TWI421031B - 供製造酸麵糰和澱粉食物用之乳酸菌和雙岐桿菌 - Google Patents

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Description

供製造酸麵糰澱粉食物用之乳酸菌和雙岐桿菌
本發明關於烘焙產品及更廣泛的澱粉食品之製造。本發明提供更容易消化之烘焙產品及其他食品，它們不含麩質或含較低且經顯著水解之麩質含量，特別適合用於乳糜瀉患者。
穀類是日常飲食的重要成分。然而麥粉麩質(尤其是麥醇溶蛋白成分)係引起人類不耐之原因。乳糜瀉亦稱口炎性腹瀉(Celiac Sprue，以下簡稱CS)或麩質敏感性腸病(gluten－sensitive enteropathy)，係廣泛的食物不耐症之一，在歐洲及美國人口中每130至300人就有1人發生此症。在南美、北非及亞洲地區，其發生率通常被低估(Fasano and Catassi；2001,Gastroenterology,120：636－651)。Logan於1992年提出的冰山模式(Logan；1992,Dyn.Nutr.Res.2：14－24)能有效說明CS的流行病學分布，其中疾病的盛行率係受到族群中易感(predisposing)基因型頻率的影響。CS之治療仍以終生禁止麩質攝取為基礎。國際糧食機構(International Food Authority)目前已重新定義無麩質(gluten－free)一詞為零容許量之麩質，然而食品標準委員會(Codex Alimentarius)允許每份食物含濃度百萬分之200的麩質。為降低人類對穀類不耐所作的努力具有高度醫學、營養及經濟利益。尤其在目前利用非常快速之技術方法的烘焙業環境中更是如此，因為這些技術方法可能造成CS流行病學之蔓延。
因此，確實有提供更容易消化及耐受之麵包及烘焙產品的需要。
CS係一種發生於遺傳性敏感患者之小腸黏膜的自體免疫性疾病。當攝取麩質時，這些病患出現自身連續性(self－perpetuating)黏膜發炎，其特徵為吸收性絨毛進行性喪失和腺窩增生(Silano and De Vincenzi,1999；Nahrung,43：175－184)。在行腸內蛋白水解消化時，例如小麥的麥醇溶蛋白釋出一群富含脯胺酸和麩胺酸之寡肽，這些寡肽引起T細胞媒介性免疫反應及/或更廣泛的CS初期之特徵性發炎狀態(Silano and De Vincenzi,1999)。有文獻報告下列寡肽之鑑定：A麥醇溶蛋白之片段31至43(Silano and De Vincenzi,1999)、α 2－麥醇溶蛋白之片段62至75(Auricchio,S.,et al.；1996,Scand.J.Gastroenterol.,31：247－253；Picarelli,A.,et al.；1999,Scand.J.Gastroenterol.,34：1099－1102)、對應α 2－麥醇溶蛋白片段57至89之表位33－mer(Shan,L.,et al.；2002.Science,297：2275－2279)、γ－麥醇溶蛋白之片段134至153(Aleanzi,M.,et al.；2001,Clin.Chem.,47：2023－2028)以及α 9－麥醇溶蛋白之片段57至68(Arentz－Hansen,et al.；2000,J.Exp.Med.,191：603－612)。CS病患無法耐受之麵粉包括小麥(wheat)、裸麥(rye)、大麥(barley)、卡姆(kamut)、黑小麥(triticale)及斯卑爾脫小麥(spelt)。關於燕麥(oat)仍有爭議存在。
為設法處理CS之跨科別的研究計畫在許多領域進行。這些努力包括無麩質穀物之改造工程(Fasano,A.,et al.；2003,Arch.Intern.Med.,163：286－292)、尋找人類CS基因(Fasano,A.,et al.,；2003)、一些保護性物質例如甘露聚糖(mannans)及N－乙醯葡萄糖胺(N－acetylglucosammine)寡體之應用，和以腦膜炎敗血性黃桿菌(Flavobacterium meningosepticum)之細菌性脯醯胺內肽酶(prolyl－endopeptidase)作為口服補充治療之應用(Shan et al.；2002)。
最近的二篇文獻指出某些酸麵糰乳酸桿菌可對麥醇溶蛋白成分行廣泛水解，像營養乳酸桿菌15M(Lactobacillus alimentarius 15M)、短毛乳酸桿菌14G(L.brevis 14G )、L.sanfranciscensis 7A及希氏乳酸桿菌51B(L.hilgardii 51B)(Di Cagno,et al.；2002,Appl.Environ.Microbiol.,68：623－33)，而且特別的是使17位CS病患耐受含2克麩質之麵包(以急性活體內腸通透性測試決定)(Di Cagno,et al.；2004,Appl.Environ.Microbiol.,70：1088－1096)。這些結果雖然令人振奮(至少就症候學而言)，但並未證實組織病理學傷害得以復原。
Wei等人(Wei,J.and Hemmings,G.P.,Medical Hypotheses,(2005),64,547－552)證實乳糜瀉與精神***症之間的遺傳關係，並指出以無麩質飲食治療乳糜瀉病患使精神***症症狀緩解之好處(De Santis,A.,et al..；J.Intern.Med.1997；242：421－3)。
某些乳酸菌在製造烘焙產品上之用途已為人所知。Kline之美國專利號碼4,140,800揭示製造冷凍乾燥酸麵糰烘焙麵種(starter)組成物之方法，該法利用舊金山乳酸桿菌(Lactobacillus sanfrancisco )，其目的為提供可用於製備法國麵包之產品。理想之該麵粉係含高量麩質。
由Di Cagno等人所提供利用酸麵糰乳酸菌的方法仍有一些無法解決的實際問題。具體來說，(i)篩選菌種係極度耗時之研究的結果，而該研究在上述酸麵糰乳酸菌菌種之菌株濃度顯示明顯差異；(ii)相同結果顯然無法在烘焙廠重現；尤其是(iii)並無商品化之篩選菌種。
其他參考文獻揭示乳酸菌及雙岐桿菌於食品製造上之用途。
歐洲專利號碼EP 0 856 259關於一種用於飼料用途之組成物，其包含凍乾活細菌之混合物及一或多種寡糖，該混合物包含至少二種選自雙岐桿菌之細菌及至少二種選自嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )、保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus )、酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei )、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )或糞鏈球菌(Streptococcus faecium )之細菌。該組成物係添加至液狀、乳脂狀或糊狀食料中，該食料係牛乳、乳底質或乳衍生製品或根據或衍生自植物產品之製品，該添加係於使用該食料時進行。該產品非用於烘焙業。
WO 03/071883關於人類及/或動物用途之飲食及/或藥學組成物以及一般食料，其根據選自乳酸菌、丙酸桿菌(propionibacteria)、酵母菌及/或黴菌之人類及動物的原籍(autochthonous)和外籍(allochthonous)菌種所組成之微生物培養。它們對人類或動物宿主之腸內菌叢具有平衡作用，對宿主生物體亦具有許多有益/益生作用。沒有跡象顯示其在乳糜瀉之可能用途。
美國專利號碼2004/265291提供用於提供或恢復接受者之有益細菌的組成物、套組及方法。該組成物及套組視需要包含促進接受者體內細菌生長和增殖之食品或營養素，或減少接受者體內不當或病原性微生物存在之抗微生物劑質。
WO 02/065842關於適用於所有穀類之麵種製劑及該相同物於根據酵母或利用酵母製作麵包和烘焙產品上之用途，尤其用於生產供乳糜瀉患者食用之無麩質烘焙產品。此專利並未揭示乳酸菌和雙岐桿菌之特別混合物。
美國專利號碼US 5,185,165揭示一種用於烘焙麵糰產品之前驅底質，該產品包含酸性濃縮物、至少一種糖類、酵母菌、至少一種麵粉、脫脂奶粉和至少一種乳酸生產菌，且亦揭示生產該前驅底質之方法。該前驅底質係用於生產前驅漿液(或活性醱酵濃縮物)之方法，該漿液係用於製造烘焙麵糰產品之前醱酵麵糰混合物。此外，此發明亦揭示製備前驅漿液和前醱酵麵糰混合物之方法，以及生產前醱酵麵糰混合物之裝置。文中提及乳酸菌完全以屬種名為之。
US 2004/110270描述一種具有免疫調節性質之細菌組成物，該組成物包含至少一種選自由嗜酸乳酸桿菌PTA－4797、胚芽乳酸桿菌PTA－4799、唾液乳酸桿菌PTA－4800、副酪蛋白乳酸桿菌PTA－4798、兩岐雙岐桿菌PTA－4801以及乳酸雙岐桿菌PTA－4802組成之群組的菌株。
EP 1 258 526揭示製造小麥前麵糰和小麥酸麵糰之麵種的生產，其藉由以包含乳酸桿菌及酵母菌之培養物(inoculum)使水和輾製小麥產品之混合物行部分醱酵，該生產包含利用含有經改造之混合菌叢的培養物，該混合菌叢包含至少一種酵母菌菌株、至少一種同質醱酵乳酸桿菌菌株和至少一種異質醱酵乳酸桿菌菌株。所提供的菌株有酵母菌屬(Saccharomyces sp.)DSM 14265、橋腦乳酸桿菌(Lactobacillus pontis )DSM 14269、橋腦乳酸桿菌DSM 14272、橋腦乳酸桿菌DSM 14273、橋腦乳酸桿菌DSM 14274、捲縮乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus )DSM 14271、胚芽乳酸桿菌DSM 14268及Lactobacillus sanfranciscensis DSM 14270；經改造之混合菌叢包含酵母菌屬DSM 14265以及橋腦乳酸桿菌DSM 14269、橋腦乳酸桿菌DSM 14272、橋腦乳酸桿菌DSM 14273、橋腦乳酸桿菌DSM 14274、捲縮乳酸桿菌DSM 14271、胚芽乳酸桿菌DSM 14268和Lactobacillus sanfranciscensis DSM 14270中的至少3種。此參考文獻關於烘焙產品之一般技術領域，無特殊之醫學適應症。
WO 99/09839關於糊狀組成物，其可應用於這類及各種食物產品之填充、塗覆或其他成分之用途，且包含顯著含量之益生菌(probiotic)。該食物產品以烘焙產品為佳，特別是含裸麥之麵包、麵包乾(rusk)、餅乾(biscuits)或該類似物。此專利關於益生菌之使用上眾所週知之觀點。
可以用簡單、可再現之製造方法及可靠、安全且有商品化之材料得到之適合乳糜瀉患者食用之烘焙產品的需求，仍然存在此領域中。
本發明藉由提供適合乳糜瀉患者之烘焙產品以符合這些需求。然而，該烘焙產品亦具有一般人飲食之用途，因為它比較容易消化。
 發明摘要
目前發現某些人類和牛乳來源之乳酸菌及雙岐桿菌之特定混合物，具有令人驚訝之水解麥醇溶蛋白和小麥穀蛋白(glutenin)成分的特性，這些成分是造成乳糜瀉的原因。
該些特定混合物在製造酸麵糰方面非常有用，並且提供定義明確之細菌菌種。
因此，本發明之目的係特定乳酸菌和雙岐桿菌混合物於製造酸麵糰上之用途。
本發明之另一個目的係以穀類食品為代表，特別是通常比較容易消化且尤其以CS病患可耐受之烘焙產品為代表。
本發明之另一個目的係製造穀類食品之方法，尤其是適合乳糜瀉患者食用及適用於預防麩質污染無麩質產品之烘焙產品。
本發明之其他目的係以無麩質穀類產品為代表，尤其是當乳酸菌和雙岐桿菌特定混合物之使用係於含有微生物蛋白水解酶之特定條件下進行時以麥粉製成的烘焙產品，該微生物蛋白水解酶係例行用於烘焙業。
本發明之另一個目的係用於乳糜瀉患者之食品，該食品包含本文所揭示之特定乳酸菌和雙岐桿菌混合物。
本發明尚有另一個目的，係上述乳酸菌和雙岐桿菌混合物於製備可用以降低血小板凝集因子(PAF)及其他發炎細胞激素的產品上之用途。
本發明之詳細說明
可以使用其他菌種，例如最新被揭露且通常可大量取得之菌種，像是ECACC、ASTM；DSM。
根據本發明，一種至少包含6種、較佳為至少7種、更佳為至少8種之乳酸菌及/或雙岐桿菌混合物係適合用於實行本發明，該乳酸菌及/或雙岐桿菌選自嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )、布氏乳酸桿菌(Lactobacillus buchneri )、酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei )、鏈狀乳酸桿菌(Lactobacillus catenaforme )、纖維二糖乳酸桿菌(Lactobacillus cellobiosus )、捲縮乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus) 、彎曲乳酸桿菌(Lactobacillus curvatus) 、戴白氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii )、戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus )、戴白氏乳酸桿菌乳酸亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis )、瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus )、詹氏乳酸桿菌(Lactobacillus jensenii )、萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillus leichmannii )、小乳酸桿菌(Lactobacillus minutus )、副酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei )、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )、洛哥葉氏乳酸桿菌(Lactobacillus rogosae )、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius )、短毛乳酸桿菌(Lactobacillus brevis )、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri )、醱酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum )、青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis )、角雙岐桿菌(Bifidobacterium angulatum )、兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum )、短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve )、鏈雙岐桿菌(Bifidobacterium catenulatum )、齒雙岐桿菌(Bifidobacterium dentium )、艾氏雙岐桿菌(Bifidobacterium eriksonii )、嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis )、長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum )、胚芽雙岐桿菌(Bifidobacterium plantarum )、假鏈雙岐桿菌(Bifidobacterium pseudo－catenulatum )、假長雙岐桿菌(Bifidobacterium pseudolongum )、乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis )、棉子糖鏈球菌(Streptococcus raffinolactis )、醱酵胺基酸球菌(Acidaminococcus fermenta )、醱酵噬胞菌(Cytophaga fermentans )、醱酵紅育菌(Rhodoferax fermentans) 、醱酵纖維單胞菌(Cellulomonas fermentans )、運動醱酵單胞菌(Zymomonas mobilis )或嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )。
根據本發明之較佳混合物係下列：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )，嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis )，長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum )，短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve )，嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )，胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )，酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei )，戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus )。嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )，乳酸雙岐桿菌(Bifidobacterium lactis )，短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve )，嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )，胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )，酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei )，瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus )。
此領域中任何具備一般經驗之人員可輕易的製備這些眾所週知之菌種的混合物。
很方便的是，這些混合物具有商品化之凍乾形式。
這些調合物適合用於作為製備酸麵糰之麵種。
穀類食品尤其是根據本發明得到之烘焙產品通常比較容易消化，因此更能被一般消費者或特別是希望或需要更好消化之食品的人所接受。
在本發明的特定實施例中，穀類食品尤其是烘焙產品可以被用於調配乳糜瀉患者之飲食，因為麩質濃度被降至低值且留在麵糰中之麩質成分係經顯著水解(尤其是造成CS之肽序列)。
在本發明的理想條件下，當上述微生物混合物之一結合足量的微生物蛋白酶，例如200 ppm的微生物蛋白酶(典型來自麴菌屬(Aspergillus sp .))，該醱酵酸麵糰之麩質濃度低於200 ppm(利用單株抗體R5測定)。如食品標準委員會(Codex Alimentarius)之聲明，該類產品被定義為無麩質，因此適用於乳糜瀉病患。
微生物蛋白酶經常使用於烘焙業，參見例如WO 88/03365、EP 0588426、US 6,465,209、GB 1,196,946。這些蛋白酶經常被銷售(參見例如Enzyme Development Corporation U.S.A.)，且本發明可利用市場上現有及烘焙業經常使用的任何產品來加以實施。
在本發明之較佳實施例中，微生物蛋白酶係來自米麴菌(Aspergillus oryzae )；活性為500,000 HUT/g；理想pH值約為3.0，活性範圍在pH 3.0至6.0；理想溫度約50℃，活性範圍在25至60℃；或另一蛋白酶係來自黑麴菌(Aspergillus niger )之酸穩定蛋白酶；活性為3,000 SAPU/g；理想pH值2.0至3.0，活性範圍在pH 2.0至6.0；理想溫度為50至60℃，活性範圍在30至60℃。這些酵素來自Bio－Cat Inc.,Troy,Virginia,U.S.A和其他許多供應商。
本發明允許以較高百分比之麥粉製造烘焙產品，所製成的產品具有較宜人之風味，更能被乳糜瀉患者接受。本發明亦可得到適合一般消費者(包括健康人)、具有較佳消化性之產品。
以較廣的觀點來說，本發明亦指包含乳酸菌混合物之澱粉產品，其視需要添加上述所揭示之酵素製劑。
以本發明最廣的觀點來說，其提供用於製備改善麩質及麩質相關物質之消化的口服產品之乳酸菌和雙岐桿菌混合物(視需要添加微生物來源之蛋白水解酶)。
包含本發明之特定混合物的酸麵糰係該相同物之關鍵形態。
該酸麵糰係用於製備烘焙產品(尤其是麵包)之方法，但是其適用於所有醱酵及非醱酵產品，例如餅乾(biscuits)、酥皮點心(pastries)、蛋糕(cakes)、派(pies)、比薩(pizza)、脆餅(crackers)、麵包棒(breadsticks)、零食(snacks)和該領域中已知的所有其他產品。
本發明之酸麵糰亦適用於製造(包括家庭製作)穀類食品(尤其是烘焙產品)之製劑。在這種情形下，烘焙產品之套組除了該特定產品之常用成分以外，將包括含有本發明之特定混合物的醱酵製劑。
本發明之醱酵製劑可以是含有特定乳酸菌和雙岐桿菌混合物之組合物，或可以在套組中和乳酸菌及雙岐桿菌之混合物分開提供並於後續使用時與之混合，例如在水中以形成醱酵懸浮液。乳酸菌之混合物可以被單獨包裝在一個容器中，或和上述蛋白水解酶(蛋白酶)混合。
澱粉產品在此領域廣為人知且係常識的一部分，同時亦為消費者所熟知且係家庭料理的一部分。具體來說，本發明係被應用於穀類產品。澱粉產品之範例包括所有種類之麵食(pasta)、麵條(noodles)(例如油炸速食麵和濕麵)、零食產品(snack products)、墨西哥麵餅(tortillas)、玉米片(corn chips)、擠壓成形及切成碎片之穀類食品(extruded cereals and shredded cereals)。
製作麵食(pasta)之方法係本領域所熟知，僅供參考之文獻包括Pasta and Semolina Technology,Edited by R.C.Kill and K.Turnbull,Blackwell Science,2001和Barilla擁有之專利。製作亞洲澱粉產品之方法亦廣為人知，僅供參考之文獻包括Asian Food,Science and Technology,Edited by Catharina Y.W.Ang,KeShun Liu and YaoWen Huang,Technomic Publishing Company,Inc.,1999及Kao Corporation之US 200220160093和Societe de Produits Nestle S.A.之WO 99/65331。
目前，大部分麵食係以連續、高產能之擠出機製作，其以螺旋擠出(auger extrusion)原理操作，使揉捏和擠出在單一步驟完成。麵食之製造包括生產乾燥通心粉(dry macaroni)、麵條(noodle)和義大利細麵(spaghetti)。
麵食(pasta)產品係藉由混合研磨小麥、水、蛋(用於蛋麵或義大利細蛋麵)及有時候之選擇性成分所生產而成。這些材料通常被加入連續、高產能之螺旋擠出機，其設有多種決定麵食形狀之模具。然後麵食被乾燥並包裝販售。
麵食產品包含研磨小麥、水，偶而有蛋及/或選擇性材料。麵食廠商在麵食生產上通常使用研磨之杜蘭(durum)小麥〔杜蘭細粒(semolina)、杜蘭粗粒(durum granulars)及杜蘭粉(durum flour)〕，雖然偶而使用常見小麥之粗穀粉(farina)和麵粉(flour)。大部分麵食廠商偏好使用杜蘭細粒(semolina)，其由大小均勻之細顆粒組成且生產最高品質之麵食產品。在麵食生產中使用的水應為純水、無異味且適合飲用。同時，由於麵食係於未達滅菌溫度下生產，因此應使用低生菌數之水。雞蛋(新鮮雞蛋、冷凍蛋、乾燥蛋、蛋黃或乾燥固體蛋)被添加至麵食以製造蛋麵或義大利細蛋麵，並提高麵食的營養價值及豐富性。亦可小量添加選擇性材料，例如鹽、芹菜、大蒜及月桂葉，以增進麵食之風味。磷酸二鈉(disodium phosphate)可以被使用以縮短烹煮時間。亦可添加其他材料，例如麩質膠(gum gluten)、甘油單硬脂酸酯(glyceryl monostearate)及蛋白。所有選擇性材料應清楚標示於包裝上。
利用碾磨機(roll mills)將杜蘭小麥研磨成杜蘭細粒(semolina)、杜蘭粗粒(durum granulars)或杜蘭粉(durum flour)。細粒研磨的獨特之處，在於其目的係製備含最少量之麵粉的中等顆粒。小麥被研磨後，其被與水、蛋和任何其他選擇性材料混合。
在混合過程中，水被加入置於混合槽中的磨碎小麥中，以產生溼度含量約31%之麵糰。亦可加入蛋及任何選擇性材料。大部分現代壓麵機設有真空室，以在擠出前除去麵食中的氣泡。如未在擠出前除去空氣，麵食中將形成小型氣泡，如此會降低物理張力，使成品呈現白色粉狀之外觀。
麵糰經混合後被移至擠出機中。螺旋擠出不光是迫使麵糰通過模具，同時也能將麵糰揉捏成均質團塊、控制生產速度，並且會影響成品之整體品質。雖然螺旋擠出機之結構及尺寸視設備製造商而有所不同，大部分現代壓麵機具有鋒利之螺旋鑽，其整支有均等之節距(pitch)。該螺旋鑽能***溝狀擠出筒，其有助於麵糰向前移動，並能減少螺旋鑽與擠出筒內壁之間的摩擦力。擠出筒設有水冷式外罩，可使擠出過程產生的熱消散。該冷卻外罩亦有助於維持恆定之擠出溫度，其應約為51℃(124℉)。如果麵糰過熱(超過74℃〔124℉〕)，麵食會被破壞。
麵糰通過擠出機之一致流速也很重要。通過模具之麵糰流速差異，會造成麵條以不同速率被擠出。大小不一致的產品必須丟棄或重新加工，如此即增加該產品之單位成本。模具之內面亦會影響產品外觀。不久前，大部分的模具為銅製，其相對較軟且需要修補或定期更換。最近，藉由在模具之擠出面安裝Teflon***物以改良模具，使模具壽命延長並提高麵食品質。
乾燥是麵食生產過程中最難控制的關鍵步驟。乾燥的目的是要將麵食含水量從大約31%降到12至13%，以使成品變硬、維持形狀及保存時不致腐壞。
大部分麵食乾燥作業在擠出後立即使用預乾機，以防止麵食沾連在一起。預乾使麵條外表變硬，同時保持內部的柔軟及可塑性。然後使用最終乾燥機，以除去產品大部分的水分。
乾燥溫度及相對溼度增加是乾燥中的重要因素。由於麵條外表相對於內部乾燥得較快，因此從麵條表面到內部形成水分梯度。如果乾燥過快，將使麵食碎裂，導致產品外觀不佳和機械張力過低。碎裂可發生在乾燥過程或產品離開乾燥機後數週。如果麵食乾燥過慢，其容易在乾燥過程中腐壞或發霉。因此，必須修改乾燥循環以符合各類產品之需求。如果乾燥循環成功，麵條達到硬實同時有足夠的彈性，使其在斷裂前可被彎曲至一定程度。
包裝能使產品不受污染、保護麵食以免在運送及儲存時受損，並以有利方式展示產品。麵條的主要包裝材料為玻璃紙袋，其可為產品提供防水保護且容易在自動包裝機上使用，但是難以堆疊在貨架上。許多製造商用盒子取代袋子來包裝麵條，因為盒子容易堆疊，對易碎之麵食產品提供良好保護，且提供相較於袋子更容易閱讀之印刷廣告的機會。
麵食製造中有許多來源會造成氣體排放。微粒物質(PM)之排放主要是因為固體的處理及混合所致。以麵食製造來說，PM排放發生於小麥研磨過程、混合粗材料時以及可能在包裝時。和小麥研磨有關之排放來源包括穀物接收、前清潔/處理、清潔房、研磨及大量裝填。其他資訊可參考D.E.Walsh and K.A.Gilles,“Pasta Technology”,Elements Of Food Technology,N.W.Desrosier,Editor,AVI Publishing Company,Inc.,1977。
本發明可應用於麵食之工業製造及家庭製作，以後者來說適合用於製作蛋麵。
根據本發明，在製作麵糰的過程中使用本文所揭示之乳酸菌混合物。
本發明的另一個實施例提供典型的亞洲穀類食品。較佳的實施例是一種在韓國稱為Ramyun、中國稱為Ramien和日本稱為Ramen的麵條。
如同本發明之一般實施方式中，該麵糰之準備係藉由添加乳酸菌混合物並使之有足夠的時間進行前醱酵。
本發明之乳酸菌和雙岐桿菌混合物(視需要添加上述微生物蛋白酶混合物)亦可被用於製造供乳糜瀉患者食用之食品，尤其是無麩質級食品。這類食品的實例為麵食(pastas)、穀類(cereals)、炸玉米餅(tacos)、墨西哥麵餅(tortillas)、爆米花(popcorn)。參考文獻見Practical Gastroenterology－April 2004,pages 86－104及該文中引述之文獻。
本發明的另一個目標係製造烘焙食品之方法，其包含添加上述酸麵糰製劑。
在本發明之較佳實施例中，該方法包含下列步驟：a)在約37℃下使20至50%重量之麵粉行液體前醱酵(整體混合物含20%至50%之麵粉和80%至50%之水，麵糰產率約300，每克麵糰約含本發明之混合物的109 細胞)達至少約24小時，較佳為約24至約31小時；b)經醱酵後，混合該麵糰和一或多種相容的麵粉(例如粟麵粉)以使最終麵糰產率約150(固體麵糰)，並加入濃度約1%重量之商業烘焙用酵母；c)在約37℃下培養該麵糰約2小時直到醱酵完全為止；d)在約250℃下烘焙約20分鐘。
在本發明之第二個實施例中，該方法可以被修改如下：a)在37℃下藉由額外添加之真菌蛋白酶(200 ppm)使20%之麵粉行液體醱酵達24至31小時；b)醱酵後烘乾除去水分，以得到無麩質之麵粉(麩質低於200 ppm)；c)使用該無麩質之麵粉作為製造穀類食品(尤其是烘焙產品)之基本成分。
在這種情形下「大約」一詞係指接近所指明之數的數值，該些數值被包含在本發明之正常實施方式中，且可依測量儀器之儀器誤差或熟悉該技術者所造成在指明之數附近的偏離而決定，但是這並不影響本發明所得到之結果。
上述之範圍亦被用來當成大約比該較低限值為高，以及大約比該較高限值為低。因此，步驟a)之液體前醱酵包含不低於大約20%且不高於大約50%重量之麵粉量，醱酵時間不短於大約24小時且不長於大約31小時。
相容麵粉之示範性清單包含豆粉(bean flours)、喬麥(buckwheat)、亞麻(flax)、玉米(玉蜀黍)、莢豆粉(legume flours)〔鷹嘴豆/雞豆(garbanzo/chickpea)、扁豆(lentil)、豌豆(pea)〕、粟(millet)、印度米草(Indian Rice Grass)、堅果粉(nut flours)〔杏仁(almond)、榛子(hazelnut)、胡桃(pecan)〕、鵝腳藜(quinoa)、馬鈴薯粉(potato flour)、甜薯粉(sweet potato flour)、西穀米(sago)、種子粉(seed flours)〔芝麻(sesame)〕、高梁(sorghum)、大豆(soy)、樹薯粉(tapioca)、畫眉草(teff)。粟係較佳之相容麵粉之一。
本發明非常有利之實施例係於烘焙產品中包含益生素，不論是否含有相容之麵粉。
益生素係一種不可消化之類纖維物質，其範例為短鏈及長鏈寡糖，例如果寡糖、大豆寡糖、木寡糖以及異麥芽寡糖。
本發明甚至更有利之實施例，係將本文所揭示之烘焙產品結合像EP 1 010 372中所揭示之烘焙產品。在這個實施例中，該烘焙產品包含一種非烘焙、本質上為無水、脂底質之組成物，該組成物包含活凍乾乳酸菌。此包含活凍乾乳酸菌之脂底質組成物當然可以結合本發明之所有烘焙產品。
本發明之穀類食品(尤其是烘焙產品)和用於製作穀類食品(尤其是烘焙產品)之套組係適合用於乳糜瀉患者。
如上所述，本發明亦包含俗稱澱粉食品之一般食品，尤其是穀類食品。
該乳酸菌混合物(視需要添加微生物蛋白酶)係如前述用於製造澱粉食品(特別是穀類食品)，以得到上述烘焙產品實施例之相同結果及好處。所以可以說，根據本發明所得到之食品係適用於乳糜瀉患者，或希望食品更好消化之一般健康消費者。例如小孩及老人可能希望較易消化之食品。
因此，本發明的另一個目的係治療乳糜瀉患者之方法，其包含以上述所揭示之烘焙產品及/或澱粉食品調配該病患之飲食。如前述，本發明之烘焙產品及澱粉食品將被包含在「穀類食品」一詞中。
在本發明的另一個實施例中，該穀類食品(特別是烘焙產品)也可以被用於維持麩質耐受性，或誘發麩質耐受性，或降低麥粉白蛋白及球蛋白引起之過敏風險。
在本發明的另一個實施例中，該穀類食品(特別是烘焙產品)可以被安全的用於乳糜瀉患者，因為其麩質濃度很低(<200 ppm)。
本發明之治療方法亦可併用乳糜瀉之其他醫學療法。
如上所述，精神***症症狀被發現於乳糜瀉患者且精神***症患者顯示對麩質之敏感行為。本發明之混合物係可用於製備無麩質之飲食產品。
因此，本發明的另一個目的係上述所揭示之混合物於製備用於治療精神***症徵候之無麩質飲食產品上之用途。具體來說，該徵候影響乳糜瀉或非乳糜瀉患者。
此領域的另一個問題係脯胺酸於腸飲食製劑中的使用。在某些病患中，脯胺酸無法被水解，且製作腸飲食解決方案之該化合物無法被消化。同時脯胺酸也會引起過敏反應。本發明揭示之乳酸菌和雙岐桿菌混合物可用於水解脯胺酸或富含脯胺酸之胜肽，因而使腸飲食製劑有效且無過敏性。
多虧本發明所揭示之乳酸菌和雙岐桿菌混合物之性質，該混合物亦可用於使富含麥醇溶蛋白之麩醯胺溶液成為低過敏性。
在本發明之另一個實施例中，亦發現本文所揭示之該混合物可以被用於製造降低血小板凝集因子(PAF)及其他發炎細胞激素以治療胃腸道疾病之產品。
PAF和一系列胃腸道疾病有關，尤其是發炎性疾病。我們可以舉出缺血性腸道壞死(Hsueh W.,Gonzalez－Crussi F.；Methods Achiev.Exp.Pathol.；1988：13；208－39)、胃潰瘍(Esplugues JV.,Whittle B.J.,Methods Find.；1989：Suppl.1,61－6)、出血性直結腸炎(Chaussade S.,Denizot Y,Ann.Gastroenterol.Hepatol.(Paris)；1991,May 27(3)：117－21)、壞死性小腸結腸炎(Ewer AK.,Acta Pediatr.Suppl.；2002,91(437)：2－5；neonatal；Caplan MS.,et al.,Semin.Pediatr.Surg.；2005,Aug 14(3)：154－51)、發炎性腸疾病(Nassif A.,et al.Dis.Colon Rectum；1996,Feb.；39(2)：217－23)及迴腸囊袋炎(Rothenberg DA.,et al.Ann.Chir.；1993；47(10)；1043－6)。
該產品可以採用食物(如上所揭示)或營養補充劑(nutritional supplement)、營養食品(nutraceutical)、藥物之形式。
營養補充劑和營養食品係此領域中眾所週知之用語(Arvanitoyannis IS,et al.；Crit.Rev.Food Sci.Nutr.；2005,45(5)：385－404 and Kalra EK,AAPS PharmSci.；2003,5(3)；E25)，無須另行定義。
下列範例進一步說明本發明。
 實施例一 酸麵糰醱酵和電泳分析
使用之麥粉特性如下：溼度12.8%；蛋白質(N x 5.70)佔10.7%之乾物重(d.m.)；脂肪佔1.8%之乾物重；灰份佔0.6%之乾物重；及總可溶性碳水化合物佔1.5%之乾物重。使用80克之麥粉和190毫升之自來水(包含細胞濃度約109 菌落形成單位/克麵糰之細胞製劑)以製作270克之麵糰(麵糰產率220)。利用下列乳酸菌和雙岐桿菌之混合物製造4個麵糰。
本發明之混合物1：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )，嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis )，長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum )，短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve )，嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )，胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )，酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei )，戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus )。
本發明之混合物2：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )，乳酸雙岐桿菌(Bifidobacterium lactis )，短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve )，嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )，胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )，酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei )，瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus )。
混合物3：嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )，短毛乳酸桿菌(Lactobacillus brevis )，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )，嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis )。
混合物4：短毛乳酸桿菌(Lactobacillus brevis )，唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius spp.salicinius )，胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )。
於37℃下進行醱酵達24小時。利用乳酸及醋酸之混合物(莫耳比4：1)，使不含細菌培養物之麵糰行化學酸化至pH 4.0，以作為對照組。經培養後，依照原先由Osborne描述(Osborne,T.B.；1970,The proteins of the wheat kernel.Carnegie Institute of Washington publication 84.Judd and Detweiler,Washington,D.C.)，後來經Weiss等人修改之方法(Weiss,et al.；1993,Electrophoresis,14：805－816)，從麵糰中萃取麥醇溶蛋白。
取10至20微升之等量樣本(約10微克之麥醇溶蛋白)以樣本緩衝液1：1稀釋，在100℃處理5分鐘，依照Laemmli方法(Laemmli；1970,Nature,227：680－685)進行十二基硫酸鈉－聚丙烯醯胺凝膠電泳分析(SDS－PAGE)；該膠體含12%之丙烯醯胺，並以B10 Bio－Safe考馬斯藍(Bio－Rad Laboratories,Hercules,CA)染色。依Di Cagno等人所述(Di Cagno；et al.,2004)進行二維膠體電泳(2DE)。分析三片凝膠，依Bini等人(Bini,et al.；1997,Electrophoresis,18：2832－2841)之報告將化學酸化麵糰斑點強度(siCAD)和酸麵糰(添加混合物1)斑點強度(siSD)正常化。各蛋白質之水解因數以〔(siCAD－siSD)/siCAD〕x100表示，所有水解因數根據三片凝膠之平均斑點強度計算，並計算標準差。只有統計顯著性之P值小於0.05之水解因數才被報告。
合成基質之水解、富含脯胺酸之多肽和RP－FPLC分析
利用合成基質例如Pro－p－NA、Leu－p－NA、Ala－p－NA、Leu－Leu、Val－Leu、Pro－Gly、Gly－Pro－Ala、Leu－Leu－Leu、Z－Gly－Pro－p－NA或NCBZ－Gly－Gly－Leu－p－NA(Sigma Chemical Co,St.Louis,Mo)，初步決定混合物1之脯胺酸特定肽酶活性。檢測混合物包含500微升之200毫莫耳的磷酸緩衝液、pH 7.5、150微升之基質(終濃度為0.2至3毫莫耳)、8微升之三氮化鈉(終濃度0.05%)及50微升之混合物1製劑(終濃度5 x 109 cfu/ml)。A麥醇溶蛋白之片段62至75(P－Q－P－Q－L－P－Y－P－Q－P－Q－S－F－P)(Silano and De Vincenzi；1999)和表位33－mer(L－Q－L－Q－P－F－P－Q－P－Q－L－P－Y－P－Q－P－Q－L－P－Y－P－Q－P－Q－L－P－YP－Q－P－Q－P－F)(Shan et al.,2002)由Neosystem Laboratoire(Strasbourg,France)以化學合成。片段62至75之檢測混合物包含320微升之20毫莫耳的磷酸緩衝液、pH 7.0、150微升之基質(終濃度450微莫耳)、8微升之三氮化鈉(終濃度0.05%)及50微升之混合物1製劑(終濃度5 x 109 cfu/ml)。表位33－mer之檢測混合物包含500微升之200毫莫耳的磷酸緩衝液、pH 7.5、150微升之基質(終濃度200微莫耳)、8微升之三氮化鈉(終濃度0.05%)及50微升之混合物1製劑(終濃度5 x 109 cfu/ml)。二種混合物均於37℃下攪拌培養(每分鐘150轉)。水解33－mer之酵素動力學利用Lineweaver－Burk圖計算(Lineweaver and Burk；1934,J.American Chem.Soc.,56：658－666)。
加入0.05%(體積比)(終濃度)之三氟乙酸以停止酵素反應。利用RP－FPLC使胜肽自混合物中被分離，使用Resource II RPC 3毫升管柱和具有於214奈米處偵測之紫外線偵測器的FPLC設備(Amersham Bioscences,Upssala,Sweden)。以含0.05%三氟乙酸之乙腈梯度(5至100%)進行每分鐘1毫升流速之沖提。乙腈濃度在16至62分鐘從5%線性增加至46%，在62至72分鐘從46%增加至100%。
利用相同步驟，決定醱酵麵糰之70%乙醇可溶性萃取物中所包含的寡肽。
真菌蛋白酶結合乳酸菌和雙岐桿菌之使用
要生產無麩質之酸麵糰(低於200 ppm)，使用混合物1和例行用於烘焙產品之200 ppm真菌蛋白酶。在醱酵過程中，細菌及真菌來源之蛋白水解活性的互補作用使特別是麥醇溶蛋白和小麥穀蛋白之成分顯著降低。該醱酵酸麵糰之乙醇可溶性萃取物顯示麥醇溶蛋白濃度低於200 ppm(利用單株抗體R5決定)。
利用R5單株抗體之西方墨漬分析及RAPD PCR分析
含混合物1(約109 菌落形成單位/克麵糰)之醱酵麵糰(37℃下24小時)被和非蛋白質成分及相容麵粉(例如粟)混合以生產義大利餅乾(biscuits)，其在250℃下烘焙15分鐘。不經混合物1醱酵所製作之義大利餅乾被當成對照組。餅乾以西方墨漬R5單株抗體及RAPD PCR在Centro National de Biotecnologia,Gluten Unit,CNB(28049 Madrid Spain)進行分析。R5單株抗體可辨識可能有毒的乳糜瀉胜肽：QQPFP及33－mer。RAPD PCR根據特定DNA序列進行，其可能和有毒胜肽有關。
麥粉鹽可溶性蛋白質(白蛋白及球蛋白)之水解
依Weiss之方法(1993)自麥粉萃取白蛋白及球蛋白。檢測混合物包含0.8毫升之白蛋白/球蛋白(約3毫克/毫升)在50毫莫耳Tris－HCl中、pH 7.0、5x109 cfu/ml之混合物1及0.05%三氮化鈉。於37℃下攪拌培養24小時。該檢測包含無微生物細胞之對照組。培養後離心收集上清液，以用於電泳。來自水/鹽可溶性部分之蛋白質(白蛋白及球蛋白)利用免疫印漬法分析(Curioni,A.,et al.,1999,Clin.Exp.Allergy,29：407－413)，以偵測來自遺傳過敏性(atopic)病患集合血清之IgE結合，這些病患於之前出現關於攝食小麥之胃腸道症狀特徵。利用半乾印漬法，將SDS－PAGE分離之蛋白質帶以Trans－blot Cell(Bio－Rad Laboratories,Milan,Italy)轉印至硝化纖維素膜上(50伏特電壓進行5小時)，轉印緩衝液含48毫莫耳之Tris、pH 9.2、39毫莫耳之甘胺酸、20%之甲醇及0.1%之SDS。將纖維素膜浸入Ponceau S(0.1%在3%之三氯乙酸中)數分鐘可看見印漬帶，用水退染前以鉛筆標示。使膜在含0.05% Tween 20(TBS－T)及5%脫脂奶粉之TBS(M－TBS－T)中阻斷2小時，與來自病患之集合血清(用TBS－T稀釋1：20)隔夜培養。墨點以M－TBS－T清洗5次後，用抗人類IgE之過氧化酶結合單株抗體(Sigma Chemical Co)(以M－TBS－T稀釋1：5000)培養1小時(Curioni,et al.；1999)。經M－TBS－T清洗4次及TBS清洗1次後，依廠商提供之說明操作Supersignal Detection kit(Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL)，使結合之IgE藉由化學發光被看見。該反應於室溫下進行。
相較於對照組，從4種細胞製劑醱酵之麵糰所萃取之麥醇溶蛋白部分的SDS－PAGE分析顯示，不是所有細胞製劑都具有相同分解麥醇溶蛋白之能力。本發明之混合物1的水解能力非常高，混合物2只有輕微能力，然而其他細胞製劑(混合物3及4)不造成明顯之分解。
這4種細胞製劑之差異藉由70%乙醇可溶性蛋白質部分之RP－FPLC分析被證實，得到該些寡肽之分子量明顯低於電泳可偵測之分子量的整體觀點。
上述結果清楚證明混合物1的表現最佳，其似乎具有對麥醇溶蛋白較為專一之蛋白水解活性。
當組成混合物1之8株細菌菌種被分別以大約109 細胞/克麵糰之相同濃度使用，沒有1株可達成如該混合物之顯著水解。這首次證明混合物1中依明確定義之比例使用之至少6株菌種之間具有互補蛋白水解活性。
麥醇溶蛋白及相關寡肽之特徵在於，它們的序列中有高比例之脯胺酸殘基(Wieser,1996,Acta Pediatr.Suppl.412：3－9)。脯胺酸在20種胺基酸中獨樹一格，因為它具有環形結構。這種特殊構造在胜肽及蛋白質的結構型態上有許多限制，使它們非常難以被水解。要適當處理這些胜肽，必須用一群特殊的肽酶水解所有其中脯胺酸殘基係存在不同位置之可能基質的肽鍵(Cunningham and Connor；1997,Biochim.Biophys.Acta,1343：160－186)。混合物1之脯胺酸特定肽酶活性利用合成基質初步決定，例如Pro－p－NA、Leu－p－NA、Ala－p－NA、Leu－Leu、Val－Leu、Pro－Gly、Gly－Pro－Ala、Leu－Leu－Leu、Z－Gly－Pro－p－NA或NCBZ－Gly－Leu－p－NA，其分別係脯胺酸亞胺肽酶(proline iminopeptidase)、胺肽酶(aminopeptidase)、二肽酶(dipeptidase)、脯胺酸酶(prolinase)、脯肽酶(prolidase)、二肽醯肽酶(dipeptidyl peptidase)、三肽酶(tripeptidase)、脯胺醯內肽酶(prolyl－endopeptidase)及內肽酶(endopeptidase)酵素相對特定之基質(表1)。
各數值為3次酵素檢測之平均值，並計算標準差。1單位(U)之p－NA基質酵素活性被定義為於410波長處每分鐘所產生吸光度增加0.01之酵素量。1單位之多肽為每分鐘釋放1微莫耳之基質的酵素量。
所有上述酵素活性大部分存在混合物1製劑中。由於很少有一種獨特的微生物菌種可具備所有前述酵素活性(Cunningham and O’Connor；1997；Kunjii,et al.；1996,Antoine Van Leeuwenhoek 70：187－221；Di Cagno et al.；2004)，因此只有經選擇的一群細菌(例如該些被包含於混合物1中者)具有水解富含脯胺酸之寡肽所需之完整肽酶模式。
在麵糰醱酵期間，混合物1製劑對麥醇溶蛋白寡肽之水解特徵被進一步以2DE分析。將化學酸化麵糰中被鑑識出之84個蛋白質斑點作為對照組(圖1A)。相較於對照組，麵糰經混合物1之醱酵後，84個麥醇溶蛋白寡肽斑點中的79個斑點被顯著分解(圖1B)。表2係以2DE分析之斑點的水解因數。大部分被分解的寡肽(79個中的65個)具有高於80%之水解因數，只有8個顯示低於40%之水解因數。
a 以Image Master軟體(Pharmacia)進行分析。分析4片獨立複製之凝膠。斑點定量及水解因數之計算見材料與方法。所有水解因數係根據4片凝膠中各片斑點強度之平均值計算，並計算標準差。b 斑點編號係對應圖1A及1B中之膠片編號。
上述結果顯示混合物1具有幾乎完全水解麥醇溶蛋白寡肽的能力。
混合物1對A－麥醇溶蛋白之片段62至75(Silano and De Vincenzi；1999)及表位33－mer(Shan,et al.；2002)之作用被進一步在活體外決定，文獻指出這些寡肽係造成CS之主要原因。如RP－FPLC分析所示，濃度450微莫耳之A－麥醇溶蛋白片段62至75以含5 x 109 cfu/ml細菌之混合物1培養6小時後被完全水解。濃度200微莫耳之表位33－mer，以含相同細菌濃度之混合物1培養24小時後被完全水解(圖2)。33－mer之水解動力學以Lineweaver－Burk圖測定，其顯示最大速度(Vm a x )為每分鐘每毫升0.26微莫耳，米氏常數(Km )為216微莫耳。如先前文獻所報告，應注意表位33－mer具有下列特性：(i)即使長時間暴露在胃蛋白酶及胰蛋白酶中，其仍維持完整；(ii)以小刷狀緣膜酵素培養超過20小時，其水解不到20%；以及(iii)長時間(約24小時)在小腸維持完整，即使濃度低仍為促使T細胞增生之可能抗原(Shan,et al.2002)。上述結果顯示混合物1含有完全水解33－mer所需之複雜酵素活性，且這些酵素之活性明顯高於位於胃腸道之酵素活性。
相較於歐洲麥醇溶蛋白之參考資料，以R5單株抗體進行之義大利餅(Italian biscuits)的西方墨點分析具有完整麥醇溶蛋白之典型特徵。R5單株抗體的主要好處在於其識別對應多免疫反應表位重複之共同胺基酸序列QXPW/FP的能力(Osman,et al.；2001,Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.,13：1189－1193)，該重複發生於α－、γ－及ω－麥醇溶蛋白以及不同小麥品種中(Shewry,et al.；1992,Cereal’s proteins and celiac disease.In：Celiac disease,Marsh M.〔ed〕,Oxford,Blackwell Scientific Publications pp.305－348)。最高的反應性與QQPFP胺基酸序列有關，但是同源重複例如LQPFP、QLPYP、QLPTF、QQSFP、QQTFP、PQPPP、QQPYP及PQPFP也被認為對R5抗體具有較弱的反應性(Osman,et al.；2001)。很有趣的是這些表位中的3個(LQPFP、QLPYP及PQPFP)被放入乳糜瀉病患之腸衍生T細胞系A麥醇溶蛋白33－mer肽可能誘導子的序列中(Shan,et al.；2002)。以混合物1醱酵之義大利餅的西方墨點顯示，由R5單株抗體識別之α－、β－及γ－麥醇溶蛋白幾乎被完全分解。
相同結果經RAPD PCR分析證實。
識別小麥白蛋白及球蛋白之過敏原部分的初步實驗顯示，受檢血清100%為白蛋白及球蛋白部分陽性。在15至75千道爾頓之明顯分子量範圍之蛋白質成分被發現有反應，有些血清在約15至45千道爾頓出現強染色性。以單維SDS－PAGE測定，未處理之白蛋白及球蛋白和經混合物1製劑水解者的比較強調一些可能過敏原多肽之水解。
實施例二
實施例一製備之酸麵糰被用於製造烘焙產品。
藉由用本發明之麵糰組成物取代美國專利6,884,443之麵糰組成物，以製備該專利之實施例所揭示的烘焙產品。如上述實施例一所揭示於37℃下醱酵24小時，並使用混合物1。
所製成之該產品更好消化並更適合乳糜瀉患者。
實施例三
以混合物2製備之實施例一的酸麵糰被用於製造麵食。
所製成之該麵食更好消化，可以被乳糜瀉患者食用。
實施例四
實施例一之混合物1被用於製造US 2002/0160093所揭示之麵條。
除了添加含有本發明之混合物1的套組至鹼水及麵粉混合物以外，重複US 2002/0160093之實施例一至四。經揉捏後，使該混合物於37℃下靜置24小時。然後依參考文獻所揭示之方式製備麵條。
所製成之該產品更好消化，適合乳糜瀉患者食用。
實施例五
實施例一之混合物2被用於製造WO 99/65331所揭示之麵條。
除了添加含有本發明之混合物2的套組至麵糰成分以外，重複WO 99/65331之實施例一至二。經混合後，使該麵糰於37℃下靜置24小時。然後依參考文獻所揭示之方式製備麵條。
所製成之該產品更好消化，適合乳糜瀉患者食用。
實施例六
實施例一之混合物1被用於製造EP 0 614 609所揭示之麵包衍生物。
除了添加含有本發明之混合物1的套組至麵糰製劑以外，重複EP 0 614 609之實施例一至五。經揉捏後，使該麵糰於37℃下靜置24小時。然後依參考文獻所揭示之方式製備產品。
所製成之產品更好消化，適合乳糜瀉患者食用。
實施例七
實施例一之混合物2被用於製造EP 1 338 209所揭示之義大利細麵。
除了添加含有本發明之混合物2的套組至麵糰成分以外，重複EP 1 338 209之實施例。經混合後，使該麵糰於37℃下靜置24小時。然後依參考文獻所揭示之方式製備麵條。
所製成之該產品更好消化，適合乳糜瀉患者食用。
實施例八
拉麵(Ramyun)組成物：1.麵條麵粉：83－85%精製油：15－18%鹽：1%其他：0.6－1%
2.乾湯底乾燥牛肉片、醬油、麩胺酸一鈉、麩胺酸二鈉、香料、葡萄糖、大蒜、洋蔥、青蔥、紅辣椒粉、其他增加風味之成分
拉麵之製造方法
依照廠商建議混合麵粉(有時候可以使用不同比例之澱粉、米製粉、大麥粉)和水。混合物1被添加至麵糰中，於37℃下靜置24小時。
以壓輥機滾壓混合麵糰，然後將麵糰放在機器中通過以製成單條狀麵條。藉由調整切條機之切口大小及負載麵條之輸送帶速度，可使麵條之形狀及厚度修飾成為想要的厚度及形狀。
麵條通過其中溫度超過100℃之蒸氣室，以誘發預膠化澱粉(α－澱粉)，使其更容易消化。
經蒸氣處理後，用模型盒使麵條形成特定之形狀。
油炸步驟：根據速食麵條的種類，透過油炸步驟使麵條脫水。麵條經150℃之油炸。有些速食麵條不經過這個油炸步驟。
在油炸步驟後，該速食麵條經過冷卻程序。
根據本發明，乳酸菌和雙岐桿菌之特定混合物係適合用於製造穀類食品(特別是烘焙產品)，這些產品可能更能被CS病患耐受。具體來說，具有下列優點：(i)在麵糰醱酵時分解麥醇溶蛋白寡肽之優越能力；(ii)2DE分析所識別之84種麥醇溶蛋白寡肽中，有79種被水解；(iii)對合成胜肽具有互補及高度酵素活性，該胜肽包含在不同位置之脯胺酸；(iv)完全水解造成CS之寡肽(A－麥醇溶蛋白之片段62至75及表位33－mer)的能力；(v)顯著降低與R5單株抗體反應之α－、β－及γ－麥醇溶蛋白的能力；(vi)水解一些過敏原多肽之能力；(vii)當上述細菌加上真菌蛋白酶被用於20%小麥麵粉之液體醱酵，其活性可大幅提高無麩質小麥麵粉之生產。
現在將詳細揭露本發明前述的這些和其他目的，同時以實施例和圖式方式說明，其中：圖1顯示以麥粉製成之不同麵糰的麥醇溶蛋白成分2DE分析。(A)化學酸化麵糰(對照組)。醇溶蛋白(prolamin)多肽以編號之紅色橢圓形標示。(B)在37℃下與下述實施例之混合物1培養24小時之麵糰。醇溶蛋白(prolamin)多肽以編號之紅色橢圓形標示。藍色數字代表被分解超過80%之多肽。Mr代表分子量。
圖2顯示混合物1(109 菌落形成單位/毫升)對33－mer肽之水解。200微莫耳之33－mer於37℃下不加微生物培養物培養24小時後(A)以及加入混合物1在37℃下水解24小時後(B)，在紫外線波長214奈米處之RP－FPLC波形。

Claims (21)

  1. 一種酸麵糰，其包含至少6種細菌與微生物蛋白水解酶之混合物，該至少6種細菌係選自嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )、戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus )、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )、酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei )、短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve )、嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis )或長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum )，其中存在至少一種雙岐桿菌，該混合物產生醱酵麵糰，該醱酵麵糰之麩質含量經使用單株抗體R5測定及經RP-FPLC偵測之麥醇溶蛋白的經水解之33聚體片段界定係低於200ppm。
  2. 如申請專利範圍第1項之酸麵糰，其中該微生物蛋白水解酶係得自麴菌屬(Aspergillus sp.)。
  3. 一種以榖類為底質之食品，其包含如申請專利範圍第1至2項中任一項之酸麵糰。
  4. 如申請專利範圍第3項之食品，其係經烘焙且係選自餅乾(biscuits)、酥皮點心(pastries)、比薩(pizza)、脆餅(crackers)或麵包棒(breadsticks)。
  5. 如申請專利範圍第3項之食品，其未經烘焙且係選自麵條(noodles)、義大利麵條(spaghetti)或麵食(pasta)、或拉麵(ramyun)。
  6. 如申請專利範圍第3至5項中任一項之食品，其另 包含益生素(prebiotic)。
  7. 如申請專利範圍第3項之食品，其係用於腸飲食。
  8. 一種能降低麵粉之麩質含量至低於200ppm之組成物，其包含至少6種細菌與微生物蛋白水解酶之混合物，該至少6種細菌係選自嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )、戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus )、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )、酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei )、短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve )、嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis )或長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum )，其中存在至少一種雙岐桿菌。
  9. 如申請專利範圍第8項之組成物，其中該微生物蛋白水解酶係得自麴菌屬(Aspergillus sp.)。
  10. 一種如申請專利範圍第1至2項中任一項之酸麵糰於製造含有降低之麩質含量的烘焙和非烘焙食品之用途。
  11. 一種乳酸菌及/或雙岐桿菌中至少6種與微生物蛋白水解酶之混合物於製造能降低食品之麩質含量至低於200ppm的組成物之用途，該乳酸菌及/或雙岐桿菌選自包含嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )、戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus )、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )、 胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )、酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei )、短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve )、嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis )及長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum )，其中存在至少一種雙岐桿菌。
  12. 一種如申請專利範圍第1至2項中任一項之酸麵糰於製備腸飲食之用途。
  13. 一種如申請專利範圍第3至7項中任一項之食品於維持乳糜瀉患者的麩質耐受性之用途。
  14. 一種如申請專利範圍第3至7項中任一項之食品於誘發乳糜瀉患者的麩質耐受性之用途。
  15. 一種如申請專利範圍第3至7項中任一項之食品於降低因麥粉白蛋白和球蛋白所引起的過敏風險之用途。
  16. 一種如申請專利範圍第3至7項中任一項之食品於調配乳糜瀉患者的飲食之用途。
  17. 一種如申請專利範圍第3至7項中任一項之食品於降低胃腸道疾病中發炎細胞激素之用途。
  18. 一種用於製備如申請專利範圍第1至2項中任一項之酸麵糰之套組，其包含(a)含有麩質之麵粉；及(b)如申請專利範圍第1至2項中任一項所述之乳酸菌、雙岐桿菌及微生物蛋白水解酶之混合物。
  19. 如申請專利範圍第18項之套組，其另包含一或多種用於製備食品之相容麵粉，該等相容麵粉選自豆粉、喬 麥粉、亞麻粉、玉米(玉蜀黍)粉、莢豆粉、粟粉、印度米草粉、堅果粉、鵝腳藜粉、馬鈴薯粉、甜薯粉、西榖米粉、種子粉、高梁粉、大豆粉、樹薯粉或畫眉草粉。
  20. 一種用於製備如申請專利範圍第1至2項中任一項之酸麵糰之方法，其包含下述步驟：(a)令20-50%含有麩質之麵粉與80-50%水混合；(b)對每克(g)麵糰加入如申請專利範圍第1至2項中任一項之酸麵糰所描述之細菌混合物109 cfu/ml；及(c)令醱酵於37℃下進行24至31小時。
  21. 如申請專利範圍第20項之方法，其另包含下述步驟：(d)加入一或多種相容麵粉和1重量%烘焙用酵母；(e)於約37℃下培養該麵糰達約2小時直至醱酵完全為止；及(f)於約250℃下烘焙約20分鐘以製備烘焙食品。
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