TWI386215B - 用於預防壞死性腸炎之組合物 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種預防壞死性腸炎之組合物。
壞死性腸炎(Necrotizing Enterocolitis,NEC)好發於早產兒腸道,是種常見且死亡率高的腸道疾病。出生體重少於1500公克的早產兒約有12%的壞死性腸炎發生率,其症狀包括食慾不振、體重下降、腹漲、血便、腹膜炎、敗血症與休克等,嚴重時會導致死亡。目前已知的相關致病因子包括早產、腸壁缺血/缺氧、細菌感染及腸道餵食等,但真正的病因仍不清楚。
壞死性腸炎的治療方式包括禁食、支持療法、抗生素與外科手術等。然而,手術對於早產新生兒的危險性甚高,抗生素治療雖可抑制腸道內致病菌生長,但另一方面也會傷害腸道中其它益菌,破壞腸道內的菌相平衡。因此,目前極需要一種安全且有效預防或治療壞死性腸炎的藥物或食品。
本發明在於非預期性地發現新穎益生菌菌株,由其中一種或三種之組合,發現經口服給予後能幫助早產兒之腸道維持健康,並進一步預防壞死性腸炎發生。
因此,本發明係提供一種具預防壞死性腸炎功效之菌株,其包含選自由下列組成之群之一種菌株:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum
) PM-A0087菌株,其係為寄存於台灣新竹食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910475;比菲德氏龍根菌(Bifidobacterium longum
) PM-A0101菌株,其係為寄存於食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910476;以及雙叉乳桿菌(Bifidobacterium bifidum
) PM-A0218菌株,其係為寄存於食品工業發展研究所寄存編號為BCRC 910477。
另一方面,本發明亦提供一種用於預防壞死性腸炎之組合物,其包含植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum
) PM-A0087菌株,其係為寄存於台灣新竹食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910475、比菲德氏龍根菌(Bifidobacterium longum
) PM-A0101菌株,其係為寄存於食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910476以及雙叉乳桿菌(Bifidobacterium bifidum
) PM-A0218菌株,其係為寄存於食品工業發展研究所寄存編號為BCRC 910477,之一或其組合。
本文所用冠詞「一」或「該」意指該冠詞之文法上受詞為一或一以上(即至少為一),除非另闡明該冠詞特別用於單數文義。
本發明係提供具有預防壞死性腸炎功效之新穎菌株,其為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum
) PM-A0087菌株,比菲德氏龍根菌(Bifidobacterium longum
) PM-A0101菌株,以及雙叉乳桿菌(Bifidobacterium bifidum
) PM-A0218菌株。
在本文中,「壞死性腸炎」係指一種急性、局部或慢性腸道的潰爛而導致腸道組織壞死之疾病,主要發生於早產兒。在本文中「預防壞死性腸炎」係指在早產兒出生後餵食本發明之益生菌組合物,能顯著性地防止壞死性腸炎之發生,或減緩壞死性腸炎之嚴重程度以降低死亡率。
根據本發明,從發酵植物(如,泡菜)經篩檢分離程序不可預期地分離出一種新穎的植物乳桿菌PM-A0087菌株,屬兼氧性革蘭氏陽性菌株,其特性為不具觸酶、氧化酶及運動性,不產生內孢子,經食品工業發展研究所鑑定為植物乳桿菌之新菌株。於99年4月30日寄存於台灣新竹食品工業發展研究所,寄存編號BCRC 910475。
根據本發明,從嬰兒糞便經篩檢分離程序不可預期地分離得到一種新穎的比菲德氏龍根菌PM-A0101菌株,屬厭氧性革蘭氏陽性桿菌株,其特性為不具觸酶、氧化酶及運動性,不產生內孢子,經食品工業發展研究所鑑定為比菲德氏龍根菌之新菌株,於99年4月30日寄存於台灣新竹食品工業發展研究所,寄存編號BCRC 910476。
又,根據本發明,從人類腸道經篩檢分離程序不可預期地分離得到一種新穎的雙叉乳桿菌PM-A0218菌株,屬兼養性革蘭氏陽性桿菌株,其特徵為不具有觸酶、氧化酶及運動性,不產生內孢子,生長於厭氧環境下,經食品工業發展研究所鑑定該菌為雙叉乳桿菌之新菌株。於99年4月30日寄存於台灣新竹食品工業發展研究所,寄存編號BCRC 910477。
同時,本發明亦提供一種用於預防壞死性腸炎之組合物,其包含植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum
) PM-A0087菌株,比菲德氏龍根菌(Bifidobacterium longum
) PM-A0101菌株,以及雙叉乳桿菌(Bifidobacterium bifidum
) PM-A0218菌株之一或其組合。
根據本發明,本發明之組合物中植物乳桿菌PM-A0087菌株、比菲德氏龍根菌PM-A0101菌株,以及雙叉乳桿菌PM-A0218菌株之菌數比例及菌數需並無特定,可依所需任意組合;菌數比例較佳為1:1:1,各乳酸桿菌之菌數較佳為0.1~10 x 109
cfu/ml。在一較佳之具體實施例中,本發明之組合物中植物乳桿菌PM-A0087菌株、比菲德氏龍根菌PM-A0101菌株以及雙叉乳桿菌PM-A0218菌株之菌數比例為1:1:1,且各乳酸桿菌之菌數約為1 x 109
cfu/ml。在本發明之另一具體實施例中,植物乳桿菌PM-A0087菌株、比菲德氏龍根菌PM-A0101菌株,以及雙叉乳桿菌PM-A0218菌株之之菌數比例為1:1:1,且各乳酸桿菌之菌數各為1.5 x 109
cfu/ml。
根據本發明之一具體實施例,本發明預防壞死性腸炎之組合物可以口服投與,並製備為任何適當之形式。舉例來說,適合口服投與的固體形式,如:丸狀、膠囊、顆粒、錠劑和粉末,或是液體形式,如:飲料、糖漿、溶液、以及懸浮液。本發明之組合物可添加一種或多種常用於口服配方之載體或賦形劑做成組合物,或視需要添加例如表面活性劑、溶解劑、穩定劑、乳化劑、濃縮劑、色素、甜味劑、風味添加劑以及防腐劑等。
根據本發明之一具體實施例,本發明組合物可製備為食品,包括但不限於乳品、發酵乳製品、飲料、運動飲料、營養添加物或保健食品、糖果或是膠體。
本發明由下列實施例做進一步的說明,但實際發明並不受限於該用於展示之實施例。
將市售泡菜放入50 ml離心管中,加入些許無菌去離子水後分別滴入如下不同分離目的之各式培養基:
(1) MRS-封:分出乳酸桿菌-兼性厭氧環境;
(2) MRS-不封:分出球菌-好氧環境;
(3) MRS+Cysteine-封(厭氧):分出乳酸桿菌之B菌-兼性厭氧環境;
(4) LBS-封:分出乳酸桿菌-兼性厭氧環境;
(5) LBS+冰醋酸-封(厭氧):分出乳酸桿菌-兼性厭氧環境;
(6) TS-不封:分出芽孢桿菌-好氧環境;
(7) LB-不封:分出大腸菌(E. Coli
);
(8) BCP-封:分離出藍色菌群(colony)非乳酸菌;
(9) BCP-不封:分離出黃色菌群(colony)是乳酸菌。
以滅菌吸管將樣品再滴入各式培養基的第一區,本次1個樣本共有九片(MRS-封及不封、MRS+Cysteine-封(厭氧)、LBS-封、LBS+冰醋酸-封(厭氧)、TS-不封、BCP-不封),再用接種環過火後將第一區液體塗開至第二區,接種環過火後再塗至第三區及第四區。將部份樣品液體行革蘭氏染色確定目前產品內菌種多少樣。翌日後取以上培養皿,將不同菌相的菌落用黑色細字筆圈出兩個以上較相同之菌落,去鏡檢後,將以上已知之菌種之菌落以它適合之培養皿再塗四區培養,一直重覆至純化菌種為止。
MRS培養基配方如下(g/L),最終pH 6.5±0.2:
蛋白(Proteose peptone),10.0 g
牛肉萃取物,10.0 g
酵母萃取物,5.0 g
右旋糖,20.0 g
聚山梨糖醇酯80,1.0 g
檸檬酸胺,2.0 g
乙酸鈉,5.0 g
硫酸鎂,0.1 g
硫酸錳,0.05 g
磷酸二鉀,2.0 g
洋菜膠,15 g
二次水,1000 mL
圖1係為純化之菌種在顯微鏡下觀察的菌相,其係為外觀呈短桿之革蘭氏陽性菌,編號為PM-A0087,寄存於台灣新竹食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910475。
自新生兒採集之糞便(2.05 g)放入50 ml離心管中,加入些許無菌去離子水後分別滴入如上述之培養基,並以與分離植物乳桿菌PM-A0087相同之純化步驟得到一純化菌株。
圖2係為純化之菌種在顯微鏡下觀察的菌相,其係為外觀呈短桿及Y字型之革蘭氏陽性菌,編號為PM-A0101,寄存於台灣新竹食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910476。
自新生兒採集之糞便(6.34 g)放入50 ml離心管中,加入些許無菌去離子水後分別滴入如上述之培養基,並以與分離植物乳桿菌PM-A0087相同之純化步驟得到一純化菌株。
圖3係為純化之菌種在顯微鏡下觀察的菌相,其係為外觀呈短桿及Y字型之革蘭氏陽性菌,編號為PM-A0218,寄存於食品工業發展研究所寄存編號為BCRC 910477。
植物乳桿菌PM-A0087菌株以MRS培養基在37℃下培養,比菲德氏龍根菌PM-A0101菌株及雙叉乳桿菌PM-A0218菌株以MRS培養基添加5%半胱胺酸在厭氧環境、37℃下培養。培養三天後,將各乳酸菌株自培養箱取出,然後將養菌管中的菌液反覆抽吸完全打散,測定吸光值並依所測之數值預估菌數,並將植物乳桿菌PM-A0087菌株、比菲德氏龍根菌PM-A0101菌株以及雙叉乳桿菌PM-A0218菌株之菌數分別調整至1.5 x 109
cfu/ml。
經調整菌數之各乳酸菌分別取1 ml分裝至1.5 ml離心管中然後進行離心,以3000 rpm轉速離心10分鐘,離心後去除上清液。於4℃冷藏30分鐘後,移至-20℃冷凍保存。餵食前,將植物乳桿菌PM-A0087菌株、比菲德氏龍根菌PM-A0101菌株以及雙叉乳桿菌PM-A0218菌株從-20℃冰箱取出,均勻混合至1 ml牛奶中備用。
取出Klebsiella pneumoniae
、Serratia marcescens
與Escherichia coli
凍菌管。將接菌環燒紅冷卻後,沾取凍菌管內菌液,在LB洋菜膠上劃四區,放入37℃培養箱培養18小時。各取5 mL生理食鹽水到三管透明玻璃試管中,並以無菌棉棒沾取LB洋菜膠上長出的菌落,放入玻璃試管中與5 mL生理食鹽水均勻混合。菌液混合均勻後,以目視方式與2號比濁管比較濁度,將試管中的菌液調整至相同濁度。將調整好之菌液,以2:2:3的比例混合均勻,分裝至1.5 mL離心管中,4℃冷藏備用。
將懷孕21天之SD母鼠以二氧化碳麻醉50秒。用酒精噴拭母鼠肚子後,剖開母鼠肚子並剪開心臟使其死亡。接著以鑷子夾住胎盤,再以小剪刀迅速將新生小鼠外膜與臍帶剪開取出新生小鼠。用棉棒輕壓臍帶剪開處避免大量出血死亡,並擦拭新生小鼠全身黏液,避免阻塞呼吸道死亡。稱重並放入37℃保溫箱中飼養(控制溼度40~50度)。用棉棒輕推新生小鼠的肚子,幫助排便及排尿。
隨機方式分為對照組與實驗組,實驗組依實驗組別分為五組,於出生後3小時餵食50 μL致病菌。出生後6小時分別餵食50 μL牛奶或添加乳酸菌的牛奶。餵完後將新生小鼠放入充滿100%氮氣盒子60秒後,再放入4℃冰箱10分鐘,進行造症,每12小時造症一次。出生後9小時兩組皆餵食50 μL致病菌,出生後12小時餵食50 μL牛奶或添加乳酸菌的牛奶,以此方式進行餵食致病菌與添加乳酸菌的牛乳。經過24小時後,會產生壞死性腸炎徵狀,如:血便、呼吸不順、食慾不振、體重下降等。當發現新生仔鼠快死亡時,採集整段小腸與大腸,放於包埋盒,再置於裝有20 mL 4%三聚甲醛之檢體盒中,進行組織切片後判讀腸道壞死程度。
如圖4示,依據切片結果將壞死性腸炎分為0級(無壞死)、1級(輕度)、2級(中度)、3級(重度)四個等級,各組小鼠之切片判讀結果整理於表1中。依據判讀結果用SPSS 12.0統計軟體以無母數Mann-Whitney檢定,顯著性p
值<0.05判定為具有顯著差異,結果如表2所示。
結果如表1、表2及圖5所示,餵食本發明乳酸菌之一或其組合之組合物的實驗組早產仔鼠,相較於對照組皆有較好的預防壞死性腸炎效果,且具差異顯著性(p<0.05)。而在實驗組中,餵食本發明之兩種或三種乳酸菌組合物之早產仔鼠,相較於對照組具有壞死性腸炎較低的發生率,且具差異顯著性(p<0.05)。此外,相較於單獨餵食含有單一乳酸菌之早產仔鼠,亦具壞死性腸炎較低之發生率,且疾病發生的嚴重程度亦被降低,且具差異顯著性(p<0.01)。
前文之所述以及實施方式可藉由附加之圖式達到更好的說明效果。為了加強本發明之說明,將適當的實施例之圖式列舉於此。
圖1係為純化之植物乳桿菌PM-A0087菌株在顯微鏡下觀察的菌相。
圖2係為純化之比菲德氏龍根菌PM-A0101菌株在顯微鏡下觀察的菌相。
圖3係為純化之雙叉乳桿菌PM-A0218菌株在顯微鏡下觀察的菌相。
圖4係為顯示腸壞死之判斷級別之切片結果:(A)腸壞死0級:無腸壞死現象,腸道中上皮細胞及絨毛組織完整;(B)腸壞死1級:輕度腸壞死,少部份絨毛組織出現不完整;(C)腸壞死2級:中度腸壞死,絨毛組織出現大面積破損壞死;(D)腸壞死3級:重度腸壞死,絨毛組織已完全消失,腸黏膜組織嚴重壞死。
圖5係為以植物乳桿菌PM-A0087菌株、比菲德氏龍根菌PM-A0101菌株以及雙叉乳桿菌PM-A0218菌株單獨或組合餵食之新生小鼠與對照組在腸壞死級數之比較圖,*及**表示具顯著性(*為p<0.05;**為p<0.01)。
Claims (6)
- 一種具預防壞死性腸炎功效之菌株,其包含選自由下列組成之群之一種菌株:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum )PM-A0087菌株,其係為寄存於台灣新竹食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910475;及雙叉乳桿菌(Bifidobacterium bifidum )PM-A0218菌株,其係為寄存於食品工業發展研究所寄存編號為BCRC 910477。
- 一種用於預防壞死性腸炎之組合物,其中該組合物包括寄存於台灣新竹食品工業發展研究所寄存編號為BCRC 910475的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum )PM-A0087菌株及寄存於台灣新竹食品工業發展研究所寄存編號為BCRC 910477的雙叉乳桿菌(Bifidobacterium bifidum )PM-A0218菌株之一或其組合。
- 如申請專利範圍第2項之組合物,其中該植物乳桿菌PM-A0087菌株及雙叉乳桿菌PM-A0218菌株組合之菌數比例為1:1。
- 如申請專利範圍第2項之組合物,其中該植物乳桿菌PM-A0087菌株及雙叉乳桿菌PM-A0218菌株之菌數分別為0.1~10 x 109 cfu/ml。
- 如申請專利範圍第2項之組合物,其中該植物乳桿菌PM-A0087菌株及雙叉乳桿菌PM-A0218菌株之菌數分別為1 x 109 cfu/ml。
- 如申請專利範圍第2項之組合物,其中該植物乳桿菌PM-A0087菌株及雙叉乳桿菌PM-A0218菌株之菌數分別為1.5 x 109 cfu/ml。
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