • «t ··· • t • · ·1· • * Φ · 9 9 · «·· · · 9 · 2 • · 3 9 99 9 9 9 99 9 9 9 • · · • ·· • ·